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UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Educação Física
Luís Antônio Baffile Leoni
Influência do uso prolongado da sildenafila no
comportamento e desempenho físico de ratos
treinados
São Paulo
2016
I
UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU
Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Educação Física
Luís Antônio Baffile Leoni
Influência do uso prolongado da sildenafila no
comportamento e desempenho físico de ratos
treinados
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação Stricto Sensu em Educação Física da
Universidade São Judas Tadeu, como parte dos
requisitos necessários para a obtenção do título de
Doutor em Educação Física.
Área de concentração: "Escola,
Atividade Física e Saúde".
Esporte,
Linha de pesquisa: Atividade Física e Disfunções
Orgânicas
Orientadora: Profa. Dra. Laura Beatriz Mesiano
Maifrino
SÃO PAULO
2016
II
III
DEDICATÓRIA
Aos que tornaram meu sonho possível!
ANTONIO LEONI CONSTANCE BAFFILE LEONI ANGELA TERESA BAFFILE LEONI TERRA DALMO
MACEDO TERRA LUÍSA LEONI TERRA PEDRO LEONI TERRA ANGELO LIMA JACON CAROLINA BAFFILE
BAPTISTA ALCINDO JOÃO BAPTISTA NEUZA JACOB VERONESE ADELINO VERONESE ELISA LEONI
VERONESE FERNANDO LEONI VERONESE MARTA LÚCIA DE CARVALHO CHEIDA PAULO MENEZES DE
CARVALHO LUÍS EDUARDO CHEIDA MÁRCIA CRISTINA IANELA ELISA YOKO HIROOKA LÚCIA MARIA
VALENTE SOARES
Aos que sonharam e caminharam comigo!
DÉBORA CRISTINA DE OLIVEIRA HAMILTON ROBERTO FORTES BAVUTTI ELIZABETH MIEKO
EGASHIRA LÉLIA KIMIKO ASAKAWA MARIA LUIZA CRUZ FRANCISCO BENEDITO KUCHINSKI MARIO
NATAL RICARDO D’AGOSTINO RODRIGUES RIVÂNIA PEREIRA DE MATOS REGINA CÉLIA DE FRANÇA
ANDRÉ RINALDI FUKUSHIMA VALQUÍRIA FERRARINI LOUSANO ANDRÉ HAHNE MARIA RAQUEL
MANHANI CÉSAR DIÓRIO CARLOS ROBERTO DIOGO LUIZ CARLOS RIZZATO GILSON VILARINS MARQUES
MARIA DE LOURDES LEITE DE MORAES RITA DE CÁSSIA BAFFILE DE OLIVEIRA LEONIR APARECIDA
PEREIRA MARCELO SOARES VIÇOSO DA SILVA WAGNER SOARES VIÇOSO DA SILVA ANTONIO GALVÃO
ROBERTO RILLO BÍSCARO RUBENEI NOVAES JAIME MONTEIRO JUNIOR SÍLVIO CESAR SANTOS ORFÃO
ANTONIO CARLOS CASTILHO ALVES SADAKO TAKESHITA LUZINETE DE FÁTIMA RODRIGUES CARLOS
ALBERTO CANHAMEIRO WALTER FERNANDES DA CUNHA JR WALTER FERNANDES DA CUNHA
LEONILDA CUNHA WANDRÉIA FERNANDES DA CUNHA WALDELIZA FERNANDES DA CUNHA HEITOR
CARVALHO LAURA FERNANDES MARIA SAITO IANELA ELPÍDIO RALEU IANELA SUZANA DE FÁTIMA
PACCOLA MESQUITA CLÁUDIO MULLER ELENI IRIS TOZATI ASSI SEDERLI RANIERI MARCIA FÁTIMA
KERKOFF MARISA MOTOMURA JOSÉ CARLOS BARBIERI MARCELO SWENSON EDUARDO VICENTE
MARIA TERESA PEDROSA DA SILVA CLERICI TANIA DA SILVEIRA AGOSTINHO TERESA CORTELAZZI
REGINA PRADO ZANES FURLANI MELQUÍADES MACHADO PORTELA RUTH YAMADA ANTONIO
MARCOLINO DO NASCIMENTO JULIO FERNANDES MARISE APARECIDA RODRIGUES POLONIO TANIA
AKIKO ANAZAWA MICHELE POLLI PARISE MARIA HELENA DE CARVALHO MAGDA CARDOSO NEMETH
NAGY CLAUDIA MAURO ALICE DA MATTA CHASIN CRISTIANE ROCHA DE FARIAS MIRIAM IWAHASHI
DURVAL LUIZ DA SILVA ROSÁRIO ANTONIO D’AGOSTINO ADELAIDE JOSÉ VAZ FERNANDO HERREN
FERNANDES AGUILLAR JOSÉ REINALDO ALTENFELDER SILVA MESQUITA MARIA CLAUDIA MESQUITA
POÇAS ANTONIO JOSÉ DA SILVA MONICA MIRANDA DA SILVA CLAUDIA SANCHES JOSÉ CARLOS JADON
ROGÉRIO BRANDÃO VICHI BRUNO RODRIGUES DEISE CRISTINA MOREIRA DA SILVA NÍVEA RUIZ
WANDERLEI DE ANDRADE LUCIA MACHADO DE ANDRADE MARISA SEVERINO SILVA KELLI DE PAULA
SQUITINO LAURA BEATRIZ MESSIANO MAIFRINO RODRIGO CESAR SEVERINO NEIVA GABRIELA
MANFREDI SALOMONE
IV
AGRADECIMENTOS
A Doutora Laura Beatriz Mesiano Maifrino, pela orientação final desse trabalho e pelo
apoio e dedicação.
Ao professor Bruno Rodrigues pela orientação de grande parte deste trabalho e pelo
auxílio e dedicação no desenvolvimento do projeto.
Aos alunos de iniciação científica Nicole Caroline de Almeida Furlan, Larissa Miranda
Gnandt e Mabilli Nadim Ribeiro de Oliveira, pelo apoio e nas diversas etapas do projeto.
Aos colegas do Programa de Pós-graduação Stricto-Sensu em Educação Física, Juliana
Valente Francica Griletti, Jurema Carmona Satin Cury e Maurício José Cagno, pelo
companheirismo e estímulo durante a jornada.
Aos colegas do Laboratório do Movimento Humano, Leandro Yanase Rocha, Marcos
Elias Vergilino Abssamra, Daniele Jardim Feriane e Catarina Andrade Barboza, pelos
ensinamentos e auxílio constante.
A Doutora Maria Claudia Irigoyen pela autorização de uso do Laboratório do INCOR
durante parte do experimento.
A Doutora Maria Martha Bernardi pelo auxílio nas fases iniciais do delineamento do
projeto e pela valiosa contribuição no seminário de apresentação do projeto.
A Doutora Helenice de Souza Spinosa, pelo auxílio nas fases iniciais do delineamento
do projeto e pela valiosa contribuição no Exame de Qualificação.
Ao Supervisor dos Laboratórios da Área de Saúde, André Hahne, pela dedicação e
auxílio constante.
V
Aos colegas do Laboratório de Farmácia, Regina Célia A. S. França e Rafael Francisco
Pereira, pela dedicação e auxílio constante.
A amiga Deise Cristina Moreira da Silva pelo auxílio na tabulação dos dados de
comportamento animal.
Ao amigo André Rinaldi Fukushima pelo apoio constante e pelos incontáveis momentos
de reflexão e companheirismo.
Aos meus amigos da Universidade São Judas Tadeu que sempre torceram por mim.
Muito Obrigado!
VI
“Cada um sabe a dor e a delícia de ser o que é”
Caetano Veloso
“Ei dor...eu não te escuto mais. Você, não me leva a nada.
Ei medo...eu não te escuto mais. Você, não me leva a nada”.
Jota Quest
“Você não sabe o quanto eu caminhei para chegar até aqui”
Cidade Negra
VII
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Quadros
RESUMO
ABSTRACT
Sumário
INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
1.1
Mecanismo de Ação ................................................................................................. 2
1.2
Usos .......................................................................................................................... 4
1.2.1
Na disfunção erétil ................................................................................................ 4
1.2.2
Na hipertensão pulmonar ...................................................................................... 4
1.2.3
Extra-bula ............................................................................................................. 5
1.3
Riscos versus Benefícios .......................................................................................... 5
1.3.1
Eficácia do uso de sildenafila ............................................................................... 6
1.3.2
Eventos Adversos decorrentes do uso de sildenafila .......................................... 11
1.4
Disfunções endotelial e erétil, atividade física e sildenafila .................................. 13
1.4.1
Atividade Física e Saúde Cardiovascular ........................................................... 14
1.4.2
Atividade Física e Disfunção Erétil .................................................................... 17
1.4.3
Atividade Física e Sildenafila ............................................................................. 20
JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 22
VIII
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 23
3.1
Objetivo Geral ............................................................................................................ 23
3.1
Objetivos Específicos ................................................................................................ 23
Capítulo I: Desenvolvimento e Validação de Método Analítico para determinação de
sildenafila em plasma de ratos .................................................................................................. 25
4.1
Objetivos Específicos ................................................................................................ 25
4.2
Revisão da Literatura ................................................................................................. 25
4.2.1
Método Analítico para Análise de sildenafila .................................................... 25
4.2.2
Quantificação da sildenafila ............................................................................... 27
4.3
Material e Métodos .................................................................................................... 31
4.3.1
Animais............................................................................................................... 31
4.3.2
Fármacos e Reagentes ........................................................................................ 31
4.3.3
Delineamento Experimental ............................................................................... 31
4.3.4
Validação do método analítico ........................................................................... 35
4.3.5
Aplicação do Método em Amostra Real ............................................................ 37
4.4
Resultados e Discussão .............................................................................................. 38
4.4.1
Quantificação e preparação das curvas de calibração ........................................ 38
4.4.2
Validação da metodologia analítica .................................................................... 41
4.4.3
Aplicação do Método em Amostra Real: ........................................................... 49
4.5
Conclusão................................................................................................................... 51
Capítulo II: Estudo Farmacocinético da sildenafila em ratos ........................................... 52
5.1
Objetivo Específico .................................................................................................... 52
5.2
Revisão da Literatura ................................................................................................. 53
IX
5.2.1
5.3
Parâmetros Farmacocinéticos ............................................................................. 53
Material e Métodos .................................................................................................... 55
5.3.1
Animais............................................................................................................... 55
5.3.2
Reagentes e Fármacos ........................................................................................ 56
5.3.3
Delineamento Experimental ............................................................................... 57
5.4
Resultados e Discussão .............................................................................................. 58
5.4.1
Verificação do teor de sildenafila no plasma...................................................... 58
5.4.2
Determinação dos parâmetros farmacocinéticos: ............................................... 59
5.5
Conclusão................................................................................................................... 62
Capítulo III: Influência da sildenafila no comportamento de ratos avaliados no campo
aberto e no labirinto em cruz elevado ....................................................................................... 63
6.1
Revisão da Literatura ................................................................................................. 64
6.2
Objetivos Específicos ................................................................................................ 67
6.3
Material e Métodos .................................................................................................... 67
6.3.1
Animais............................................................................................................... 67
6.3.2
Reagentes e Fármacos ........................................................................................ 68
6.3.3
Administração da sildenafila aos animais .......................................................... 68
6.3.4
Delineamento Experimental ............................................................................... 68
6.3.5
Avaliação da Atividade Geral em Campo Aberto .............................................. 69
6.3.6
Avaliação do Comportamento no Labirinto em Cruz Elevado .......................... 71
6.3.7
Análise Estatística .............................................................................................. 74
6.4
Resultados e Discussão .............................................................................................. 74
X
6.4.1
Avaliação da Atividade Geral em Campo Aberto .............................................. 74
6.4.2
Avaliação do Comportamento no Labirinto em Cruz Elevado .......................... 82
6.5
Conclusão................................................................................................................... 87
Capítulo IV: Influência da sildenafila sobre o desempenho físico de ratos ..................... 89
7.1
Introdução .................................................................................................................. 89
7.2
Objetivos Específicos ................................................................................................ 90
7.3
Revisão da Literatura ................................................................................................. 90
7.3.1
Sildenafila e capacidade física em hipóxia ......................................................... 91
7.3.2
Sildenafila e capacidade física em normóxia ..................................................... 91
7.4
Material e Métodos .................................................................................................... 92
7.4.1
Animais............................................................................................................... 92
7.4.2
Reagentes e Fármacos ........................................................................................ 93
7.4.3
Delineamento Experimental ............................................................................... 94
7.4.4
Peso corporal ...................................................................................................... 94
7.4.5
Teste de Esforço Máximo e Treinamento Físico ................................................ 95
7.4.6
Avaliações Hemodinâmicas e da Sensibilidade Baroreflexa ............................. 96
7.4.7
Avaliação da Modulação Autonômica ............................................................... 98
7.4.8
Análise Estatística .............................................................................................. 98
7.5
Resultados e Discussão .............................................................................................. 99
7.5.1
Peso Corporal ..................................................................................................... 99
7.5.2
Capacidade Física ............................................................................................. 100
7.5.3
Variáveis Hemodinâmicas - Resultados ........................................................... 105
XI
7.5.4
Modulação Autonômica - Resultados............................................................... 109
7.5.5
Variáveis Hemodinâmicas e Modulação Autonômica - Discussão .................. 113
7.6
Conclusão................................................................................................................. 118
Considerações Finais ...................................................................................................... 119
Referências Bibliográficas .............................................................................................. 120
ANEXOS ............................................................................................................................... 137
Anexo 1 .................................................................................................................................. 137
Anexo 2 .................................................................................................................................. 138
Anexo 3 .................................................................................................................................. 139
Anexo 4 .................................................................................................................................. 140
Anexo 5 .................................................................................................................................. 141
XII
Lista de Figuras
Figura 1: Estrutura química da sildenafila (CAS Number 171599083-0)............
2
Figura 2: Mecanismo de Ação da sildenafila (modificado de LEONI et al.,
2013)....................................................................................................................
3
Figura 3: Causas da Disfunção Erétil (modificado de LEONI et al., 2013).........
6
Figura 4: Estrutura química do propilparabeno (CAS Number 94-13-3).............
29
Figura 5: Representação gráfica das 5 replicatas da curva de calibração da
sildenafila.............................................................................................................
38
Figura 6: Curvas de Calibração A, B, C, D provenientes de animais em jejum....
39
Figura 7: Curva de Calibração H proveniente de animais em jejum com plasma
hemolisado...........................................................................................................
40
Figura 8: Curva de Calibração L..........................................................................
41
Figura 9: Cromatograma da Amostra Branco – matriz processada sem adição
do analito e padrão interno....................................................................................
43
Figura 10: Cromatograma da Amostra Zero – matriz processada com adição
do padrão interno..................................................................................................
44
Figura 11: Cromatograma de Amostra de Controle de Qualidade – matriz
processada com adição do analito e padrão interno...............................................
44
Figura 12: Cromatograma de mistura de padrão interno – Propilparabeno e
Sildenafila............................................................................................................
45
Figura 13: Cromatograma do padrão de Sildenafila............................................
45
Figura 14: Curva de Calibração da Recuperação.................................................
49
Figura 15: Curva de Concentração (µg/mL) versus Tempo de Exposição ao
Fármaco (minutos)...............................................................................................
59
Figura 16: Campo aberto ....................................................................................
70
Figura 17: Labirinto em cruz elevado .................................................................
73
Figura 18: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na frequência
de locomoção, na frequência de levantar e na frequência de autolimpeza de
ratos, avaliada em campo aberto. .........................................................................
77
XIII
Figura 19: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) no tempo de
locomoção, tempo de levantar, tempo de autolimpeza e tempo de imobilidade
de ratos, avaliada em campo aberto. (*p<0,05).....................................................
78
Figura 20: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) e de placebo na
avaliação do comportamento de ratos treinados e sedentários no labirinto em
cruz elevado..........................................................................................................
84
Figura 21: Número de Cruzamentos nos braços abertos do LCE em ratos
sedentários e treinados mediante a administração de dose de 1,5 mg/Kg de
sildenafila ou placebo...........................................................................................
85
Figura 22: Treinamento físico dos ratos em esteira ergométrica. Fonte: Bruno
Rodrigues.............................................................................................................
96
Figura 23: Peso Corporal dos ratos treinados e sedentários expostos à
sildenafila e ao placebo.........................................................................................
100
Figura 24: Capacidade física de ratos sedentários (S) e treinados (T) nos grupos
Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S SIL, n=8), Treinado
+ Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (T SIL, n=12).................................
103
XIV
Lista de Tabelas
Tabela 1: Pontos da Curva de Calibração...................................................................
34
Tabela 2: Precisão avaliada por meio do coeficiente de variação (CV%) do
Limite Inferior de Quantificação (LIQ).....................................................................
42
Tabela 3: Resposta de Picos Interferentes no tempo de retenção da sildenafila..........
42
Tabela 4: Equação da Reta e Coeficiente de Correlação Linear das Curvas de
Calibração...................................................................................................................
46
Tabela 5: Desvio Padrão Relativo dos Pontos das Curvas de Calibração...................
47
Tabela 6: Erro Padrão Relativo.................................................................................
48
Tabela 7: Porcentagem de Recuperação do Método..................................................
49
Tabela 8: Concentração da Sildenafila em Amostras de Plasma de Ratos que
receberam 1,5 mg/Kg de sildenafila............................................................................
50
Tabela 9: Concentração Plasmática de sildenafila em ratos.......................................
58
Tabela 10: Parâmetros Farmacocinéticos..................................................................
61
Tabela 11 : Efeitos da administração de a sildenafila (1,5 mg/Kg) na atividade geral
de ratos, avaliada em campo aberto. Os valores são representados como média ±
desvio padrão (n=10 para ambos os grupos)...............................................................
75
Tabela 12 : Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na atividade geral
de ratos, avaliada em campo aberto. O teste estatístico empregado é o Anova de
duas vias (n=10 para ambos os grupos).......................................................................
76
Tabela 13: Número de Defecações nos testes de campo aberto mediante a
administração de dose de 1,5 mg/Kg de sildenafila. (n=10)...................................
78
Tabela 14: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na avaliação do
comportamento de ratos sedentários no labirinto em cruz elevado. Os valores são
representados como média ± desvio padrão (n=8 para ambos os grupos)...................
82
Tabela 15: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na avaliação do
comportamento de ratos treinados no labirinto em cruz elevado. Os valores são
representados como média ± desvio padrão (n=8 para ambos os grupos)...................
82
Tabela 16: Resultado do teste ANOVA de duas vias entre ratos treinados e
sedentários placebo e sildenafil..................................................................................
83
Tabela 17 : Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na avaliação do
comportamento de ratos treinados no labirinto em cruz elevado. O teste estatístico
empregado é o Anova de duas vias (n=8 para ambos os grupos).................................
83
XV
Tabela 18: Número de Cruzamentos e % de Entradas nos braços abertos do LCE
em ratos sedentários e treinados mediante a administração de dose de 1,5 mg/Kg de
sildenafila. Os valores são representados como média ± desvio padrão (n=8 para
ambos os grupos)........................................................................................................
84
Tabela 19: Resultado do teste ANOVA de duas vias entre ratos treinados e
sedentários placebo e sildenafil na avaliação do comportamento de ratos treinados
e sedentários no labirinto em cruz elevado..................................................................
85
Tabela 20: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) e ao placebo na
avaliação do comportamento de ratos treinados no labirinto em cruz elevado. O
teste estatístico empregado é o Anova de duas vias (n=8 para ambos os grupos)........
85
Tabela 21: Peso corporal e ganho de peso de ratos nos grupos Sedentário + Placebo
(S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S Sil, n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e
Treinado + Sildenafila (T Sil, n=12)...........................................................................
99
Tabela 22: Capacidade física de ratos sedentários (S) e treinados (T) nos grupos
Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S Sil, n=8), Treinado +
Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (T Sil, n=12)...........................................
101
Tabela 23: Variáveis hemodinâmicas avaliadas SEM o uso de Sildenafila ou
Placebo nos grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (SS,
n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (TS, n=12)...................
105
Tabela 24: Variáveis hemodinâmicas avaliadas COM o uso de Sildenafila ou
Placebo nos grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (SS,
n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (TS, n=12)...................
108
Tabela 25: Modulação autonômica cardiovascular SEM o uso de Sildenafila ou
Placebo nos grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S Sil,
n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (T Sil, n=12)................
110
Tabela 26: Modulação autonômica cardiovascular COM o uso de Sildenafila ou
Placebo nos grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (SS,
n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (TS, n=12)...................
112
XVI
Lista de Quadros
Quadro 1: Eventos Adversos decorrentes do uso de sildenafila..................................
12
Quadro 2: Principais métodos empregados na análise de sildenafila (SIL), seu
metabólito e de outros inibidores da 5-PDE em plasma...............................................
26-27
XVII
RESUMO
Influência do uso prolongado da sildenafila no comportamento e
desempenho físico de ratos treinados
Autor: Luís Antônio Baffile Leoni
A sildenafila é um inibidor da 5-fosfodiesterase utilizado no tratamento da
disfunção erétil. Promove a ereção por ação periférica não exercendo efeito relaxante
diretamente sobre os corpos cavernosos isolados de humanos, mas aumentando potencialmente
o efeito relaxante do óxido nítrico sobre esse tecido. É empregada como adjuvante no
tratamento de hipertensão pulmonar e também em situação de hipóxia no manejo da hipertensão
pulmonar. Tem sido utilizada por atletas em competição em situação de hipóxia originada por
grandes altitudes. O objetivo do trabalho é verificar a influência do uso prolongado de
sildenafila no comportamento motor e no desempenho físico de ratos treinados e sedentários,
bem como desenvolver e validar um método analítico por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência para conhecer a farmacocinética do fármaco em ratos Wistar. O método
desenvolvido e validado foi considerado um método simples, rápido, específico, linear, preciso
e exato para identificar e quantificar sildenafila em plasma de ratos. A sildenafila administrada
pela via oral (dose de 1,5 mg/Kg) a ratos machos saudáveis apresentou uma rápida absorção,
atingindo a Concentração Máxima – Cmax de 6,4121 m µg/mL em um tmax de 40 min. O volume
de distribuição foi de 1,93 mL, indicando uma alta ligação às proteínas plasmáticas. O
clearance ou depuração calculado foi de 1,36 horas e a Área Sob a Curva foi de 801,21, em
consequência, o tempo de meia-vida calculado foi de 88,8 min (1,48 h). Quanto ao
comportamento de ratos foi possível concluir que a sildenafila promoveu aumento da atividade
motora e impediu a habituação dos animais, além de promover ansiedade e ter ação estimulante
motora sugerida por efeitos motores e não efeitos emocionais. Quanto à capacidade física, foi
possível concluir que a sildenafila não interfere no peso corpóreo dos animais, mas o uso
prolongado durante 60 dias em doses orais diárias de 1,5 mg/Kg em animais sedentários não
apresenta nenhuma influência significante. No entanto, em animais treinados, a sildenafila
melhora significantemente a capacidade física, além de contribuir para o aumento da
capacidade aeróbica. A administração prolongada do fármaco conduziu a um aumento da
pressão arterial de repouso, possivelmente associada à elevação da modulação simpática
vascular. Assim, ao extrapolar para as competições esportivas, nossos resultados possibilitam
inferir que o uso prolongado de sildenafila por atletas pode melhorar a capacidade aeróbica dos
mesmos, possibilitando um melhor rendimento na competição, ficando a ressalva de que tal
XVIII
comportamento pode promover elevação dos níveis pressóricos em atletas, tornando-os
suscetíveis a eventos cardiovasculares indesejáveis durante uma prova ou competição.
Palavras-Chave: Sildenafila; Método Analítico; Farmacocinética; Comportamento Motor;
Desempenho Físico; Capacidade Física;
XIX
ABSTRACT
Influence of prolonged use of sildenafil in the behavior and physical
performance of trained rats
Author: Luís Antônio Baffile Leoni
Sildenafil is a 5-fosfodiesterase inhibitor employed in the treatment of erectile
dysfunction. It promotes the erection through peripheral action not by producing direct relaxing
effect on isolated human corpus cavernosum, but potentially increasing the relaxing effect of
nitric oxide upon this tissue. It has been employed as adjuvant in the treatment of lung
hypertension and in hypoxia in the handling of lung hypertension. It has been employed by
competing athletes in situation of hypoxia originated from high altitude. The purpose of the
thesis is to verify the influence of the extended use of sildenafil in the motor activity and in the
physical performance of both trained and sedentary rats. An additional objective of the work is
to develop and validate an analytical method employing High Performance Liquid
Chromatography in order to acknowledge the drug’s pharmacokinetics in Wistar rats. The
method developed and validated was considered a simple, quick, specific, linear, accurate and
exact method to identify and quantify sildenafil in rat’s plasma. Sildenafil orally administered
(dosis of 1,5 mg/Kg) to male healthy rats presented a rapid absorption, reaching the Maximum
Concentration – Cmax of 6,4121 µg/mL in a tmax of 40 min. The volume of distribution was 1,93
mL, indicating a high plasma protein binding. The calculated clearance or depuration was 1,36
hours and the Area Under the Curve was 801,21. As a consequence, the half-life was calculated
in 88,8 min (1,48 h). With regard to the rats’ motor activity, it was possible to conclude that
sildenafil promoted the increase of motor activity and prevented the habituation of the animals,
besides causing anxiety and stimulation to the motion action suggested rather by motion effects
and not by emotional effects. As to the physical capacity it was possible to conclude that
sildenafil does not interfere with the bodily weight of the animals, and the extended use in daily
oral dosis of 1,5 mg/Kg, during 60 days, in sedentary animals does not present any significant
influence. However, in trained subjects sildenafil improves significantly the physical capacity
of the animals. It also contributes significantly in the increase of aerobic capacity. However,
the extended exposure to the drug has led to an increase in the blood pressure at rest, possibly
associated to the elevation of the vascular sympathetic modulation. Thus, extrapolating the
analysis to the sportive competitions, our results allow the inference that the extended use of
sildenafil by athletes can improve their aerobic capacity, providing a better performance in the
XX
competition. It is remarked that this behavior may promote the elevation of blood pressure
levels in athletes, subjecting them to undesirable cardiovascular events during a test or
competition.
