2 - Univali

DESCOBERTA DE COMPOSTOS ANTIFÚNGICOS DE ORIGEM VEGETAL EM ESPÉCIES UTILIZADAS NA MEDICINA POPULAR
Prof. Susana A. Zacchino
Farmacognosia
Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas
Dano do tecido epitelial
From Department of Microbial Pathogenicity Mechanisms (MPM) at the Leibniz Institute of Natural Product Research and Infection Biology, Hans Knoell Institute (HKI).
Os FUNGOS PRODUZEM
infecções
denominadas MICOSES
Que tipo de micoses produzem?
Micoses SUPERFICIAIS da pele e mucosas
Micoses SISTÊMICAS
O fungo entra nos tecidos profundos ou nos órgãos internos
Em pacientes hospitalizados
Erna M. Kojic and Rabih O. Darouiche Candida Infections of Medical Devices Clinical Microbiology Reviews, 17 255–267, 2004.
Existem drogas antifúngicas o suficientemente úteis para combater às infecções fúngicas ?
POLIENOS
AZOLES
CASPOFUNGINA
ALILAMINAS
No entanto, todas possuem MUITOS INCONVENIENTES.
TODAS LEVAM AO DESENVOLVIMENTO DE RESISTÊNCIA.
Como tem que ser o antifúngico ideal ?
• Amplo espectro
• Fungicida
• Não tóxico
• Não muito caro
• Via oral e intravenosa
As plantas provêem ilimitadas oportunidades
para o isolamento de novos compostos
antifúngicos por sua disponibilidade inigualável
de diversidade química. Mas,
como selecioná-las para começar seu estudo?
Por famílias vegetais?
¿ Por regiões geográficas ?
Entonces, dentro de uma região, cómo las escogemos? baseando‐nos em dados etnofarmacológicos ?
A esmo ?
Hay trabajos que se basan em dados etnofarmacológicos Otros las eligen al azar
Nós fizemos um estudo com plantas de sete países de Latinoamerica financiado pela Organização de Estados Americanos
Director: Prof. Dr. Mahabir Gupta
E encontramos
Svetaz, et al., J. Ethnopharmacol., enviado Julio 2009
Além da forma de selecionar as plantas,
o sucesso depende de muitos outros fatores
por exemplo
MÉTODOS sem alvo específico PARA BIOGUIAR O ESTUDO
QUALITATIVO
BIOAUTOGRAFIA EM CAPA DE ÁGAR
QUANTITATIVO
Método de DILUIÇÃO
ALGUNS RESULTADOS UTILIZANDO MÉTODOS SEM
ALVO ESPECÍFICO
Vejamos resultados com diferentes
extratos de partes aéreas
Avaliação da atividade antifúngica dos extratos pelo método de microdilución em caldo:
Ca: Candida albicans; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cn: Cryptococcus neoformans; Afum: Aspergillus fumigatus; Afl:
Aspergillus flavus; An: Aspergillus niger; Mg: Microsporum gypseum; Tr: Trichophyton rubrum; Tm: Trichophyton
mentagrophytes. ≥1000: no activo.
Detecção de compostos antifúngicos em todos os extratos que apresentaram atividade por microdiluição em caldo.
Poligodial
Isopoligodial
Hex
DCM
AcOEt MeOH
Derita, M., et al., J. Ethnopharmacol. 124, 377‐383, 2009
No entanto, quando começamos a extração com
metanol em lugar de hexano
MeOH
Extrato MeOH
Hexano
Sub-extracto
hexánico
Marco
DCM
Sub-extracto
DCM
Marco
Sub-extracto
AcOEt
AcOEt
Material residual
Avaliação da atividade antifúngica dos extratos pelo método de microdilución em caldo:
Ca: Candida albicans; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Cn: Cryptococcus neoformans; Afum: Aspergillus fumigatus; Afl:
Aspergillus flavus; An: Aspergillus niger; Mg: Microsporum gypseum; Tr: Trichophyton rubrum; Tm: Trichophyton
mentagrophytes. ≥1000: no activo.
Que pode ter pasao ?
