Desenvolvimento de um teste rápido microfluídico para

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS
DESENVOLVIMENTO DE UM TESTE
RÁPIDO MICROFLUÍDICO PARA
DETECÇÃO COLORIMÉTRICA DO
VÍRUS DA CINOMOSE CANINA
Aluna: Ana Carolina Rafanhin Sousa
Orientador: Prof. Dr. Emanuel Carrilho
INTRODUÇÃO
o Cinomose Canina (Canine Distemper Virus):
• Altas taxas de mortalidade em cães;
• Possui 8 proteínas virais: 2 não estruturais e 6 estruturais;
• Maior incidência entre 60 e 90 dias de idade;
• Forma de transmissão: secreções e excreções oculares,
respiratórias, digestivas e urinárias;
• Incidência no Brasil: 11% das mortes em cães.
2
INTRODUÇÃO
o Por que utilizar papel?
•
•
•
•
•
•
•
•
Simples, fácil e rápida fabricação;
Mínima infraestrutura;
Uso fácil e remoto;
Portáteis, descartáveis e biodegradáveis;
Baixo custo;
Baixo volume de reagentes e amostras;
Multianálises em um mesmo dispositivo;
Compatibilidade com análises químicas, bioquímicas e
médicas.
3
INTRODUÇÃO
o Nanopartículas de ouro (AuNPs):
• Propriedades de alta estabilidade e capacidade de carga;
• Detecção de DNA, anticorpos ou íons;
• AuNPs dispersas: coloração vermelha;
• AuNPs agregadas: coloração azul ou púrpura.
4
EXPERIMENTAL
o Fabricação dos microdispositivos:
5
EXPERIMENTAL
o Produção nas AuNPs colidais:
aquecimento
agitação
Solução
amarela
HAuCl4.3H2O
(0,5 mmol L-1)
AuNPs colidal
C6H5Na3O7.2H2O
(1 %)
6
EXPERIMENTAL
o Conjugação das AuNPs com anticorpos policlonais:
+
C6H5Na3O7.2H2O (0,04 %)
K2CO3 (0,26 mmol L-1)
NaN3 (0,02%)
AuNPs colidal
(1,0 mL)
Ressuspensão em
BSA (1 %)
Centrífuga
(4 ºC; 20 min.)
+
Anticorpos policlonais antivírus da cinomose
(produzidos em coelhos) e
anticorpos de coelho
produzidos em cabra
(SIGMA-A0545)
BSA (1 %)
+
Agitação
(2h)
7
EXPERIMENTAL
o Imobilização de anticorpos policlonais em papel de filtro:
• Solução de anticorpos policlonais anti-vírus da cinomose canina
diluída em tampão.
• Tampões: carbonato-bicarbonato (0,2 mol L-1, pH 9,6)
carbonato de sódio (0,1 mol L-1, pH 9,5)
fosfato de sódio (0,1 mol L-1, pH 6,5)
• Diluições: 1:2, 1:4, 1:8 e 1:16
8
EXPERIMENTAL
o Imobilização de anticorpos policlonais em papel de filtro:
• Controle positivo: anticorpos IgG de coelho (SIGMA)
mesmos tampões e mesmas diluições
• Controle negativo: mesmos tampões (ausência de anticorpos)
9
RESULTADOS
o Ensaio de espessura dos microcanais na plataforma em
papel:
• t = 0:
6 mm
5 mm
4 mm
3 mm
2 mm
• t = 4 min:
10
RESULTADOS
o Tempo de fluidez de diferentes amostras em papel de
filtro:
• Amostra: soro (10 µL)
11
RESULTADOS
o Tempo de fluidez de diferentes amostras em papel de filtro:
• Amostra: sangue total (20 µL)
• Sangue total puro;
• 1:2 (tampão carbonatobicarbonato, pH 9,6)
• 1:4 (tampão carbonatobicarbonato, pH 9,6
12
RESULTADOS
o Tempo de fluidez de diferentes amostras em papel de
filtro:
• Amostra: sangue total
(20, 30 e 40 µL)
• 1:4 (tampão carbonatobicarbonato, pH 9,6)
13
RESULTADOS
o Tempo de fluidez de diferentes amostras em papel de
filtro:
• Amostra: sangue total
(30 µL)
• 1:4 (tampão carbonatobicarbonato, pH 9,6)
14
RESULTADOS
o Imobilização dos anticorpos policlonais em papel de
filtro:
• Melhor resultado: tampão carbonato de sódio, 0,1 mmol L-1, pH 9,5
• Diluição 1:4
15
RESULTADOS
o Reatividade do antígeno da cinomose canina em papel de
filtro:
• Tampão carbonato-bicarbonato, pH 9,6
1:2
1:4
16
CONCLUSÃO
• Desenvolvimento de um protótipo de teste imunocromatográfico com amplificação enzimática para detecção dos
antígenos da cinomose canina utilizando plataforma em
papel:
• Pequeno volume de amostras;
• Pouco tempo para fabricação e realização dos ensaios;
• Não necessita leitor de microplacas;
• Totalmente portátil.
17
AGRADECIMENTOS
• Comissão organizadora do evento;
• FAPESP;
• Instituto de Química de São Carlos;
• BioMicS.
18