Análise do Padrão de Marcação da NADPH diaforase na

Análise do Padrão de Marcação da NADPH diaforase
na Área Somestésica Primária (SI) de Ratos Adultos
Submetidos à Intoxicação por Metilmercúrio (MeHg)
Marco Aurélio de Moura Freire*, Walace Gomes Leal, Antônio Pereira Jr.** & Cristovam
Wanderley Picanço Diniz. Laboratório de Neuroanatomia Funcional, Departamento de
Morfologia, Centro de Ciências Biológicas – Universidade Federal do Pará.
* Bolsista de Iniciação Científica PIBIC – CNPq.
** Orientador
Resumo
O mercúrio (Hg) é um metal pesado que apresenta efeitos tóxicos largamente
estudados em seres humanos. O mercúrio é muito utilizado na região amazônica em garimpos
para a extração do ouro e a sua presença nos dejetos oriundos desta atividade constitui uma
ameaça à saúde das populações ribeirinhas que se alimentam de peixe. Para analisar o efeito
deste metal na área somestésica primária (SI) de ratos adultos intoxicados experimentalmente
com cloreto de metilmercúrio (MeHg) numa concentração de 4 mg/kg/dia, utilizamos a
histoquímica para a enzima NADPH diaforase, a enzima de síntese do óxido nítrico (gás
envolvido em diversos processos cerebrais como plasticidade e transmissão sináptica). O
córtex somestésico foi escolhido como alvo do estudo por apresentar uma elevada taxa
metabólica, fator determinante para o tropismo do MeHg pelo sistema nervoso central.
Os resultados obtidos indicam que houve uma drástica redução da reatividade da
NADPH diaforase nos barris de SI dos animais intoxicados quando comparados com os
animais controle. Tais resultados sugerem que o metilmercúrio tem uma ação danosa sobre o
córtex somestésico, como já descrito para o cerebelo e para o córtex visual, confirmando sua
ação como um veneno metabólico de ação lesiva em diferentes regiões do sistema nervoso.
Abstract
Mercury (Hg) is a heavy metal that has known toxic effects on the human central
nervous system. However, mercury is still used in the amazon region as part of processes
related to gold extraction. The dejects resulting of these processes are simply discarded on the
rivers of that region. The continued use of mercury in this region is a dramatic public health
concern threatening people living alongside rivers and who depend on them for their
subsistence.
In order to evaluate the toxic effects of this metal in the mammalian nervous system,
we apllied NADPH diaphorase (NADPH-d) histochemistry to tangential sections of the
primary somatosensory area (SI) of adult rats experimentally intoxicated with methylmercury
(MeHg) in a concentration of 4 mg/kg/day. NADPH-d is the molecule responsible for the
synthesis of nitric oxide, a neuronal messenger that performs some key-roles in the nervous
system. The somatosensory cortex was chosen because of its high metabolic rate, which is a
key factor determining the tropism of MeHg for the central nervous system. Our results
indicate that reactivity for NADPH-diaphorase in SI is drastically reduced in intoxicated
animals, suggesting that this system is altered for the harmful action of this metal, such as
described previously to cerebellar and visual cortices.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-1-
Introdução
O mercúrio (Hg) é um metal pesado que apresenta efeitos tóxicos bastante conhecidos
e largamente estudados em seres humanos (Hunter & Russel, 1954). Este composto pode ser
encontrado em várias formas químicas, tais como o vapor de mercúrio metálico, o mercúrio
inorgânico e o mercúrio orgânico (Clarkson, 1997). O metilmercúrio (MeHg), a forma
orgânica do mercúrio, é um veneno sistêmico com ação lesiva preferencial no sistema
nervoso (WHO, 1991). Os efeitos lesivos do MeHg no sistema nervoso começaram a ser mais
profundamente investigados a partir de um grave acidente ocorrido na região de Minamata,
Japão, na década de 50. Neste local, o MeHg era lançado em grandes quantidades como
dejeto industrial na Baia de Minamata e foi introduzido na cadeia alimentar deste
ecossistema. Como conseqüência, as pessoas consumidoras habituais de peixes e mariscos
obtidos no local foram contaminadas pelo metal. O quadro clínico observado nestes
indivíduos foi chamado de ´doença de Minamata´ e se caracteriza por comprometimento do
campo visual periférico, disartria e ataxia cerebelar (WHO, 1991), entre outros problemas.
