5 Materiais e Métodos - Maxwell - PUC-Rio

5
Materiais e Métodos
5.1.
Eletroforese capilar
As separações foram realizadas em um sistema para eletroforese capilar
modelo HP-CE 3D (Agilent Technologies) equipado com detector UV-Vis e
passível de adaptação para acoplamento com outros sistemas de detecção através
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do uso de uma interface (Figura 9).
Figura 9: Equipamento para eletroforese capilar utilizado neste trabalho.
63
Este
equipamento
possui
um
carrossel
com
48
posições
para
posicionamento de frascos de vidro ou de polipropileno (Agilent Tecnologies),
para colocação de padrões e amostras. O capilar é mantido numa determinada
temperatura controlada, através de um sistema de resfriamento a ar, sendo
possível obter um resfriamento a água, que se apresenta mais eficaz, pelo uso de
uma adaptação externa. As amostras são introduzidas no capilar pelo uso de
injeção hidrodinâmica (pressão ou vácuo) ou eletrocinética (corrente) e todas as
seqüências, desde a injeção até a aplicação do campo elétrico, são automatizadas.
O Chemstation® (software da Agilent Technologies) é o programa de integração
dos picos se a detecção for por UV, mas para o acoplamento com o ICPMS, o
software Origin 7.0 (Microcal Software INC., EUA) foi utilizado para a
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integração.
5.1.1.
Condicionamento dos capilares
Os capilares utilizados para a separação eletroforética tinham 50 ou 75 µm
de diâmetro interno, sendo fabricados pela Agilent Technologies e Microsolv
Tecnology Corporation, USA.
O condicionamento do capilar é uma etapa importante para garantir boas
condições de operação, pois como os capilares são feitos de sílica fundida,
existem nas paredes grupos silanóis que são ionizados, dependendo da solução
utilizada no condicionamento. Neste trabalho, como o pH utilizado nas separações
eletroforéticas foi maior que sete, pois as espécies a serem determinadas são
aniônicas, o condicionamento foi feito com uma solução de hidróxido de sódio,
seguido de água e tampão de separação. Todas as soluções utilizadas nesta etapa
de condicionamento foram específicas para eletroforese e fabricadas pela Agilent
Technologies.
Quando o capilar é utilizado pela primeira vez, o condicionamento é feito
da seguinte forma:
- Rinsar o capilar com uma solução 1,0 mol L-1 de NaOH por 10 minutos
- Rinsar o capilar com água Milli-Q por 10 minutos
- Rinsar o capilar com o tampão de separação por 20 minutos
64
A etapa de condicionamento também é realizada entre as corridas
eletroforéticas, com o objetivo de regenerar a parede do capilar, removendo
qualquer substância que tenha sido adsorvida. No entanto, esta etapa gasta menos
tempo que a anterior sendo feita da seguinte maneira:
- Rinsar o capilar com uma solução 0,1 mol L-1 de NaOH por 1 minuto
- Rinsar o capilar com água Milli-Q por 1 minuto
- Rinsar o capilar com o tampão de separação por 2 minutos.
A Figura 10 apresenta os dois tipos de cassetes para uso em eletroforese
capilar, dependendo do tipo de detecção.
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(a)
(b)
Figura 10: Cassetes e capilares para acoplamento com ICPMS (a) e para detecção UV
(b).
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5.2.
Espectrômetro de massas com plasma indutivamente acoplado
(ICPMS)
O equipamento utilizado para a detecção das espécies foi um ICPMS de
baixa resolução (quadrupolo), modelo Elan-6000 (PerkinElmer-Sciex), mostrado
na Figura 11. Para determinação de As-total pela técnica de geração de hidretos
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(HG) foi usado um modelo Elan 5000, do mesmo fabricante.
Figura 11: ICPMS Elan 6000 no Laboratório de Espectrometria de Massas da PUC-Rio.
As condições operacionais e instrumentais utilizadas em ICPMS são
apresentadas na Tabela 3.
66
Tabela 3 – Parâmetros operacionais/instrumentais utilizados em medidas de ICPMS.
