Na Bahia, Ribeiro Filho et al. (2003) relatam à influência

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Biotecnologia da Reprodução Aplicada a Bubalino
(Biotechnology of Reprdoduction Applayied to Buffaloes)
Otávio Mitio Ohashi1,2, Marcela da Silva Cordeiro1, Moysés dos Santos Miranda1,3
1
2
Laboratório de Fecundação in vitro, Universidade Federal do Pará, Belém-PA, Brazil
Laboratório de Morfofisiologia Molecular e do Desenvolvimento, Universidade de São Paulo,
Pirassununga-SP, Brazil.
3
Departamento de Biologia da Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brazil
[email protected]
Resumo
Neste trabalho, são apresentados dados sobre as principais biotécnicas da reprodução plicadas a
bubalino tais como, a Inseminação Artificial (IA), a Superovulação (SOV), Produção In Vitro de
Embrião (PIVE) e a Transferência Nuclear (TN). Até o momento, apenas a IA tem apresentado
resultados consistentes que assegure o seu uso em escala comercial, especialmente com o advento do
protocolo de Inseminação Artificial em Tempo Fixo. As outras biotécnicas, apesar dos esforços de
vários grupos de pesquisas de diferentes paises, ainda precisam de aperfeiçoamentos que permitam que
as mesmas sejam usadas em rebanho comercial.
Palavras-chaves: Biotecnologia da reprodução, Búfalo.
Abstract
In this paper are presented datas on the mainly biotechniques of reproduction used in water
buffalo such as Artificial Insemination (AI), Multiple Ovulation Embryo Transfer (MOET), In Vitro
Embryo Production (IVEP) and Nuclear Transfer (NT). So far, only AI has presented consistent results
which assegure it use in comercial scale, escpecially with the advent of the protocolo of artificial
insemination in fixed time. The other biotechniques spite of the efforts of many research groups in
many coutries they still need improvements in order to use them in comercial herd.
Keywords: Biotechnology of reproduction, buffalo.
Introdução
As principais biotécnicas aplicadas à reprodução animal, tais como Inseminação Artificial (IA),
Superovulação (SOV) e mais recentemente a Produção In Vitro de Embrião (PIVE) são importantes
ferramentas em programas de melhoramento animal. Entre essas biotécnicas, somente a IA é de uso
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rotineiro na espécie bubalina, tendo em vista que a SOV e especialmente a PIVE, ainda não
apresentam resultados consistentes que assegurem sua aplicação a nível comercial.
Inseminação artificial
Esta é uma técnica, que apesar de comprovada eficiência, ainda pouco utilizada na espécie bubalina.
Alguns fatores parecem colaborar para esse quadro como a falta de informações técnicas básicas
(características do cio, detecção dificultada pelo cio discreto; definição do melhor momento para
inseminação; pouca disponibilidade de sêmen de animais de comprovada produção).
As características de cio na búfala são menos evidentes que na vaca bovina e por isso em programas de
IA é imprescindível à utilização de um rufião. O melhor momento para a inseminação da búfala parece
ser após o término do cio, quando a mesma começa rejeitar a monta do rufião, fato que dificulta o
processo de IA, em função da necessidade de manter na propriedade pelo menos dois rufiões, um no
pasto para detecção de cio e outro no curral para detecção do término do cio.
Em um programa de IA, em búfalas no estado do Pará, Vale et al. (1990) inseminaram animais em
diferentes períodos, sendo 42 inseminadas 24 horas após a detecção do cio (animal em cio pela manhã
inseminado na manhã do dia seguinte) obtiveram uma taxa de gestação de 59%, com taxa de concepção
(dose / prenhez) de 3,16 doses. Em 64 animais foi empregado o esquema de inseminação utilizado em
bovino, ou seja, a inseminação dos animais foi realizada 12 horas após a observação do cio, onde
obtiveram uma taxa de gestação de 43,3%, com 5,1 doses / prenhez. Outras 70 búfalas foram
inseminação após detecção do término do cio e obtiveram uma taxa de gestação de 67,1 % com 2,06
doses / prenhez.
Baruselli (1997), desenvolvendo um programa de IA no Vale do Ribeira (SP), observou que 62,23%
das búfalas apresentaram o cio com duração de 12 horas, preconizou então que para esses animais
poderia ser usado o mesmo processo de inseminação empregado em bovinos (método de Trimberger).