Key-Words: Sildenafil; Analytical Method; Pharmacokinetics; Motor Activity; Physical
performance; Physical capacity;
XXI
INTRODUÇÃO
O fármaco sildenafila é o primeiro agente inibidor da 5-fosfodiesterase (PDE-5),
uma enzima responsável pela conversão do AMPc (adenosina monofosfato cíclico) e do GMPc
(guanosina monofosfato cíclico) em AMP (adenosina monofosfato) e GMP (guanosina
monofosfato), respectivamente, utilizado no tratamento da disfunção erétil humana.
Em 1989, pesquisadores do laboratório farmacêutico Pfizer, com vistas ao tratamento de
pacientes com angina, sintetizaram uma molécula denominada sildenafila. Em 1991, iniciaramse testes clínicos com o fármaco em indivíduos saudáveis e em pacientes com distúrbios
cardiovasculares. Os resultados clínicos de eficácia em pacientes com angina foram claramente
fracos. No entanto, uma aumentada tendência a ter ereções foi manifestada pelos pacientes
como um evento adverso. Assim, os estudos foram direcionados para a aplicação da molécula
no manejo da disfunção erétil. Em 1998 o FDA (Food and Drug Administration) aprovou a
sildenafila para o tratamento da disfunção erétil (KATZENSTEIN, 2001) .
A sildenafila é utilizada na forma de citrato de sildenafila e como medicamento de
referência é comercializado sob o nome comercial Viagra®. Como similar tem-se Dejavú®,
Revatio®, Suvvia®, Tandrix®, dentre outros. Sua descoberta foi um marco para a indústria
farmacêutica e, desde seu lançamento, outras novas substâncias têm sido incorporadas à
terapêutica e apresentam o mesmo mecanismo de ação. Entre estas tem-se a tadalafila e a
vardenafila (BOOLELL et al., 1996; KLOTZ et al., 2001; PADMA-NATHAN et al., 2001) .
A sildenafila, cujo nome químico é (5-[2-etoxi-5-(4-metilpiperazina-1-sulfonil)fenil]-1metil-3-propil-1,6-diidro-7H-pirazol[4,3-d]pirimidin-7-ona) é um composto orgânico de
origem sintética que apresenta a fórmula molecular C22H30N6O4S e massa molecular de 474,59.
Sua estrutura pode ser visualizada na Figura 1.
1
O
O
N
N
N
N
O
S
O
N
N
Figura 1: Estrutura química da sildenafila (CAS Number 171599083-0)
1.1 Mecanismo de Ação
A sildenafila atua como inibidor da enzima 5-fosfodiesterase (PDE-5). A PDE5 é uma hidrolase que faz parte da família das fosfodiesterases. As fosfodiesterases estão
amplamente distribuídas no organismo principalmente nos seguintes locais: olhos, fígado,
cérebro, rins, musculatura esquelética e lisa, pênis, testículos e pâncreas (SODERLING;
BEAVO, 2000). São isoenzimas responsáveis pela conversão do AMPc (adenosina
monofosfato cíclico) em AMP (adenosina monofosfato) e do GMPc (guanosina monofosfato
cíclico) em GMP (guanosina monofosfato). AMPc e GMPc são conhecidos como segundos
mensageiros (CAMPBELL, S F, 2000; GLICK; BEAVO, 2003).
Estudos demonstram que a seletividade da sildenafila à PDE-5 é de 10 a 10.000
vezes superior àquela apresentada para outras fosfodiesterases (PDE 1, 2, 3, 4 e 6). Em
particular, a sildenafila tem afinidade pela PDE-5, 4.000 vezes superior à PDE-3, a
fosfodiesterase isomórfica específica do AMPc envolvida no controle da contratilidade
cardíaca. A sildenafila também tem afinidade 10 vezes menor à PDE-6, envolvida na cascata
de fototransdução da retina (GLICK; BEAVO, 2003).
O mecanismo fisiológico responsável pela ereção do pênis envolve a liberação de
óxido nítrico nos corpos cavernosos durante a estimulação sexual. O óxido nítrico ativa a
enzima guanilato ciclase, que, por sua vez induz o aumento dos níveis de GMPc, produzindo
um relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos, permitindo o influxo de sangue
(LAU; ADAIKAN, 2006). A Figura 2 ilustra esse efeito.
A ereção peniana prescinde de uma estimulação sexual que desencadeia a liberação
de óxido nítrico nos corpos cavernosos do pênis. O óxido nítrico liberado, por sua vez, ativa a
enzima adenilato ciclase, que induz o aumento dos níveis de GMPc. O GMPc produz
2
relaxamento da musculatura lisa dos corpos cavernosos, permitindo o influxo de sangue no
pênis, mantendo-o ereto. Uma vez cessado o estímulo ou, após a ejaculação, ocorrerá a
liberação da PDE-5 responsável pela redução dos níveis de GMPc e, consequentemente, ocorre
o efluxo de sangue dos corpos cavernosos (KATZENSTEIN, 2001).
A sildenafila promove a ereção por ação periférica. A substância não exerce efeito
relaxante diretamente sobre os corpos cavernosos isolados de seres humanos, mas aumenta
potencialmente o efeito relaxante do óxido nítrico sobre esse tecido. Quando a via óxido
nítrico/GMPc é ativada, como ocorre com a estimulação sexual, a inibição da PDE-5 pela
sildenafila resulta em um aumento dos níveis de GMPc nos corpos cavernosos. Portanto, a
estimulação sexual é necessária para que a sildenafila possa produzir seus efeitos
farmacológicos benéficos (CAMPBELL, HELEN ELOISE, 2005).
Figura 2: Mecanismo de Ação da sildenafila (modificado de LEONI et al., 2013)
Além da sildenafila, outros inibidores das fosfodiesterases tem aplicação clínica
como, por exemplo, a milrinona utilizada em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva,
o cilostazol em pacientes com claudicação intermitente e o roflumilaste utilizado no manejo da
asma (GLICK; BEAVO, 2003). A cafeína, conhecido agente termogênico também é um
inibidor da enzima fosfodiesterase.
3
1.2 Usos
1.2.1 Na disfunção erétil
A principal utilização terapêutica da sildenafila é no tratamento da disfunção erétil.
A substância age restaurando a função erétil resultante de uma resposta natural à estimulação
sexual.
O tratamento da disfunção erétil com medicamentos, por via oral, é relativamente
recente e os tratamentos disponíveis até então incluíam dispositivos de constrição à vácuo,
injeções no corpo cavernoso peniano, aplicação transuretral de prostaglandina E1, implantação
de próteses no pênis ou a realização de cirurgias venosas ou arteriais (LINET; OGRINC, 1996).
Inúmeros estudos e ensaios clínicos têm sido conduzidos para a avaliar a eficácia
do fármaco na disfunção erétil e sua segurança em relação a ausência ou presença de comorbidades específicas. Numa revisão detalhada realizada por Leoni et al. (2013), concluiu-se
que a sildenafila é um tratamento eficaz no manejo da disfunção erétil, na ausência ou presença
de co-morbidades, e os benefícios do fármaco superam os riscos, além de representar uma
melhoria significativa na vida de homens com disfunção erétil.
1.2.2 Na hipertensão pulmonar
A hipertensão pulmonar, doença de alta morbimortalidade na infância, tem
etiologia multifatorial e ocorre em aproximadamente 1,9 nascidos vivos a cada 1.000.
Caracteriza-se por aumento da resistência vascular pulmonar, resultando em shunt da câmara
cardíaca direita para a esquerda, com passagem de sangue não-oxigenado pelo ducto arterioso
ou forame oval (BENTLIN et al., 2005).
A sildenafila é um inibidor potente e seletivo da PDE-5 na musculatura vascular
pulmonar,
no
qual
a
enzima
é
responsável
pela
degradação
do
GMPc.
O fármaco aumenta o GMPc dentro das células do músculo liso vascular pulmonar, resultando
em relaxamento. Em pacientes com hipertensão arterial pulmonar, isto pode levar à
vasodilatação do leito vascular pulmonar e, em menor grau, à vasodilatação da circulação
sistêmica. O fármaco tem sido empregado como adjuvante no tratamento de hipertensão
pulmonar primária ou secundária. É utilizado geralmente associado ao óxido nítrico inalável,
injeções de epoprostenol intravenoso ou iloprosta inalável (ZHAO et al., 2001).
4
No Brasil é comercializado na forma de comprimidos revestidos de 20 mg de citrato
de sildenafila pela indústria farmacêutica Pfizer sob o nome comercial de Revatio®, enquanto
que para uso na disfunção erétil, os comprimidos são de 25, 50 e 100 mg.
1.2.3 Extra-bula
A sildenafila tem sido utilizada por atletas, principalmente ciclistas, triatletas,
corredores e jogadores de futebol, em competição, em situação de hipóxia originada por grandes
altitudes (GHOFRANI et al., 2002, 2004). Particularmente sobre o sistema respiratório, a
sildenafila promove vasodilatação pulmonar; por isso em situação de hipóxia o medicamento
tem se mostrado eficaz no manejo da hipertensão pulmonar desencadeada pela diminuição de
oxigênio disponível. Por essa razão, a sildenafila parece emergir como uma potente ajuda
ergogênica durante o exercício executado em situação de hipóxia (HSU et al., 2006).
Desde 2007, a American Medical Association (AMA) oficializou a realização de
projetos de pesquisa que investigam o uso da sildenafila em situações adversas ao recomendado
pelo fabricante e pelo FDA, órgão que decide pelo uso de medicamentos nos Estados Unidos.
Os seguintes projetos foram anunciados: Can sildenafil improve exercise performance at
moderate altitude?; Decreased pulmonary artery pressure by oral sildenafil ingestion at mild
altitude during exercise in air pollution increases exercise performance; Effect of sildenafil on
athletic performance in athletes with spin al cord injury: a prospective, placebo controlled,
blinded, crossover study (JACOBS; FRIEDLANDER, 2015; RUNDELL et al., 2015;
WILLICK et al., 2015).
1.3 Riscos versus Benefícios
A disfunção erétil pode ser definida como uma persistente inabilidade de conseguir
ou manter uma ereção peniana suficiente para um desempenho sexual satisfatório e
frequentemente está associada à idade ou à presença de co-morbidades como o diabetes
mellitus, hipertensão, dislipidemia e outros fatores de risco cardiovascular, tais como o uso de
tabaco e o excesso de peso (NIH CONSENSUS CONFERENCE, 1993) – Figura 3.
5
Figura 3: Causas da Disfunção Erétil (modificado de LEONI et al., 2013).
Diante das inúmeras informações disponíveis sobre o uso terapêutico da sildenafila,
a seguir é apresentada uma análise crítica dos dados disponíveis na literatura internacional sobre
a eficácia e a segurança da sildenafila na presença ou não de co-morbidades associadas.
1.3.1 Eficácia do uso de sildenafila
Nos estudos desenvolvidos na ausência de co-morbidades à disfunção erétil, podese verificar que em homens com disfunção erétil de diferentes etiologias a sildenafila oral foi
eficaz e bem tolerada, com taxas de sucesso expressivas (BOOLELL et al., 1996; EARDLEY
et al., 2001; GOLDSTEIN et al., 1998; MEULEMAN et al., 2001; MONTORSI et al., 1999;
PALUMBO et al., 2001). O uso de sildenafila oral provou ser eficaz e bem tolerado tanto no
início do tratamento como no tratamento a longo prazo e, para a maioria dos pacientes, o
tratamento medicamentoso deve ser continuado para que a melhora da função erétil possa ser
mantida (CHRISTIANSEN et al., 2000).
Em um estudo com escalonamento de dose (25, 50 ou 100 mg) realizado em
homens com mais de 18 anos, a sildenafila apontou ser bem segura e ter efeitos benéficos sobre
todos os índices de função erétil e qualidade de vida (BENCHEKROUN et al., 2003). Já em
idosos a sildenafila demonstrou ser eficaz e bem tolerada mesmo entre aqueles com idade
superior a 70 anos. Entretanto, a taxa de melhoria na função erétil em homens mais jovens é
maior do que em homens mais velhos (FUJISAWA; SAWADA, 2004).
6
Ensaios clínicos variados em diferentes regiões geográficas indicam que a
sildenafila é um tratamento eficaz e bem tolerado para homens com disfunção erétil no Egito e
África do Sul (LEVINSON et al., 2003), na Colômbia, Equador e Venezuela (GÓMEZ et al.,
2002), na Argentina (BECHER et al., 2002), em Cingapura (LIM et al., 2002; TAN et al.,
2000), na Malásia e nas Filipinas (TAN et al., 2000) e em Taiwan (CHEN et al., 2001) .
Resultados semelhantes foram verificados em negros e hispânicos americanos (YOUNG et al.,
2002), brasileiros, mexicanos (GLINA et al., 2002) e coreanos (CHOI et al., 2003), indicando
não haver diferença no perfil de eficácia da sildenafila entre povos ocidentais e orientais. A
sildenafila também pode desencadear melhorias significativas na autoestima, na confiança, na
satisfação e no relacionamento de homens com disfunção erétil (ZONANA FARCA et al.,
2008). O grau de satisfação dos parceiros também foi avaliado, em estudos placebo-controlados
e confrontada com a avaliação dos pacientes e verificou-se que o grau de satisfação dos
parceiros e pacientes é superior àquele relatado com o uso do placebo (LEWIS et al., 2001;
MONTORSI et al., 1999).
Nos estudos desenvolvidos na presença de co-morbidades à disfunção erétil a
eficácia da sildenafila foi avaliada e, a seguir sua performance é apresentada de acordo com
a(s) doença(s) concomitante(s).
Doenças do Sistema Cardiovascular
Em um estudo com homens com disfunção erétil associado a fatores de risco
cardiovascular como diabetes, hipertensão arterial e/ou hiperlipidemia, tanto a sildenafila como
a vardenafila apresentaram-se eficazes e bem toleradas no tratamento da disfunção erétil
(RUBIO-AURIOLES et al., 2006) .
Um levantamento realizado na Espanha com pacientes hipertensos apontou que a
sildenafila possui uma excelente resposta e um perfil seguro no tratamento da disfunção erétil
(ARANDA, 2004).
A insuficiência cardíaca congestiva (ICC) é uma doença cardiovascular cada vez
mais comum e a disfunção erétil ocorre na maioria dos pacientes (75%) (KATZ et al., 2005).
A sildenafila é eficaz e bem tolerada no manejo da disfunção erétil em homens que têm ICC de
leve a moderada (AMIN et al., 2013). Também em pacientes com doença arterial coronária
estável, a sildenafila apresentou-se como um tratamento eficaz e bem tolerado para a disfunção
7
erétil. O uso do medicamento não foi associado a riscos adicionais de segurança nesta
população.
Entre os homens que tomam anti-hipertensivos para o controle da pressão arterial a
disfunção erétil costuma ser frequente e a sildenafila mostrou ser eficaz e segura no manejo
desse distúrbio sem causar alterações significativas nas medições da pressão arterial
(ALBUQUERQUE et al., 2005; PARK et al., 2008; PICKERING et al., 2004).
Diabetes Mellitus
O diabetes mellitus é um importante fator de risco para a disfunção erétil, pois,
geralmente, homens diabéticos desenvolvem prematuramente tal distúrbio (ESCOBARJIMÉNEZ, 2002; LEWIS et al., 2001).
Diversos autores têm evidenciado a eficácia da sildenafila no manejo da disfunção
erétil em estudos placebo-controlados, no entanto, SAFARINEJAD e MOHAMMAD (2004)
evidenciaram que a eficácia da sildenafila em pacientes diabéticos foi menor e os eventos
cardiovasculares foram maiores que aqueles previamente relatados em pacientes não diabéticos
(PRICE et al., 1998; RENDELL, 1999; SAFARINEJAD, MOHAMMAD R, 2004)
Em pacientes diabéticos exclusivamente do tipo 2, o tratamento com sildenafila
também demonstrou ser eficaz e seguro e os eventos adversos leves e transitórios (ESCOBARJIMÉNEZ, 2002).
Lesão da Medula Espinhal
A sildenafila é bem tolerada e de forma segura e eficaz melhora a função erétil em
pacientes com disfunção erétil atribuíveis à lesão traumática da medula espinhal, especialmente
naqueles com lesão incompleta (DERRY et al., 1998; ERGIN et al., 2008; GIULIANO et al.,
1999; MAYTOM et al., 1999), independentemente da causa e do tempo da lesão (SÁNCHEZ
RAMOS et al., 2001). A aceitação e satisfação dos pacientes com o uso da sildenafila é elevada
(SCHMID; SCHURCH; HAURI, 2000) além de apresentarem uma melhora significativa no
orgasmo e na ejaculação (CHICHARRO et al., 2008).
Em um estudo comparando o uso da sildenafila oral, à administração de injeção
intracavernosa e ao uso de dispositivos de constrição à vácuo, verificou-se que 90% dos
8
pacientes relataram melhora da ereção ao utilizar a sildenafila e este tratamento foi considerado
o mais eficaz e amplamente aceito pela população em estudo (MOEMEN et al., 2008).
Tanto a sildenafila quanto a vardenafila e a tadalafila são eficazes e bem toleradas
no tratamento da disfunção erétil em pacientes com lesão da medula espinhal. Cabe ressaltar
que o sucesso terapêutico é ausente se houver um distúrbio completo da transmissão dos
impulsos neurogênicos (SCHMID; SCHURCH; HAURI, 2000).
Apneia Obstrutiva do Sono
Uma das prováveis consequências da apneia obstrutiva do sono, uma desordem que
causa a cessação ou redução da respiração durante o sono, com consequente dessaturação de
oxigênio no sangue, é a disfunção erétil (PERIMENIS; KARKOULIAS; et al., 2007) e a
sildenafila tem sido eficiente no manejo dessa disfunção. No entanto, verificou-se que a
eficiência da sildenafila é aumentada quando a apneia é controlada com técnicas específicas,
tal como a aplicação de Pressão Positiva Contínua nas Vias Aéreas - CPAP. Ambos tratamentos
quando utilizados isoladamente têm impacto positivo sobre a doença, mas o uso de sildenafila
foi superior. Embora ambas modalidades sejam seguras e bem toleradas, cabe ressaltar que as
taxas de insatisfação com o manejo da disfunção erétil nesses casos variam de 33 a 50%,
indicando a necessidade de novos agentes terapêuticos ou de um manejo mais eficaz da doença
(PERIMENIS; KONSTANTINOPOULOS; et al., 2007).
Esclerose Múltipla
Pacientes com esclerose múltipla, uma doença autoimune que pode acometer
jovens e adultos de meia-idade, têm grande probabilidade de apresentarem disfunção erétil. A
alteração na função erétil pode ser decorrente da disfunção neurológica da doença de base, de
fatores psicológicos ou evento adverso dos medicamentos empregados no tratamento da doença
autoimune.
Um estudo placebo-controlado verificou que a sildenafila tem pouco efeito sobre a
disfunção erétil em pacientes com esclerose múltipla, e não deve ser recomendado como
tratamento de escolha para a disfunção erétil nestes pacientes (SAFARINEJAD,
MOHAMMAD REZA, 2009), contrastando com os resultados apresentados por Fowler et al.
(2005) que demonstraram que a sildenafila foi um tratamento eficaz e bem tolerado em homens
com esclerose múltipla e resultou em melhorias significativas na qualidade da ereção e na
qualidade de vida dos pacientes. Estudos adicionais são necessários para esclarecer a eficácia
9
do uso de sildenafila oral na disfunção erétil em pacientes com esclerose múltipla (FOWLER,
2005; SAFARINEJAD, M R; KOLAHI; GHAEDI, 2009).
Câncer de Próstata
A incidência de disfunção erétil em pacientes que realizaram cirurgia de remoção
radical da próstata ou que foram submetidos a radioterapia tridimensional em função da
presença de câncer de próstata é alta (EL-BAHNASAWY et al., 2008)(WEBER et al., 1999).
A sildenafila demonstrou ser um tratamento seguro e satisfatório para a disfunção
erétil em ambas situações, sendo que os pacientes com tumescência parcial póscistoprostatectomia foram os que tiveram melhor resposta. O efeito foi dose-dependente e os
eventos adversos aumentaram com o aumento da dose (EL-BAHNASAWY et al., 2008;
WEBER et al., 1999) .
Depressão
O uso de inibidores seletivos da recaptura de serotonina para o tratamento da
depressão, tal como a fluoxetina, pode desencadear disfunção erétil no paciente durante o
período de uso do medicamento. Diante de tal constatação, FAVA et al. (2006) avaliaram a
eficácia da sildenafila em tais pacientes e evidenciou-se uma melhora significativa na função
erétil e na satisfação sexual em homens com disfunção erétil associada ao uso de inibidores da
recaptura de serotonina.
Doença de Parkinson
Estimativas da prevalência de disfunção erétil em pacientes com Doença de
Parkinson indicam que a incapacidade de atingir ou manter a ereção é um problema que
acomete esses pacientes. O uso de sildenafila, via oral é eficaz e melhora significativamente a
função erétil e a qualidade da vida sexual desses pacientes (HUSSAIN, 2001; RAFFAELE,
2002). Num estudo desenvolvido por RAFFAELE (2002), em 25 de 33 pacientes com a Doença
de Parkinson, ou seja, 75% apresentaram uma clara melhoria nos sintomas depressivos em
decorrência do manejo da disfunção erétil.
Disfunção Renal
A disfunção erétil é comum em homens com insuficiência renal, mas nem sempre
é aliviado após o transplante de rim (MAHON et al., 2005).
10
A sildenafila provocou melhora significativa da função erétil em pacientes em
diálise peritoneal, com taxa de sucesso, pelo menos, tão elevada como a relatada em outros
grupos de pacientes (MAHON et al., 2005).
Não foi relatada interação entre os medicamentos imunossupressores e não houve
efeitos adversos significativos de sildenafila sobre a função do transplante (BARROU et al.,
2003)
A sildenafila pareceu ser um tratamento eficaz e seguro para a disfunção erétil em
pacientes com insuficiência renal crônica que realizam hemodiálise (SEIBEL, 2002).
Estresse Traumático Pós-Combate
O estresse traumático relacionado ao combate pode desencadear disfunção erétil de
origem psicogênica nos pacientes. Num estudo placebo controlado, com veteranos de guerra,
excluindo-se aqueles com co-morbidades e fumantes, verificou-se que a sildenafila não
demonstrou ser melhor que o placebo no tratamento do distúrbio erétil. Ensaios clínicos
randomizados adicionais são necessários para melhor elucidar o papel do fármaco no
tratamento dessa desordem (SAFARINEJAD, MOHAMMAD REZA, 2009).
1.3.2 Eventos Adversos decorrentes do uso de sildenafila
Os eventos adversos mais frequentemente relatados nos ensaios clínicos, em
homens, independente da etiologia da disfunção erétil são: cefaleia, rubor, dispepsia, tontura,
perturbação visual, alterações na visão de cores, insônia, mialgia, dor nas costas e dor
musculoesquelética pélvica, geralmente de natureza leve e transitórias (BECHER et al., 2002;
BOOLELL et al., 1996; CHEN et al., 2001; CHOI et al., 2003; CHRISTIANSEN et al., 2000;
FOWLER, 2005; GLINA et al., 2002; GOLDSTEIN et al., 1998; LEVINSON et al., 2003;
LIM et al., 2002; YOUNG et al., 2002). Em pacientes idosos os eventos adversos mais
comumente relatados foram rubor e dispepsia (FUJISAWA; SAWADA, 2004).
No quadro 1 é possível observar os eventos adversos mais comumente relatados
nos ensaios clínicos em homens com disfunção erétil na presença ou ausência de co-morbidades
ou mediante o uso de categorias de fármacos específicos.
11
Quadro 1: Eventos Adversos decorrentes do uso de sildenafila.
PACIENTES
Fazendo uso de antihipertensivos:
EVENTO ADVERSO
cefaleia, rubor, dispepsia, tontura, perturbação
visual, alterações na visão de cores, insônia,
mialgia, dor nas costas e dor musculoesquelética
pélvica;
rubor facial, cefaleia, dispepsia, taquicardia,
rinite, tonturas, dispneia e náuseas
Com Insuficiência
Cardíaca Congestiva
cefaleia transitória, rubor, infecção do trato
respiratório e astenia;
ALBUQUERQUE et al., 2005; DEBUSK, 2004; KATZ et al., 2005; PARK
et al., 2008;
Com doença arterial
coronária estável
Fazendo uso de inibidores
da recaptura de
serotonina
Com disfunção erétil
decorrente de lesão da
medula
Submetidos a
prostatectomia
cefaléia transitória, hipertensão, rubor e
dispepsia;
ALBUQUERQUE et al., 2005; DEBUSK, 2004; KATZ et al., 2005; PARK
et al., 2008;
cefaleia, dispepsia, ansiedade e visão anormal;
FAVA et al., 2006;
tontura;
SCHMID; SCHURCH; HAURI, 2000;
cefaleia transitória, rubor facial e dispepsia;
WEBER et al., 1999;
Com distúrbios renais
rubor e dispepsia;
BARROU et al., 2003; SEIBEL, 2002;
Diabéticos
em maior grau, rubor e dispepsia e em menor
grau, dispneia, rinite, congestão nasal, dores
musculares e efeitos cardiovasculares;
PRICE et al., 1998; RENDELL, 1999; SAFARINEJAD, MOHAMMAD R,
1998; SAFARINEJAD, MOHAMMAD REZA, 2009;
Homens com disfunção
erétil
FONTE
BECHER et al., 2002; BOOLELL et al., 1996; CHEN et al., 2001; CHOI et
al., 2003; CHRISTIANSEN et al., 2000; FOWLER, 2005; GLINA et al.,
2002; GOLDSTEIN et al., 1998; LEVINSON et al., 2003; LIM et al., 2002;
YOUNG et al., 2002;
ALBUQUERQUE et al., 2005; DEBUSK, 2004; KATZ et al., 2005; PARK
et al., 2008;
12
De uma maneira geral a sildenafila é um tratamento eficaz e bem controlado para a
disfunção erétil em pacientes tanto na ausência quanto na presença de co-morbidades e os
eventos adversos mais comumente relatados nos ensaios clínicos são cefaleia, rubor e dispepsia
(LEONI et al., 2013).