Em exames histopatológicos, as lesões encontradas no cérebro humano contaminado por
mercúrio localizam-se principalmente na camada de células granulares do cerebelo e no
córtex visual (Chang, 1975). O MeHg afeta também o cérebro em desenvolvimento, porém
com um padrão de lesão mais generalizado (WHO, 1991; Mottet et al., 1997).
Os efeitos do MeHg também foram observados em cérebros de animais submetidos à
intoxicação experimental (Chang, 1975; WHO, 1991; Nagashima, 1997). Em ratos, além da
lesão cerebral, observa-se também degeneração axonal, com comprometimento secundário da
bainha de mielina no ramo sensorial de nervos periféricos (Nagashima, 1997). Para estudos
no córtex visual, com vistas à correlação com seres humanos, entretanto, as espécies mais
indicadas são gatos e macacos (Nagashima, 1997).
O mecanismo de neurotoxicidade do MeHg ainda não é totalmente conhecido. Os
efeitos celulares do MeHg são diversos e a lesão ocorre provavelmente por mais de um
mecanismo (Chang, 1975; Atchison & Hare, 1994; Clarkson, 1997). Classicamente, tem sido
enfatizado que a morte celular decorrente do MeHg ocorre por necrose (Chang, 1975).
Porém, mais recentemente, tem sido proposto que o MeHg poderia induzir a morte celular
também por apoptose (Kunimoto, 1994; Nagashima, 1997).
As áreas sensoriais do necórtex de mamíferos se caracterizam por possuir módulos de
processamento organizados em forma de colunas, que vão da pia à substância branca (ver
Purves et al., 1997 para revisão). Dentre estas estruturas, uma das mais estudadas é o campo
de barris de roedores (Woolsey & van der Loos, 1970; van der Loos & Woolsey, 1973;
Welker & Woolsey, 1974). Os barris são estruturas citoarquitetônicas discretas observadas na
camada IV do córtex somestésico de algumas espécies de mamíferos (Woolsey et al., 1975) e
foram revelados inicialmente pela técnica clássica de coloração de Nissl (Woolsey & van der
Loos, 1970; Welker, 1971), que cora corpos celulares de neurônios e glia. Posteriormente, os
barris foram revelados através da reação histoquímica para várias enzimas metabólicas, como
a citocromo oxidase (Wong-Riley e Welt, 1980), a succinato desidrogenase (Wallace, 1987) e
a NADPH diaforase (Franca & Volchan, 1995; Pereira Jr. et al., 2000), que comprova o alto
grau de metabolismo desta região. A taxa metabólica parece ser um dos fatores cruciais para
explicar o tropismo do mercúrio pelo sistema nervoso central.
O presente trabalho visa investigar os efeitos da intoxicação experimental por MeHg
sobre a estrutura tridimensional dos barris da área somestésica primária de ratos revelados
pela NADPH diaforase procurando evidenciar possíveis alterações que possam ser
relacionadas ao metabolismo energético desta região e à expressão do óxido nítrico,
neurotransmissor gasoso envolvido em vários processos no sistema nervoso central, como a
plasticidade, neuroproteção e toxicidade isquêmica.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-2-
Materiais e Métodos
Seis ratos Wistar machos e adultos foram utilizados para a realização deste trabalho.
Os animais foram divididos em dois grupos (I – controle; II – tratados). Os animais do grupo
II foram intoxicados com cloreto de metilmercúrio (Ultrascientific) segundo o protocolo
adaptado de Nagashima et al. (1996). Um total de 160 mg de metimercúrio foi dissolvido em
400 ml de etanol a 5% (4 mg/10 ml). Os ratos foram contaminados por via intraperitoneal
com uma dose diária de 4 mg/kg durante 7 dias. Animais do grupo I receberam apenas etanol
a 5% através do mesmo esquema de tratamento.