Método no qual vacas em cio pela manhã seriam inseminadas à tarde, enquanto vacas em cio no final
da tarde seriam inseminadas na manhã do dia seguinte. O autor observou também que 38,77% das
búfalas apresentaram variações na duração do cio em períodos variados, sendo que para esses animais
poderia ser aplicado o processo de inseminação utilizado quando a búfala não mais aceitar ser montada
pelo rufião. No período de 1993 a 1995, Baruselli (1997) totalizou 853 inseminações em 10
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propriedades obtendo a média de gestação de 52,2% (variação de 40,44 a 60,68%) com média de 1,91
dose / prenhez (variação de 1,64 a 2,47).
Tendo em vista a dificuldade de realização da IA, em função da necessidade de acompanhamento do
cio, Baruselli (2000) adaptou à espécie bubalina o protocolo de inseminação artificial em tempo fixo
(IATF) utilizada em bovinos. Esta é uma ferramenta que pode incentivar o uso da IA em búfalas pela
facilidade de manejo dos animais eliminando, assim, a necessidade de observação de cio e diminuindo,
significativamente, os custos com a mão de obra e manutenção de rufiões.
O protocolo para a IATF baseado no método “ovsynch” foi adaptado para bubalino por Baruselli
(2000) e consiste, basicamente, em aplicar a 1a dose de GnRH, sete dias depois aplicar prostaglandina e
48 h após aplicar a 2a dose de GnRH. A inseminação pode ser realizada 16 horas após a aplicação da 2 a
dose de GnRH. Utilizando este protocolo Baruselli (2000) relatou taxas de gestação variando de 37,9 a
56,7%, salientando que vários fatores podem interferir nos resultados como, por exemplo, o escore
corporal (EC) (EC  3 = 39,7%; EC = 3,5 = 53,9%; EC  4 = 56,7%), estação reprodutiva (na estação =
50,5%; fora da estação = 7,8%), período do pós-parto (< 60 dias = 52,5%; 60-99 dias = 50,8%; > 100
dias = 46,2) e a ordem de parição (1o parto = 37,9%; 2o parto = 47,1%; 3o para o 5o parto = 52,3%; > 5o
parto = 55,7%).

Na Bahia, Ribeiro Filho et al. (2003) relatam à influência do EC sobre a taxa de gestação obtida
pelo do uso da IATF, onde animais com EC  2,5 apresentaram taxa acumulada de 50%,
enquanto que animais com escore > 2,5 apresentaram taxa de gestação acumulada de 90,9%.

Na Amazônia, Ribeiro et al. (2003) verificou que o protocolo “ovsynch” associado a um
progestágeno (CIDR) apresentou melhor resultado do que o protocolo convencional, com taxa
de gestação de 50% e 36,6%, respectivamente.
Atualmente existem vários protocolos para a realização da IATF utilizando implantes vaginais a base
de progestágenos, inclusive para o programa de IATF fora da estação reprodutiva, tendo em vista que
esta espécie apresenta estacionalidade em regiões com as quatro estações do ano definidas. Aqui no
Brasil, esses protocolos foram descritos por Baruselli & Carvalho (2005), permitindo que a parição dos
seja distribuída uniformemente por todos os meses do ano, melhorando com isso a produção leiteira da
espécie.
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Superovulação (SOV)
A técnica de SOV foi introduzida na espécie bubalina por Drost (1983, 1985) e desde então tem sido
aplicada, mesmo que experimentalmente, na maioria dos paises onde há rebanhos de búfalos, entretanto,
até agora os resultados apresentados, quando comparados aos de bovinos, tem sido inconsistentes (Misra,
1993).
Em geral as búfalas respondem bem ao protocolo de superovulação apresentando boa taxa de ovulação
e formação de corpo lúteo, apesar de ocorrer uma grande variação individual na resposta
superovulatória. Entretanto, o principal fator para o insucesso da SOV em bubalino esta relacionado à
baixa taxa de recuperação embrionária (Baruselli, 1997; Baruselli et al., 1999, Carvalho, 2006), fato
também descrito por Kamonpatana (1990) que observou que os resultados da SOV em búfalas,
invariavelmente mostram baixa taxa de recuperação embrionária (média de 1,16 embriões por doadora
e 0,51 de embriões em condições de serem transferidos). Zicarelli et al. (1994) obtiveram taxa de
recuperação embrionária de 1,59 embriões por doadora e apenas 45.1% das búfalas produziram pelo
menos um embrião.
A razão da baixa taxa de recuperação embrionária é desconhecida, bem como, o destino dos embriões.