1.4 Disfunções endotelial e erétil, atividade física e
sildenafila
O endotélio é um órgão endócrino que desempenha um importante papel na
manutenção da homeostase vascular. Seu papel não se restringe a manutenção do tônus
vascular, mas também à regulação da inflamação, ativação plaquetária e trombose.
As
substâncias produzidas pelo endotélio podem ter ação vasodilatadora, tais como óxido nítrico
(NO), prostaciclina (PGI2), fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) e cininas, ou
ação vasoconstritora, como endotelina, prostaglandinas, angiotensina II e espécies reativas de
oxigênio (BEHRENDT; GANZ, 2002; FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2006; SUDANO et al.,
2006). Quando a função do endotélio é normal, há um equilíbrio entre a produção destas
substâncias com uma tendência à vasodilatação. Mas quando tais substâncias são liberadas em
desequilíbrio, desencadeiam a disfunção endotelial (FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 2006).
A hipertensão, o diabetes, a dislipidemia, o tabagismo e o excesso de peso são
situações que podem desencadear estresse oxidativo que pode promover disfunção endotelial.
A disfunção endotelial tem sido relacionada a alguns processos fisiopatológicos, tais como
infarto do miocárdio, doença vascular periférica, doença renal e disfunção erétil, ou seja, o
estresse oxidativo parece ser um denominador comum básico na disfunção endotelial nas
doenças cardiovasculares (GUAY, 2007).
A disfunção erétil (DE) é a incapacidade persistente de alcançar ou manter ereção
suficiente para uma performance sexual satisfatória (NIH CONSENSUS CONFERENCE,
1993). A DE é altamente prevalente e sua causa pode ser neurológica, endócrina, psicogênica,
farmacogênica ou vascular. A etiologia vascular é a mais comum. A incidência da DE aumenta
com o número de co-morbidades tais como hipertensão, diabetes, dislipidemia, tabagismo e
aterosclerose, tal como nas doenças cardiovasculares. Uma das primeiras manifestações de
13
dano endotelial em homens com fatores de risco vascular é a manifestação da DE, ou seja, a
DE pode ser a primeira manifestação clínica dessas co-morbidades (KENDIRCI et al., 2005).
Um estudo realizado em ratos evidenciou que a DE está relacionada ao aumento do
estresse oxidativo e à diminuição da biodisponibilidade de NO. O mesmo estudo também
revelou que o treinamento físico reverte o aumento do estresse oxidativo, melhorando a DE
(CLAUDINO et al., 2010).
A atividade física tem sido considerada um fator de proteção contra as doenças
cardiovasculares desde os anos de 1950 (MORRIS et al., 1953) e, como há uma estreita relação
entre doenças cardiovasculares, disfunção endotelial e disfunção erétil, é razoável inferir que
este efeito protetor se estendesse às outras condições.
1.4.1 Atividade Física e Saúde Cardiovascular
Diversos estudos epidemiológicos visando investigar a associação entre atividade
física e doenças cardiovasculares são realizados desde meados do século XX.
Ao longo das últimas décadas é possível verificar um aumento expressivo no
número de publicações científicas que buscam demonstrar existir correlação positiva entre
atividade física e saúde cardiovascular. A seguir são apresentadas, numa sequência cronológica,
algumas evidências científicas dessa correlação.
A primeira evidência da correlação que se tem registro foi realizada em 1953, em
trabalhadores londrinos. No referido estudo inglês verificou-se que homens fisicamente ativos
no trabalho tinham a metade das taxas de mortalidade por doenças coronarianas daquelas
apresentadas por homens sedentários (MORRIS et al., 1953).
Já nos anos de 1960, nos Estados Unidos, um estudo demonstrou que os homens
que morriam de doenças cardíacas eram 40 a 50% menos ativos que aqueles homens que
permaneciam vivos (PAFFENBARGER et al., 1966). Ainda com a população masculina em
geral, um estudo buscou correlacionar o nível de atividade física realizada no período de lazer
ao risco de doença coronariana e morte. Os resultados indicaram existir uma modesta relação
inversa entre nível de atividade física realizada no período de lazer e risco de doença
coronariana e mortalidade global em homens de meia-idade (LEON et al., 1987).
Como os estudos anteriores envolviam populações masculinas mistas, com variados
fatores de risco para doenças cardiovasculares e, na sua grande maioria, de meia-idade, em
14
1999, um estudo realizado com homens jovens e saudáveis buscou minimizar os efeitos da
idade e dos fatores de risco para avaliar a influência da prática de atividade física na saúde
cardiovascular. O estudo revelou que a prática regular de atividade física pode contribuir
beneficamente na prevenção de doenças cardiovasculares em homens jovens e saudáveis, pois
o exercício melhorou a função vascular, por meio da melhora da vasodilatação endotéliodependente (CLARKSON et al., 1999). À mesma conclusão chegou um estudo realizado em
homens normotensos, pois HIGASHI et al. (1999) observaram que a prática de atividade física
durante um período de doze semanas melhorou a vasodilatação endotélio dependente por meio
do aumento da liberação de óxido nítrico em pacientes normotensos (HIGASHI et al., 1999).
São inúmeras as evidências sugerindo que o exercício físico regular não somente
melhora a capacidade funcional, expressa pelo aumento do VO2 max, como também reduz a
morbidade e, possivelmente, a mortalidade, justificando assim a sua indicação
(BELARDINELLI et al., 1999).
Em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva, a prática de atividade física
corrigiu a disfunção endotelial existente e melhorou a capacidade frente a exercícios, pois o
exercício melhorou a formação de óxido nítrico endotelial e a vasodilatação endotéliodependente na musculatura esquelética dos pacientes (HAMBRECHT et al., 1998). A
suplementação com L-arginina em pacientes com ICC, quando somada à pratica de atividade
física pareceu ter efeito aditivo sobre o endotélio, pois houve melhora na vasodilatação
endotélio-dependente dos pacientes que sofreram as duas intervenções (HAMBRECHT et al.,
2000).
A participação de pacientes com síndrome metabólica, durante três meses, em um
programa de atividade física, resultou em uma melhora na dilatação fluxo-mediada resultando
em aumento na capacidade máxima de realização de exercícios dos pacientes (LAVRENCIC;
SALOBIR; KEBER, 2000).
A combinação de exercício resistido e exercício aeróbico colaborou para a melhora
dos índices glicêmicos e melhora da função endotelial de pacientes com diabetes tipo 2,
indicando que a prática de atividade física pode ser um componente importante no manejo da
doença em pacientes que possam realizar exercícios (MAIORANA et al., 2001).
Com o objetivo de verificar a influência do exercício aeróbico moderado sobre a
função endotelial de pacientes pós-infarto do miocárdio, um estudo revelou que a prática de
15
atividade física colaborou para o aumento da vasodilatação endotélio-dependente nos pacientes
recém-infartados, além de aumentar a tolerância ao exercício; observou-se também que com o
destreinamento, os benefícios surgidos desaparecem (VONA et al., 2004).
Ainda, buscando verificar a influência da prática de atividade física sobre
enfermidades ou situações clínicas específicas, foram conduzidos diversos estudos envolvendo
pacientes com hipertensão (HIGASHI et al., 1999), insuficiência cardíaca congestiva (ICC)
(HAMBRECHT et al., 1998)(HAMBRECHT et al., 2000), síndrome metabólica (SM)
(LAVRENCIC; SALOBIR; KEBER, 2000), diabetes (MAIORANA et al., 2001), infarto do
miocárdio (VONA et al., 2004) e doença coronariana (STEINER et al., 2005).
Em um estudo realizado em pacientes com doença coronariana e com múltiplos
fatores de risco cardiovascular, verificou-se que a prática regular de atividade física aumenta o
número de células progenitoras endoteliais circulantes além de melhorar a função vascular e a
síntese de NO (STEINER et al., 2005).
Em 2008, em um estudo transversal envolvendo voluntários saudáveis, foi
observado o número de células progenitoras endoteliais, quando os mesmos foram submetidos
a três níveis distintos de intensidade de corrida: intensivo (30 minutos a 100% da velocidade
do limiar anaeróbico individual- correspondente a 82% do Volume de Oxigênio Máximo VO2 max), moderado
(30 minutos a 80% da velocidade do limiar anaeróbico individual-
correspondente a 68% do VO2 max) e moderado com curto tempo de corrida (10 minutos a
80% da velocidade do limiar anaeróbico individual- correspondente a 68% do VO2 max).
LAUFS et al. (2005) verificaram que nos níveis intensivo e moderado com 30 minutos ocorreu
um aumento no número de células progenitoras endoteliais circulantes, o que representa um
importante benefício da atividade física; a quantificação das células progenitoras endoteliais
circulantes mostrou ser um importante parâmetro na avaliação dos efeitos vasculares do
exercício Outro estudo similar concluiu que o aumento no número de células progenitoras
endoteliais parece ser maior nos indivíduos com um perfil lipídico menos favorável (VAN
CRAENENBROECK et al., 2008).
De uma maneira geral é possível constatar que a disfunção endotelial pode ser
revertida por meio de medidas terapêuticas que sabidamente são capazes de reduzir a evolução
dessa doença, tais como exercício físico, melhora da hiperglicemia no diabetes melittus,
cessação do fumo, entre outras. Nesse sentido, pode-se afirmar que a prática regular de
atividade física melhora consistentemente a biodisponibilidade de NO e aumenta o número de
16
células progenitoras endoteliais (ADAMS et al., 2008; MÖBIUS-WINKLER et al., 2009;
NAVASIOLAVA et al., 2010; STEINER et al., 2005) e também diminuem o nível dos
marcadores inflamatórios - citocinas pró-inflamatórias e proteína C reativa (RIBEIRO,
FERNANDO et al., 2010).
Diante das constatações científicas, ao longo das últimas décadas foram surgindo
recomendações que estimulassem a prática de atividade física. Em 1996, o National Institutes
of Health Consensus Development Panel on Physical Activity and cardiovascular Health
recomendou que todos americanos deveriam engajar-se em atividades físicas regulares (NIH
CONSENSUS CONFERENCE, 1996). Em 2002 o American Hearth Association recomendou,
para a prevenção primária de doenças cardiovasculares, a realização de 30 minutos ou mais de
atividade física moderada na maioria dos dias da semana (PEARSON et al., 2002), pois a
atividade física é reconhecida por ser crucial na prevenção de doenças cardiovasculares e, por
isso, deve ser considerada como fator protetor contra tais doenças (LEON et al., 1987; SISSON
et al., 2009).
1.4.2 Atividade Física e Disfunção Erétil
A prática de atividade física, em diferentes estudos experimentais e clínicos, tem
proporcionado uma melhora significativa na função erétil (AGOSTINI et al., 2011; BACON et
al., 2006; CHENG et al., 2007; DERBY et al., 2000; ESPOSITO et al., 2004, 2009;
GIUGLIANO et al., 2010; HSIAO et al., 2012; JANISZEWSKI; JANSSEN; ROSS, 2009;
KRATZIK et al., 2009; LA VIGNERA et al., 2011; MAIO; SARAEB; MARCHIORI, 2010;
POHJANTÄHTI-MAAROOS; PALOMÄKI; HARTIKAINEN, 2011).
Dados do Massachusetts Male Aging Study, incluindo uma amostra de 1.156
homens entre 40-70 anos acompanhados por 8,8 anos, mostrou que o menor risco para DE foi
entre homens fisicamente ativos quando comparados a homens sedentários (<200 Kcal/dia de
atividade física) (DERBY et al., 2000).
No Health Professionals Folow-up Study, um estudo de corte com 22.086 homens,
a atividade física foi associada com o baixo risco de DE. O risco relativo multivariado foi de
0,7 para >32,6 equivalentes metabólicos de exercícios por semana. Interessantemente, todos
tipos de exercícios incluídos no protocolo demonstraram significantes benefícios (BACON et
al., 2006).
17
Um estudo desenvolvido em Hong Kong demonstrou que a idade, o nível de
atividade física e o grau de angústia psicológica foram independentemente associados à DE. A
relação entre IMC e DE foi somente observada em homens inativos fisicamente (< 1 vez por
semana), enquanto em homens fisicamente ativos (≥ 1000 Kcal/semana) o risco de DE reduziu
somente nos homens obesos (CHENG et al., 2007).
Uma orientação detalhada sobre como perder 10% ou mais do peso corporal pela
redução da ingestão calórica e aumento nos níveis de atividade física em homens obesos na
Itália, após dois anos da intervenção inicial, resultou em aumento do nível de atividade física,
redução do IMC (índice de massa corpórea) e aumento na função erétil avaliada por meio do
preenchimento de um questionário padronizado com geração de um índice denominado Índice
Internacional de Função Erétil (IIEF). ESPOSITO et al. (2004) verificaram que o IMC teve
maior influência na DE em pacientes com baixo nível de atividade física. Em contrapartida o
nível de atividade física exerceu maior influência quando o IMC era mais alto Num estudo
muito semelhante envolvendo o fornecimento de orientações detalhadas frente a orientações
gerais, os pesquisadores concluíram também que é possível atingir uma melhora na função
erétil sem o uso de intervenção farmacológica, desde que haja uma perda de peso e aumento na
atividade física (ESPOSITO et al., 2009).
Num estudo que dividiu os sujeitos de pesquisa em ativos (≥150 min/semana),
moderadamente ativos (30-149 min/semana) e inativos (<30 min/semana), observou-se que
homens inativos ou moderadamente ativos tiveram uma probabilidade de 40-60% maior de DE
do que os homens ativos. (JANISZEWSKI; JANSSEN; ROSS, 2009) concluíram que homens
com circunferência da cintura maior e baixo nível de atividade física (inativos e moderadamente
ativos) foram associados a maior probabilidade de apresentar DE, no entanto, quanto ao IMC,
não houve uma correlação significativa. Concluiu-se que a manutenção da circunferência da
cintura abaixo de 102 cm e a realização de atividade física de intensidade moderada (≥150
min/semana) são condições que estão associadas a uma adequada função erétil,
independentemente do IMC.
KRATZIK et al., (2009) em um estudo transversal com 674 homens, idade entre
45-60 anos, nos seus locais de trabalho, apresentaram correlação positiva entre o Índice
Internacional de Função Erétil e a atividade física de 1.000 a 4.000 Kcal/semana. O risco de
DE severa foi diminuído para 82,9% com um mínimo de 3.000 Kcal/semana de gasto de
18
energia. Foi possível concluir que um aumento do nível de atividade física semanal de 1.000
para 4.000 Kcal pode reduzir o risco de DE.
Em homens diabéticos entre 35-70 anos verificou-se também que a prática de
atividade física é um fator protetor da função erétil (GIUGLIANO et al., 2010).
Pacientes de meia-idade (48-62 anos) com DE, de origem vascular, foram
submetidos a um protocolo de atividade aeróbica de moderada a intensa (150 minutos/semana)
e, após 3 meses, verificou-se que a atividade física melhora a qualidade da função erétil,
provavelmente por reduzir a apoptose endotelial (LA VIGNERA et al., 2011).
Com o intuito de verificar se o aparecimento de marcadores subclínicos da
aterosclerose estão associados à DE, pacientes com síndrome metabólica e indivíduos saudáveis
tiveram seus dados confrontados e verificou-se existir a associação que se mostrou mais
evidente nos indivíduos com síndrome metabólica e DE, ou seja, pacientes com síndrome
metabólica e disfunção erétil devem ser considerados de alto risco para eventos
cardiovasculares futuros e, mais uma vez, evidenciou-se que a atividade física parece ter um
efeito
protetor
da
função
erétil
(POHJANTÄHTI-MAAROOS;
PALOMÄKI;
HARTIKAINEN, 2011).
Reforçando o efeito de que hábitos saudáveis têm um efeito direto sobre a função
erétil, um estudo buscou associar a atividade física e o nível de aptidão física com a DE em
homens entre 40 e 75 anos. Os resultados evidenciaram que homens mais jovens com maior
nível de atividade física e melhor condicionamento são menos propensos à DE (AGOSTINI et
al., 2011).
Os estudos experimentais para avaliar a influência da atividade física na função
sexual, até então, eram realizados em adultos, na maioria das vezes já apresentando certo grau
de DE, ou seja, ainda era desconhecida a influência do exercício em jovens saudáveis. HSIAO
et al. (2012) concluíram que o aumento na atividade física está associado a uma melhor função
sexual em jovens saudáveis (idade inferior a 40 anos); assim, não só indivíduos idosos ou na
meia-idade têm uma melhora na função erétil.
19
1.4.3 Atividade Física e Sildenafila
Desde 2004, a sildenafila tem sido alvo de pesquisas que avaliam a influência do
fármaco na capacidade de realizar exercícios, tanto em nível do mar, quanto em grandes
altitudes, (GHOFRANI et al., 2004)(RICHALET et al., 2005)(HSU et al., 2006).
Em 2004, GHOFRANI et al., desenvolveram um estudo placebo-controlado que
avaliou a influência da sildenafila na capacidade de 14 alpinistas jovens saudáveis realizarem
exercícios físicos, em cicloergômetro, sob condições de hipóxia tanto ao nível do mar quanto
em grandes altitudes (5245m). A dose utilizada de sildenafila foi de 50 mg. Os resultados
apontaram um aumento na capacidade de realização de exercício em hipóxia nos indivíduos
que fizeram uso da sildenafila tanto ao nível do mar quanto em grande altitude (GHOFRANI
et al., 2004).
Em 2005, RICHALET et al., também num estudo placebo-controlado, avaliaram
em 12 homens moderadamente treinados a influência do uso da sildenafila em situação de
altitude (4350 m) na capacidade de realização de exercícios em cicloergômetro. A sildenafila
foi utilizada durante seis dias, em três doses diárias de 40 mg. Os resultados apontaram que a
sildenafila, devido ao seu efeito vasodilatador sobre a circulação pulmonar: suprimiu a
hipertensão pulmonar induzida pela altitude; melhorou a hemodinâmica pulmonar e troca
gasosa, limitando a hipoxemia induzida pela altitude e favoreceu a adaptação cardiovascular ao
exercício; não alterou o processo fisiológico de aclimatação (RICHALET et al., 2005).
Em 2006, HSU et al., em um outro estudo placebo-controlado, compararam a
influência da sildenafila na capacidade de 10 homens treinados (ciclistas e triatletas) realizarem
exercícios em cicloergômetro em situação de hipóxia (simulação de 3874 m) e de normóxia
(nível do mar). A sildenafila foi empregada durante três dias em doses de 50 ou 100mg. Os
resultados apontaram que a sildenafila melhorou o débito cardíaco, a saturação arterial de
oxigênio e o desempenho durante o exercício em situação de normóxia, mas não apresentou
efeitos significativos sobre o desempenho no exercício em normóxia, embora tenha ocorrido
uma tendência de aumento na frequência cardíaca e diminuição da pressão arterial sistólica
durante o exercício (HSU et al., 2006).
Os experimentos citados nos parágrafos anteriores foram realizados em homens
saudáveis, treinados ou moderadamente treinados e envolveram a administração aguda de
sildenafila de, no máximo, três dias de administração do fármaco, não refletindo a influência
da substância em indivíduos sedentários ou por um período prolongado de tempo, ou seja, na
20
literatura disponível há uma lacuna acerca da influência, aguda ou prolongada, da sildenafila
sobre a performance física em indivíduos sedentários ou treinados.
Nos últimos anos, no Laboratório do Movimento Humano da Universidade São
Judas Tadeu, vinculado ao Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Educação Física vem
sendo desenvolvidos protocolos para avaliação física em modelos experimentais envolvendo
ratos Wistar. Sendo assim, decidiu-se aplicar os protocolos desenvolvidos para aprofundar os
estudos da influência do uso prolongado da sildenafila sobre o comportamento e desempenho
físico de ratos treinados e em ratos sedentários.
21
JUSTIFICATIVA
São justificativas para a realização deste estudo:
A necessidade do entendimento da influência da administração oral prolongada de
sildenafila na capacidade física de ratos treinados e da administração oral aguda sobre o
comportamento motor de ratos Wistar machos.
Para tal, se fez necessário desenvolver um método analítico fácil, rápido e de baixo
custo para a identificação e quantificação de sildenafila em plasma de ratos por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência. O método desenvolvido foi validado utilizando os parâmetros da
legislação específica e aplicado na estimativa dos parâmetros farmacocinéticos da sildenafila
em ratos Wistar machos.
Uma vez conhecida a farmacocinética da sildenafila nos animais foi possível
investigar os efeitos do fármaco sobre o comportamento motor dos animais. Os parâmetros
farmacocinéticos também foram importantes para determinar a concentração máxima do
fármaco no sangue dos animais e determinar o melhor momento para realizar os testes de
esforço físico nos animais treinados e sedentários e verificar a influência do fármaco sobre o
sistema cardiovascular e sobre a modulação autonômica dos ratos treinados e sedentários.
A fim de facilitar a compreensão e organizar a apresentação dos resultados o
presente estudo foi dividido em quatro capítulos, nos quais são distribuídas as diferentes
atividades de investigação propostas, a seguir apresentadas:
Capítulo I: Desenvolvimento e Validação de Método Analítico para determinação
de sildenafila em plasma de ratos.
Capítulo II: Estudo Farmacocinético da sildenafila em ratos.
Capítulo III: Influência da sildenafila no comportamento de ratos avaliados no
campo aberto e no labirinto em cruz elevado.
Capítulo IV: Influência da sildenafila sobre o desempenho físico de ratos.
22
OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Verificação da influência do uso prolongado de sildenafila no comportamento
motor de ratos e no desempenho físico de ratos treinados e sedentários, bem como desenvolver
e validar um método analítico para conhecer a farmacocinética do fármaco em ratos.
3.1 Objetivos Específicos
A fim de facilitar a compreensão e organizar a apresentação dos resultados o
presente estudo foi dividido em quatro capítulos com seus objetivos específicos:
Capítulo I - Desenvolvimento e Validação de Método Analítico para
determinação de sildenafila em plasma de ratos:
a) Desenvolver um método analítico para a identificação e quantificação de
sildenafila em plasma de ratos por cromatografia líquida de alta eficiência empregando
detecção por UV- ultravioleta;
b) Validar o método analítico desenvolvido de acordo com a legislação em vigor;
c) Aplicar o método em amostras reais.
Capítulo II - Estudo Farmacocinético da sildenafila em ratos:
a) Conhecer os parâmetros farmacocinéticos da sildenafila em ratos machos
utilizando dose única de sildenafila.
Capítulo III - Influência da sildenafila no comportamento de ratos avaliados
no campo aberto e no labirinto em cruz elevado:
a) Investigar os efeitos da administração de dose única de sildenafila sobre a
atividade geral de ratos observados em campo aberto;
b) Investigar os efeitos da sildenafila sobre o comportamento de ratos sedentários
e treinados observados no labirinto em cruz elevado após a administração de
sildenafila por 60 dias;
23
Capítulo IV- Influência da sildenafila sobre o desempenho físico de ratos:
a) Verificar a influência da administração oral prolongada, por 60 dias, de
sildenafila, em conjunto com o treinamento físico aeróbico, sobre o ganho de
peso de ratos;
b) Verificar a influência da administração oral prolongada, por 60 dias, de
sildenafila, em conjunto com o treinamento físico aeróbico, sobre a capacidade
física de ratos;
c) Verificar a influência da administração oral prolongada, por 60 dias, de
sildenafila, em conjunto com o treinamento físico aeróbico, sobre parâmetros
hemodinâmicos e autonômicos de ratos;
24
Capítulo I: Desenvolvimento e Validação de Método
Analítico para determinação de sildenafila em plasma de
ratos
Foi desenvolvido e validado um método analítico para identificação e quantificação
de sildenafila em plasma de ratos empregando cromatografia líquida de alta eficiência.
Empregou-se a Resolução da Diretoria Colegiada da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância
Sanitária) de número 27, de 17 de maio de 2012, para validação do método (BRASIL, 2012).
4.1 Objetivos Específicos
a) Desenvolver um método analítico para a identificação e quantificação de
sildenafila em plasma de ratos por cromatografia líquida de alta eficiência;
b) Validar o método analítico desenvolvido de acordo com a legislação em vigor;
c) Aplicar o método em amostras reais.
4.2 Revisão da Literatura
4.2.1 Método Analítico para Análise de sildenafila
Diferentes métodos analíticos têm sido empregados na identificação e quantificação
de sildenafila. A maioria dos métodos desenvolvidos emprega a Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) ou a Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE). Em menor
frequência, alguns métodos desenvolvidos empregam a Cromatografia Gasosa e a
Cromatografia de Camada Delgada associadas à espectrometria de massa na análise de
sildenafila (AL-GHAZAWI; TUTUNJI; ABURUZ, 2007; LIEW et al., 2015; ORIYASU et al.,
2001; SAISHO et al., 2001; SIMIELE et al., 2015; STRACH et al., 2015; WITJES et al., 2009)
Alguns métodos objetivam a determinação simultânea de diferentes inibidores da
PDE-5, tais como a tadalafila e a vardenafila, enquanto outros se destinaram à análise isolada
de somente um deles. Alguns métodos incluem a determinação simultânea da sildenafila e seu
principal metabólito, o N-desmetil sildenafila (AL-GHAZAWI; TUTUNJI; ABURUZ, 2007;
BARTOŠOVÁ; JIROVSKÝ; HORNA, 2011; EL-BAGARY et al., 2014; KIM et al., 2003;
LIEW et al., 2015; MARCELÍN-JIMÉNEZ et al., 2012; QUINTERO et al., 2010; RUST et al.,
25
2012; SIMIELE et al., 2015; TANG et al., 2005; TRIPATHI, A. et al., 2013; WITJES et al.,
2009; YOKOYAMA et al., 2014).
Os métodos analíticos existentes foram desenvolvidos para a análise da sildenafila
em diferentes matrizes, quer seja em formulações farmacêuticas ou amostras biológicas. Dentre
as amostras biológicas utilizadas destacam-se o plasma, a urina e o cabelo (LIEW et al., 2015;
SAISHO et al., 2001; UNCETA et al., 2012)
No quadro 2 são apresentados os principais métodos utilizados na análise de
sildenafila e de outros inibidores da PDE-5 e metabólitos em amostras.
