virologia ambiental

VIROLOGIA AMBIENTAL:
Desafios da Detecção de Vírus
Gastrentéricos em Águas e Alimentos
Dra. Adriana de Abreu Corrêa
Pesquisadora Visitante
Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental
Setembro/2011
Meio Ambiente
MEIO AMBIENTE
Conjunto de fatores físicos, químicos, bióticos
e climáticos, que age sobre um determinado
organismo ou uma comunidade ecológica,
determinando a forma de convivência e de
sobrevivência de quem nele habita.
Meio Ambiente
O QUE RECEBEMOS …
Meio Ambiente
O QUE DEVOLVEMOS …
Meio Ambiente
FONTES DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL
•Hidrocarbonetos;
•Metais Pesados;
•Pesticidas;
•Toxinas Marinhas;
•Potenciais Carcinógenos;
•Alergenos;
•Materiais Radioativos;
•Patógenos: Agentes Causadores de Alguma
Enfermidade (em geral, EPISÓDIOS AGUDOS).
Meio Ambiente
Bactérias
Protozoários
Vírus
Biotoxinas
Diversas
Doenças
Doenças de Veiculação Hídrica
Doenças transmitidas pelo consumo de água
ou alimentos contaminados ou após
contato direto pela pele ou ingestão de
águas de recreação poluídas
A água atua como carreador
passivo do agente infeccioso
Agentes etiológicos : patógenos excretados nas fezes, capazes de
iniciar uma infecção
Doenças de Veiculação Hídrica
AGENTES MICROBIOLƒGICOS ASSOCIADOS
COM DOEN„AS
DE VEICULA„…O H†DRICA
“WATERBORNE e
FOODBORNE DISEASES”
Bact•rias:
Coliformes fecais, Vibrio spp., Salmonella spp., Listeria sp., Clostridium
sp., Aeromonas spp., E.coli, Yersinia enterolytica, Campylobacter sp.,
etc.)
Parasitas:
Cryptosporidium sp.; Giardia sp., etc.
V‚rus :
Vírus Entéricos
Vírus em Alimentos
Vias de contaminação dos alimentos
-Cultivo de Moluscos Bivalves
em águas contaminadas
- Manipuladores contaminados
(sinto ou assintomáticos)
- Fômites contaminados
- Irrigação e/ou lavagem dos
alimentos com água contaminada
Virus em Alimentos: Histórico
- 1914 – Primeiro surto viral de origem alimentar – Poliomielite relacionado
ao consumo de leite.
- 1956 e 1962 - Primeiros surtos de HAV por moluscos bivalves, na Su•cia
e EUA, respectivamente.
- No in‚cio da d•cada de 1970, surtos nŠo-bacterianos de gastroenterite foram
registrados, mas nenhum agente p‹de ser isolado in vitro. Estudos
posterioresfocaram na transmissŠo viral por moluscos bivalves, e no
potencial risco de transmissŠo viral pelo uso de Œgua contaminada para
irriga•Šo.
- 1990 - Disponibilidade de m•todos moleculares, os v‚rus foram implicados
como os principais agentes etiolŽgicos de doen•as de origem alimentar no
mundo.
v‚rus da hepatite A,
norov‚rus, astrov‚rus e
rotav‚rus
Vírus Entéricos
DISTINTAS FAM†LIAS VIRAIS
IGUAL VIA DE TRANSMISS…O: FECAL – ORAL
Vírus Entéricos
MAIS DE 15 GRUPOS DIFERENTES DE V†RUS INCLUINDO 140
SUBTIPOS DIVIDIDOS DE ACORDO A EPIDEMIOLOGIA
- N…O ENTEROPATOG•NICOS OU QUE CAUSAM DOEN„AS
N…O RELACIONADAS AO EPIT•LIO INTESTINAL –
POLIOVIRUS, COXSACKIE A E B, ECHOVIRUS, HAV, HEV
- V†RUS RESPONS‘VEIS PELAS GASTRENTERITES AGUDAS
EM HUMANOS –ROTAVIRUS, ADENOVIRUS ENT•RICOS,
ASTROVIRUS E CALICIVIRUS
- ENTEROPATƒGENOS SEM RELA„…O CAUSAL COMPROVADA
– CORONAVIRUS, ENTEROVIRUS, TOROVIRUS,
PARVOVIRUS E REOVIRUS.
Doenças Virais de Veiculação Hídrica
(Abdel-Moety et al, 2008)
Disseminação Viral no Ambiente

GRANDE N’MERO DE PART†CULAS VIRAIS ELIMINADAS NAS
FEZES DE INDIVIDUOS INFECTADOS (105 – 1011/G)