Segundo alguns autores esses embriões podem ser perdidos na cavidade abdominal (Baruselli, 1997),
na cavidade uterina (Segundo Deshpande et al. (1988) por ficarem retidos nas dobras do endométrio
dificultando o deslocamento pela lavagem uterina), a falta de ovulação e/ou a alta incidência de cisto
folicular em búfalas submetidas à superovulação podem ser a causa dessa baixa taxa de recuperação
embrionária (Zicarelli, 1994).
Segundo Misra (1996), diversos fatores tem contribuído para esta baixa taxa de recuperação
embrionária tais como, falta de seleção baseada na capacidade reprodutiva tanto para as doadoras como
para receptoras, falta de conhecimento sobre a dosagem e metabolismo das gonadotrofinas e falta de
um protocolo definido do processo de SOV e IA. Adicionalmente, outros fatores como a reprodução
estacional e a falta de informação sobre o melhor momento para realização da lavagem uterina,
também, parecem influenciar o resultado da SOV.
De acordo com Boni (1994) outro fator que pode estar relacionado à baixa taxa de recuperação é o
aumento do tamanho ovariano devido ao alto estímulo hormonal provocado pela superovulação, o que
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dificultaria a captação do oócito pela tuba uterina. Para testar esta hipótese, Sousa et al. (2002)
realizaram um experimento de superovulação utilizando baixa concentração hormonal com o objetivo
de evitar o aumento ovariano exagerado e facilitar sua captura pela tuba uterina. Obtiveram, assim, 2,8
corpo lúteo por ovário, bem abaixo da média citada na literatura com cerca de 5-6 corpos lúteos por
ovário (Baruselli, 1999, Misra, et al., 1990). Após lavagem uterina, os autores ainda tiveram baixa taxa
de recuperação que variou de 23,5 a 31,6%, mesmo sem haver um grande aumento do tamanho
ovariano, concluindo que a hipótese da dificuldade na captura do oócito pela tuba uterina não foi o
fator responsável pela baixa taxa de recuperação embrionária.
Outra hipótese lançada por Baruselli et al. (2002) foi a de que haveria uma superestimulação da
contratilidade da tuba uterina o que comprometeria o transporte do oócito/embrião até o utero,
entretanto, após a realização do experimento, não foi observada diferença na taxa de recuperação
embrionária entre animais com baixa ou alta concentração plasmática de estrógeno.
Carvalho (2006) tentando desvendar o problema da baixa taxa de recuperação embrionária em, realizou
diversos experimentos aferindo a atividade de transporte de oócitos pela tuba uterina comparativamente
com vacas bovinas e observou que:
1. A taxa de recuperação de oócitos após a lavagem das tubas uterinas de animais submetidos à
ovulação única ou múltipla foi menor nas búfalas;
2. O estrógeno quando adicionado ao cultivo da tuba uterina não interferiu na direção do movimento
ciliar do epitélio tubárico e no transporte de microesferas (utilizadas para simular a presença de
embriões) em nenhuma porção do oviduto, independente das espécies (vaca ou búfala);
3. Houve uma maior taxa de recuperação de oócitos das tubas uterinas de vacas bovinas que de
búfalas, após cultivo das mesmas por 24 horas, independentemente se foram cultivadas com
estrógeno ou sem estrógeno;
4. Houve, também, uma maior taxa de recuperação embrionária da tuba uterina de vacas bovinas que
búfalas, independentemente dos animais apresentarem ovulação única ou múltipla.
Em resumo foi observado que, independente dos experimentos, a vaca bovina sempre mostrou
melhores taxas de recuperação de ovócito/embrião. Estes resultados indicam que, apesar de ainda não
haver explicação conclusiva, parece haver maior dificuldade da tuba uterina da búfala em transportar
os oócitos/embriões do que a de vacas.
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Produção in vitro de embrião (PIVE)
Apesar da técnica de SOV na espécie bubalina está sendo bastante investigada, através dos esforços de
vários grupos de pesquisas (Misra, 1993; Baruselli, 1998, 1999, 2000; Satrapa, 1998; Gasparinni, 2002;
Ohashi et al., 2002), resultados consistentes que assegurem seu uso comercial no rebanho ainda não
foram alcançados. Por este motivo, as atenções dos pesquisadores estão voltadas para a técnica da
produção in vitro de embrião (PIVE) como uma forma alternativa para a produção de embrião da
referida espécie.
Em bubalino, a técnica de PIVE, que associa a técnica de maturação oocitária (MIV), fecundação in
vitro (FIV) e cultivo embrionário in vitro (CIV) e a técnica de aspiração folicular (OPU-Ovum Pickup), foi tentada pela primeira vez por Boni et al. (1994a) e obteveram resultados animadores, próximos
aos obtidos em bovinos com relação à taxa de recuperação de oócitos, mesmo utilizando animais em
anestro. Entretanto, o autor recomenda estudos adicionais para avaliação destes parâmetros quando a
técnica for aplicada em animais que estejam ciclando regularmente.