Quadro 2: Principais métodos empregados na análise de sildenafila (SIL), seu metabólito e de
outros inibidores da 5-PDE em plasma.
Analito
Analisado
SIL
NDMSIL
SIL
NDMSIL
SIL
SIL
Nicorandil
Arginina
SIL
NDMSIL
Plasma
Método
Extração
Padrão Interno
Autor
Humano
CLUE
dietil éter
Loperamida
Humano
CLUE
acetonitrila
Quinoxalina
De rato
CLAE
acetato de
etila:hexano
(30:70 v:v)
ácido trifluor
acético
(LIEW et al.,
2015)
(SIMIELE et al.,
2015)
(STRACH et al.,
2015)
Humano
CLUE
Humano
CLAE
SIL
De rato
Glimepirida
CLAE
Paroxetina
Pregapalina
(EL-BAGARY
et al., 2014)
2% de ácido
fórmico e
metanol
30 µL de
acetonitrila e 5
mL de dietil
éter
Etil éter
Sildenafila
deuterado
(YOKOYAMA
et al., 2014)
Não usou
(TRIPATHI
al., 2013)
Tadalafil
(MARCELÍNJIMÉNEZ et al.,
2012)
(RUST et al.,
2012)
SIL
Humano
CLUE
SIL
VARD
TADA
metabólitos
SIL
VARD
NDMSIL
NDEVAR
Humano
CLAE
Dietil éter: etil
acetato (1:1)
Trimipramina
deuterada
Humano
CLAE
t-butil metil
éter
Floretin
et
(BARTOŠOVÁ;
JIROVSKÝ;
HORNA, 2011)
(continua)
26
(continuação)
Analito
Analisado
SIL
NDMSIL
Plasma
Método
Extração
Humano
CLUE
SIL
Humano
CLAE
SIL
NDMSIL
Humano
CLAE
Acetato de
etila em meio
básico
200 µL de
bicarbonato de
sódio e 5 mL
de dietil éter:
diclorometano
(1:1)
Tert-butil metil
éter
SIL
De rato
CLAE
Padrão
Interno
Sildenafila
deuterado
Autor
(WITJES et al.,
2009)
Diazepam
(QUINTERO et
al., 2010)
Roxitromicina
(ALGHAZAWI;
TUTUNJI;
ABURUZ,
2007)
(TANG et al.,
2005)
Acetato de
Paroxetina
Etila : hexano
(30:70)
SIL
Humano
CLAE
Diclorometano
Udenafil
(KIM et al.,
NDMSIL
em meio
2003)
básico
CLUE: Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência; CLAE: Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência; NDMSIL: n-desmetil sildenafila; VARD: Vardenafila; TADA:Tadalafila;
NDEVAR: n-desetil vardenafila
Os métodos desenvolvidos envolveram o uso de diferentes solventes na etapa de
extração e limpeza das amostras biológicas, destacando-se o acetonitrila, o dietil éter, o etil éter,
o diclorometano, o t-butil-metil éter, entre outros.
4.2.2 Quantificação da sildenafila
A quantificação de um dado analito por cromatografia pode ser feita por
superposição de matriz,
adição de padrão, padronização externa e padronização interna
(RIBANI et al., 2004).
A superposição de matriz é utilizada quando há a possibilidade de obter uma matriz
isenta do analito, alvo da pesquisa; para tanto, é realizada a adição do padrão do analito em
diversas concentrações. Como segundo passo é realizada a construção da curva de calibração,
estabelecendo uma correlação entre as áreas obtidas após os procedimentos adotados, com as
concentrações dos padrões que foram adicionados (CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2003).
27
Tanto a padronização interna quanto a externa podem ser utilizadas junto à
superposição de matriz. Essas são formas eficientes que tem a finalidade de avaliar o efeito que
a composição da matriz, eventualmente poderia gerar no método analítico. Para avaliar a
superposição de matriz é recomendando medir parâmetros como a recuperação de extração e a
seletividade ou a detecção da substância de interesse, as quais fornecem melhor
correspondência em relação à composição da amostra, uma vez que se mimetiza uma situação
real de análise da mesma (CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2003).
Outro desafio para o analista durante o processo de validação ocorre quando é
impossível obter matriz isenta do analito de interesse; nessa situação é possível optar pela
adição de padrão em concentrações conhecidas do analito de interesse em quantidades
conhecidas na matriz antes do seu preparo. Estas são utilizadas para a obtenção da resposta do
método, por meio da construção de uma curva de calibração relacionando as quantidades da
substância adicionada à amostra com as respectivas áreas obtidas (CUADROS-RODRÍGUEZ
et al., 2003).
A padronização externa consiste em comparar a área do analito com as áreas
obtidas, com soluções de concentrações conhecidas, preparadas a partir de um padrão. A partir
de uma equação gerada na curva de calibração, calcula-se a concentração do analito em questão.
Tal método é sensível aos erros de preparo e de injeção, tanto da amostra como dos padrões
(RIBANI et al., 2004).
A padronização interna consiste em preparar soluções padrão de concentrações
conhecidas do analito às quais se adiciona uma mesma quantidade de um composto denominado
padrão interno. A razão entre as áreas obtidas do analito e do padrão interno é utilizada como
sinal analítico. Na escolha do padrão interno, é importante selecionar uma substância similar
ao analito, sendo que a mesma não deve interagir com os elementos da matriz e não poderá ser
um elemento comumente encontrado na matriz em questão. No processo cromatográfico é
importante que o tempo de retenção do padrão interno seja distinto do tempo de retenção do
analito e que não aumente o tempo da corrida cromatográfica (RIBANI et al., 2004).
O propilparabeno (figura 4), um éster do ácido p-hidroxibenzóico empregado como
conservante em alimentos e formulações farmacêuticas ou cosméticas, tem sido utilizado como
padrão interno em CLAE em metodologias para a análise de fármacos em diversas matrizes.
Assim, o uso do propilparabeno tem sido feito para a análise de metil-prometazina, um antihistamínico e anticolinérgico, em preparações farmacêuticas (SMET et al., 2000) de
28
ofloxacina, cloridrato de tetra-hidrozolina e acetado de prednisolona em suspensões oftálmicas
(ALI; GHORI; SAEED, 2002) e de terbinafina em formulações farmacêuticas (MATYSOVÁ
et al., 2006).
Na análise de amostras biológicas, o emprego do propilparabeno foi relatado para
análise de indapamida, um diurético com finalidade anti-hipertensiva, em sangue (TANG et al.,
2005), de carbamazepina, um anticonvulsivante, em plasma de coelho (MOWAFY;
ALANAZI; EL MAGHRABY, 2012) e de paclitaxel, um antineoplásico, em plasma (KUMAR;
SRINATH; SAHA, 2012).
CH3
O
HO
O
Figura 4: Estrutura química do propilparabeno (CAS Number 94-13-3)
4.2.2.1 Validação
A validação, segundo a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) número 27, de 17 de maio de 2012, é a
confirmação por ensaio e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos
para um determinado uso pretendido são atendidos. Uma validação parcial compreende a
realização de parte dos ensaios da validação total em decorrência de modificação no método
bioanalítico validado. A validação total envolve a realização de todos os ensaios de validação
de um método bioanalíticos (BRASIL, 2012).
A busca incessante pela qualidade nas análises químicas por meio de
comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade determina a necessidade de se averiguar se a
performance do método analítico é adequada para as condições nas quais será aplicado. Tal
verificação tida como validação prescinde de parâmetros conhecidos como figuras de mérito
(RIBEIRO, FABIANA ALVES DE LIMA et al., 2008; VALDERRAMA; BRAGA; POPPI,
2009).
29
Os ensaios de validação compreendem as seguintes figuras de mérito: linearidade,
precisão, exatidão, seletividade, efeito matriz, limite de detecção, limite de quantificação,
homogeneidade, estabilidade, robustez e incerteza de medição.
Os principais órgãos reguladores internacionais de métodos analíticos são a United
States Pharmacopeia (USP), a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC),
a American Society for Testing and Materials (ASTM)(RIBEIRO, FABIANA ALVES DE
LIMA et al., 2008; VALDERRAMA; BRAGA; POPPI, 2009). No Brasil, o Instituto Nacional
de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO) e a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) desempenham esse papel.
Para a validação de métodos bioanalíticos, a ANVISA publicou em 2003 a
Resolução n° 899 que continha o Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos.
Nessa publicação as figuras de mérito a serem avaliadas foram as seguintes: especificidade e
seletividade, linearidade, precisão, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e
robustez (ANVISA, 2003). Posteriormente, em 2012, foi publicada a Resolução da Diretoria
Colegiada n° 27 pela ANVISA que substituiu a anterior. A publicação definiu como
obrigatórias as seguintes figuras de mérito: linearidade, precisão, exatidão, seletividade, efeito
matriz, homogeneidade e estabilidade. Essa resolução substitui a Resolução 899, em relação
aos ensaios bioanalíticos (BRASIL, 2012). No presente estudo optou-se pela adoção dessa
normativa para a validação do método para quantificação da sildenafila em plasma de ratos.
30
4.3 Material e Métodos
4.3.1 Animais
Para a realização dos estudos foram utilizados ratos Wistar (Rattus norgevicus, var.
albinus) machos, saudáveis, provenientes do Biotério da Universidade São Judas Tadeu.
O manejo dos animais obedeceu às normas estabelecidas e os princípios éticos da
experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e esteve
de acordo como o ARRIVE guidelines for reporting animal research (KILKENNY et al., 2010).
Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno (43 x 23 x 16
cm), forradas com maravalha, contendo, no máximo, 4 animais em cada uma, em ambiente com
temperatura controlada de 22 – 24º C, sob ciclo claro/escuro de 12 horas (luz acesa às 6 h) e
com livre acesso à água e alimento normoproteico.
Os protocolos experimentais realizados neste trabalho foram aprovados pela
Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade São Judas Tadeu – CEUA/USJT em
três projetos: Projeto 003/2013 – Influência do uso agudo e crônico de um inibidor da enzima
fosfodiesterase-5 sobre o desempenho físico de ratos treinados, aprovado em 15 de maio de
2013; Projeto 010/2013 – Influência do uso agudo de um inibidor da fosfodiesterase-5 sobre o
comportamento motor de ratos, aprovado em 09 de outubro de 2013; Projeto 012/2014 –
Avaliação da Biodisponibilidade e Verificação da Velocidade de Absorção de um inibidor da
enzima fosfodiesterase-5 administrado por via oral a ratos Wistar machos, aprovado em 13 de
maio de 2014.
4.3.2 Fármacos e Reagentes
A sildenafila empregada no desenvolvimento e validação do método analítico foi o
citrato de sildenafila (Sigma-Aldrich). Como padrão interno foi empregado o propilparabeno
(Pharma Special). No procedimento de extração foi utilizado bicarbonato de sódio (Vetec) e
acetonitrila grau cromatográfico (CRQ).
4.3.3 Delineamento Experimental
Para o desenvolvimento do método analítico foram empregados 6 ratos, sendo cinco
animais em jejum de 6 horas e um animal alimentado (amostra lipêmica). Dos animais em
31
jejum, um deles teve o plasma hemolisado mediante o uso de uma fração de água destilada
(amostra hemolisada).
Para o procedimento da aplicação do método em amostras reais foram empregados
seis ratos que receberam uma dose fixa de sildenafila de 1,5 mg/Kg. Os animais foram
eutanasiados por decapitação nos seguintes tempos: 0, 10, 20, 30, 60 e 120 min após a
administração da sildenafila. As amostras de sangue foram coletadas em tubos previamente
preparados com heparina sódica e as respectivas amostras foram analisadas quanto ao teor de
sildenafila.
Administração da sildenafila aos animais:
A administração aos animais foi realizada por meio de um tubo orogástrico – um
tubo de aço inox curvo específico para gavagem em ratos - composta por uma cânula com
diâmetro de 1,2 mm que apresenta uma esfera de 2,25 mm na ponta. O comprimento total do
dispositivo é de 38 mm. A dose utilizada foi de 1,5 mg/Kg e o veículo utilizado foi o óleo de
milho.
A referida dose foi escolhida tendo como base o uso da sildenafila em humanos. A
dose de 1,5 mg/Kg corresponde ao uso de comprimidos de 100 mg de sildenafila para um
homem de 70 Kg.
4.3.3.1 Equipamentos e Condições Cromatográficas
Para análise cromatográfica foi utilizado o seguinte sistema: Cromatógrafo Líquido
(CLAE) da marca Shimadzu, modelo LC10 AD VP acoplado a um detector UV-Visível
(Shimadzu) modelo SPD-10A VP, no comprimento de onda de 292 nm; coluna cromatográfica
C18 Kromasil 100 nas dimensões de 250 x 4,6 mm e tamanho de partícula de 5,0 μm da marca
Sigma-Aldrich; fase móvel composta por 20 mM de KH2PO4 : acetonitrila (50:50, v/v); fluxo
de fase móvel foi de 1,0 mL/min. a temperatura ambiente; volume de injeção foi de 20 μL. A
fase móvel empregada foi previamente filtrada a vácuo em um conjunto para filtração da marca
Milipore, empregando filtro LCR em PTFE modificado com poro de diâmetro de 0,45 μm e
bomba a vácuo compressor e aspirador da marca Fanem Diapump. A fase móvel foi
degaseificada em banho de ultrassom (Unique) modelo Ultrassônico Cleaner USC-2850. O
KH2PO4 foi da marca Vetec e a solução foi preparada em água ultra purificada em sistema de
ultra purificação de água no sistema Millipore Simplicity.
32
4.3.3.2 Preparação da amostra e padrão interno.
O preparo e limpeza da amostra foi realizado empregando a técnica QuEChERS
(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) usualmente utilizada em métodos de análise de
pesticidas, por tratar-se de uma técnica rápida, fácil, barata, efetiva, robusta e segura
(ANASTASSIADES et al., 2003).
A preparação da amostra foi realizada adicionando em um tubo de micro centrífuga
da marca Ependorff, 200 μL de plasma de rato Wistar, 50 μL do padrão interno propilparabeno
na concentração de 200 μg/mL, 50 μL de solução de bicarbonato de sódio 1N (pH=9,1) e 300
µL de acetonitrila. Em seguida, o conteúdo foi homogeneizado com o auxílio de um agitador
tipo vortex (Quimis modelo Q220B2) por 30 segundos. Os tubos foram mantidos a temperatura
de -20ºC durante 5 minutos para, em seguida, serem centrifugados em microcentrífuga (Sanyo
modelo Micro Centaur MSE) a 13000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi coletado e
filtrado em filtros Milex LCR com membrana PTFE modificada para filtração de solventes
orgânicos e aquosos de 0,45μm, 13 mm não estéril da marca Millipore
4.3.3.3 Quantificação e preparação das curvas de calibração
A quantificação foi realizada por meio da construção de sete curvas de calibração.
Inicialmente foi construída a curva P – utilizando 7 (sete) pontos com concentrações
progressivas de padrão de sildenafila (0,350 μg/mL; 0,437 μg/mL; 0,875 μg/mL; 1,750 μg/mL;
3,500 μg/mL, 7,000 μg/mL e 17,500 μg/mL) juntamente com o padrão interno propilparabeno
em concentração fixa (16,700 μg/mL). Posteriormente foram construídas 06 (seis) curvas em
plasma fortificado com padrão interno e concentrações progressivas de sildenafila (0,350
μg/mL; 0,875 μg/mL; 1,750 μg/mL; 3,500 μg/mL, 7,000 μg/mL e 17,500 μg/mL).
As concentrações de sildenafila foram escolhidas com o objetivo de incluir no
procedimento amostras de controle de qualidade específicas e os limites inferiores e superiores
de quantificação.
O Limite Inferior de Quantificação (LIQ) é considerado como a menor
concentração do analito na curva de calibração preparada na matriz. Nas curvas em questão a
concentração de sildenafila empregada no LIQ foi de 0,350 µg/mL.
33
O Limite Superior de Quantificação (LSQ) é considerado como a maior
concentração do analito na curva de calibração preparada na matriz. Nas curvas em questão a
concentração de sildenafila empregada no LSQ foi de 17,500 µg/mL.
A amostra de controle de qualidade de alta concentração (CQA) é a amostra de
matriz adicionada do analito em concentrações entre 75 e 85% da maior concentração da curva
de calibração. Nas curvas em questão não foram incluídas as amostras de CQA de sildenafila a
15,000 µg/mL.
A amostra de controle de qualidade de baixa concentração (CQB) é a amostra de
matriz adicionada do analito em concentrações até três vezes o LIQ. Nas curvas em questão a
concentração de sildenafila empregada no CQB foi de 0,8750 µg/mL.
A amostra de controle de qualidade de média concentração (CQM) é a amostra de
matriz adicionada do analito em concentração próxima à média entre o LIQ e o LSQ. Nas curvas
em questão a concentração de sildenafila empregada no CQM foi de 7,000 µg/mL.
Nas curvas de calibração foram introduzidas concentrações intermediárias (CI)
denominadas CI 1 e CI 2.
A tabela 1 mostra os pontos considerados da curva de calibração.
Tabela 1: Pontos da Curva de Calibração.
Ponto
1
2
3
4
5
6
Denominação
LIQ – Limite Inferior de Quantificação
CQB – Controle de Qualidade de Baixa Concentração
CI 1 - Controle de Qualidade Intermediário 1
CI 2 - Controle de Qualidade Intermediário 2
CQM - Controle de Qualidade de Média Concentração
LSQ – Limite Superior de Quantificação
Concentração (µg/mL)
0,350
0,875
1,750
3,500
7,000
17,500
Para construção das curvas foram utilizadas amostras de plasma coletados de
01(um) animal alimentado (amostra lipêmica) - curva L e 04 (quatro) animais em jejum – curvas
A, B, C e D. Adicionalmente, mais um animal em jejum teve seu plasma hemolisado – curva
H. Foram utilizadas medidas de áreas relativas (sildenafila/propilparabeno) e por meio dessas
foram construídas as curvas de calibração utilizando a técnica de regressão linear dos mínimos
quadrados. As equações das retas calculadas foram utilizadas posteriormente para o cálculo das
34
concentrações de sildenafila no plasma dos animais. As equações das retas foram obtidas pelo
software Excel professional 2013.
4.3.4 Validação do método analítico
A RDC da ANVISA de número 27, de 17 de maio de 2012, a qual dispõe sobre os
requisitos mínimos para a validação de métodos bioanalíticos empregados em estudos com fins
de registro e pós-registro de medicamentos foi utilizada para validar o método desenvolvido
(BRASIL, 2012).
A validação do método analítico foi conduzida considerando as figuras de mérito
descritas a seguir:
Limite Inferior de Quantificação (LIQ)
A menor quantidade de sildenafila na amostra que pode ser determinada
quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis foi estabelecida como a menor
concentração da curva de calibração.
Especificidade:
A habilidade do método de medir e diferenciar a sildenafila dos componentes que
possam estar presentes na amostra foi avaliada por meio da análise de amostras de plasma
obtidas de seis indivíduos, sendo quatro normais, uma lipêmica e uma hemolisada, sob
condições controladas referentes ao tempo, alimentação e outros fatores importantes para o
estudo. Cada amostra branca (matriz processada sem adição de analito e padrão interno) foi
testada utilizando o procedimento e as condições cromatográficas propostas. Os resultados
foram comparados com aqueles obtidos com solução aquosa de sildenafila, em concentração
próxima ao LIQ. A resposta de picos interferentes no tempo de retenção do fármaco foi
verificada e deveria ser inferior a 20% da resposta do LIQ. As respostas de picos interferentes
no tempo de retenção do fármaco e do padrão interno devem ser inferiores, respectivamente, a
20% e 5% da resposta na concentração utilizada para o método ser considerada a especificidade
do método.
Foram utilizados nesse procedimento as seguintes substâncias: cafeína, testosterona
e hidroclortiazida, a fim de verificar a possível coeluição dessas substâncias com a sildenafila.
As três substâncias em questão poderão potencialmente estar presentes em indivíduos que
35
façam uso de substâncias ergogênicas, anabolizantes ou diuréticos. Os referidos compostos não
estavam presentes nas amostras de plasma utilizadas no experimento, uma vez que os animais
não foram expostos a essas substâncias.
Linearidade:
A capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à
concentração do analito foi avaliada. Foram analisadas a amostra branco (matriz biológica
isenta de padrão do fármaco e de padrão interno), a amostra zero (matriz biológica adicionada
de padrão interno) e sete amostras contendo padrão do fármaco nas seguintes concentrações:
0,350 μg/mL; 0,440 μg/mL; 0,875 μg/mL; 1,750 μg/mL; 3,500 μg/mL, 7,000 μg/mL e 17,500
μg/mL. A cada uma das amostras foram adicionados 200 μg/mL do padrão interno
propilparabeno. Para cada uma das curvas, foram calculados o coeficiente de correlação linear
(R2), o coeficiente angular (alfa) e o intercepto da reta. Foram considerados os seguintes
critérios para aceitação de cada curva de calibração: desvio menor ou igual a 20% para o LIQ
em relação a concentração nominal; desvio menor ou igual a 15% para os demais pontos em
relação a concentração nominal; no mínimo quatro de seis concentrações da curva de calibração
devem cumprir com os critérios anteriores; na legislação de 2003 o coeficiente de correlação
linear deve ser igual ou superior a 0,98, no entanto na legislação atual, tal limite não é
apresentado, o mesmo é apresentado na legislação anterior, ou seja na RE 899 de 2003
(ANVISA, 2003)
Precisão:
O grau de repetibilidade entre os resultados de análises individuais, quando o
procedimento foi aplicado diversas vezes numa mesma amostra homogênea, em idênticas
condições de ensaio foi avaliado. Foi verificada a concordância entre os resultados obtidos,
respectivamente, em uma mesma corrida (intra dia) e em corridas diferentes (inter dia). Para
isso, foram utilizados no mínimo nove medições (CQB, CQM e CQA em triplicatas)
contemplando o intervalo linear do método (corridas intra dia e inter dia). O desvio padrão
admitido não poderia ser superior a 15%, exceto para o LIQ, para o qual serão admitidos DPR
inferior a 20%. O Desvio Padrão Relativo foi calculado pela fórmula:
𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑜 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑅𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 = 𝐷𝑒𝑠𝑣𝑖𝑜 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜/𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝑥 100.
36
Exatidão
O grau de concordância entre os resultados individuais encontrados e um valor
aceito como referência foi avaliado empregando amostras em três concentrações (baixa, média
e alta), contemplando a faixa de variação do procedimento. As concentrações foram preparadas
em quintuplicata. A exatidão foi determinada em uma mesma corrida e também em corridas
diferentes, podendo ser expressa pela relação entre a concentração média determinada
experimentalmente e a concentração teórica correspondente. A exatidão foi calculada pela
fórmula:
𝐸𝑥𝑎𝑡𝑖𝑑ã𝑜 = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙/𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑥 100.
Recuperação
Utilizada para medir a eficiência do procedimento de extração dentro de um limite
de variação. Foi realizada comparando-se os resultados analíticos de amostras extraídas a partir
de três concentrações (baixa, média e alta), contemplando a faixa de linearidade do método,
com os resultados obtidos com soluções padrão não extraídas que representam 100% de
recuperação. O cálculo da recuperação foi feito em função da relação de área do padrão extraído
e não extraído, tanto para o analito quanto para o padrão interno, separadamente.
4.3.4.1 Análises Estatísticas
Para a realização das análises estatísticas propostas pela RDC nº 27 de 2012 da
ANVISA (BRASIL, 2012) foi empregado o software Excel Professional 2013.
4.3.5 Aplicação do Método em Amostra Real
Foram analisadas quanto ao teor de sildenafila empregando o método desenvolvido
seis amostras de plasma de rato provenientes de animais que receberam uma dose oral de
sildenafila de 1,5 mg/Kg. Os seis animais foram eutanasiados por decapitação em tempos
distintos após a administração da sildenafila (0, 10, 20, 30, 60 e 120 min). Sendo assim, os seis
valores obtidos representarão a concentração plasmática de sildenafila existente nos tempos 0,
10, 20, 30, 60 e 120 minutos após a administração do fármaco.
37
4.4 Resultados e Discussão
4.4.1 Quantificação e preparação das curvas de calibração
A curva de calibração (figura 5) construída a partir de sete pontos de concentrações
progressivas de padrão apresentou a seguinte equação da reta:
𝑦 = 0,7025 𝑥 + 0,192
Os resultados indicam que quando a concentração de sildenafila for zero, o valor
de y será de 0,192 e o intercepto cruza o eixo y acima de zero.
O coeficiente de determinação (r2) obtido foi de 0,9997 indicando ser o modelo
proposto adequado para descrever o fenômeno, pois quanto mais próximo de um, maior será a
adequação do modelo proposto.
RELAÇÃO ENTRE AS ÁREAS (MÉDIA)
CURVA DE CALIBRAÇÃO P (PADRÃO)
14
12
10
8
6
4
2
0
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000 12,0000 14,0000 16,0000 18,0000 20,0000
CONCENTRAÇÃO (µg/mL)
Figura 5: Representação gráfica das 5 replicatas da curva de calibração da sildenafila.
As curvas de calibração A, B, C e D construídas a partir de plasma de quatro animais
(A,B,C e D) em jejum fortificados com concentrações progressivas de padrão de sildenafila
juntamente com uma concentração fixa do padrão interna apresentaram as seguinte equações
da reta:
Curva A: 𝑦 = 0,8796 𝑥 − 0,0183,
Curva B: 𝑦 = 1,0402 𝑥 – 0,3269
38
Curva C: 𝑦 = 0,8842 𝑥 + 0,0425
Curva D: 𝑦 = 0,828 𝑥 + 0,1542
Os coeficientes de determinação (r2) obtidos para as Curvas A, B, C e D foram
0,9993; 0,9975; 0,9981 e 0,9985, respectivamente, indicando ser o modelo proposto adequado
para descrever o fenômeno. As quatro amostras eram oriundas de quatro animais distintos, no
entanto, os valores apresentados são muito aproximados, indicando um perfil muito semelhante.