INACTIVO
Ying, B et. al. (1995) Phytochemistry 38, 909-15
Se evidenció que la actividad de Polygonum acuminatum se debía a los dialdehidos poligodial e isopoligodial,
los cuales se inactivaban en MeOH. Para comprobar que eran realmente los dialdehidos sesquiterpénicos los responsables de la actividad
Fizemos um estudo da variação do
conteúdo de poligodial e relação de este
conteúdo com a atividade antifúngica
Variáveis
Solvente
Partes da planta
Coleta em diferentes estações do ano
Solvente
Se estudou o conteúdo de poligodial nas diferentes partes da planta nos diferentes solventes
folhas
frutos
tallos
raiz
Extrato DCM
Coleta em diferentes estações do ano
Verão
Outono Inverno
Primavera
FOLHAS: Correlação do conteúdo de poligodial e a atividade antifungica em extratos DCM
Derita, M., et al., J. Ethnopharmacol. 124, 377‐383, 2009
Derita M., et al., Biochem. System. Ecol. 36, 55‐58, 2008 Resumo:
A atividade antifúngica de Polygonum acuminatum se deve principalmente a poligodial, mas para mostrar atividade o extrato não deve ser alcoólico. A atividade é maior em outono e em inverno em que a concentração de poligodial é maior. O sucesso depende de muitos fatores
Extractos a probar
Mostras
Método sem
Metodología alvo específico
a utilizar
Fungos
Método con alvo
específico
Panel de hongos
prueba
Outras
estratégias
O ideal é usar um painel amplo
FUNGOS que atacam a humanos
leveduras
Candida albicans
C. tropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Cryptococcus neoformans
fungos filamentosos
Aspergillus nIger
A. fumigatus
A. flavus
Microsporum gypseum
M. canis
Trichophyton rubrum
T. mentagrophytes
Epidermophyton floccosum
E também podemos usar fungos que atacam aos
cultivos ou a animais
Vamos ver os resultados diferentes que se obtêm quando
se usam diferentes tipos de fungos con Zuccagnia
punctata Cav.
Quando a provamos contra fungos patogénicos
oportunistas para o humano com método sem alvo
específico
Frutos
Partes Aéreas
HEXANO
BIOENSAiOS
AHex, FHex Material Vegetal Residual
DCM
ADCM, FDCM
Material Vegetal Residual
MeOH
AMeOH, FMeOH
CIM de extratos de las partes aéreas
fueron aisladas dos chalconas como los compuestos responsables de la actividad.
No entanto, quando se provou Zuccagnia punctata Cav. Contra fungos que causam infecções em soja
O extrato DCM de partes aéreas
2',4'‐Dihidroxi‐3'‐metoxichalcona (1)
7‐Hidroxiflavanona (3)
2',4'‐Dihidroxichalcona (2)
Cafeato de 1‐metil‐3‐(4'‐hidroxifenil)‐propilo (4)
Cafeato de 1‐metil‐3‐(3', 4'‐dihidroxifenil)‐propilo (5)
Comparação da atividade antifúngica (CIM em µg/mL)
dos compostos 1-5 isolados de Z. punctata frente a tudo
o painel de fungos patogenicos para soja.
Svetaz L., et al., J. Agric. Food Chem. 52, 3297‐3300, 2004
O sucesso depende de muitos fatores
Extractos a probar
Mostras
Método sem
Metodología alvo específico
a utilizar
Método con alvo
específico
Panel de hongos
prueba
Fungos
Outras estratégias
Quais são os alvos possíveis para um fungo ?
Membrana citopl ásmica
Pared celular
A maioria de ANTIFÚNGICOS em uso clínico tem como alvo a membrana fúngica
Membrana
Metabolismo
intermediario
Otras dianas
Un mecanismo muy importante es la UNIÓN AL ERGOSTEROL de la membrana fúngica, que es el mecanismo por el que actúa Anfotericina B
OH
H3C
HO
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
CH3
COOH
OH
H3C
Anfotericina B
O
NH2
OH
CH3
Que compostos se liberan ?
Que tienen un máximo de absorción a 260 nm
União ao ergosterol da membrana celular fúngica dos compostos isolados de Zuccagnia punctata
Composto antifungico
ENSAIO PARA DETERMINAR ROTURA DA MEMBRANA
Sólo chalcona 2 resultó activa para este ensayo Se consideró que el ácido perclórico produce un leakage celular del 100 %.
Svetaz, L., et al., Planta Med. 73, 1074‐1080, 2007
Extractos a probar
Mostras
Método sem
Metodología alvo específico
a utilizar
Método con alvo
específico
Panel de hongos
prueba
Fungos
Outras estratégias
Cambios en la morfología fúngica
permiten inferir que ese compuesto es
antifúngico
y además da idea de su mecanismo de acción.