Espectrômetros de Massas
ELAN 5000 e ELAN 6000
Resolução de massa
normal (0,8 u)
75
As, 103Rh, 85Rb, 133Cs,
Principais massas medidas
Amostrador e ”skimmer”
127
I, 121 Sb, 35 Cl
ambos de platina
Vazão do argônio do plasma
15,0 L min-1
Vazão de argônio auxiliar
1,0 L min-1
Vazão de argônio do nebulizador
otimizada diariamente
0,85 - 0,95 L min-1
Sensibilidade para Rh (cps)
50.000 - 60.000 cps para o ELAN 5000
200.000 -3 00.000 cps para o ELAN 6000
% de Óxidos (CeO+)
< 3%
2+
% íons bivalentes (Ba )
< 1%
Fundo (background) em m/z =220
25 cps
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Modos de varredura
Peak-hop
peak-hop
scanning
Tempo de permanência no pico (dwell
time)
60
130 ms
Varreduras por leitura
1
2000
Número de replicatas
3
1
No acoplamento com a eletroforese capilar foi utilizado um regulador de
fluxo externo (MKS Instruments Inc., EUA) para o controle da vazão do gás de
nebulização, mantendo a pressão do sistema em 7,5 bar, ideal para uso com micro
nebulizadores. Para isto, foi necessária a utilização de uma linha adicional de
argônio, uma vez que a pressão de entrada no Elan 6000 para este gás é de apenas
5 bar, insuficiente para a maioria dos micro nebulizadores testados.
Um fator importante no acoplamento CE-ICPMS é a composição do
líquido de complementação (make up). Este líquido tem duas funções: (1) fechar o
circuito elétrico, permitindo assim a separação eletroforética e (2) providenciar
um volume suficiente do líquido para possibilitar a nebulização com os
nebulizadores
atualmente
disponíveis
no
mercado,
já
que
a
vazão
eletroforética/osmótica é de apenas alguns nanolitros por minuto. No entanto, o
volume aspirado deste líquido deve ser o menor possível para que não haja grande
diluição da amostra originada do capilar, mas o suficiente para permitir o
transporte do analito até o plasma. Ao longo do trabalho foram usadas diferentes
soluções, de acordo com o tipo de nebulizador ou recomendação do fabricante. O
67
ideal é que seja utilizado um eletrólito para garantir uma boa estabilidade da
corrente elétrica, gerada após a aplicação da voltagem, podendo-se usar,
eventualmente, o próprio tampão de separação. Outro fator de consideração é que
este eletrólito não deve causar interferências espectrais e não espectrais em
ICPMS, além de ser pouco corrosivo para o sistema de introdução de amostra
(nebulizador) e da interface (amostrador e skimmer). Na continuação deste texto,
o líquido de complementação será denominado apenas de make up, como é de
praxe na apresentação dos artigos.
Diariamente, após o espectrômetro de massa ser deixado ligado por um
período de cerca de 1 hora para estabilização do sistema, procedia-se à realização
de testes de repetitividade e sensibilidade do sinal analítico pela aspiração de uma
solução de ródio (Rh) de 10 µg L-1, utilizando-se o sistema padrão de introdução
de amostra (nebulizador Meinhard com câmara de nebulização ciclônica).
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Tipicamente, sensibilidades entre 100.000 e 300.000 cps eram obtidas para esta
solução de Rh. Sendo necessário, a posição da tocha em relação à interface do MS
era realinhada. Em seguida, procedia-se à leitura do sinal de Cs (m/z = 133)
presente no make up, o qual foi monitorado até apresentar um valor estável em
diferentes vazões do gás de nebulização.
Dependendo do tipo de nebulizador utilizado (auto-aspirante ou não), foi
necessário o uso de bombas para a aspiração da solução make up. Ao longo do
trabalho foram comparadas três diferentes tipos: duas bombas peristálticas modelo
Ismatec (Ismatec, Gmbh, EUA) e Minipuls 3 (Gilson, FR) e outra de pistão,
modelo ABI 1400 (PerkinElmer). Este estudo comparativo foi realizado, fazendose a aspiração da solução contendo 1 µg.L-1 de Cs em diferentes vazões e
escolhendo-se aquela que apresentasse a melhor estabilidade na nebulização para
vazões (da ordem de microlitro), faixa ideal para não provocar grandes diluições
da amostra.
68
5.3.
Interfaces utilizadas entre CE e ICPMS
A primeira fase do trabalho experimental objetivou a comparação de
diferentes interfaces, para que fosse possível obter a melhor configuração
nebulizador/câmara de nebulização e, assim, chegar à condição ideal de
interfaceamento. Foram testados cinco diferentes conjuntos (Tabela 4).