Na figura 6 é possível verificar as Curvas de Calibração A, B, C e D.
CURVAS DE CALIBRAÇÃO
RELAÇÃO ENTRE AS ÁREAS (MÉDIA)
Curva A
Curva B
Curva C
Curva D
20
15
10
5
0
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000 12,0000 14,0000 16,0000 18,0000 20,0000
CONCENTRAÇÃO (µg/mL)
Figura 6: Curvas de Calibração A, B, C, D provenientes de animais em jejum.
A curva de calibração H construída a partir de plasma hemolisado de um rato em
jejum fortificado com concentrações progressivas de padrão de sildenafila juntamente com uma
concentração fixa do padrão interna apresentou a seguinte equação da reta:
𝑦 = 1,0183 𝑥 − 0,0574
O coeficiente de determinação (r2) obtido foi de 0,9976 indicando ser o modelo
proposto adequado para descrever o fenômeno, pois quanto mais próximo de um maior será a
adequação do modelo proposto. O resultado apresentado, embora proveniente de uma amostra
hemolisada não diferiu do coeficiente de determinação das curvas anteriores.
39
Na figura 7 é possível verificar a Curva de Calibração H construída a partir de
plasma hemolisado de um animal em jejum fortificado com concentrações progressivas de
padrão de sildenafila juntamente com uma concentração fixa do padrão interna.
CURVA DE CALIBRAÇÃO H
20
RELAÇÃO ENTRE AS ÁREAS (MÉDIA)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000
12,0000
14,0000
16,0000
18,0000
20,0000
CONCENTRAÇÃO µg/mL
Figura 7: Curva de Calibração H proveniente de animais em jejum com plasma hemolisado.
A curva de calibração L construída a partir de plasma de um animal alimentado
(lipêmico) fortificado com concentrações progressivas de padrão de sildenafila juntamente com
uma concentração fixa do padrão interna apresentou a seguinte equação da reta:
𝑦 = 1,0557 𝑥 − 0,3043
O coeficiente de determinação (r2) obtido foi de 0,9951 indicando ser o modelo
proposto adequado para descrever o fenômeno, pois quanto mais próximo de um maior será a
adequação do modelo proposto. O r2 obtido foi o menor entre todas as curvas realizadas o que
pode ser justificado por ser amostra lipêmica contendo potencialmente mais interferentes.
Na figura 8 é possível verificar a Curva de Calibração L construída a partir de
plasma de um animal alimentado (amostra lipêmica) fortificado com concentrações
progressivas de padrão de sildenafila juntamente com uma concentração fixa do padrão interna.
40
CURVA DE CALIBRAÇÃO L
RELAÇÃO ENTRE AS ÁREAS (MÉDIA)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000 12,0000 14,0000 16,0000 18,0000 20,0000
CONCENTRAÇÃO (µg/mL)
Figura 8: Curva de Calibração L.
Considerando as equações da reta obtidas das Curvas de Calibração A, B, C, D, H
e L percebeu-se que todas as curvas atendem ao proposto na legislação, ou seja r2 acima de
0,99, mesmo aquelas provenientes de plasma hemolisado e lipêmico, portanto atendem a
legislação específica.
4.4.2 Validação da metodologia analítica
Limite Inferior de Quantificação (LIQ)
O Limite Inferior de Quantificação definido para o método foi de 0,350 μg/mL.
A concentração de fármaco no LIQ pôde ser determinada quantitativamente com
precisão, ou seja, com Desvio Padrão Relativo (DPR) de 18,71%.
A concentração de fármaco no LIQ pôde ser determinada quantitativamente com
exatidão, ou seja, com Erro Padrão Relativo (EPR) de 3,14%.
41
Tabela 2: Precisão avaliada por meio do coeficiente de variação (CV%) do Limite Inferior de
Quantificação (LIQ).
Ponto
Curvas de Calibração
Média das
da
Curva
LIQ
A
B
C
H
L
0,297 0,288 0,425 0,318 0,411
Relações
0,348
EPR
CONC
0,361
3,149%
CONC- Concentração Experimental; EPR – Erro Padrão Relativo;
DPR – Desvio Padrão Relativo;
DP
DPR
0,065
18,71
DP- Desvio Padrão;
A quantificação no LIQ pôde ser realizada com precisão e exatidão, cumprindo com
a legislação específica.
Especificidade:
Comparando os resultados obtidos àqueles decorrentes da injeção de solução
aquosa de sildenafila em concentração de 0,350 μg/mL, observou-se que o tempo de retenção
da cafeína foi de 3,568 min, da testosterona foi de 2,814 min e da hidroclortiazida foi de 2,800
min, ou seja, todos inferiores a 20% da resposta do LIQ.
Os resultados indicam que tais possíveis interferentes, caso presentes nas amostras
de plasma, não interfeririam na identificação e quantificação da sildenafila por apresentarem
tempos de retenção distintos da sildenafila e do padrão interno.
Tabela 3: Resposta de Picos Interferentes no tempo de retenção da sildenafila.
Substância
Tempo de Retenção (min)
Sildenafila
8,058
Padrão Interno
6,709
Cafeína
3,568
Testosterona
2,814
Hidroclortiazida
2,800
42
As figuras de 9 a 13 representam os cromatogramas das amostras branco (matriz
biológica extraída isenta de padrões), zero (amostra branco adicionado de padrão interno), real
(amostra de controle de qualidade proveniente de um animal que foi exposto a sildenafila),
mistura de padrão interno e sildenafila (soluções de padrões misturados - 50:50 v:v) e padrão
de sildenafila.
Os presentes resultados indicam que o método possui especificidade para
sildenafila.
Figura 9: Cromatograma da Amostra Branco – matriz processada sem adição do analito e
padrão interno.
43
Figura 10: Cromatograma da Amostra Zero – matriz processada com adição do padrão interno.
Figura 11: Cromatograma de Amostra de Controle de Qualidade – matriz processada com
adição do analito e padrão interno.
44
Figura 12: Cromatograma de mistura de padrão interno – Propilparabeno e Sildenafila.
Figura 13: Cromatograma do padrão de Sildenafila.
45
Linearidade:
A linearidade pôde ser verificada a partir das equações das retas e dos coeficientes
de correlação linear obtidos. Na tabela 4 estão apresentadas as equações das retas e o coeficiente
de correlação linear (r2).
Tabela 4: Equação da Reta e Coeficiente de Correlação Linear das Curvas de Calibração.
Curvas
Equação da reta
r2*
P
y=0,7025x + 0,192
0,9997
A
y=0,8796x - 0,0183
0,9993
B
y=1,0402x – 0,3269
0,9975
C
y=0,8842x + 0,0425
0,9981
D
y=0,828x + 0,1542
0,9985
H
y=1,0183x - 0,0574
0,9976
L
y=1,0557x - 0,3043
0,9951
* Coeficiente de Correlação Linear
O coeficiente de correlação (r2) estabelece o grau de relação linear entre duas
variáveis quantitativas. Quanto mais próximo de 1, maior a indicação de uma relação linear
perfeita e quanto mais o valor se distancia de 1, maior será a indicação da inexistência de uma
relação linear.
Os valores obtidos respeitam a legislação em vigor e se assemelham aos resultados
encontrados na literatura. Valores de r2 de 0,9976; 0,9966; 0,9999 e 0,9966 foram obtidos nos
ensaios de validação dos métodos desenvolvidos por LIEW et al.,(2015), YOKOYAMA et al.,
(2014), EL-BAGARY et al., (2014) e TRIPATHI et al., (2013), respectivamente.
Por meio da equação da reta é possível inferir o quanto a variação da concentração
de sildenafila na amostra de plasma pode interferir na relação entre as áreas da sildenafila e do
padrão interno apresentadas no cromatograma.
O coeficiente linear (α) expressa o valor que a relação entre as áreas da sildenafila
e do padrão interno (y) assume quando a concentração de sildenafila na amostra for zero.
A curva P, devido à ausência de interferentes possui uma relação linear mais
próxima da perfeição.
46
A curva L, construída a partir de uma matriz proveniente com maior teor de
lipídeos, apresentou um coeficiente de correlação menor, o qual pode ser explicado devido a
uma maior probabilidade de interferentes na amostra empregada.
A Curva H, construída a partir de uma matriz proveniente de sangue hemolisado
não apresentou um coeficiente de correlação menor, embora a probabilidade de interferentes na
amostra fosse maior.
O método desenvolvido demonstrou possuir linearidade uma vez que o método
apresentou a capacidade de fornecer dados diretamente proporcionais à concentração do
analito.
Precisão:
A precisão pôde ser verificada a partir do desvio padrão relativo obtido a partir das
curvas de calibração. Na Tabela 5 estão apresentados os Desvios Padrões Relativos dos Pontos
das Curvas de Calibração.
Tabela 5: Desvio Padrão Relativo dos Pontos das Curvas de Calibração.
Pontos
Média das Áreas
Relativas
Desvio Padrão
Desvio Padrão
Relativo
LIQ
0,34835
0,065207
18,71872
CQB
0,728091
0,084238
11,56968
CQM
3,264033
0,41836
12,81727
CQA
6,329979
0,187799
2,966824
CQD
17,08314
1,54584
9,048924
O método em questão pode ser considerado preciso uma vez que o Desvio Padrão
Relativo do LIQ de 18,72% foi inferior a 20% e os DPRs dos demais pontos foram inferiores a
15%.
47
Exatidão:
A exatidão pôde ser verificada a partir do Erro Padrão Relativo. Na tabela 6 estão
apresentadas os referidos EPR.
Tabela 6: Erro Padrão Relativo.
Pontos
Concentração
Relação entre
Concentração
EPR
Nominal
Áreas
Experimental
LIQ
0,35
0,34835
0,361022
3,149241
CQB
0,875
0,728091
0,754576
13,7627
CQM
3,5
3,264033
3,382768
3,34948
CQA
7
6,329979
6,560244
6,28224
CQD
17,5
17,08314
17,70457
1,16895
O método demonstrou possuir exatidão. Houve concordância entre o resultado do
ensaio com o valor de referência, uma vez que o EPR no LIQ foi de 3,14%, ou seja, inferior a
20%, e os EPR dos demais pontos foram inferiores a 15%.
Recuperação
A eficiência do procedimento de extração pôde ser verificada em função da relação
de área do padrão extraído e não extraído tanto para o analito quanto para o padrão interno
separadamente. Primeiramente foi calculada a concentração experimental dos pontos na curva
R e, em seguida, a mesma foi comparada àquela obtida no procedimento de exatidão. Na tabela
7 estão apresentadas as porcentagens de recuperação obtidas.
A recuperação média do método foi de 84,3% indicando que o método possui um
eficiente procedimento de extração. Na literatura são encontrados valores de 83,2%; 80,5%;
83,4-88,12% e 88,5-89,4% nos ensaios de validação realizados por SIMIELE et al., (2015);
EL-BAGARY et al., (2014); YOKOYAMA et al., (2014) e TRIPATHI et al.,(2013),
respectivamente.
O procedimento de extração e limpeza da amostra de plasma baseado na
precipitação de proteínas pelo uso do acetonitrila se mostrou eficiente, além de ser prático e
rápido. O método desenvolvido é de baixo custo pois emprega reagentes comuns e não envolve
48
etapas complexas ou o uso colunas de extração em fase sólida de alto custo (YOKOYAMA et
al., 2014).
CURVA DE CALIBRAÇÃO DA RECUPERAÇÃO
RELAÇÃO ENTRE AS ÁREAS ( MÉDIA)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0,0000
2,0000
4,0000
6,0000
8,0000
10,0000 12,0000 14,0000 16,0000 18,0000 20,0000
CONCENTRAÇÃO (µg/mL)
Figura 14: Curva de Calibração da Recuperação
Tabela 7: Porcentagem de Recuperação do Método.
CONCENTRAÇÃO
PONTOS
EXPERIMENTAL DA
EXATIDÃO
CONCENTRAÇÃO
PORCENTAGEM
EXPERIMENTAL
DE
DA
RECUPERAÇÃO
RECUPERAÇÃO
(%)
LIQ
0,361022
0,474037
76,2
CQB
0,754576
1,13693
66,4
CQM
3,382768
3,767399
89,8
CQA
6,560244
7,60503
86,3
CQD
17,70457
17,18898
102,9
Recuperação Média
84,3
4.4.3 Aplicação do Método em Amostra Real:
As análises das seis amostras de plasma de rato provenientes de animais que
receberam uma dose oral de sildenafila de 1,5 mg/Kg ou placebo foram analisadas quanto ao
49
teor de sildenafila empregando a metodologia desenvolvida. Os resultados obtidos estão
apresentados na tabela 8.
Tabela 8: Concentração Média de Sildenafila em Amostras de Plasma de Ratos que receberam
1,5 mg/Kg de sildenafila.
Tempo
Concentração de Sildenafila
(min)
µg/mL*
0
0
10
0,357±0,4532
20
0,279±2,9721
30
0,533±0,5345
40
1,265±0,2194
60
3,515±0,1087
*valores médios (desvio padrão)
A amostra número 1 é referente a um rato que recebeu dose oral de sildenafila e foi
eutanasiado imediatamente. A ausência de picos no tempo de retenção da sildenafila confirma
a ausência do analito na amostra em questão.
As amostras de 2 a 6 referem-se a amostras de animais que receberam sildenafila
em concentrações de 1,5 mg/Kg. As amostras são oriundas de cinco animais distintos e foram
coletados em diferentes tempos de exposição ao fármaco (10, 20, 30, 40 e 60 min) indicando
uma concentração crescente de fármaco no plasma dos animais.
Os resultados indicam que a concentração de sildenafila nas amostras variou de
0,279 a 3,515 µg/mL, indicando que o método se mostrou eficiente para identificar e quantificar
o analito em questão e as concentrações do analito encontram-se dentro do intervalo linear nos
animais quando administrada a dose equivalente a terapêutica.
50
4.5 Conclusão
No presente estudo utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência foi
desenvolvido e validado, de acordo com a legislação em vigor, um método simples, rápido,
específico para sildenafila, linear, preciso e exato para identificar e quantificar sildenafila em
plasma de ratos. O procedimento de extração e limpeza baseado na precipitação proteica
demonstrou ser simples, rápido e de baixo custo. A recuperação média foi de 84,3%. A
metodologia proposta demonstrou ser capaz de identificar e quantificar amostras reais de
animais expostos a sildenafila, podendo ser facilmente empregado em estudos de
farmacocinética da sildenafila, em estudos de bioequivalência, de biodisponibilidade, de
interação entre fármacos, e em procedimentos clínicos de rotina para a identificação e
quantificação do fármaco em amostras de plasma.
51
Capítulo II: Estudo Farmacocinético da sildenafila em
ratos
A sildenafila tem sido amplamente investigada em estudos farmacológicos e
toxicológicos, tanto em ensaios em animais quanto in vitro e os resultados obtidos apresentam
um histórico comprovado de segurança. Na literatura não existem registros de efeitos
indesejáveis da sildenafila sobre a fertilidade ou efeitos teratogênicos bem como foi
comprovado que a molécula não apresenta genotoxicidade ou potencial carcinogênico
(ABBOTT et al., 2004).
A via usual de administração de sildenafila é oral. Deste modo é importante
conhecer o comportamento do fármaco no organismo definindo a biodisponibilidade oral do
fármaco, sua concentração plasmática máxima, seu tempo para atingir a concentração máxima
e o tempo de meia-vida da substância em questão.
De uma maneira geral, a sildenafila, após administração oral, é rapidamente e quase
completamente absorvida pelo trato gastrointestinal. O metabolismo pré-sistêmico resulta em
alta biodisponibilidade oral no homem (41%) e cão (54%) e menor taxa em ratos machos (15%)
e camundongos (17%). O metabolismo da sildenafila ocorre principalmente no fígado e é
mediado por duas isoformas da citocromo P450 (CYP2C9 e CYP3A4). A sildenafila é
altamente ligada às proteínas plasmáticas em ratos (95%), cachorro (86%) e em seres humanos
(96%) sendo predominantemente excretada nas fezes (ABBOTT et al., 2004).
Com o objetivo de otimizar o estudo da influência da sildenafila no comportamento
de ratos avaliados no campo aberto e no labirinto em cruz elevado e o estudo da influência da
sildenafila sobre o desempenho físico de ratos, tornou-se necessário conhecer o perfil
farmacocinético da sildenafila nessa espécie. Assim, foi desenvolvido o presente protocolo para
determinação dos parâmetros farmacocinéticos de sildenafila em ratos machos.
5.1 Objetivo Específico
Conhecer os parâmetros farmacocinéticos da sildenafila em ratos machos utilizando
dose única de sildenafila.
52
5.2 Revisão da Literatura
A biodisponibilidade de um fármaco é o termo usado em farmacocinética para
descrever a quantidade e a velocidade com que um fármaco fica disponível em seu lugar de
ação após ter sido administrado em dose única (ANVISA, 2002).
Os protocolos de obtenção de dados de biodisponibilidade de um fármaco
envolvem a administração de uma única dose do fármaco (D), e a tomada sequencial de
amostras de sangue em tempos específicos (t0, t1, t2...tk). As amostras coletadas são investigadas
quanto ao teor do fármaco e são obtidas as concentrações medidas no sangue (C0, C1, C2...Ck).
De posse dos dados referentes à concentração de fármacos no sangue e dos tempos
nos quais foram tomadas as amostras, constrói-se a Curva de Concentração do Fármaco em
função do tempo.
A partir da curva construída é possível obter os principais parâmetros
farmacocinéticos.
5.2.1 Parâmetros Farmacocinéticos
Os principais parâmetros farmacocinéticos obtidos a partir da curva são a
Concentração Máxima (Cmax), o Tempo que o fármaco demora em atingir a concentração
máxima (Tmax) e a Área Sob a Curva (ASC).
Concentração Máxima (Cmax)
É o pico da concentração que um fármaco atinge um lugar especificado do
organismo depois da administração e antes da administração de uma segunda dose (ANVISA,
2002).
Tempo que o fármaco demora em atingir a Cmax (Tmax)
É a abscissa do ponto que corresponde à Cmax.
Volume Aparente de Distribuição (Vd)
É uma medida que correlaciona a quantidade de fármaco no organismo com a sua
concentração (C) no sangue ou plasma. Expressa o volume de líquido que seria necessário para
53
conter todo o fármaco no organismo na mesma concentração presente no sangue ou plasma
(ANVISA, 2002). É calculado a partir da seguinte equação:
𝑉𝑑 = 𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 𝑛𝑜 𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑚𝑜/𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 𝑛𝑜 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑢𝑒
Tempo de Meia-vida (t ½ )
É o tempo gasto para que a concentração plasmática do fármaco diminua em 50%
e é definido pela seguinte equação:
𝑡1/2 = log 2/𝐾𝑒
Onde: Ke é a constante de eliminação.
Depuração ou clearance
É a medida da capacidade do organismo em eliminar um fármaco e é dada pelo
produto do volume aparente de distribuição e da constante de eliminação (ANVISA, 2002).
𝐷 = 𝑉𝑑 . 𝐾𝑒
Área sob a curva (ASC)
A área sob a curva da concentração plasmática ou sérica versus tempo é um dos
principais parâmetros farmacocinéticos. O método dos trapézios é o método mais simples para
obter a ASC.
Para obter a ASC do tempo zero até o tempo da última coleta é empregado o método
dos trapézios, ou seja, traçam-se retas paralelas à ordenada partindo da curva e atingindo a
abscissa, criando-se assim diversos trapézios, nos quais as áreas são calculadas. A soma das
áreas dos diferentes trapézios é a ASC ANVISA, 2002).
Para obter a ASC utiliza-se a seguinte equação:
𝐴𝑆𝐶 =
𝐹𝐷
𝑉𝑑 . 𝐾𝑒
Onde:
FD é o fármaco efetivamente absorvido e disponível para ser distribuído no
organismo;
54
KeVd expressa o clearance total do fármaco (depuração) ou seja, sua velocidade de
eliminação a partir do volume de distribuição, sendo que Ke corresponde à constante de
velocidade de eliminação total do fármaco no organismo (ANVISA, 2002).
A ASC do tempo zero até o tempo da última coleta ASCtk é obtido a partir da
seguinte equação:
𝑘
𝐴𝑆𝐶 𝑡𝑘 = ∑(𝑐𝑖 1 + 𝐶𝑖/2) . (𝑡1 − 𝑡 𝑖 1)
−
−
𝑖=1
A ASC pode também ser extrapolada e calculada do tempo zero até o tempo relativo
à completa eliminação do fármaco. Essa medida é citada na literatura como a área sob a curva
do tempo zero a infinito. A porção adicional é expressa por uma relação entre a última
concentração medida Ck e a constante de velocidade de eliminação do fármaco Ke (ANVISA,
2002).
A área sob a curva de zero a infinito é obtido a partir da seguinte equação:
𝐴𝑆𝐶∞ = 𝐴𝑆𝐶𝑡𝑘 + 𝐶𝑘/𝐾𝑒
5.3 Material e Métodos
5.3.1 Animais
Para a realização dos estudos foram utilizados ratos Wistar (Rattus norgevicus, var.
albinus) machos, jovens, saudáveis, pesando de 300 a 330 g, provenientes do Biotério da
Universidade São Judas Tadeu.
O manejo dos animais obedeceu às normas estabelecidas e os princípios éticos da
experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e esteve
de acordo como o ARRIVE guidelines for reporting animal research (KILKENNY et al., 2010).
Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno (43 x 23 x 16
cm), forradas com maravalha, contendo, no máximo, 4 animais em cada uma, em ambiente com
55
temperatura controlada de 22 – 24º C, sob ciclo claro/escuro de 12 horas (luz acesa às 6 h) e,
com livre acesso à água e alimento normoproteico.
Os protocolos experimentais realizados neste trabalho foram aprovados pela
Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade São Judas Tadeu – CEUA/USJT em
três projetos: Projeto 003/2013 – Influência do uso agudo e crônico de um inibidor da enzima
fosfodiesterase-5 sobre o desempenho físico de ratos treinados, aprovado em 15 de maio de
2013; Projeto 010/2013 – Influência do uso agudo de um inibidor da fosfodiesterase-5 sobre o
comportamento motor de ratos, aprovado em 09 de outubro de 2013; Projeto 012/2014 –
Avaliação da Biodisponibilidade e Verificação da Velocidade de Absorção de um inibidor da
enzima fosfodiesterase-5 administrado por via oral a ratos Wistar machos, aprovado em 13 de
maio de 2014.
5.3.2 Reagentes e Fármacos
Neste protocolo as doses de sildenafila foram preparadas a partir de citrato de
sildenafila da marca Pharmanostra® com teor de pureza de 99,51% e diluídos em óleo de milho
comercial.
Administração da sildenafila aos animais:
A administração aos animais foi realizada por meio de um tubo orogástrico – um
tubo de aço inox curvo específico para gavagem em ratos - composta por uma cânula com
diâmetro de 1,2 mm que apresenta uma esfera de 2,25 mm na ponta. O comprimento total do
dispositivo é de 38 mm. A dose utilizada foi de 1,5 mg/Kg e o veículo utilizado foi o óleo de
milho.
A referida dose foi escolhida tendo como base o uso da sildenafila em humanos. A
dose de 1,5 mg/Kg corresponde ao uso de comprimidos de 100 mg de sildenafila para um
homem de 70 Kg.
Verificação do teor de sildenafila no plasma:
Após a coleta do sangue com heparina sódica, este foi centrifugado e submetido à
quantificação de sildenafila de acordo com o método de CLAE desenvolvido e validado.
56
Cada uma das amostras de plasma coletadas dos animais pertencentes ao presente
estudo foi submetida ao procedimento de extração e quantificação por três vezes, sendo assim,
a concentração plasmática do fármaco e o desvio-padrão entre as três análises realizadas da
mesma amostra foram utilizados para a obtenção dos dados analíticos.
Determinação dos parâmetros farmacocinéticos:
A concentração plasmática máxima, a duração da ação e o tempo de meia-vida
foram calculados por métodos não compartimentais e obtidos diretamente da curva de
concentração versus tempo. A correspondente área sob a curva foi obtida a partir da análise do
tempo zero até a última concentração atingida.
5.3.3 Delineamento Experimental
Foram empregados 36 ratos divididos em 12 grupos de três animais cada: T0, T1,
T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, T9, T10 e T11. Todos os animais receberam 1,5 mg/Kg de
sildenafila, sendo submetidos a eutanásia por decapitação para a retirada do sangue nos
seguintes tempos – 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 120, 240 e 480 minutos, respectivamente.
O protocolo de determinação da biodisponibilidade é importante para elucidar a
absorção, a duração da ação, a concentração plasmática máxima e o tempo de meia-vida do
fármaco na espécie em questão.
5.3.3.1 Análise Estatística:
Todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. Para análise
dos dados foi utilizado o software Excel Professional 2013.
57
5.4 Resultados e Discussão
5.4.1 Verificação do teor de sildenafila no plasma
Após a administração oral, a sildenafila foi rapidamente absorvida no trato
gastrointestinal. Em 10 minutos o fármaco atingiu a concentração plasmática de 0,4687 µg/mL
representando 3% da concentração plasmática máxima alcançada. Em 20 minutos o fármaco
atingiu 44.4% e em 30 minutos, 68,3%, representando quase dois terços da concentração
máxima alcançada.
A concentração plasmática máxima de sildenafila de 6,4121 µg/mL foi alcançada
aos 40 minutos (0,66 h) e a partir desse tempo houve um decaimento dos teores de sildenafila
no plasma dos animais.
Na tabela 9 é possível verificar os dados referentes às concentrações plasmáticas
atingidas nos respectivos tempos de exposição ao fármaco.
Tabela 9: Concentração Plasmática em ratos após administração de sildenafila por via oral de
1,5 mg/Kg
Tempo de Exposição ao Fármaco
(min)
Concentração Plasmática
(µg/mL)
0
0
10
0,4687
20
2,8486
30
4,3816
40
6,4121*
50
4,4047
60
3,6258
70
2,7942
100
1,5276
120
1,1062
240
1,1411
480
0,4066
* Pico de Concentração Plasmática
58
5.4.2 Determinação dos parâmetros farmacocinéticos:
A partir da curva de concentração da sildenafila versus tempo foi possível calcular
a concentração plasmática máxima (Cmax), o tempo em que a mesma foi atingida (tmax), o
volume de distribuição (Vd), o tempo de meia-vida (t1/2) e a depuração (D).