BAIXA DOSE INFECCIOSA (O CONTATO COM APENAS UMA ’NICA
PART†CULA VIRAL • CAPAZ DE DESENCADENAR UMA INFEC„…O

ESTABILIDADE DOS V†RUS
• NO ESGOTO: RESISTEM AOS TRATAMENTOS
• NOS SEDIMENTOS: ADSORVEM-SE AOS SEDIMENTOS
• NOS MOLUSCOS: ADSORVEM-SE AOS TECIDOS
(BR“NQUIAS E TRATO GASTROINTESTINAL)
Virologia Ambiental
 2,4 bilhões de pessoas não dispõem de tratamento
de água
morbidade e mortalidade devido a doenças
causadas por microorganismos presentes em água.
Segundo o Banco Mundial, mais de 2,2 milhões de
pessoas morrem anualmente devido ao consumo de
água contaminada (JFSP, 04/12/2004).
 ¼ dos leitos hospitalares são ocupados por
pacientes com complicações decorrentes de infecções
de veiculação hídrica.
 Aumento do número de surtos de doenças virais
entéricas de veiculação hídrica.
(Straub & Chandler, 2003)
Virologia Ambiental
NÚMERO DE CASOS DE GASTRENTERITES EM
CRIANÇAS < 5 ANOS
1.7 milhão
de óbitos
18 milhões de
hospitalizações
25 milhões de
consultas
111 milhões de casos
domiciliares
Ministério da Saúde, 2002
3.070 óbitos de crianças < 5
anos por doenças diarréicas
em todo o Brasil ( 1/3 viral)
2 bilhões de casos
40-60% dos casos de etiologia viral
Aho, 2000 et al.; Mitchell, 2002; Kosek, 2003; Parashar et al., 2003 ; WHO 2005
Virologia Ambiental
Qual a importância de conhecimentos sobre a
Virologia Ambiental???
Vias de Transmissão
Estudos
Epidemiólogicos
Controle de
Contaminação
Virologia Ambiental
VIROLOGIA AMBIENTAL
QUANDO COMEÇOU?
História, Metodologias, Aplicação e Desafios
Virologia Ambiental : Histórico
1965 - I Confer”ncia Internacional – “Transmission of
Viruses by the Water Route”, Cincinatti, Estados
Unidos da Am•rica
Objetivos deste Encontro :
- Desenvolver métodos quantitativos adequados para detectar a
transmissão viral através da água
- Verificar como os vírus podem sobreviver, sem serem detectados, em
condições nas quais se consegue eliminar coliformes fecais
-
Determinar quais as doses infecciosas virais para humanos
-
Estudar a persistência viral em águas de esgoto (reuso)
- Intensificar esforços para conhecer o agente infeccioso da hepatite
viral
Virologia Ambiental : Histórico
D•cada de 1970 e in‚cio de 1980:
- Papel dos moluscos na transmissão de doenças virais
humanas; Evolução das técnicas de Concentração
-
1979 – Organiza•Šo Mundial da Sa•de, Genebra
“Report of WHO Scientific group of Human Viruses in water,
wastewater and soil”
• ReuniŠo de experts, relatŽrio para planejamento em sa•de
p•blica e economia – pa‚ses desenvolvidos e em
desenvolvimento: import–ncia, riscos, m•todos de detec•Šo,
Œreas de estudo.
Virologia Ambiental : Histórico
D•cada de 1980 – Nova Era para a Virologia Ambiental
1. Reconhecimento do vírus da Hepatite E como vírus entérico capaz de
produzir surtos de veiculação hídrica
2. Adaptação do HAV para replicar em cultura de células e
desenvolvimento de ensaios sensíveis para detecção de antígeno de
HAV
3. Desenvolvimento de métodos de concentração de HAV
4. Reconhecimento do envolvimento de HAV em surtos de veiculação
hídrica
5. Surtos de gastrenterites não bacterianas causados por calicivirus
6. Demonstração do envolvimento dos rotavirus com responsáveis pela
diarréia infantil
7. Reconhecimento de adenovirus entéricos, calicivirus e astrovirus
como responsáveis por quadros de gastrenterite aguda
8. Reconhecimento de que surtos de hepatites e gastrenterites podem
ser causado pela transmissão de vírus no ambiente
Virologia Ambiental : Histórico
D•cada de 1990 - ‘gua e Microbiologia
1. In•meros artigos e livros publicados
2. Recursos humanos formados
3. Cursos e Congressos
Metodologias moleculares
de detec•Šo e
caracteriza•Šo de virus
fastidiosos.
D•cada de 2000 - S•culo XXI
1. Aumento significativo de publica•—es cientificas (5X) quando
comparada com a d•cada de 90;
1. SYMPOSIUM COST 929 - “CURRENT DEVELOPMENTS IN FOOD
AND ENVIRONMENTAL VIROLOGY” Pisa, 9-11 October 2008;
3. PeriŽdico espec‚fico para a Œrea de
Virologia Ambiental (2010)
Food and Environmental Virology
Editor-in-Chief: Nigel Cook
ISSN: 1867-0334 (print version)
Journal no. 12560
Springer US
Virologia Ambiental : Histórico
Virologia Ambiental : Histórico
Virologia Ambiental no
Brasil
em 2004
Virologia Ambiental : Histórico
Curso Teórico - Prático de Virologia
Ambiental
Florianópolis, junho de 2006
UFSC/FIOCRUZ
BRASIL
Virologia Ambiental
no Brasil
em 2011
Virologia Ambiental : Histórico
Virologia Ambiental
APLICAÇÕES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
-
Esclarecimento de surtos
Desenvolvimento e validação de metodologias
Controle microbiológico da água
Monitoramento ambiental
Desinfecção
Avaliação de risco
Matrizes ambientais:
Água de consumo humano (Mineral),
Água de reuso (águas residuárias),
Água de recreação (lagoas, rios, piscinas, praias)
Água de lastro;
Águas subterrâneas;
Lodo e sedimentos;
Superfícies e Alimentos
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas





Análise de vírus em
amostras ambientais
envolve diferentes etapas:
coleta,
clarificação,
concentração,
descontaminação/remoção de inibidores
detecção específica dos vírus
- Padronização e validação intra e interlaboratorial
- Uso Controle interno
Virologia Ambiental: Questões Técnico-científicas
Reduzir
inibidores
Diminuir
volume da
amostra
Concentração
e detecção
de vírus
no ambiente
Detectar qualitativamente e
quantitativamente
Evitar a perda
de viabilidade
Virologia Ambiental: Questões Técnico-científicas
DESAFIOS
MAIOR RECUPERAÇÃO
VIRAL
CONTROLE INTERNO
VIRUS INFECCIOSOS
x
NÃO-INFECCIOSOS
Bacteriofágo PP7
Mengo virus
Norovirus murino
INDICADORES VIRAIS
Vírus RNA
Vírus DNA - JCPyV
Adenovirus
Vírus em Alimentos: Questões Técnico-científicas
FBVE – Food Borne Viruses in Europe
Grupo de 13 paises europeus para reunir informa•—es sobre epidemiologia,
monitoramento e rotas de infec•Šo de v‚rus ent•ricos, principalmente norov‚rus.
Vírus em Alimentos: Questões Técnico-científicas
Butot et al., 2007. Appl Environ Microbiol. 2007; 73, 186-92.
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
Métodos de detecção
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS EM
AMOSTRAS CONCENTRADAS:
1. MOLECULARES: Detecção da Presença do GENOMA viral
ISOLAMENTO DO MATERIAL GENÉTICO VIRAL (DNA/RNA)
Etapa SUPER Importante
 PCR ou RT-PCR (QUALITATIVO)
 PCR em tempo real - QPCR ou RT-QPCR (QUANTITATIVO)
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
MÉTODOS DE DETECÇÃO DE VÍRUS EM
AMOSTRAS CONCENTRADAS:
2. INFECCIOSIDADE: Detecção da Presença vírus VIÁVEIS
Cultivo Celular in vitro
Células
Não
Infectadas
Células
Infectadas
(efeito
citopático)
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
Ensaios de Infecciosidade Viral
ICC/PCR (PCR integrado
ao cultivo celular)
PFU (Placas de Lise)
Ensaio Enzimático
TCID50
( Dose
Infecciosa
Mínima)
IFA
(Imunofluorescencia
indireta)
51
Virologia Ambiental : Questões Técnico-científicas
Métodos de detecção: vantagens e desvantagens
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
EXPERIÊNCIA DA FIOCRUZ
Centro Colaborador OPAS/OMS em
Saúde Pública e Ambiental
Laboratório de Virologia Comparada e
Ambiental:
- Referência Regional para Rotaviroses
- Referência em Virologia Ambiental
Laboratório de Desenvolvimento
Tecnológico em Virologia
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
OBJETIVOS
Detectar e caracterizar vírus em águas ambientais e
alimentos, contribuindo para o esclarecimento de surtos
de gastrenterites aguda e hepatites de veiculação hídrica
de modo a possibilitar ações epidemiológicas efetivas no
controle destas infecções.
Metodologías para concentração de virus por diferentes métodos
Validar métodos moleculares para a detecção viral em diferentes
matrizes ambientais
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
LINHAS DE PESQUISA
1. Avaliação da disseminação ambiental dos vírus da
hepatite A e E responsáveis pelas hepatites de
transmissão entéricas
2. Avaliação de risco pela contaminação viral em águas
ambientais
3. Avaliar os Rotavírus, Astrovírus, Norovírus e
Adenovirus entéricos como indicadores de
saneamento ambiental através da detecção e
caracterização molecular destes vírus.
4. Detecção e quantificação de Norovírus em
ecossistemas aquáticos e animais
5. Estabilidade de norovirus em matrizes ambientais
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
PARTICIPANTES
Dr. Marize Pereira Miagostovich
Dr. José Paulo Gagliardi Leite
Dr. Adriana de Abreu Corrêa
PESQUISADORES
PESQUISADORES
Dr. Ana Maria Coimbra Gaspar
Dr. Jaqueline Mendes de Oliveira
Dr. Débora Regina Lopes dos Santos
Túlio Machado Fumian
Carmen Baur Vieira
Tatiana Prado
Ana Caroline Ganime
Julia Fioretti
Alunos
Alunosde
de
Pós
PósGraduação
Graduação
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
Grupo de Pesquisa em Virologia Ambiental
AGRADECIMENTOS
[email protected]