Uma das primeiras descrições da técnica de fecundação in vitro em bubalino foi realizada por
Majundar et al. (1988) and Singh et al. (1989) que utilizaram oócitos maturados in vitro, fecundados
com semên congelado e cultivo in vitro dos zigotos até o estágio de mórula. Dois anos mais tarde
Suzuki et al. (1991) relataram a primeira gestação em búfalas com embrião produzido in vitro e
MADAN et al. (1992) o nascimento do primeiro bezerro bubalino produzido in vitro.
A PIVE já está sendo utilizada com sucesso como instrumento para a melhoria da produção no rebanho
bovino. No Brasil, 40% dos embriões transferidos em 2004 foram produzidos in vitro (Camargo et al.,
2006), entretanto, em bubalinos até o momento, a PIVE ainda tem apresentado algumas limitações que
serão discutidas a seguir.
A quantidade e qualidade dos oócitos coletados por ovário são muito inferiores as das vacas bovinas. O
número de oócitos obtidos por ovário de animais abatidos em matadouro descrito na literatura varia de
0,73 (Totey et al., 1992) a 2,2 (Ohashi, et al., 2003). Com relação à qualidade do oócito, Ohashi et al.
(2003) observaram, em material de matadouro, que o número de oócitos com cumulus compacto por
ovário, foi cerca de três vezes maior em bovinos que em bubalinos (2,9 vs. 0,9 oócitos por ovário,
respectivamente). Entretanto, dados de aspiração folicular transvaginal realizada com auxílio de ultraENCONTRO INTERNACIONAL DE ATUALIZAÇÃO EM NUTRIÇÃO, MELHORAMENTO E REPRODUÇÃO EM BUBALINOS. Belém, PA, Brasil, 2007
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som, tem demonstrado que o número de oócitos obtidos é mais expressivo do que os dados relatados
para ovários obtidos de matadouro (3,0 em Boni et al., 1994b; 4,9 em Neglia et al., 2002; 9,3 em Ferraz
et al., 2005; 13,2 em Ohashi et al., 2002), o que pode estar relacionado ao melhor estado nutricional
dos animais. Já que os animais submetidos à aspiração folicular guiada por utra-som, quase sempre, são
animais de elite, que desde o nascimento são submetidos a um melhor manejo nutricional.
Vários trabalhos foram realizados com o objetivo de aumentar a quantidade e, mas especialmente, a
qualidade de oócitos das búfalas. Ohashi et al. (2002) propuseram o controle da onda de crescimento
folicular com dispositivo intra-vaginal e aspiração dos folículos no quarto dia (D4) após a colocação do
dispositivo com o objetivo de melhorar a quantidade e a qualidade dos oócitos. A intenção dos autores
foi de aspirar os folículos em fase inicial de crescimento entretanto foi observada melhora apenas na
quantidade dos oócitos. Sá Filho (2006) tratou búfalas com somatrotopina recombinante bovina (bST)
também com o objetivo de melhorar a quantidade e qualidade dos oócitos. Foi observado baixo número
e qualidade após aspiração folicular e embora alguns animais tenham apresentado aumento no número
de folículos e oócitos, mesmo assim não houve melhoria na qualidade e nem na capacidade de
desenvolvimento embrionário.
A pressão da aspiração também parece ser um dos fatores que podem comprometer a qualidade dos
oócitos de bubalinos, visto que a adesão das células do cumulus oophorus a zona pelúcida parece não
ser tão forte (Boni et al. (1992). Este fato pode levar, dependendo da pressão exercida pelo sistema de
aspiração folicular, a dispersão dessas células, comprometendo assim a qualidade do processo de
maturação oócitária, influenciando negativamente na fecundação e no desenvolvimento embrionário in
vitro, como tem sido demonstrado por Nandi et al. (1998).
Com relação ao aperfeiçoamento dos meios de cultivo Gasparrini et al. (2000, 2002 e 2005) vem
estudado o efeito da adição de compostos derivados de thiol e observou que o acréscimo de cisteamina
ou cistina ao meio de cultivo melhou significativamente as taxas de maturação e de blastocisto em
bubalino.
Apesar dos esforços dos pesquisadores do mundo todo, até o momento, foram obtidos poucos bezerros
bubalinos produzidos inteiramente pelo processo de PIVE. O primeiro registro de nascimento de um
bezerro búfalo foi realizado na Índia por Madan et al. (1991), mas com oócitos obtidos de ovários de
matadouro.