A concentração plasmática máxima (Cmax) atingida após a administração de 1,5
mg/Kg aos ratos machos foi de 6,4121 µg/mL em 40 min (tmax) como demonstrado na figura
15.
O Vd calculado foi de 1,93 mL, t1/2 foi 1,48 h e a depuração 4,32 h, conforme
apresentado na tabela 10.
Concentração de Sildenafila (µg/mL)
Concentração de Sildenafila versus Tempo
7
6
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
400
500
600
Tempo (minutos)
Figura 15: Curva de Concentração (µg/mL) versus Tempo de Exposição ao Fármaco
(minutos).
No presente estudo a sildenafila apresentou rápida absorção oral, visto que atingiu
a Cmax de 6,4121 µg/mL em 40 minutos após a administração do fármaco (tmax), Esta observação
é consistente com os dados encontrados por e TRIPATHI et al., (2013) que relataram rápida e
completa absorção da sildenafila no trato gastrointestinal com tmax médias de 38,1 min (0,64 h)
e 60 minutos, respectivamente.
Comparando os valores obtidos no presente estudo em ratos com os ensaios
realizados em humanos a mesma consistência é observada. O tmax encontrado para ratos também
59
se encontra dentro da faixa de 39,6 minutos a 1 hora relatados nos ensaios de farmacocinética
realizados em humanos (AL-GHAZAWI; TUTUNJI; ABURUZ, 2007; KIM et al., 2003; LEE;
MIN, 2001; MARCELÍN-JIMÉNEZ et al., 2012; NICHOLS; MUIRHEAD; HARNESS,
2002).
Uma modesta, embora, estatisticamente significante redução na taxa de absorção e
nenhuma mudança na extensão da absorção, em homens saudáveis, foram observadas quando
a sildenafila foi administrada em conjunto com uma refeição rica em gorduras quando
comparadas com as dosagens nos indivíduos em jejum (NICHOLS; MUIRHEAD; HARNESS,
2002). Esses achados estão em concordância com aqueles encontrados em um estudo cruzado
randomizado no qual foram administrados a um grupo de voluntários em estado de jejum ou
não (MUIRHEAD et al., 2002). O referido retardo na absorção é mais provável devido ao
retardo no esvaziamento gástrico que ocorre na presença de alimentos, visto que os padrões de
esvaziamento gástrico são dependentes de diversas características dos materiais ingeridos,
incluindo propriedades físicas e nutritivas, tais como sólidos, líquidos nutritivos e líquidos não
nutritivos, que possuem diferentes taxas de esvaziamento, pois o esvaziamento líquido ocorre
com uma relativa facilidade mecânica enquanto os sólidos dependem de um processo inicial de
trituração das partículas no antro antes do processo de esvaziamento (CALABRESI, 2013).
Corroborando com a informação de que o esvaziamento líquido ocorre com uma
relativa facilidade mecânica, num estudo farmacocinético em idoso envolvendo a
administração de comprimidos de 100 mg de sildenafila com a ingestão simultânea com água
ou com suco de grapefruit, observou-se valores de tmax de 1,0 h com dose oral acompanhada de
água e tmax de 0,66 h com dose oral acompanhada de suco de grapefruit. Não se conhece os
motivos pelos quais a administração dos comprimidos acompanhada de suco de grapefruit
acelera a absorção da sildenafila, no entanto também podemos complementar que a
administração do fármaco dissolvido em óleo de milho pode ter colaborado para acelerar a
absorção do fármaco. Estudos adicionais necessitam ser realizados para elucidar essa questão.
O t1/2 1,48 h ( 88,8 min) obtido no presente estudo está pouco abaixo do t 1/2 de 95,6
min relatado por um estudo também realizado em ratos (SHIN; BAE; LEE, 2006), embora
esteja muito mais distante do t ½ de 6,93 h reportado por TRIPATHI et al., (2013).
O tempo de meia-vida da sildenafila varia significantemente entre as diferentes
espécies e também de acordo com o gênero do animal. Na literatura, tem sido relatado um
60
tempo de meia-vida em cachorros de 6,1±5,8 h, em contrapartida em coelhos o t ½ relatado é
de 1,8 h (MUIRHEAD et al., 2002).
Tabela 10: Parâmetros Farmacocinéticos.
Parâmetro Farmacocinético
Concentração Máxima (Cmax)
Valores
6,4121 µg/mL
Tempo em que é atingida a Cmax (T max)
40 min
Área Sob a Curva (Asc)
801,21
Volume de Distribuição (Vd)
1,93 mL
Tempo de Meia-vida (t 1/2)
1,48 horas
Depuração (D)
1,36 horas
O tempo de meia-vida da sildenafila em ratos machos difere do t ½ nas ratas fêmeas,
pois a metabolização do fármaco em ratos ocorre via CYP3A2, que é sexo-específica e é
expressa somente em ratos machos (CZERNIAK, 2001).
Em humanos o t
½
da sildenafila nos ensaios de farmacocinética têm variado de
3,23 a 5,3 h (AL-GHAZAWI; TUTUNJI; ABURUZ, 2007; KIM et al., 2003; LEE; MIN, 2001;
MARCELÍN-JIMÉNEZ et al., 2012; NICHOLS; MUIRHEAD; HARNESS, 2002).
O tempo de meia-vida da sildenafila, ao ser administrada em conjunto com suco de
grapefruit, foi aumentado para 5,3 h quando comparado ao t ½ de 4,6 h apresentado quando a
administração do fármaco foi acompanhada de água (LEE; MIN, 2001).
O volume de distribuição obtido no presente ensaio de 1,93 mL, está condizente
com os valores encontrados num ensaio realizado em diferentes espécies, cujos volumes de
distribuição da sildenafila foram similarares em roedores e seres humanos (entre 1,1 e 2,0 L/
kg), mas foi maior em cães (5,2 l L/kg), devido à baixa ligação às proteínas plasmáticas (84
versus 94± 96% respectivamente) (WALKER et al., 1999).
Em humanos a sildenafila apresentou um volume aparente de distribuição de 1,5
L/Kg indicando que o fármaco fica extensivamente (96%) ligado às proteínas plasmáticas
(CHEITLIN et al., 1999).
A depuração obtida no presente estudo foi de 1, 36 h
A depuração alta foi o principal determinante da curta meia-vida de eliminação da
sildenafila em roedores (0.4± 1,3 h), enquanto que, em cães e homens, a depuração moderada
61
resultou em tempos de meia-vida maiores (6,1 e 3,7 h, respectivamente). Os dados de depuração
estão consistentes com as taxas de metabolismo in vitro pelos microssomas hepáticos de várias
espécies (WALKER et al., 1999).
5.5 Conclusão
A sildenafila administrada pela via oral a ratos machos saudáveis apresentou uma
rápida absorção, atingindo a Concentração Máxima – Cmax de 6,4121 m µg/mL em um tmax de
40 min (0,66 h). O volume de distribuição foi de 1,93 mL, indicando uma alta ligação às
proteínas plasmáticas. O clearance ou depuração calculado foi de 1,36 horas e a Área Sob a
Curva foi de 801,21, em consequência, o tempo de meia-vida calculado foi de 88,8 min
(1,48 h).
62
Capítulo III: Influência da sildenafila no comportamento
de ratos avaliados no campo aberto e no labirinto em
cruz elevado
A sildenafila tem sido amplamente utilizada no manejo da disfunção erétil e
também é empregada como adjuvante no tratamento da hipertensão pulmonar. Além desses
efeitos, nos últimos anos, tem-se descoberto efeitos da sildenafila sobre outros sistemas, tais
como o Sistema Cardiovascular e o Sistema Nervoso Central (HSU et al., 2006; VOLKE;
WEGENER; VASAR, 2003).
Alguns estudos experimentais e observações clínicas indicam que a sildenafila tem
efeitos sobre o SNC, mas seu mecanismo de ação não é precisamente conhecido. Tem sido
relatado que a sildenafila possui um efeito ansiogênico em ratos resultantes da promoção da via
Óxido Nítrico/cGMP após a inibição da hidrólise do GMPc em GMP (VOLKE; WEGENER;
VASAR, 2003).
Relatos do uso de sildenafila por atletas, durante competições, têm sido divulgados
na imprensa. No entanto o fármaco não faz parte da relação de substâncias proibidas pelas
autoridades antidoping, mas é importante que se aprofundem os estudos sobre a possível
influência da sildenafila sobre a performance física.
Como o Laboratório do Movimento Humano da Universidade São Judas Tadeu
(LMH) tem, ao longo dos anos, desenvolvido pesquisas avaliando a capacidade física de ratos
frente a estímulos externos, decidiu-se avaliar a influência da sildenafila no desempenho físico
de ratos, que será tratado no próximo capítulo. No entanto, os protocolos usuais do LMH não
envolviam a avaliação do comportamento dos animais. Sendo assim, foi escolhida a medida da
atividade geral de ratos adultos no campo aberto e a avaliação do comportamento de ratos no
labirinto em cruz para fornecer informações adicionais sobre o comportamento dos animais.
A medida da atividade geral de ratos adultos no campo aberto pode ser empregada
como índice para medir emocionalidade ou alterações motoras produzidas por uma substância
e a avaliação do comportamento de ratos no labirinto em cruz avalia o potencial ansiogênico
ou ansiolítico de uma referida substância, empregá-los no presente estudo serviriam para
contribuir para o conhecimento da influência da sildenafila na performance de atletas, visto
63
que, alterações na atividade locomotora e na ansiedade poderiam ter um impacto no
desempenho esportivo.
6.1 Revisão da Literatura
Medida de Atividade Geral de Ratos Adultos no Campo Aberto
O teste de campo aberto, originalmente descrito por HALL, (1941) consiste em uma
arena circular para testar os efeitos de ambientes não familiares sobre a emocionalidade dos
ratos. É considerado um método simples, não invasivo, rápido, de fácil execução e
quantificação.
Uma das mais amplas utilizações do teste de campo aberto é a avaliação do
potencial ansiolítico de fármacos. O antagonismo entre a tendência instintiva de explorar e a
tendência de esquivar-se deste novo ambiente é avaliado principalmente com base nos
parâmetros avaliados no teste tais como frequência de locomoção e de levantar, bem como a
duração de limpeza ou imobilidade. O número de defecações também tem sido um parâmetro
avaliado neste teste (WALSH; CUMMINS, 1976).
O parâmetro frequência de locomoção pode ser expresso pelo número de secções
do ambiente transpassado pelo corpo inteiro do animal. A resposta exploratória de levantar-se
nas patas traseiras, também conhecida como rearing é muito comum em roedores e tem sido
utilizada como medida do nível de excitabilidade. A autolimpeza corporal, denominada
grooming consiste em momentos nos quais os animais lambem-se e sua medição pode ser feita
pelo número de vezes que a ação ocorre e pelo tempo dedicado a essa ação. Tal comportamento
tem sido utilizado para medir a ansiedade do animal ou indicativo não invasivo para estresse.
A taxa de defecação é obtida por meio da contagem do número de bolos fecais que o animal
elimina em uma sessão de teste. Tal comportamento é um indicador de aumento ou diminuição
da resposta autonômica do animal (FLORINDO, 2015; WALSH; CUMMINS, 1976).
O princípio que sustenta o teste é que um local não conhecido pelo animal
(ambiente não familiar) e que possui características diferentes de seu ambiente comum
normalmente é uma situação ansiogênica e assustadora para o animal. O medo gera no animal
dois comportamentos típicos, que são a defecação e imobilidade, muito embora a função ligada
64
a emocionalidade interpretadas pelas taxas de defecação e pela deambulação ainda não estão
bem elucidadas(BRUHWYLER et al., 1991) (WALSH; CUMMINS, 1976).
Na literatura são encontrados dois relatos do uso do teste de campo aberto para
avaliação de sildenafila. O primeiro estudo desenvolvido em 2003 por VOLKE, WEGENER e
VASAR, revelou que a sildenafila (0,05-10 mg/kg) não afetou o comportamento dos animais
nos testes de campo aberto. A associação de sildenafila e L-arginina também não influenciou a
atividade locomotora dos animais (VOLKE; WEGENER; VASAR, 2003). O outro estudo, de
2014, retornou resultados mais significativos, comparando a influência da sildenafila entre
camundongos jovens e idosos. Os resultados indicaram que a sildenafila (3 e 10 mg/kg)
aumentou significativamente a frequência de locomoção de camundongos jovens mas não nos
idosos (DEMIRCI et al., 2014).
Avaliação do Comportamento de Ratos no Labirinto em Cruz Elevado
O teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE), originalmente proposto FILE, S.;
HYDE, (1979) é um dos mais populares testes animais para pesquisa sobre ansiedade. Baseiase na aversão natural dos roedores para espaços abertos. O dispositivo possui dois braços
abertos e dois braços fechados posicionados numa plataforma elevada. É um teste rápido, não
invasivo e sensível aos efeitos de substâncias ansiolíticas e ansiogênicas (HARDLEY;
MITHANI, 1984; MONTGOMERY, 1958).
Para avaliação da ansiedade frente a uma determinada substância, o LCE depende
somente da tendência natural dos roedores para procurar espaços fechados. Outros ensaios
comportamentais dependem da apresentação de estímulos nocivos, tais como choques elétricos,
privação de comida e/ou água, ruídos, exposição ao predador, odores, entre outros, que
geralmente produzem uma resposta condicionada (WALF; FRYE, 2007).
A avaliação do comportamento de ansiedade em roedores tem sido realizada usando
a razão entre o tempo gasto pelo animal nos braços abertos do aparato e o tempo gasto nos
braços fechados (MONTGOMERY, 1958).
Na literatura são encontrados quatro relatos do uso do LCE para avaliação de
sildenafila. O primeiro estudo, de 2003, revelou que doses de 0.05 e 10 mg/kg não afetaram o
comportamento dos camundongos no LCE mas a associação entre sildenafila e L-arginina
significantemente diminuiu a porcentagem de entrada nos braços abertos e o tempo gasto nos
65
braços abertos concluindo que o aumento da cascata da via NO-cGMP induz efeitos
ansiogênicos nos camundongos (VOLKE, V; WEGENER; VASAR, 2003)
O segundo estudo que empregou o LCE para avaliação de sildenafila revelou que a
sildenafila na dose de 0,5 mg/kg não surtiu nenhum efeito significativo no comportamento dos
camundongos, mas em doses de 1 e 3 mg/kg induziu um efeito ansiogênico, evidenciado pela
diminuição do número de entradas nos braços abertos e pela diminuição da porcentagem de
tempo gasto nos braços abertos. A combinação de sildenafila (1 mg/kg) e azul de metileno
(1mg/kg) aboliu o efeito ansiogênico do fármaco. A combinação de sildenafila (1 mg/kg) e de
L-arginina (50 mg/kg) diminuiu a porcentagem de tempo gasto nos braços abertos em relação
ao grupo controle. Tais resultados sugeriram via do óxido nítrico-cGMP parece desempenhar
um papel importante na indução do efeito ansiogênico (KURT et al., 2004).
O terceiro estudo, também realizado em camundongos, contrariando os resultados
dos estudos anteriores, revelou resultados bastante controversos. Doses de 1,2 e 10 mg/Kg de
sildenafila aumentaram significantemente o tempo de permanência dos animais nos braços
abertos mas não aumentaram significantemente o número de entradas nos mesmos. Tais
resultados indicaram que a sildenafila poderia ter efeitos ansiolíticos, em contraponto à
conclusão dos dois estudos anteriores (SHAHIDI et al., 2011).
Mais recentemente, no quarto estudo, DEMIRCI et al., (2014) investigaram os
efeitos da sildenafila (3 e 10 mg/kg) na ansiedade em ratos jovens e idosos. Os resultados
indicaram que a sildenafila (3 e 10 mg/kg) diminuiu significantemente a porcentagem de tempo
gasto nos braços abertos em relação ao grupo controle em animais jovens, no teste do LCE,
mas apenas a dose de 10 mg/kg, diminuiu significantemente a porcentagem do número total de
entradas para os braços abertos em animais jovens. Nos animais idosos a sildenafila (3 e 10
mg/kg) diminuiu significantemente somente a porcentagem do número total de entradas para
os braços abertos. Assim, foi demonstrado que a sildenafila apresenta efeito ansiogênico tanto
em ratos jovens quanto em ratos idosos.
Tanto os estudos que fizeram uso do teste do campo aberto quanto aqueles que
fizeram uso do LCE revelaram que a sildenafila, em doses que variaram de 0,5 a 10 mg/Kg,
produz um potencial efeito ansiogênico nos camundongos analisados. A única exceção é o
estudo de Shahidi e colaboradores que indicaram um efeito ansiolítico. Todos os ensaios foram
realizados em camundongos e a via de administração da sildenafila foi a intraperitoneal e
66
envolveram animais jovens e idosos. Nenhum ensaio foi realizado em ratos, treinados ou não,
e não envolveram o uso da via oral para a administração da sildenafila.
Estudos adicionais são necessários para avaliar a influência da sildenafila em ratos
treinados empregando a via oral, a mais usual via de administração do fármaco, para avaliar o
potencial ansiogênico da substância mediante o uso do teste de campo aberto e do teste do LCE.
Tais estudos contribuirão para o entendimento da influência da sildenafila na performance de
atletas, visto que, alterações na atividade locomotora e na ansiedade poderiam ter um impacto
no desempenho esportivo.
6.2 Objetivos Específicos
c) Investigar os efeitos da administração de dose única de sildenafila sobre a
atividade geral de ratos observados em campo aberto;
d) Investigar os efeitos da sildenafila sobre o comportamento de ratos sedentários
e treinados observados no labirinto em cruz elevado após a administração de
sildenafila por 60 dias;
6.3 Material e Métodos
6.3.1 Animais
Para a realização dos estudos foram utilizados ratos Wistar (Rattus norgevicus, var.
albinus) machos, jovens, saudáveis, pesando de 300 a 330 g, provenientes do Biotério da
Universidade São Judas Tadeu.
O manejo dos animais obedeceu às normas estabelecidas e os princípios éticos da
experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e esteve
de acordo como o ARRIVE guidelines for reporting animal research (KILKENNY et al., 2010).
Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno (43 x 23 x 16
cm), forradas com maravalha, contendo, no máximo, 4 animais em cada uma, em ambiente com
temperatura controlada de 22 – 24º C, sob ciclo claro/escuro de 12 horas (luz acesa às 6 h) e,
com livre acesso à água e alimento normoproteico.
67
Os protocolos experimentais realizados neste trabalho foram aprovados pela
Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade São Judas Tadeu – CEUA/USJT em
três projetos: Projeto 003/2013 – Influência do uso agudo e crônico de um inibidor da enzima
fosfodiesterase-5 sobre o desempenho físico de ratos treinados, aprovado em 15 de maio de
2013; Projeto 010/2013 – Influência do uso agudo de um inibidor da fosfodiesterase-5 sobre o
comportamento motor de ratos, aprovado em 09 de outubro de 2013; Projeto 012/2014 –
Avaliação da Biodisponibilidade e Verificação da Velocidade de Absorção de um inibidor da
enzima fosfodiesterase-5 administrado por via oral a ratos Wistar machos, aprovado em 13 de
maio de 2014.
6.3.2 Reagentes e Fármacos
Neste protocolo as concentrações de sildenafila foram preparadas a partir de citrato
de sildenafila da marca Pharmanostra® com teor de pureza de 99,51% e diluídos em óleo de
milho comercial.
6.3.3 Administração da sildenafila aos animais
A administração aos animais foi realizada por meio de um tubo orogástrico – um
tubo de aço inox curvo específico para gavagem em ratos - composta por uma cânula com
diâmetro de 1,2 mm que apresenta uma esfera de 2,25 mm na ponta. O comprimento total do
dispositivo é de 38 mm. A dose utilizada foi de 1,5 mg/Kg e o veículo utilizado foi o óleo de
milho.
A referida dose foi escolhida tendo como base o uso da sildenafila em humanos. A
dose de 1,5 mg/Kg corresponde ao uso de comprimidos de 100 mg de sildenafila para um
homem de 70 Kg.
6.3.4 Delineamento Experimental
Protocolo do Campo Aberto em ratos
Os animais foram divididos em dois grupos de dez animais cada, totalizando 20
animais no ensaio:
Grupo 1: Pla - Grupo de animais com administração de uma única dose de placebo;
68
Grupo 2: Sil - Grupo de animais com administração de uma única dose de
sildenafila de 1,5 mg/Kg;
Protocolo do Labirinto em cruz elevado em ratos sedentários e treinados
Os animais foram divididos em quatro grupos de dez animais cada, totalizando 40
animais no ensaio:
Grupo S: Grupo de animais sedentários observados durante sessenta dias e com
uso diário de placebo;
Grupo SS: Grupo de animais sedentários observados durante sessenta dias com
administração diária de sildenafila de 1,5 mg/Kg;
Grupo T: Grupo de animais treinados em esteira durante sessenta dias com
administração diária de placebo;
Grupo TS: Grupo de animais treinados em esteira durante sessenta dias com
administração diária de sildenafila de 1,5 mg/Kg;
6.3.5 Avaliação da Atividade Geral em Campo Aberto
Esse modelo é utilizado para observação de atividade geral, no qual pode-se avaliar
vários parâmetros como a frequência de locomoção e de levantar, a duração de limpeza, a
duração de imobilidade e o número de defecações. A atividade geral observada no campo aberto
pode ser empregada como índice para medir emocionalidade ou alterações motoras provocadas
por diferentes agentes (SANT ’ ANNA. MARCELA GONÇALVES ; SÁ; ALVES, [S.d.]).
A atividade geral foi avaliada em campo aberto, da marca Insight. O equipamento
consistiu em uma arena circular, construída em acrílico de alta resistência, nas medidas de 90
cm de diâmetro por 28 cm de altura, conforme ilustrado pela figura 16. O assoalho da arena é
dividido em 12 regiões com áreas aproximadamente iguais, delimitadas por duas
circunferências concêntricas de raios diferentes e segmentos de retas radiais demarcados em
preto em sua superfície. O equipamento foi instalado em uma sala isolada, com luz difusa e
isenta de ruídos, com a finalidade de evitar quaisquer estímulos sonoros ou luminosos externos
69
ao ambiente do Campo Aberto. A observação foi registrada por uma câmera filmadora da marca
Sony, modelo HDR-CX520VE posicionada a 180 cm acima da arena.
Antes e após cada observação a arena foi limpa com um pano umedecido em
solução de álcool a 5%.
O procedimento de medida de atividade geral de ratos adultos no campo aberto foi
realizado conforme o Procedimento Operacional Padrão nº 2 da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo elaborado por Marcela Gonçalves
Sant’Anna, Patrícia de Sá e Benevides Rodrigues Alves (SANT ’ ANNA. MARCELA
GONÇALVES ; SÁ; ALVES, [S.d.]).
O procedimento consiste em, inicialmente ligar a câmera filmadora para, em
seguida, retirar o animal de sua gaiola moradia e colocá-lo no círculo central da arena. Ao final
dos cinco minutos de observação, ou seja, após cinco minutos da colocação do animal na arena,
a gravação do vídeo é finalizada e o rato é devolvido à sua gaiola moradia.
As observações dos ratos foram feitas sempre no mesmo período do dia para evitar
variações circadianos do comportamento.
Figura 16: Campo aberto.
Cada animal foi observado por 5 minutos nos tempos 10, 20, 30, 60, 120 e 240
minutos (6 sessões) após a administração da sildenafila ou do placebo.
70
Posteriormente os vídeos gravados referentes às seis observações de cada animal
foram analisados e os seguintes parâmetros foram tabulados e/ou cronometrados:
a) Frequência e tempo de locomoção: é o número de vezes e o tempo em que o
animal entra com as quatro patas em uma divisão contígua do chão da arena, durante o período
de observação. Esse parâmetro é registrado com o auxílio de um contador manual.
b) Frequência de levantar: é o número de vezes que o animal adquire a postura
de permanecer apoiado nas patas posteriores com o tronco perpendicular ao chão, tendo a
cabeça dirigida para cima, podendo ou não tocar com as patas anteriores a parede do campo
aberto. Esse parâmetro é registrado com o auxílio de um contador manual.
c) Duração de Limpeza: é o tempo, em segundos, que o animal lambe as patas
e/ou os pelos, fazendo sua higiene (grooming). Esse tempo é medido com o auxílio de um
cronômetro.
d) Duração de Imobilidade: é o tempo, em segundos, que o animal não tem
qualquer movimento espontâneo. Esse tempo é medido com o auxílio de um cronômetro.
e) Número de defecações: após o término do tempo de observação, conta-se o
número de bolos fecais na arena.
6.3.6 Avaliação do Comportamento no Labirinto em Cruz Elevado
O comportamento no labirinto em cruz elevado (LCE) foi proposto como modelo
para avaliação de fármacos ansiolíticos do grupo dos benzodiazepínicos em ratos. O racional
desse modelo leva em conta o comportamento do rato que procura locomover-se em ambientes
fechados (túneis) para evitar predadores. Assim, quando o rato pode escolher entre um ambiente
aberto e um fechado, ele prefere este último. O comportamento animal neste aparelho é
considerado um modelo experimental de ansiedade (BERNARDI, MARIA MARTHA, [S.d.];
VOLKE; WEGENER; VASAR, 2003).
O procedimento de avaliação do comportamento de ratos no labirinto em cruz
elevado foi realizado conforme o Procedimento Operacional Padrão nº 9 da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo elaborado por Maria Martha
Bernardi (BERNARDI, MARIA MARTHA, [S.d.]).