Após um período de sobrevida de 7 dias, ambos os grupos foram perfundidos, sob
anestesia profunda induzida por inalação de éter ou clorofórmio, através do ventrículo
esquerdo com volumes sucessivos de solução salina 0,9% e paraformaldeído a 4% ou
formalina a 10%. Em seguida, o cérebro foi retirado da caixa craniana e posicionado entre
duas lâminas de vidro e imerso em tampão fosfato 0,1 M por cerca de 24 horas para ser
aplanado. No dia seguinte, secções tangenciais de 100 µm de espessura foram obtidas em um
vibrátomo (Pelco), sendo recolhidas em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2 – 7,4). As secções de
tecido dos animais tratados e controle foram incubadas na mesma solução e submetidas aos
mesmos procedimentos histoquímicos. A histoquímica para a revelação da atividade da
enzima NADPH diaforase foi realizada pelo método indireto (ou da enzima málica) adaptado
de Scherer-Singler et al. (1983), a partir do protocolo descrito a seguir: Adicionou-se 15 mg
de azul de nitrotetrazólio (do inglês nitroblue tetrazolium - NBT) (Sigma) a 0,5 ml de
dimetil sulfóxido (DMSO) (Inlab) (solução I). Posteriormente, acrescentou-se 300 mg de
ácido málico (Sigma) em um becker contendo 50 ml de solução de TRIS 0,05 M (Nuclear)
(solução II), ajustando-se então o pH para 8,0 utilizando-se HCl. A correção do pH da
solução II é crítica para se obter uma boa reação. Em seguida, acrescentou-se à solução II 50
mg de β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (β-NADP) (Sigma) e 20 mg de cloreto
de manganês (Sigma). As soluções I e II foram então misturadas, acrescentando-se em
seguida 3 ml de TRITON X-100 (Sigma). Foi obtida uma solução de cor amarela
fotossensível, sendo protegida da luz com papel laminado.
Os cortes foram incubados nesta solução e mantidos, sob agitação constante, numa
temperatura em torno de 40o C e protegidos da luz. A reação foi monitorada em intervalos de
30 minutos, utilizando-se um microscópio óptico, para evitar que os cortes ficassem
demasiadamente escuros em decorrência da redução excessiva do azul de nitrotetrazólio em
formazan, sendo interrompida em 3 ou 4 horas, quando os campos de barris e as células
NADPH d+ estavam bem evidentes. Algumas secções foram coradas pelo método de
coloração de Nissl, para evidenciar o padrão normal dos campos de barris.
A seguir, os cortes foram lavados em tampão fosfato 0,1 M e montados em lâminas
gelatinizadas, desidratados em cubetas de vidro contendo álcool com diferentes gradientes de
concentração (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) e clareados em xileno sendo, então cobertos
com lamínula com o auxílio de um meio de inclusão (Entellan, Merck).
Resultados
A reação enzimática para a NADPH diaforase permitiu revelar a topografia dos barris
na área somestésica primária de animais do grupo I (Figura 1a), como já previamente descrito
na literatura para o rato (Franca & Volchan, 1995) e para o camundongo (Pereira Jr. et al.,
2000). Os maiores barris ocupam a região denominada de subcampo póstero-medial de barris
e correspondem às grandes vibrissas mistaciais da face do animal (Woolsey & van der Loos,
1970; Nussbaumer & van der Loos, 1985). Outras partes do corpo são também identificadas
por suas representações no campo de barris, como pata anterior e posterior, tronco e região
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-3-
anterior do focinho. A coloração de Nissl, realizada em secções alternadas, revela um padrão
de organização semelhante (Figura 1b).
A reação de NADPH diaforase revelou também o padrão de distribuição dos
neurônios diaforase positivos (NADPH d+) (Figura 1a) ao longo da área SI. Nos campos de
barris, estes neurônios localizam-se predominantemente nas regiões do septo, que separa os
barris individuais, embora perceba-se a presença de alguns poucos neurônios no interior dos
barris (Figura 1a). Também existe um gradiente de densidade de corpos celulares nos eixos
anterior-posterior (maior concentração de células na porção anterior) e medial-lateral (maior
concentração na região medial, como descrito por Franca et al., 2000).