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Tabela 4: Diferentes sistemas de introdução de amostras testados neste trabalho.
Nebulizador
Câmara de
Nebulização
Fabricante
MCN
Cilindrica, sem dreno
CETAC, mod. CEI100 (EUA)
Neb. concêntrico,
operado com vazão
de < 10 µL min-1
MCN-100
Câmara ciclônica
CETAC (EUA)
idem,100 µL min-1
MicroMist
Câmara ciclônica
Glass Expansion
(AU)
idem, 200 µL min-1
MicroMist
Câmara ciclônica
Glass Expansion
(AU)
idem, 400 µL min-1
MiraMist CE
Câmara ciclônica (mod.
Cinnabar de 20 mL)
Neb.: Burgener
Research (Au),
Neb. de fluxo
paralelo, 3 - 10 µL
min-1
Câmara: Glass
Expansion
Observações*
* vazões recomendadas pelo fabricante
Cada um destes conjuntos foi montado em uma base de plástico, contendo
uma peça em formato de “X” ou “T”, por onde passa a solução make up e possui
um eletrodo de platina para fazer o contato elétrico. A câmara de nebulização foi
ligada ao tubo injetor da tocha do espectrômetro de massas através de uma
mangueira de polietileno. Como o desempenho destas interfaces é diretamente
relacionado com as suas condições de operação, maiores detalhes serão
apresentados no próximo capítulo.
69
5.4.
Preparo de reagentes e padrões
Todas as soluções utilizadas neste trabalho foram preparadas a partir de
sais de alta pureza. Soluções estoque contendo 1000 µg L-1 de As(III), As(V),
MMA(V), DMA(V) e arsenobetaína foram preparadas com água Milli-Q
(resistividade > 16 MΩ cm). As2O3 e arsenato de sódio foram utilizados para o
preparo das soluçãoes de As(III) e As(V), respectivamente. Os ácidos monometil
arsônico (MMA) e dimetilarsínico (DMA) e a arsenobetaína foram adquiridos da
Tri Chemical Laboratory Inc. (Japão). As soluções padrão de Cs, In, Rb e Li
foram da marca Titrisol® (Merck), utilizados rotineiramente em nosso
laboratório. Soluções estoque de 1.000 mg L-1 de Sb(III) e Sb(V) foram
preparadas a partir de tartarato de antimônio-III (C4H4KO7Sb.0,5H2O) e de
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antimoniato de potássio (KSb(OH)6), respectivamente, ambos da firma Merck.
Uma solução de 1.000 µg L-1 de trimetil antimônio (TMSb) foi preparado a partir
do sal (CH3)2SbBr2. Os padrões de As(III), As(V) e TmSb foram cedidos pelo Dr.
Joerg Feldman da Universidade de Aberdeen (Reino Unido). Diariamente, foram
preparadas soluções de trabalho a partir de diluições das soluções estoque, na
concentração desejada, com água Milli-Q. Todas as soluções foram filtradas com
filtro de seringa de 0,45 µm (Sartorius) e guardadas na geladeira. No dia da
análise, as soluções foram degaseificadas em banho de ultra-som por, no mínimo,
15 minutos.
Soluções tampão de borato e fosfato foram utilizadas durante o
desenvolvimento do trabalho, fazendo-se o ajuste do pH no valor desejado com
solução de NaOH 0,1 ou 1,0 mol L-1 (todas as soluções da Agilent Technologies).
A solução utilizada como make up foi preparada a partir de uma mistura do
tampão de separação com Cs+ na concentração de 1 µg L-1 e 10 % (v/v) de
metanol (Merck), ajustando-se o pH no mesmo valor usado na separação
eletroforética. NH4NO3 (Merck) na concentração de 20 mmol L-1 também foi
utilizado como make up, por recomendação do fabricante de um dos
nebulizadores.
A droga Arsenil® (Shering-Plough) utilizada neste trabalho tem como
composição 100 mg mL-1 de monometilarsenato de sódio (MMA) em água. As
70
diluições necessárias foram feitas com água Milli-Q e as soluções guardadas na
geladeira.
A validação das metodologias analíticas envolvendo arsênio e de alguns
outros elementos foi feita utilizando um material de referência: SERONORM
(urina liofilizada), distribuído pela BIORAD (EUA) e um material de referência
certificado: CASS-3 (água do mar), fornecido pela National Research Council
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Canadá (NRCC).