71
O LCE é constituído de dois braços abertos, opostos, medindo 50 x 10 cm e dois
braços fechados medindo 50 x 10 X 40 cm com o teto aberto, colocados de tal forma que os
braços fechados e abertos fiquem dispostos em um ângulo de 90 graus (figura 17). O piso do
labirinto é de madeira pintada de branco e a sala é iluminada artificialmente. O LCE fica
suspenso a uma altura de 50 cm do assoalho da sala por meio de um suporte de madeira. O
equipamento foi instalado em uma sala isolada, com luz difusa e isenta de ruídos, com a
finalidade de evitar quaisquer estímulos sonoros ou luminosos externos ao ambiente do
labirinto em cruz. A observação foi registrada por uma câmera filmadora da marca Sony,
modelo HDR-CX520VE posicionada a 180 cm acima da arena.
O procedimento consiste em ligar a câmera filmadora, retirar o animal de sua gaiola
moradia e colocá-lo na plataforma central do LCE. Ao final dos cinco minutos de observação,
ou seja, após cinco minutos da colocação do animal na arena, a gravação do vídeo é finalizada
e o rato é devolvido à sua gaiola moradia.
Antes e após de cada observação a arena foi limpa com um pano umedecido em
solução de álcool a 5%.
As observações dos ratos foram feitas sempre no mesmo período do dia para evitar
variações circadianos do comportamento.
Posteriormente os vídeos gravados referentes às observações de cada animal foram
analisados e os seguintes parâmetros foram tabulados e/ou cronometrados:
a) Número de entradas nos braços abertos: é considerada uma entrada quando o
animal coloca as quatro patas dentro nestes compartimentos.
b) Número de entradas nos braços fechados: é considerada uma entrada quando
o animal coloca as quatro patas dentro nestes compartimentos.
c) Tempo de permanência nos braços abertos: com o auxílio de um cronômetro
é registrado o tempo, em segundos, em que o animal permanece nesses compartimentos.
d) Tempo de permanência nos braços fechados: com o auxílio de um cronômetro
é registrado o tempo, em segundos, em que o animal permanece nesses compartimentos.
72
e) Tempo de permanência na plataforma central: com o auxílio de um
cronômetro é registrado o tempo, em segundos, em que o animal permanece nesse
compartimento.
Figura 17: Labirinto em cruz elevado.
A partir dos dados obtidos é possível calcular, para cada animal, o número total de
cruzamentos (soma do número de entradas nos braços abertos e fechados) e a porcentagem de
entradas e de tempo dispendido nos braços abertos conforme mostrado a seguir:
73
6.3.7 Análise Estatística
Para as análises estatísticas foi empregado o programa GraphPad Prism 6,01®
(GraphPad software Inc., San Diego, Ca, USA). Depois de confirmar que todas as variáveis
contínuas foram normalmente distribuídas pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, o teste de
análise de variância (ANOVA) de duas vias e para medidas repetidas foi devidamente aplicado
para a análise dos dados, seguidos do post-hoc de Bonferroni. Para os testes que consideravam
apenas uma variável, a análise foi conduzida pelo teste T de studant.
Em todas as análises as diferenças foram consideradas significantes quando p<0,05. Os
dados foram expressos como média ± desvio padrão, média ± erro padrão ou como mediana e
respectivos limites mínimo e máximo.
6.4 Resultados e Discussão
6.4.1
Avaliação da Atividade Geral em Campo Aberto
Os resultados provenientes dos efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg)
na atividade geral de ratos, avaliada em campo aberto estão apresentados nas tabelas 11 e 12 e
ilustrados nas figuras 18 e 19.
74
Tabela 11 : Efeitos da administração oral de sildenafila (1,5 mg/Kg) e de placebo na atividade
geral de ratos, avaliada em campo aberto. Os valores são representados como média ± desvio
padrão (n=10 para ambos os grupos).
Parâmetros
Frequência de
locomoção
(nº)
Frequência de
Levantar (nº)
Duração de
Limpeza
(s)
Duração de
Imobilidade (s)
10 min
20 min
30 min
60 min
120 min
240 min
10 min
20 min
30 min
60 min
120 min
240 min
10 min
20 min
30 min
60 min
120 min
240 min
10 min
20 min
30 min
60 min
120 min
240 min
Placebo
5,0 ±5,1
4,7 ±7,5
0,90 ±1,4
4,7 ±6,5
1,6 ±2,3
2,1 ±3,5
3,1 ±3,5
1,7 ±2,5
0,4 ±0,9
2,0 ±2,7
1,6 ±3,7
1,1 ±1,9
46±25
27±26
6,7±7,9
19±23
14±17
25±24
203±45
219±66
279±24
244±57
263±47
256±43
Sildenafil
16,0 ±14
6,7 ±6,5
11 ±11
13 ±12
5,3 ±5,6
8,0 ±6,2
8,9 ±9,1
2,7 ±2,2
5,4 ±6,1
7,3 ±7,9
3,8 ±6,0
6,1 ±4,9
29±22
32±23
28±32
38±41
31±40
32±41
149±98
208±41
178±78
158±93
209±71
172±83
75
Tabela 12 : Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na atividade geral de ratos,
avaliada em campo aberto. O teste estatístico empregado é o Anova de duas vias (n=10 para
ambos os grupos).
Parâmetros
Frequência de
locomoção
(nº)
Frequência de
Levantar (nº)
Frequência de
Limpeza
(s)
Duração de
Locomoção (s)
Duração de
Levantar (s)
Duração de
Autolimpeza (s)
Duração de
Imobilidade (s)
ANOVA
SS
DF
MS
F (DFn, DFd)
Interação
Fator Tempo
Fator
Tratamento
244,3
471,8
5
5
48,85
94,36
F (5, 108) = 0,9867
F (5, 108) = 1,906
1216
1
1216
F (1, 108) = 24,56
Interação
Fator Tempo
Fator
coluna
Interação
Fator Tempo
Fator
Tratamento
Interação
Fator Tempo
Fator
Tratamento
Interação
Fator Tempo
Fator
Tratamento
Interação
95,78
201,8
5
5
19,16
40,36
F (5, 108) = 0,7834
F (5, 108) = 1,650
492,1
23,57
49,27
1
5
5
492,1
4,713
9,853
F (1, 108) = 20,13
F (5, 108) = 0,5297
F (5, 108) = 1,107
28,03
11331
16848
1
5
5
28,03
2266
3370
F (1, 108) = 3,150
F (5, 108) = 1,053
F (5, 108) = 1,566
70374
993,6
874,0
1
5
5
70374
198,7
174,8
F (1, 108) = 32,71
F (5, 108) = 1,332
F (5, 108) = 1,171
1665
5174
1
5
1665
1035
F (1, 108) = 11,16
F (5, 108) = 1,278
4683
5
936,6
F (5, 108) = 1,157
2193
23916
45782
1
5
5
2193
4783
9156
F (1, 108) = 2,708
F (5, 108) = 1,095
F (5, 108) = 2,096
129955
1
129955
F (1, 108) = 29,75
Fator Tempo
Fator
Tratamento
Interação
Fator Tempo
Fator
Tratamento
F= razão de duas estimativas; SS= soma dos quadrados; DF= graus de liberdade; MS= média
dos quadrados;
76
Figura 18: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na frequência de locomoção,
na frequência de levantar e na frequência de autolimpeza de ratos, avaliada em campo aberto.
(*p<0,05)
77
Figura 19: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) no tempo de locomoção, tempo
de levantar, tempo de autolimpeza e tempo de imobilidade de ratos, avaliada em campo aberto.
(*p<0,05)
Na tabela 13 é possível observar o número de defecações dos ratos expostos a
sildenafila e ao placebo.
Aos 10, 20, 60 e 240 min é possível verificar que a sildenafila influenciou
significantemente o número de defecações dos animais no campo aberto.
Tabela 13: Número de Defecações nos testes de campo aberto mediante a administração de
dose de 1,5 mg/Kg de sildenafila. (n=10)
Tempo (min)
10
20
30
60
120
240
Sildenafila
Placebo
0,30±0,48
0,10±0,32
0
0,10±0,32
0,10±0,32
0,30±0,67
2,0±1,6
2,1±2,4
0,40±0,70
2,3±2,4
1,9±3,2
3,2±2,6
Estatística
(t-student)
*p=0,0038
*p=0,0160
*p=0,0104
*p=0,0029
78
Na análise dos efeitos da sildenafila no campo aberto é importante compreender o
que ocorre quando um rato, em condições normais, é colocado repetidamente no campo aberto.
Originalmente o teste de campo aberto foi utilizado para avaliar a emocionalidade
em condições de alta luminosidade e som. Quando são reduzidos os estímulos ambientais, como
foi o caso deste trabalho, outros comportamentos como o exploratório e o motor são expressos.
Inicialmente o parâmetro proposto para avaliar a emocionalidade foi a frequência
de defecação. Notou-se, a seguir, que em situações de alta emocionalidade havia correlação
inversa entre a defecação e a locomoção.
A locomoção em campo aberto é um padrão complexo de comportamento
influenciado não só pelo componente exploratório como também pelo “ emocional “(BARON,
1964; MONTGOMERY; MONKMAN, 1955; WALSH; CUMMINS, 1976). Assim, na
primeira sessão de observação, ocorre competição entre os comportamentos de evitação ou fuga
com o aspecto de novidade que leva à exploração do ambiente. Nas demais sessões de
observação predomina o aspecto de investigação do ambiente, ou seja, de exploração
(WHIMBEY; DENENBERG, 1967). Portanto, a locomoção apresenta características, ora de
emocionalidade, ora de exploração. Além disso, em função do tempo, a locomoção apresenta,
inicialmente, um decréscimo na sua frequência seguida de um platô. Exposições repetidas ao
campo aberto levam à habituação às condições do teste e a locomoção é reduzida
gradativamente (TAMASY et al., 1973).
Por outro lado, quando as condições ambientais são de baixa de luminosidade, a
locomoção e a imobilidade podem refletir o comportamento motor dos animais (BERNARDI,
M. M.; DE SOUZA; NETO, 1981; BERNARDI, M. M.; NETO, 1979). Os presentes resultados
mostram que a sildenafila aumentou a frequência e o tempo de locomoção aos 10 min de
observação, comparados aos animais do grupo placebo. Associando os dados obtidos no estudo
da farmacocinética da sildenafila discutido no capítulo anterior é possível notar que aos 10
minutos a concentração média plasmática de sildenafila é de 0,4687 µg/mL, ou seja, neste
momento da observação o fármaco já está presente na circulação sanguínea do animal e,
portanto, pode estar envolvido com o aumento da frequência deste parâmetro. Além disto
verifica-se que não só aos 10 minutos, mas aos 30, 60 e 240 minutos houve maior tempo de
locomoção dos animais do grupo experimental. Paralelamente, nota-se que nestes momentos
que o tempo de imobilidade foi reduzido nos ratos tratados com sildenafila. Estes dados
sugerem que o fármaco interferiu aumentando a atividade motora dos animais.
79
No entanto, nota-se que aos 20 minutos após a administração do fármaco não foram
evidenciadas alterações significantes na frequência de locomoção e nos tempos de locomoção
e imobilidade dos animais do grupo experimental, embora os níveis plasmáticos do fármaco
apresentados no estudo da farmacocinética estivessem aumentados quando comparados ao
existente aos 10 minutos.
Dos 30 minutos em diante verifica-se aumento nos tempos de locomoção e redução
do tempo de imobilidade dos animais tratados com o fármaco com relação àqueles do grupo
placebo, embora se observem diferenças significantes apenas em alguns tempos (frequência de
locomoção aos 30 minutos; tempo de locomoção e de imobilidade aos 30, 60 e 240 minutos).
Pode-se então sugerir que a sildenafila apresente um efeito bifásico com um pico
aos 10 minutos e voltando a ter efeitos estimulantes após 30 minutos de observação.
Tomando-se em conta a relação inversa entre os dados da locomoção e imobilidade
pode-se sugerir que a sildenafila promoveu aumento da atividade motora dos animais em campo
aberto.
Nota-se ainda que este efeito perdurou até o final das observações. Desde que a
exposição repetida ao campo aberto levou à habituação dos animais do grupo placebo, pode-se
sugerir que a sildenafila impede a habituação dos animais.
Segundo ADES, (1975) o levantar no campo aberto pode ser tido como
manifestação de um processo exploratório de aproximação por parte do animal de regiões
modificadas do ambiente, ou, de modo alternativo, como um estado de ativação generalizada
da qual faltaria o componente exploratório. Assim, a locomoção teria características
exploratórias e de emocionalidade e o levantar , embora falho em alguns aspectos, teria também
conotações exploratórias (CARNEVALE; VITULLO; SADILE, 1990). Embora não se tenha
observado diferenças significantes no levantar dos ratos tratados com a sildenafila com relação
ao grupo placebo, o perfil deste comportamento sugere também aumento deste parâmetro
similar àquele da locomoção. É fato conhecido que a expressão do levantar no campo aberto é
reduzida quando ocorre ativação motora havendo competição com a expressão da locomoção
(BERNARDI, M. M.; PALERMO-NETO, 1984). Desta forma, a ausência de diferenças
significantes entre os grupos placebo e experimental no levantar pode ter sido consequência da
competição entre locomoção e levantar devido à estimulação da locomoção.
80
Embora menos evidente, o perfil do parâmetro autolimpeza é também similar ao do
levantar e locomoção embora nos momentos iniciais de observação sua expressão seja menor
que do grupo placebo.
É importante notar que no campo aberto dois tipos de comportamento ocorrem:
aqueles voltados ao meio ambiente e os voltados ao próprio animal. A locomoção e levantar
são expressos em relação ao meio ambiente e o limpar ao próprio animal. E nos casos de
ativação motora, a limpeza também aumenta paralelamente aos demais parâmetros, mas
inicialmente o componente exploratório é mais relevante reduzindo a expressão do levantar.
No presente trabalho o perfil dos resultados da autolimpeza também são compatíveis com o
aumento da atividade motora.
Finalmente, os presentes resultados mostraram aumento da locomoção em paralelo
à redução na imobilidade dos animais tratados com a sildenafila, os quais são compatíveis com
um efeito estimulante motor do fármaco.
Neste sentido, os sistemas dopaminérgicos do núcleo accumbens modulam a
atividade locomotora (PULVIRENTI; SWERDLOW; KOOB, 1989). Além dos efeitos em
áreas ligadas ao comportamento sexual, a sildenafila também age nos sistema dopaminérgicos
do núcleo accumbens (KYRATSAS et al., 2013), o que pode justificar seu efeito estimulante
motor presentemente observado.
A exposição repetida ao campo aberto leva à habituação à situação de novidade e o
rato branco gradativamente reduz a exploração do ambiente e, suas atividades voltam-se ao
próprio animal, sendo este fenômeno denominado habituação (BOLIVAR et al., 2000). No
presente experimento, nota-se que os ratos do grupo placebo na medida que as exposições ao
campo aberto decorrem, observa-se redução gradativa dos parâmetros voltados ao meio
ambiente e aumento naqueles voltados ao próprio animal quando comparados à primeira
exposição ao aparelho. Por outro lado, os ratos tratados com sildenafila não mostram habituação
às várias exposições ao campo aberto. Neste sentido, fármacos que aumentam a atividade
motora como as anfetaminas também impedem a habituação a diferentes exposições ao campo
aberto (FURLAN; BRANDÃO, 2001). Altas doses de cafeína, um outro inibidor da
fosfodiesterase, também aumentam a atividade motora de ratos (CAMPOS et al., 2005).
No campo aberto a defecação é tida como um índice de reatividade emocional
(ORTET; IBÁÑEZ, 1999). Neste trabalho observa-se redução persistente na frequência de
defecação dos ratos tratados com sildenafila em comparação aos ratos do grupo placebo, o que
81
reforça a sugestão de que o fármaco teria efeitos motores e não emocionais no campo aberto.
6.4.2 Avaliação do Comportamento no Labirinto em Cruz Elevado
Os resultados provenientes das avaliações do comportamento de ratos, sedentários
e treinados, no labirinto em cruz elevado mediante administração prolongada à sildenafila (1,5
mg/Kg/dia durante 60 dias) estão apresentados nas tabelas 14 a 20 e ilustrados nas figuras 20 e
21.
Tabela 14: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na avaliação do comportamento
de ratos sedentários no labirinto em cruz elevado. Os valores são representados como média ±
desvio padrão (n=8 para ambos os grupos).
Substância
NBA
NBF
TBA
TBF
0
3,25±1,49
0
291,63±7,84
0,63±0,74
6,88±1,79
8±13,60
177,88±70,81
Sildenafil
(1,5 mg/Kg)
Placebo
NBA- Nº de Entradas nos Braços Abertos; NBF- Nº de Entradas nos Braços Fechados; TBATempo nos Braços Abertos; TBF- Tempo nos Braços Fechados;
Tabela 15: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) na avaliação do comportamento
de ratos treinados no labirinto em cruz elevado. Os valores são representados como média ±
desvio padrão (n=8 para ambos os grupos).
Substância
NBA
NBF
TBA
TBF
Sildenafil
0,25±0,46
3,13±2,85
5,88±12,01
265,75±36,73
0,63±0,92
3,75±2,60
17,75±26,58
198,63±103,26
(1,5 mg/Kg)
Placebo
NBA- Nº de Entradas nos Braços Abertos; NBF- Nº de Entradas nos Braços Fechados; TBATempo nos Braços Abertos; TBF- Tempo nos Braços Fechados;
82
Tabela 16: Resultado do teste ANOVA de duas vias entre ratos treinados e sedentários placebo
e sildenafil.
Variação do recurso % de variação total
Valor de P
Índice de P
Significante?
Interação
12,28
0,0006
***
Sim
Fator Tempo
44,66
< 0,0001
****
Sim
Fator Tratamento
0,5455
0,6975
ns
Não
Tabela 17: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) durante 60 dias na avaliação
do comportamento de ratos treinados no labirinto em cruz elevado. O teste estatístico
empregado é o Anova de duas vias (n=8 para ambos os grupos).
Tabela do ANOVA
SS
DF
MS
F (DFn, DFd)
Interação
2523
9
280,4
F (9, 112) = 3,594
Fator Linha
9176
3
3059
F (3, 112) = 39,21
Fator Tratamento
112,1
3
37,37
F (3, 112) = 0,4790
83
40
Sedentário Placebo
Sedentário Sildenafila
Treinado Placebo
Treinado Sildenafila
** **
30
20
10
e
(B
e
A
e
N
N
B
B
A
F(
A
F(
TB
D
)
C
)
C
)
D
(B
A
TB
)
0
e
Número de entradas nos braços
Sedentário x Treinados e Sildenafila x Placebo
Grupos
Figura 20: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) e de placebo na avaliação do
comportamento de ratos treinados e sedentários no labirinto em cruz elevado.
Tabela 18: Número de Cruzamentos e % de Entradas nos braços abertos do LCE em ratos
sedentários e treinados mediante a administração de dose de 1,5 mg/Kg de sildenafila. Os
valores são representados como média ± desvio padrão (n=8 para ambos os grupos).
Sedentários
Treinados
Nº Cruzamentos
% Entrada nos
Braços Abertos
Nº Cruzamentos
% Entrada nos
Braços Abertos
Sildenafil
2,8±1,8
15±22
3,4±2,8
4,5±8,5
Placebo
7,5±4,5
0
5,1±3,4
14±16
NBA- Nº de Entradas nos Braços Abertos; NBF- Nº de Entradas nos Braços Fechados; TBATempo nos Braços Abertos; TBF- Tempo nos Braços Fechados;
84
Tabela 19: Resultado do teste ANOVA de duas vias entre ratos treinados e sedentários placebo
e sildenafil na avaliação do comportamento de ratos treinados e sedentários no labirinto em
cruz elevado.
Variação do recurso
% de variação total
Valor de P
Índice de P
Significante?
Interação
2,913
0,2515
ns
Não
Fator Tempo
17,89
0,0065
**
Sim
Fator Tratamento
1,988
0,3421
ns
Não
Tabela 20: Efeitos da administração de sildenafila (1,5 mg/Kg) e de placebo na avaliação do
comportamento de ratos treinados no labirinto em cruz elevado. O teste estatístico empregado
é o Anova de duas vias (n=8 para ambos os grupos).
Tabela ANOVA
SS
DF
MS
F (DFn, DFd)
Valor de P
Interação
13,23
1
13,23
F (1, 36) = 1.358
P = 0.2515
Fator Tempo
81,23
1
81,23
F (1, 36) = 8.343
P = 0.0065
Fator Tratamento
9,025
1
9,025
F (1, 36) = 0.9270
P = 0.3421
Interação
350,5
36
9,736
-
-
Número de Crizamentos
Numero de Cruzamentos
8
Treinado
Sedentário
6
4
2
Si
ld
en
af
ila
Pl
ac
eb
o
0
Figura 21: Número de Cruzamentos nos braços abertos do LCE em ratos sedentários e
treinados mediante a administração de dose de 1,5 mg/Kg de sildenafila ou placebo.
85
No labirinto em cruz elevada nota-se que a sildenafila, em ratos sedentários,
aumenta o tempo no braço fechado e o número de cruzamentos com relação ao seu grupo
placebo. Pode-se então sugerir que a sildenafila promove ansiedade neste modelo
comportamental e aumento de sua atividade motora. Este último dado está de acordo com
aqueles observados em campo aberto em que notou-se aumento da atividade motora induzido
pela sildenafila.
Os dados sobre os efeitos da sildenafila na ansiedade no labirinto em cruz elevada
são controversos. Assim, KURT et al.(2004) mostram que em camundongos a administração
aguda de sildenafila em doses que variaram entre 1 e 3 mg/kg promove ansiedade no teste do
labirinto em cruz elevada e que este efeito seria independente daqueles observados na atividade
motora espontânea observada em caixa de motilidade. Assim, os autores verificaram que a
atividade motora dos ratos não era modificada pela menor dose do fármaco e prejudicada na
maior dose empregada. No entanto, nos dois tratamentos, a sildenafila reduziu a porcentagem
de tempo no braço aberto. DEMIRCI et al., (2014) relataram também que a sildenafila aumenta
a atividade motora em ratos jovens e promove ansiedade em animais adultos e jovens em doses
que variaram entre 3 e 10 mg/kg, i. ., 30 minutos antes dos testes, momento este que coincide
com os observados no campo aberto.
Por outro lado, em outro estudo, foi relatado que a administração de sildenafila
(0.05-10 mg/kg i.p.) não afetou o comportamento de camundogos no labirinto em cruz elevada
e no campo aberto(VOLKE; WEGENER; VASAR, 2003).
Somente quando se associou a sildenafila com o precursor de NO, a L-arginina (200
mg/kg, i.p.) é que observou-se aumento da ansiedade e redução da atividade geral em campo
aberto. Os autores concluíram que este fármaco apresenta efeito ansiogênico em ratos resultante
da promoção da via do NO-GMPc seguido da inibição da hidrólise do GMPc a GMP (VOLKE;
WEGENER; VASAR, 2003). Neste sentido, a via do GMPc-NO deve estar envolvida na
regulação de certas funções do Sistema Nervoso Central - SNC, incluindo a atividade
locomotora e ansiedade. Muitos estudos experimentais e observações clínicas indicam que a
sildenafila tem algum efeito sobre o SNC, no entanto o mecanismo de ação não é precisamente
conhecido (KURT et al., 2004; SHAHIDI et al., 2011).
É importante lembrar que as diferenças entre os presentes resultados e aqueles da
literatura podem ser consequência de diferenças nas doses empregadas, via de administração e,
finalmente, da espécie empregada.
86
É fato conhecido que o exercício moderado tem efeitos ansiolíticos por reduzir o
estresse oxidativo em várias áreas cerebrais implicadas nas respostas de ansiedade (PIETRELLI
et al., 2012; SALIM et al., 2010; VOLLERT et al., 2011). Os presentes resultados nos ratos
treinados do grupo placebo mostram que os mesmos permanecem maior tempo no braço aberto
que os demais grupos e mostram redução no número cruzamentos quando comparados aos
animais do grupo sildenafila não treinados. Pode-se então sugerir que o treinamento reduza
tanto a ansiedade destes ratos como sua ativação motora em relação a ratos não treinados
concordando com dados da literatura.
Por outro lado, nota-se que ratos treinados e tratados com sildenafila mostram
redução do tempo no braço aberto em relação ao grupo placebo porém o número de
cruzamentos é reduzido. Desta forma pode-se sugerir que a sildenafila promove ansiedade
mesmo em ratos treinados e que, de acordo com KURT et al., ( 2004) é independente da
ativação motora.
A comparação dos resultados obtidos no estudo da farmacocinética, um estudo
invasivo, com os resultados obtidos no teste do campo aberto, um estudo não invasivo, nos
permitem sugerir que as alterações do comportamento motor e da emocionalidade acontecem
nos tempos próximos ao tmax (40 min), ou seja, um método não invasivo forneceu informações
de que nos momentos onde houve uma maior manifestação do aumento da atividade motora e
aumento da emocionalidade, coincidem com os momentos nos quais a concentração plasmática
de sildenafila estão aumentados.
6.5 Conclusão
O presente estudo é o primeiro a ser realizado em ratos, treinados ou não, que
envolveu o uso da via oral para a administração da sildenafila, a via mais usual desse fármaco
em humanos.
A sildenafila promove um aumento da atividade motora em campo aberto e também
impediu a habituação dos animais.
Os resultados no campo aberto permitem concluir que a sildenafila tem ação
estimulante motora sugerida por efeitos motores e não efeitos emocionais.
87
No labirinto em cruz elevada a sildenafila promove ansiedade e aumento da
atividade motora. Este último dado está de acordo com aqueles observados em campo aberto
em que notou-se aumento da atividade motora induzido pela sildenafila.
A sildenafila, tanto no campo aberto quanto no labirinto em cruz elevada, induz um
aumento da atividade motora dos animais.
A sildenafila também promove ansiedade nos animais experimentais.
O treinamento reduz tanto a ansiedade quanto a ativação motora em relação a ratos
não treinados, mas o uso de sildenafila promove a ansiedade mesmo em ratos treinados.
88
Capítulo IV: Influência
desempenho físico de ratos
da
sildenafila
sobre
o
7.1 Introdução
A sildenafila, por promover vasodilatação sobre o sistema respiratório, em situação
de hipóxia tem se mostrado eficaz no manejo da hipertensão pulmonar desencadeada pela
diminuição de oxigênio disponível, principalmente em altitude. Justamente por essa razão a
sildenafila parece emergir como uma potente ajuda ergogênica durante o exercício executado
em situação de hipóxia (HSU et al., 2006). Nesse sentido, a sildenafila tem sido utilizado por
atletas, principalmente ciclistas, triatletas, corredores e jogadores de futebol, em competição
em situação de hipóxia originada por grandes altitudes (GHOFRANI et al., 2004, 2002).