A reação de NADPH diaforase nos animais intoxicados revela, em uma análise
qualitativa, que a intensidade de marcação da neurópila foi drasticamente reduzida,
principalmente no centro dos barris (Figura 2), quando comparada aos animais controle
(grupo I). Devido a esta reação mais difusa, os barris apresentam um aspecto “pálido”,
provavelmente devido à menor quantidade da enzima.
A diminuição da reatividade de neurópila também foi notada na região localizada na
borda rostral de SI, conhecida como “cortex disgranular” (Figura 3a), onde se pode perceber
um aspecto mais difuso de reação enzimática quando comparado à mesma região dos animais
do grupo I (Figura 3b).
Não foi possível determinar se ocorreram alterações na distribuição dos neurônios
NADPH d+ em qualquer uma das áreas analisadas tampouco mudanças sutis na morfologia
celular.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-4-
A
B
Figura 1. Padrão de organização dos campos de barris de um rato do grupo II revelado pela
NADPH-d. Notar a presença de células no interior dos barris (seta branca) e nos septos (seta
preta) (A). Coloração de Nissl evidenciando o aspecto “cheio” dos barris do PMBSF (seta)
(B). PMBSF: subcampo póstero-medial de barris; Barra de calibração: 250 µm.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-5-
Figura 2. Fotomicrografia de um barril do PMBSF de um rato do grupo I demonstrando a
presença de neurônios NADPH d+ no interior do barril (*) e no septo (**). Observar a região
mais pálida no centro do barril (neurópila mais fracamente reagida) indicada pela seta. I:
barril; II: septo. Barra de calibração: 100 µm.
A
B
Figura 3. Fotomicrografia de um neurônio NADPH d+ de um animal do grupo I (A). Notar a
neurópila mais fracamente reagida. Neurônio NADPH d+ positivo de um animal do grupo II
(B). Notar a neurópila mais fortemente reagida, quando comparada com A. Barra de
calibração: 100 µm.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-6-
Discussão
Os resultados obtidos no presente trabalho relacionam-se a questões referentes aos
efeitos da intoxicação aguda por metilmercúrio no sistema nervoso central, indicando que
este modelo de intoxicação pode causar alterações similares àquelas relatadas na literatura
causadas pela intoxicação crônica, quando os sintomas característicos da intoxicação por
mercúrio manifestam-se após um período relativamente longo tanto em animais (Hansen et
al., 1989) quanto em humanos, como aconteceu em Minamata, no Japão (Irukayama et al.,
1962), no Iraque (WHO, 1991), ou nos EUA com uma família que se contaminou ao
consumir porcos intoxicados com mercúrio (Davis et al., 1993).
Em relação às células NADPH diaforase positivas, sabe-se, desde os estudos pioneiros
de Thomas e Pearse no começo da década de 60 (Thomas & Pearse, 1961; 1964), que estas
células apresentam resistência a venenos metabólicos. Uma das hipóteses para esta proteção
seria o fato de estas células serem responsáveis pela síntese do óxido nítrico (Valtschanoff et
al., 1993), uma molécula gasosa altamente difusível e que atua como um neurotransmissor
não convencional (Snyder, 1992). O óxido nítrico, em baixas concentrações, possui um papel
neuroprotetor no sistema nervoso central. Este fato poderia explicar a manutenção do padrão
morfológico normal das células NADPH d+ nos animais intoxicados de forma aguda por
mercúrio.
Por outro lado, Oliveira e colaboradores, em 1998, ao realizarem uma análise
estatística dos ramos dendríticos mais distais de células NADPH d+ da substância branca de
gatos intoxicados por metilmercúrio, observaram que estas células apresentavam uma
diminuição em sua árvore dendrítica, porém não sofreram alterações na área de corpo celular
(Oliveira et al., 1998). Ainda neste trabalho, estes pesquisadores relatam a aparente
resistência das células NADPH d+ da substância cinzenta, porém uma elevada alteração na
reatividade de neurópila nesta área, resultado semelhante ao encontrado no córtex
somestésico dos ratos analisados neste estudo.