Seiler et al., MBC, 14, 4352‐4364, 2003
Gunji, S. Agric. Biol. Chem. 47, 2061‐2069, 1983
Phytolacca tetramera Hauman
Fitolacósido B
Escalante A, et al. J Ethnopharmacol. 82, 29-34 2002.
Efeito de Fitolacósido B sobre Saccharomyces cerevisiae
(a) Cultivo controle; (b) Micrografías de contraste de fase (400x) de
Saccharomyces cerevisiae em presença de Fitolacósido B (37 μM).
Escalante et al, J. Nat. Prod. 2008
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB)
Crecimiento normal
Crecimiento en presencia de Fitolacósido B
Escalante, A., et al., J. Nat. Prod., 71, 1720‐1725, 2008.
Polygonum ferrugineum Wedd. (Polygonaceae)
Comparação das atividades antifúngicas das chalconas mais ativas
H3CO
OH
H3CO
OH
pashanona
O
HO
OH
OCH3
cardamonina
O
MeO
O
OH
OMe
O
O
Del arilo de Myristica fragrans (macis)
Configuración
relativa ERITRO
CIM= 5 μg/ml frente
a dermatofitos
Crescimento de um fungo filamentoso
Crescimento normal
Crescimento em presença do neolignano
Zacchino, S. et al., J. Ethnopharmacol. 62, 35‐41, 1998.
O sucesso depende de muitos fatores
Obtener análogos de Productos obtendios de plantas
Phyllanthus sellowianus
O
N
(CH 3)2N
(CH 2)2
O
Filantimida
Sortino, M., et al., Tetrahedron: Asimmetry 20, 1106–1108, 2009
Sortino et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 560‐568, 2008
López, S. et al. Arzn. Forsch. (Drug. Res.) 55, 123‐132, 2005.
Zamora, et al., Intern. J. Quant. Chem. 93, 32‐46, 2003. Sortino et al., Bioorg. Med. Chem. 16, 560‐568, 2008
Sortino et al., Tetrahedron: Asimmetry, 20 1106–1108, 2009
López et al., Arzn. Forsch. (Drug. Res.) 55, 123‐132.
Zamora et al., J. Quant. Chem. 93, 32‐46, 2003. Outra estrategia es voltar a testar os extratos inativos com outros bioensaios Qual estrategia escolher?
Todas as estratégias são úteis !!
É necessário usar las estratégias que tenemos y encontrar novas estratégias que permitam aproveitar a grande diversidade química da natureza
Las metodologías se publicaron en un libro
con el apoio de CYTED
CIBE, Merck Sharp & Dohme de España,
Madrid
Instituto de Microbiología Bioquímica,
Salamanca
Instituto de Salud Carlos III, Madrid
Instituto Venezolano de Investigaciones
Científicas, IVIC , Caracas
Ciflorpan, Panamá
Instituto Malbrán, Buenos Aires
ISBN 978-950-9030-40-4
Mayo 2007
Universidad de San Carlos de Guatemala
CEREMIC, Farmacognosia y Biología Vegetal
de Universidad Nac de Rosario
Agradecimientos
• Agencia de Promoción Científica y Tecnológica de la Argentina (ANPCyT)
• Organización de Estados Americanos (OAS) • Programa Iberoamericano (CYTED)
• Internation al Foundation for Sciences (IFS)
• Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de Argentina (CONICET)
Colaboraciones
Bolivia
Dr A. Giménez
Brasil
Dr V. Cechinel Filho (Itajaí)
Dr R. Yunes
Dr. M. Furlán
Dra S. Kuze Rates
Dra G. von Poser
Chile:
Dr G. Schmeda Hirschmann
Colombia:
Dr. J. Quiroga
Dr. V. Kouznetsov
Costa Rica
Dra A. Pérez
México
Dr. R. Pereda Miranda (UNAM)
Dr. L Peña Rodríguez, (Mérida)
Dra R. Encarnación
España
Dr. A.San Feliciano
Dra. E. del Olmo
Dr.S. Cañigueral,
Dra R. Vila
Dr A. Durán
Dr. J.C. Ribas
Dra P. Pérez
Paraguay:
Dr E. Ferro
Panamá:
Dr M. Gupta
Venezuela
Dr. G. Visbal
Dra G. San Blas
Dr. J. Domínguez