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Somente sete anos depois na Itália, Galli et al. (1998) relataram o nascimento de três bezerros
produzidos pelo método de PIVE, entretanto, o ponto mais delicado do processo, representado pelo
cultivo embrionário, foi realizado no oviduto de uma ovelha. Ainda na Itália, Zicarelli et al. (2003)
relataram o nascimento de dois bezerros produzidos in vitro, cujos embriões haviam sido vitrificados e
transferidos para as receptoras, entretanto, cerca de vinte dias após o nascimento os bezerros morreram.
Mais recentemente na Filipinas, Hufana-Duran et al. (2004) relataram taxa de gestação de 16,36% para
embriões bubalinos vitrificados (9/55) dos quais foram obtidos seis bezerros normais (10,91%). No
Brasil, Baruselli (2004a) obteve gestação de três animais (9,4%) dos 32 embriões bubalinos
transferidos após vitrificação. Sá filho et al. (2005) obtiveram 14% de prenhez (1/7) com embriões
bubalinos produzidos in vitro e transferidos a fresco e 8% de prenhez (2/25) quando foram transferidos
após vitrificação. Em 2005 Baruselli e Carvalho relatam o nascimento de dois bezerros bubalinos
produzidos pelo processo de PIVE.
Apesar do progresso nos processos de aspiração folicular, maturação e fecundação in vitro, os embriões
bubalinos ainda são de baixa qualidade, o que indica a necessidade de aprimoramentos nas diferentes
etapas do processo de PIVE.Umas das medidas seria a
elaboração de meios mais adequados e
específicos para o processo de capacitação espermática, bem como, para o cultivo dos gametas e
embriões. A utilização de animais em boas condições de manejo e alimentação, com o objetivo de
promover obtenção de
melhor qualidade, também auxiliam no aprimoramento da técnica, pois
resultam em um blastocisto de melhor qualidade, melhorando desta forma a taxa de prenhez e o
desenvolvimento normal da gestação. Deste modo a técnica de PIVE poderá se tornar realmente uma
técnica alternativa para a produção de embrião na espécie bubalina.
Transferência nuclear (Clonagem)
A técnica de clonagem em bubalino esta sendo estudada por vários grupos de pesquisa em diferentes
paises. Semelhante as outras biotécnicas de reprodução, a clonagem também é baseada no protocolo
utilizado em bovinos.
A ativação partenogênica que é uma etapa fundamental na clonagem, segundo Miranda et al. (2001)
apresenta baixa taxa de ativação com etanol, com 30 horas de MIV, quando comparado com bovinos.
Gasparrini et al. (2004) verificaram que oócitos bubalinos ativados com etanol apresentaram melhores
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taxas de clivagem, mórula e blastocisto do que oócitos submetidos à fecundação in vitro. De modo
geral temos observado que o oócito de bubalino não ativa bem, por inúmeras razões já descritas no
processo de fecundação in vitro, portanto era de se esperar que o mesmo ocorresse com relação a
ativação partenogenênica.
Por esta razão e pela qualidade oócitária inferioir dos bubalinos, a técnica de xenotransplante vem
sendo utilizada. Nesta técnica, oócitos bovinos estão sendo usados como receptores de núcleos de
células bubalinas (Kitiyanant et al., 2001; Saikhum et al., 2002), com taxa de clivagem e blastocisto
semelhantes a clonagem utilizando o oócito bubalino como citoplasto. Os mesmos autores divulgaram
via imprensa, na Thailândia, a gestação do primeiro clone a nascer usando citoplasto bovino. Lu et al.
(2005) também usaram citoplasto bovino e observaram que os mesmos desenvolveram embriões
melhores que quando o citoplasto era bubalino.
Comentários finais
Várias biotécnicas da reprodução utilizadas em bovino são também aplicadas (transferidas) para
bubalino, sendo que apenas algumas foram apresentadas neste trabalho. Técnicas como, por exemplo, a
sexagem de espermatozóides e embrião, estudos das características epigenéticas de clones e embriões
produzido pela fecundação in vitro estão sendo aplicadas em bubalino, entretanto, até o momento só a
técnica de inseminação artificial tem apresentado resultados consistentes, ou seja, relação custo x
benefício favorável, o que assegura sua aplicação ao nível comercial. As biotécnicas de superovulação
e PIVE apesar de apresentarem resultados promissores, ainda necessitam de aprimoramentos que as
tornem viáveis para uso em rotina comercial.
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