A drástica diminuição de reatividade de neurópila observada nos animais intoxicados
sugere que o metilmercúrio pode ocasionar alterações na enzima de síntese do óxido nítrico
(NOS), indicando que este metal poderia comprometer a expressão do óxido nítrico
(provavelmente alterando seu transporte pelo comprometimento de terminais axonais), gás
que está envolvido com diversas funções importantes no sistema nervoso como plasticidade,
neuroproteção e neurotransmissão sináptica.
Conclusão
A partir desta abordagem experimental, é possível concluir que o sistema somestésico
de ratos apresenta alterações após intoxicação com metilmercúrio. A alteração do padrão de
marcação da enzima NADPH diaforase é um indicador que o metilmercúrio altera a
expressão da enzima de síntese do óxido nítrico, um gás envolvido em vários processos
cerebrais como plasticidade sináptica, neurotransmissão e neuroproteção. Todavia, o padrão
de lesão observado no córtex somestésico é diferente daquele observado no cerebelo destes
animais (Nagashima, 1997). A comparação morfológica entre os barris e as células NADPH
d+ dos animais intoxicados com MeHg e animais normais, utilizando procedimentos
morfométricos semelhantes aos utilizados por Oliveira e colaboradores (1998) fornecerá,
futuramente, informações mais concretas a respeito da fisiopatologia da intoxicação
mercurial no sistema somestésico de roedores.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-7-
Referências Bibliográficas
ATCHISON, W.D. and HARE, M.F. Mechanisms of methylmercury-induced neurotoxicity.
FASEB Journal, 8: 622-629, 1994.
CHANG, L.W. Neurotoxic effects of mercury – a review. Environmental Research, 14:
329-373, 1975.
CLARKSON, T.W. The toxicology of mercury. Critical Reviews in Clinical Laboratory
Sciences, 34: 369-403, 1997.
DAVIS, L.E., KORNFELD, M., MOONEY, H.S., FIEDLER, K.J., HAALAND, K.Y.,
ORRISON, W.W., CERNICHIARI, E. and CLARKSON, T.W. Methylmercury
poisoning: Long term clinical, radiological, toxicological and pathological studies of an
affected family. Annals of Neurology, 35: 680-688, 1993.
FRANCA, J.G. and VOLCHAN, E. NADPH diaphorase histochemistry as a marker for
barrels in rat somatosensory cortex. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, 28: 787-790, 1995.
FRANCA, J.G., VOLCHAN, E., JAIN, N., CATANIA, K.C., OLIVEIRA, R.L.S., HESS,
F.F., JABLONKA, M., ROCHA-MIRANDA, C.E. and KAAS, J.H. Distribution of
NADPH diaphorase cells in visual and somatosensory cortex in four mammalian species.
Brain Research, 864: 163-175, 2000.
HANSEN, J.C., RESKE-NIELSEN, E., THORLACIUS-USSING, O., RUNGBY, J. and
DANSCHER, G. Distribution of dietary merscury in a dog. Quantitations and
localization of total mercury in organs and cerebral nervous system. The Science of the
Total Environment, 78: 23-43, 1989.
HUNTER, D. and RUSSEL, D. Focal cerebral and cerebelar atrophy in a human subject due
to organic mercury compounds. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 17: 235-241, 1954.
IRUKAYAMA, K., KAI, F., FUJIKI, M. and KONDO, T. Studies on the origin of the
causative agent of Minamata disease. III. Industrial waste containing mercury
compounds from Minamata factory. Kumamoto Med J 15: 57-68, 1962.
KUNIMOTO, M. Methylmercury induces apoptosis of rat cerebellar neurons in primary
culture. Biochem Biophys Res Comm 204: 310-317, 1994.
MOTTET, N.K., VAHTER, M.E., CHARLESTON, J.S. and FRIBERG, L.T. Metabolism of
methylmercury in the brain and its toxicological significance. Metal Ions in
Biological Systems, 34: 371-403, 1997.
NAGASHIMA, K. A review of experimental methylmercury toxicity in rats: neuropathology
and evidence for apoptosis. Toxicol Pathol, 25: 624-631, 1997.