71
5.5.
Coleta e preparo das amostras
5.5.1.
Urina, sangue, plasma e pêlo
Todos os procedimentos relativos às amostras clínicas foram realizados
nos laboratórios do Jóquei Clube do Brasil, sendo levadas posteriormente para o
laboratório de ICPMS da PUC-Rio em caixas de isopor para as determinações de
arsênio. Amostras de sangue, plasma e urina foram analisadas pela técnica de
geração de hidreto (HG) acoplada a ICPMS (vide capítulo 5.6) para excluir
interferências espectrais causadas pelas elevadas concentrações de cloreto nestas
matrizes. Amostras de pêlo da crina de cavalo foram analisadas seguindo-se uma
metodologia descrita anteriormente (Miekeley et al., 1998; Miekeley et al., 2001;
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Carneiro et al., 2002) que dispensa do uso da HG-ICPMS, uma vez que neste
material as concentrações de cloreto são negligenciáveis. A análise de especiação
de arsênio por eletroforese capilar acoplada ao ICPMS foi realizada apenas na
urina, com o objetivo de seguir o protocolo antidoping que determina o estudo da
presença de arsênio na urina do animal.
As amostras de urina, sangue e pêlo foram cedidos pelo Jóquei Clube do
Brasil (Rio de Janeiro) de cavalos da “escola de equitação”. Inicialmente, para a
determinação dos valores basais de arsênio nestas amostras, o projeto previa a
coleta em 10 cavalos antes da aplicação do medicamento. No entanto, todos os
procedimentos relativos à urina só puderam ser feitos em um cavalo, devido à
grande dificuldade de se conseguir a coleta da urina dos outros cavalos.
Os cavalos Cath Talescoean (Cta), Chaca (Ch) e Black Bits (Bl) que
participaram do estudo da cinética de excreção do arsênio receberam uma dose de
0,27 g/dia de arsênio, na forma de MMA(V) (medicamento Arsenil®) durante 5
dias seguidos. Durante 14 dias, a urina do cavalo Cath Talescoean (Cta) foi
coletada e acondicionada em tubo de polipropileno de 50 mL (Sarstedt,
Alemanha) e guardados em geladeira. Antes da análise, as amostras foram
diluídas, com uma proporção mínima de 1:10 com água Milli-Q, filtradas e
degaseificadas. Com o objetivo de verificar se o aparecimento de outras espécies
na urina é resultado de processos metabólicos ou apenas devido à passagem do
tempo, foi realizado um teste de estabilidade da espécie MMA(V) em urina
72
humana e do animal. Para isto, a urina (sem a presença do medicamento) foi
fortificada com 500 µg L-1 do Arsenil® e mantida sob refrigeração, fazendo-se a
análise por CE-ICPMS por vários dias.
Neste mesmo período, foram retirados 50 mL de sangue dos três cavalos e
colocados em frascos de polipropileno contendo 1 mL de epinefrina para evitar a
coagulação do sangue. Para a análise do sangue total foram separados
aproximadamente 10 mL de cada amostra de sangue, sendo o restante
centrifugado a 4.000 rpm para coleta de 15 mL de plasma. Todas as alíquotas
foram acondicionadas em frascos de polipropileno com capacidade de 15 mL e
guardadas na geladeira. A Tabela 5 apresenta o nome dos cavalos que
participaram do estudo e o código de identificação dos mesmos.
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Tabela 5: Nome e código dos cavalos que participaram do estudo.
Nome do Cavalo
Código de Identificação
Cath Talescoean
CTa
Shadow Badger
Sh
Doc Pastorean
Do
Black Bits
Bl
Detetive
De
Hillie
Hi
Campanário
Ca
Umbral Real
Um
Chaca
Ch
Cath Trilho
Ctr
73
5.5.2.
Suco de uva
Foram analisadas diferentes marcas de “suco de uva integral”, comprados
em supermercados locais. A análise de especiação de arsênio no suco de uva por
CE-ICPMS foi realizada com a marca que apresentou o maior teor de arsênio
total. Nos outros, As-total e As(III) foram determinados por HG-ICPMS (vide
capítulo 5.6). As amostras foram filtradas em filtro de membrana (0,45 µm) no dia
da análise. A Tabela 6 apresenta a marca e procedência dos sucos de uva
analisados.
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Tabela 6: Sucos de uva analisados para determinação de arsênio.