NAGASHIMA, K., FUJII, Y., TSUKAMOTO, T., NUKUSUMA, S., SATOH , M., FUJITA,
M., FUJIOKA, Y. and AGAKI, H. Apoptotic process of cerebellar degeneration in
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-8-
experimental methylmercury intoxication of rats. Acta Neurophatologica, 91: 72-77,
1996.
NUSSBAUMER, J.C. and VAN DER LOOS, H. An electrophysiological and anatomical
study of projection to the mouse cortical barrel field and its surroundings. Journal of
Neurophysiology, 53: 686-698, 1985.
OLIVEIRA, R.B., GOMES-LEAL, W. DO NASCIMENTO, J.L.M. and PICANÇO-DINIZ,
C.W. Methylmercury intoxication and histochemical demonstration of NADPH
diaphorase activity in the striate cortex of adult cats. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, 31: 1157-1161, 1998.
PEREIRA JR, A., FREIRE, M.A.M., PACHECO-BAHIA, C., FRANCA, J.G. and
PICANÇO-DINIZ, C.W. The barrel field of the adult mouse SmI cortex as revealed by
NADPH diaphorase histochemistry. Neuroreport, 11: 1889-1892, 2000.
PURVES, D., AUGUSTINE, G.J., FITZPATRICK, D., KATZ, L.C., LAMANTIA, A.S.,
MACNAMARA, J.O. Neuroscience. Purves, D. et al. (eds.). Sinauer Associates, Inc.
1997.
SCHERER-SINGLER, V., VINCENT, S.R., KIMURA, H. and MCGEER, F.G.
Demonstration of a unique population of neurons with NADPH diaphorase
histochemistry. Journal of Neuroscience Methods, 9:229-234, 1983.
SNYDER, S.H. Nitric oxide: first in a new class of neurotransmitters? Science, 257, 494-496,
1992.
THOMAS, E. and PEARSE, A. G. E. The fine localization of dehydrogenases in the
nervous system. Histochemic, 2: 266-282, 1961.
THOMAS, E. and PEARSE, A. G. E. The solitary active cells. Histochemical demonstration
of damage resistant nerve cells with a TPN diaphorase reaction. Acta
Neuropathologica, 3: 238-249, 1964.
VALTSCHANOFF, J.G., WEINBERG, R.J., KHARAZIA, V.N., SCHMIDT, H.H.H.W.,
NAKANE, M. and RUSTIONI, A. Neurons in rat cerebral cortex that synthesize nitric
oxide: NADPH diaphorase histochemistry, NOS immunocytochemistry and
colocalization with GABA. Neuroscience Letters, 157: 157-161, 1993.
VAN DER LOOS, H. and WOOLSEY, T.A. Somatosensory cortex: structural alterations
following early injury to sensory organs. Science, 179: 395-398, 1973.
WALLACE, M.N. Histochemical demonstration of sensory maps in the rat and mouse
cerebral cortex. Brain Research, 418: 178-182, 1987.
WELKER, C. Microelectrode delineation of fine grain somatotopic organization of SI
cerebral cortex in albino rat. Brain Research, 26: 259-275, 1971
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
-9-
WELKER, C. and WOOLSEY, T.A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of
the rat: description and comparison with the mouse. The Journal of Comparative
Neurology, 158: 437-454, 1974.
WHO, IPCS, Environmental Health Criteria 118, World Health Organization, Geneva. 1991.
WONG-RILEY, M.T.T. and WELT, C. Histochemical changes in cytochrome oxidase of
cortical barrel of the vibrissal removal in neonatal and adult mice. Proceedings of
National Academy of Sciences of the USA, 77: 2333-2337, 1980.
WOOLSEY, T.A., WELKER, C. and SCHWARTZ, R.H. Comparative anatomical studies of
the SmI face cortex with special reference to the occurrence of barrels in layer IV. The
Journal of Comparative Neurology, 164: 79-94, 1975.
WOOLSEY, T.A and VAN DER LOOS, H. The structural organization of layer IV in the
somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field
composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Research, 17: 205-242, 1970.
Revista Virtual de Iniciação Acadêmica da UFPA http://www.ufpa.br/revistaic Vol 1, No 2, Outubro 2001
- 10 -