Identificação
Aurora
Bela Ischia
Big_Fruit
Casa de Bento
Casa da Madeira
Curumatan
Dom_Cândido
Imbiara
Jandaia
Maguary
Maravilha
Pérgola
Pindorama
Rossoni
Salton
Santal
Serigy
Sinuelo
Superbom_
Uva Só
Procedência
Rio Grande do Sul
Minas Gerais
Sergipe
Rio Grande do Sul
Rio Grande do Sul
Rio de Janeiro
Rio Grande do Sul
Santa Catarina
Ceará
Minas Gerais
Sergipe
Rio Grande do Sul
Alagoas
Rio Grande do Sul
Rio Grande do Sul
São Paulo
Sergipe
Rio Grande do Sul
Santa Catarina
Rio Grande do Sul
74
5.6.
Análise por geração de hidretos
A análise por geração de hidreto é a mais empregada para determinação de
arsênio, pois a remoção do analito da matriz através da formação de um composto
volátil (AsH3) elimina as possíveis interferências espectrais neste elemento
monoisotópico. Nas amostras analisadas, a alta concentração de cloretos interfere
quando um espectrômetro do tipo quadrupolo sem recursos adicionais (célula de
colisão/reação) é utilizado, devido à formação do íon
40
Ar35Cl+ que possui a
mesma razão m/z (75) do elemento arsênio. Desta forma, o uso da geração de
hidreto elimina esta interferência, além de aumentar a sensibilidade e
confiabilidade dos resultados.
As determinações de arsênio total foram realizadas por HG-ICPMS,
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utilizando um espectrômetro de massa de modelo Elan 5000 (PerkinElmer-Sciex)
conectado a um sistema de injeção em fluxo (FIAS 2000, PerkinElmer) para
geração de hidreto de modo automatizado. Foram utilizadas, tipicamente,
alíquotas de 1 mL das amostras de urina, sangue, plasma e suco de uva para as
análises. O procedimento utiliza três etapas distintas e se baseia em metodologia
semelhante à descrita por Stroh et al. (1993), onde maiores detalhes podem ser
encontrados.
(1) Oxidação prévia de uma alíquota da amostra em tubo de polipropileno
fechado com acido nítrico concentrado (qualidade Suprapur®) em bloco digestor
a 80
o
C durante uma noite. Este procedimento visa destruir compostos
“refratários” de arsênio que não possam ser pré-reduzidos na etapa (3).
(2) Evaporação do excesso de HNO3 que iria interferir no processo de préredução (3).
(3) Redução de As(V) para As(III) com 1 mL de uma solução contendo KI
(5% m/v) e ácido ascórbico (5% m/v), e 3 mL de HCl concentrado, mantendo-se a
mistura em repouso durante 15 min.
(4) Geração de AsH3 em sistema FIAS 200 com borohidreto de sódio
(NaBH4, 0,4% m/v), utilizando-se HNO3 (3% v/v) como carreador. Foi
empregado um separador gás/líquido de membrana e o analito, na forma gasosa
(arsina), foi diretamente transportado com auxílio de argônio para o tubo injetor
75
da tocha do ICPMS, dispensando uma câmara de nebulização. Utilizou-se uma
alça de amostragem de 200 µL.
Para quantificação de arsênio nas amostras, foram estabelecidas curvas
analíticas com cinco pontos, utilizando-se soluções analíticas adequadas e
submetidas ao procedimento anteriormente descrito. A exatidão e repetibilidade
dos resultados foram avaliadas através da análise de materiais de referência
certificados. Parâmetros típicos de desempenho desta técnica serão mostrados no
Capítulo 6.
Para se obter informações complementares sobre as formas químicas de
arsênio presente nos sucos de uva, primeiramente, determinou-se a concentração
de As(III) na amostra original, ou seja, sem prévia oxidação e pré-redução (etapas
1-3, vide página anterior). Numa segunda alíquota da amostra original efetuou-se
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a pré-redução (etapa 3) e posterior determinação do arsênio total (As-III + As-V)
pela etapa 4, sendo a concentração de As-V a diferença entre os dois valores
obtidos. Finalmente, a comparação destes valores com a concentração total obtida
após oxidação completa do extrato com HNO3 fornece informações sobre a fração
de arsênio associada aos compostos “refratários” (p.ex. compostos orgânicos de
As), que não são reduzidas nas etapas 3 e 4.