Alguns ensaios clínicos realizados em humanos, na maioria das vezes, atletas,
indicaram que, em situação de hipóxia, a capacidade média de realização de exercícios diminui
significativamente nos voluntários que fizeram uso de placebo; porém, naqueles que fizeram
uso da sildenafila houve restauração parcial da tolerância ao exercício (HSU et al., 2006;
RICHALET et al., 2005). A própria inibição da PDE-5 pode ter um efeito vasodilatador sobre
a circulação pulmonar , provavelmente pelo aumento da disponibilidade de GPMc dentro da
vasculatura pulmonar (RICHALET et al., 2005). Em normóxia, a administração aguda à
sildenafila não desencadeou nenhuma mudança significativa na capacidade física e no débito
cardíaco dos indivíduos (HSU et al., 2006).
A maioria dos estudos encontrados na literatura investigou somente os efeitos da
administração aguda da sildenafila sobre o desempenho físico de atletas, no entanto, poucos
trabalhos estudaram os efeitos da administração prolongada ao fármaco, bem como seus
possíveis efeitos em indivíduos não treinados.
Nesse sentido, as perguntas que norteiam este capítulo são:
a) O uso prolongado da sildenafila poderia influenciar no desempenho físico em
situação de normóxia?
b) Indivíduos treinados responderiam diferentemente de indivíduos sedentários à
administração prolongada do medicamento em situação de normóxia?
89
Como o Laboratório do Movimento Humano da Universidade São Judas Tadeu
vem, ao longo dos últimos anos, desenvolvendo protocolos para avaliação física em modelos
experimentais envolvendo ratos, decidiu-se buscar respostas às perguntas norteadoras por meio
do uso de protocolos experimentais envolvendo ratos machos saudáveis.
7.2 Objetivos Específicos
a)
Verificar a influência da administração oral prolongada, por 60 dias, de
sildenafila, em conjunto com o treinamento físico aeróbico, sobre o ganho de peso de ratos;
b)
Verificar a influência da administração oral prolongada, por 60 dias, de
sildenafila, em conjunto com o treinamento físico aeróbico, sobre a capacidade física de
ratos;
c)
Verificar a influência da administração oral prolongada, por 60 dias, de
sildenafila, em conjunto com o treinamento físico aeróbico, sobre parâmetros
hemodinâmicos e autonômicos de ratos;
7.3 Revisão da Literatura
7.3.1. Treinamento físico e modulação autonômica cardiovascular
O exercício físico regular promove alterações estruturais e funcionais nos
mecanismos centrais e periféricos do sistema cardiovascular (MARTINS-PINGE, 2011;
MICHELINI; STERN, 2009). A bradicardia de repouso observada em atletas é um marcador
do efeito do exercício físico (DIXON et al., 1992) que está relacionada com as adaptações
autonômicas cardiovasculares, bem como da frequência cardíaca intrínseca (AUBERT; SEPS;
BECKERS, 2003). Nesse sentido, tem se observado que o balanço autonômico de atletas é
caracterizado pela predominância da atividade parassimpática em relação à simpática (DE
ABREU et al., 2009).
O controle autonômico cardíaco pode ser avaliado através do monitoramento da
variabilidade da frequência cardíaca (VFC), uma técnica não invasiva utilizada para avaliar a
90
variação instantânea dos intervalos entre ondas R (intervalo RR) do eletrocardiograma
(BERNTSON et al., 1997; TASK FORCE OF THE EUROPEAN SOCIETY OF
CARDIOLOGY;
NORTH
AMERICAN
SOCIETY
OF
PACING
AND
ELECTROPHYSIOLOGY, 1996; VANDERLEI et al., 2009) ou através da variação dos
intervalos de pulsos pressóricos (intervalo de pulso – IP). As mudanças nos índices da VFC
indicam a capacidade do sistema nervoso autônomo em responder a vários estímulos
fisiológicos e ambientais, tais como a respiração, exercício físico, estresse mental, alterações
hemodinâmicas e metabólicas, do sono e postura, bem como compensar desordens resultantes
de doenças (THAYER; STERNBERG, 2006; THAYER et al., 2012). Fatores como nível de
condicionamento físico, a experiência, a intensidade, programação de treinamento e rotina
diária do atleta podem influenciar aspectos fisiológicos e emocionais relacionados a mudanças
nas respostas autonômicas durante o treino, e consequentemente os índices de VFC.
7.3.1 Sildenafila e capacidade física em hipóxia
Alguns estudos têm investigado os efeitos da sildenafila sobre a performance física
em altitude.
GHOFRANI et al., (2004) encontraram que a administração aguda de sildenafila a
indivíduos saudáveis levou a uma diminuição da pressão pulmonar arterial e aumento do débito
cardíaco. Houve também aumento da capacidade de exercício durante exposição à hipóxia
aguda (10% de oxigênio) e em 5245 m de altitude (GHOFRANI et al., 2004).
RICHALET et al., (2005) também observaram perda do decréscimo na
performance no exercício máximo em sujeitos tratados com sildenafila comparado ao uso de
placebo a 4350 m de altitude, apesar do débito cardíaco não ter sido diferente entre os grupos
de indivíduos que usaram sildenafila e os que utilizaram placebo (RICHALET et al., 2005).
Em contraste, o estudo de RICART et al., (2005) mostrou uma supressão na pressão
pulmonar arterial com sildenafila durante o exercício em altitude simulada de 5000 m, mas
verificou alteração na saturação de oxigênio ou medidas ventilatórias e indicou que os efeitos
da sildenafila sobre o exercício eram inconclusivos (RICART et al., 2005).
7.3.2 Sildenafila e capacidade física em normóxia
HSU et al. (2006) com o propósito de examinar o efeito de duas doses de sildenafila
sobre a função cardiovascular em normóxia durante um ensaio em submáxima realizado em
91
ciclo ergômetro com tempo definido, verificou que não houve melhoria do débito cardíaco e da
performance no exercício em situação de normóxia. No entanto houve uma tendência de
aumento na frequência cardíaca e diminuição da pressão arterial sistólica durante o exercício.
O experimento foi realizado em ciclistas e triatletas e a sildenafila foi administrada durante três
dias seguidos. Os resultados apontam que, de onze sujeitos inicialmente incluídos no protocolo,
um teve uma intolerável dor de cabeça após a administração do medicamento e não cumpriu o
protocolo, ou seja, dez sujeitos concluíram o experimento. Desses dez indivíduos, seis foram
enquadrados como não respondedores ao medicamento e quatro como respondedores, portanto
as considerações sobre o efeito do medicamento sobre a performance dos indivíduos foram
centradas somente em quatro sujeitos (HSU et al., 2006).
7.4 Material e Métodos
7.4.1 Animais
Para a realização dos estudos foram utilizados ratos Wistar (Rattus norgevicus, var.
albinus) machos, jovens, saudáveis, pesando de 300 a 330 g, provenientes do Biotério da
Universidade São Judas Tadeu.
O manejo dos animais obedeceu às normas estabelecidas e os princípios éticos da
experimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA e esteve
de acordo como o ARRIVE guidelines for reporting animal research (KILKENNY et al., 2010).
Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno (43 x 23 x 16 cm)
forradas com maravalha, contendo, no máximo, 4 animais em cada uma, em ambiente com
temperatura controlada de 22 – 24º C, sob ciclo claro/escuro de 12 horas (luz acesa às 6 h) e,
com livre acesso à água e alimento normoproteico.
Os protocolos experimentais realizados neste trabalho foram aprovados pela
Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade São Judas Tadeu – CEUA/USJT em
três projetos: Projeto 003/2013 – Influência do uso agudo e crônico de um inibidor da enzima
fosfodiesterase-5 sobre o desempenho físico de ratos treinados, aprovado em 15 de maio de
2013; Projeto 010/2013 – Influência do uso agudo de um inibidor da fosfodiesterase-5 sobre o
comportamento motor de ratos, aprovado em 09 de outubro de 2013; Projeto 012/2014 –
Avaliação da Biodisponibilidade e Verificação da Velocidade de Absorção de um inibidor da
92
enzima fosfodiesterase-5 administrado por via oral a ratos Wistar machos, aprovado em 13 de
maio de 2014.
7.4.2 Reagentes e Fármacos
Neste protocolo as doses de sildenafila foram preparadas a partir de citrato de
sildenafila da marca Pharmanostra® com teor de pureza de 99,51% e diluídos em óleo de milho
comercial.
Administração da sildenafila e do placebo aos animais:
A administração aos animais foi realizada por meio de um tubo orogástrico – um
tubo de aço inox curvo específico para gavagem em ratos - composta por uma cânula com
diâmetro de 1,2 mm que apresenta uma esfera de 2,25 mm na ponta. O comprimento total do
dispositivo é de 38 mm. A dose utilizada foi de 1,5 mg/Kg e o veículo utilizado foi o óleo de
milho. A alíquota administrada foi de 0,5 mL. Para ajuste da dose à alíquota de 0,5 mL os
animais foram pesados a cada semana e, de acordo com o peso dos animais, as soluções de
sildenafila foram preparadas para que a dose de 1,5 mg/Kg seja obedecida.
A dose de 1,5 mg/Kg foi escolhida tendo como base o uso da sildenafila em
humanos. A dose de 1,5 mg/Kg corresponde ao uso de comprimidos de 100 mg de sildenafila
para um homem de 70 Kg.
A administração de placebo (0,5 mL de óleo de milho comercial) foi realizada
durante 60 dias em razão do protocolo de treinamento físico.
Verificação do teor de sildenafila no plasma:
Após a eutanásia dos animais por decapitação, foi realizada a coleta do sangue com
heparina sódica, este foi centrifugado e submetido à quantificação de sildenafila de acordo com
o método de CLAE desenvolvido e validado.
Cada uma das amostras de plasma coletada dos animais pertencentes ao presente
estudo foi submetida ao procedimento de extração e quantificação por três vezes, sendo assim,
93
a concentração plasmática do fármaco e o desvio-padrão entre as três análises realizadas da
mesma amostra foram utilizados para a obtenção dos dados analíticos.
7.4.3 Delineamento Experimental
A administração de sildenafila ou placebo nos grupos treinados foi realizada sempre
uma hora antes do início do treinamento físico. Para manter o padrão de treinamento os grupos
sedentários foram tratados com sildenafila ou placebo nos mesmos horários.
Os animais foram divididos em quatro grupos e, de acordo com o cálculo amostral,
contaram com 8 animais por grupo a seguir relacionados:
S – Grupo de animais sedentários. No 1º dia foi realizado o teste de esforço inicial.
No 61º dia foram submetidos a uma dose de placebo e, em seguida, submetidos ao teste de
esforço final.
S Sil– Grupo de animais sedentários. No 1º dia foi realizado o teste de esforço
inicial. Todos os dias os animais receberam uma dose média de sildenafila de 1,5 mg/Kg. No
61º dia foram submetidos a uma dose de sildenafila e, em seguida, submetidos ao teste de
esforço final.
T– Grupo de animais treinados por sessenta dias. No 1º dia foi realizado o teste de
esforço inicial. No 61º dia foram submetidos a uma dose de placebo e, em seguida, submetidos
ao teste de esforço final.
T Sil – Grupo de animais treinados por sessenta dias. No 1º dia foi realizado o teste
de esforço inicial. Todos os dias os animais receberam uma dose média de sildenafila de 1,5
mg/Kg. No 61º dia foram submetidos a uma dose de sildenafila e, em seguida, submetidos ao
teste de esforço final.
7.4.4 Peso corporal
Os animais constantes do presente protocolo foram pesados, uma vez por semana,
em balança digital, com a finalidade de obter o peso corporal de cada rato. O referido peso
corporal de cada animal foi empregado para o ajuste da dose de fármaco administrada aos
animais.
94
7.4.5 Teste de Esforço Máximo e Treinamento Físico
Antes da realização do teste de esforço inicial, os animais foram adaptados em
esteira ergométrica (figura 22) durante 10 minutos a 0,3 Km/h por três dias. Inicialmente todos
os animais (treinados e sedentários) foram submetidos a um primeiro teste de esforço, a fim de
estabelecer a velocidade máxima de cada animal. O teste de esforço consistiu em colocar o
animal correndo na esteira a 0,3 Km/hora por 3 minutos, sendo que esta carga foi incrementada
em 0,3 Km/h a cada três minutos até que o animal atingisse a exaustão (MOSTARDA,
CRISTIANO; ROGOW; et al., 2009). O critério utilizado para a determinação da exaustão do
animal e interrupção do teste foi o momento em que o rato não foi mais capaz de correr mediante
o incremento de velocidade da esteira (BROOKS; WHITE, 1978). Os grupos treinados
realizaram um teste de esforço intermediário (com trinta dias de protocolo) para reajuste da
intensidade do treinamento. Ao final do estudo, após sessenta dias de treinamento/tratamento,
todos os grupos experimentais realizaram o teste de esforço máximo na presença de seus
respectivos tratamentos, ou seja, placebo e sildenafila.
Este teste apresenta correlação positiva com a medida do consumo direto de
oxigênio em ratos machos, conforme evidenciado por Rodrigues et al., (2007), o que permitiu
fidedignidade para a prescrição e controle do treinamento físico (RODRIGUES et al., 2007).
Os animais pertencentes aos grupos T e T Sil foram submetidos a um protocolo de
treinamento físico em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva, em uma
intensidade de 60 a 75% da velocidade máxima atingida no teste de esforço cinco dias por
semana, durante 60 dias.
95
Figura 22: Treinamento físico dos ratos em esteira ergométrica. Fonte: Bruno Rodrigues.
7.4.6 Avaliações Hemodinâmicas e da Sensibilidade Baroreflexa
Após o período de treinamento, no 61º dia os animais foram anestesiados (i.p.) com
uma solução de cloridrato de cetamina (50mg/Kg, Ketalar, Parke-Davis©) e cloridrato de
xilazina (12mg/Kg, Rompum, Bayer), e colocados em decúbito dorsal para que se realizasse
uma pequena incisão na região inguinal por onde foram implantados cateteres de polietileno
(cânulas; tygon P50) preenchidos com soro fisiológico. Essas cânulas foram posicionadas no
interior da artéria carótida e veia jugular para registro da pressão arterial (PA), frequência
cardíaca (FC) e administração de fármacos. Após a correta e firme implantação das cânulas,
estas foram exteriorizadas no dorso do animal na região cervical e fixadas com fio de algodão
na pele (IRIGOYEN et al., 2005; MOSTARDA, CRISTIANO; ROGOW; et al., 2009)
Para o registro da pressão arterial e frequência cardíaca de repouso os animais foram
mantidos em caixas individuais (Plexiglas, 25x15x10cm). As avaliações hemodinâmicas
sistêmicas ocorrem após 24 horas da canulação, com o animal acordado. A cânula arterial foi
conectada a uma extensão de 20 cm (P50), permitindo livre movimentação do animal pela
caixa, durante todo o período do experimento. Esta extensão esteve conectada a um transdutor
eletromagnético, (Blood Pressure XDCR, Kent Scientific, Litchfield, CT, EUA) que, por sua
96
vez, estava conectada a um pré-amplificador (STEMTECH BPMT-2, Quintron Instrument Inc,
Milwaukee, EUA). Os sinais de PA foram gravados durante um período de 30 minutos em um
microcomputador equipado com um sistema de aquisição de dados (CODAS, DATAQ
Instruments©, Akron, OH, EUA), permitindo análise dos pulsos de pressão, batimento-abatimento, com uma frequência de amostragem de 2000 Hz por canal. A análise foi feita
utilizando-se programa comercial associado ao sistema de aquisição. Este programa permitirá
a detecção de máximos e mínimos da curva de pressão batimento a batimento, fornecendo os
valores de pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e média (PAM), pela integral da
área sob a curva no tempo. A FC foi determinada a partir do intervalo entre dois picos sistólicos.
Após o registro da PA, com os animais em condições de repouso, a sensibilidade
dos pressorreceptores foi testada por meio de doses crescentes da infusão de fenilefrina (0,25
µg, 0,5 µg, 1,0 µg, 2,0 µg, 4,0 µg e 8,0 µg) e de nitroprussiato de sódio (0,25 µg, 0,5 µg, 1,0
µg, 2,0 µg, 4,0 µg e 8,0 µg). A sensibilidade barorreflexa foi avaliada pelo índice calculado por
meio da divisão da variação da FC pela variação PAM. Esses fármacos foram injetados
randomicamente entre os animais, iniciando-se a sessão com um ou outro fármaco. Para a
análise da sensibilidade dos pressorreceptores, o pico máximo ou mínimo da PAM foi
comparado aos valores de PAM do período controle. Da mesma forma, a variação máxima da
FC foi comparada com os valores de FC do período controle, imediatamente antes da injeção
dos fármacos, para posterior quantificação das respostas. A sensibilidade barorreflexa foi
avaliada pelo índice calculado por meio da divisão da variação da FC pela variação PAM
(IRIGOYEN et al., 2005; MOSTARDA, C et al., 2012; MOSTARDA, CRISTIANO;
ROGOW; et al., 2009).
Vale salientar que as avaliações hemodinâmicas foram realizadas em dois
momentos: no momento 1, os registros hemodinâmicos foram realizados sem a adição de
sildenafila ou placebo; no momento 2, ou seja, no dia seguinte, com os animais canulados, os
registros hemodinâmicos e da sensibilidade barorreflexa foram realizados após uma hora da
administração da sildenafila ou placebo, mimetizando as condições que os animais eram
treinados.
97
7.4.7 Avaliação da Modulação Autonômica
A variabilidade da FC e da PAS foi avaliada no domínio do tempo (variância) e no
domínio da frequência usando o modelo auto regressivo. Em resumo, neste método, séries
temporais do intervalo de pulso e da PAS foram divididas em segmentos de 350 batimentos
com sobreposição de 50%. Um espectro foi obtido para cada um dos segmentos via o recurso
de Levinson-Durbin, com a ordem modelo escolhido de acordo com critério do Akaike,
variando entre 10 e 14. Os componentes oscilatórios dos espectros foram quantificados em 2
faixas de frequência: baixa frequência (LF: 0,20-0,75 Hz) e alta frequência (HF: 0,75-4,0 Hz).
A potência do espectro foi calculada para cada componente reconhecível nas faixas de LF e HF
integrando-se os espectros dos componentes. A potência foi expressa como a intensidade de LF
e HF. Os segmentos que apresentaram oscilações muito lentas (<0,1 Hz), que contribuem para
mais de 70% da variabilidade total, foram considerados não estacionários e descartados do
estudo (MOSTARDA, CRISTIANO; WICHI; et al., 2009; RODRIGUES et al., 2012).
Como os registros hemodinâmicos foram realizados em 2 momentos, conforme
explicado acima, as análises da variabilidade da frequência cardíaca e da pressão arterial
sistólica foram também assim realizadas.
7.4.8 Análise Estatística
Todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. Para análise
dos dados foi utilizado o software STATISTICS® 6.0 (Statsoft©). Depois de confirmar que
todas as variáveis contínuas foram normalmente distribuídas pelo teste de KolmogorovSmirnov, o teste de análise de variância (ANOVA) de duas vias e para medidas repetidas foi
devidamente aplicado para a análise dos dados, seguidos do post-hoc de Bonferroni. Valores
de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
98
7.5 Resultados e Discussão
7.5.1 Peso Corporal
A Tabela 21 mostra e a Figura 23 ilustra os resultados provenientes da aferição do
peso corporal dos animais.
Analisando os resultados foi possível observar que todos os animais ganharam peso
ao longo dos sessenta dias do protocolo.
Tabela 21: Peso corporal e ganho de peso de ratos nos grupos Sedentário + Placebo (S, n=8),
Sedentário + Sildenafila (S Sil, n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (T
Sil, n=12).
S
S Sil
T
T Sil
(N=8)
(N=8)
(N=10)
(N=12)
Inicial (g)
315±12
325±4
306±4
330±6
Final (g)
357±11
366±6
318±5*†
337±5†
Ganho de peso (g)
40,5±3,1
43,6±4,2
10,5±1,3*†
8,2±2,0*†
PESO
Os dados representam média ± EPM. * P<0,05 vs. S; † P<0,05 vs. SS.
O ganho de peso foi significantemente menor nos animais treinados tratados com
placebo quando comparados aos animais sedentários que utilizaram placebo, ou seja, o
treinamento contribuiu significantemente com um menor ganho de peso corporal. Nos animais
treinados tratados com sildenafila o ganho de peso foi ainda mais atenuado.
Nos animais sedentários, o uso de sildenafila não influenciou significantemente no
ganho de peso dos ratos, quando comparados aos animais que foram tratados com placebo.
Os resultados obtidos demonstram que o protocolo de treinamento físico em esteira
ergométrica com velocidade e carga progressiva, em uma intensidade de 60 a 75% da
velocidade máxima atingida no teste de esforço cinco dias por semana, durante 60 dias, levou
a menor ganho de peso nos animais, comprovando, mais uma vez, o benefício da prática de
99
exercício físico regular sobre o peso corpóreo (JANSSEN; KATZMARZYK; ROSS, 2004;
OSCAI; HOLLOSZY, 1969; PARIZKOVAF, 1963). Também foi possível constatar que a
sildenafila não influencia no ganho de peso nem de animais treinados e nem de animais
sedentários, ou seja, o uso prolongado da sildenafila (60 dias) não interfere no peso corpóreo
dos animais.
*
*
Peso Corporal (g)
400
†
†
300
200
100
0
Pi Pf G
Pi Pf G
Pi Pf G
S
S Sil
T
Pi Pf G
T Sil
Grupos
Pi = peso corporal inicial; Pf= peso corporal final; G= Ganho de
peso corporal; S = sedentários; T= treinados; Sil= sildenafila;
P=placebo; * e # p<0,05;
Figura 23: Peso Corporal dos ratos treinados e sedentários expostos à sildenafila e ao placebo.
7.5.2 Capacidade Física
A capacidade física dos animais foi verificada mediante a avaliação da velocidade
atingida nos testes de esforço inicial e final, da distância percorrida nos referidos testes e pelo
tempo necessário para atingir a exaustão nos testes de esforço inicial e final.
A Tabela 22 mostra e a Figura 24 ilustra os resultados relativos à capacidade física
dos ratos sedentários e treinados tratados com sildenafila ou placebo.
A velocidade atingida pelos animais nos teste de esforço inicial nos quatro grupos
do estudo variaram de 1,46 a 1,58 Km/h e não foram significantemente diferentes, confirmando
a homogeneidade entre os grupos experimentais. As mesmas afirmações são válidas para a
100
distância percorrida pelos animais no teste de esforço inicial e para o tempo necessário para
atingir a exaustão.
Quanto à velocidade máxima atingida no teste de esforço final, é possível constatar
que entre os animais sedentários, a sildenafila não interferiu significantemente na velocidade
atingida no teste. Em relação aos efeitos do treinamento físico, os animais treinados atingiram
uma velocidade máxima no teste de esforço final maior que os animais sedentários. Nos grupos
dos animais treinados, os animais tratados com sildenafila atingiram uma maior velocidade
quando comparados aos animais tratados com placebo. Assim, os dados relativos à velocidade
máxima atingida pelos animais nos testes de esforço final revelam que a sildenafila aumenta
significantemente a velocidade somente nos animais submetidos ao treinamento físico
aeróbico.
Quanto à distância percorrida pelos animais no teste de esforço final é possível
constatar que entre os animais sedentários, a sildenafila não interferiu significantemente na
distância percorrida.
Tabela 22: Capacidade física de ratos sedentários (S) e treinados (T) nos grupos Sedentário +
Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S Sil, n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e
Treinado + Sildenafila (T Sil, n=12).
PARÂMETROS
S
S Sil
T
T Sil
Vel. TE Inicial (Km/h)
1,58±0,08
1,46±0,11
1,56±0,04
1,58±0,05
Vel. TE Final (Km/h)
1,65±0,08
1,67±0,06
2,65±0,09*†
2,97±0,08*†‡
Dist Perc. TE Inicial (Km)
0,25±0,02
0,19±0,02
0,21±0,01
0,23±0,01
Dist Perc. TE Final (Km)
0,23±0,01
0,24±0,01
0,61±0,03*†
0,71±0,03*†‡
Tempo TE Inicial (min)
16,42±1,01
12,51±2,35
13,52±1,34
14,59±1,55
Tempo TE Final (min)
14,32±0,84
15,2±0,78
24,25±1,9*†
29,1±0,69*†‡
Os dados representam média ± EPM. PC – peso corporal; Vel. – velocidade; TE – teste de
esforço; Dist. Perc. – distância percorrida. * P<0,05 vs. S; † P<0,05 vs. SS; ‡ P<0,05 vs. T.
101
Conforme
esperado,
os
animais
treinados
percorreram
uma
distância
significantemente maior que os animais sedentários. Nos grupos dos animais treinados (tratados
ou não), os animais tratados com sildenafila percorreram uma maior distância se comparados
aos animais tratados com placebo e, quando comparados ao grupo dos animais sedentários
(tratados ou não). Quanto ao tempo gasto pelos animais para atingir a exaustão no teste de
esforço final é possível constatar que entre os animais sedentários, a sildenafila não interferiu
significantemente no tempo gasto durante o teste. Os animais treinados resisitiram
significantemente mais tempo que os animais sedentários. Nos grupos dos animais treinados,
os animais tratados com sildenafila resistiram mais tempo quando comparados aos animais
tratados com placebo e, quando comparados ao grupo dos animais sedentários os tempos gastos
são significantemente maiores que nos animais sedentários expostos à sildenafila e ao placebo.
102
Velocidade no TE Final
Velocidade (Km/h)
4
***
3
**
**
2
***
1
SI
L
T
S
S
SI
L
T
0
Grupos
Distância Percorrida no TE Final
Distância (Km)
0.8
***
***
0.6
0.4
**
**
0.2
L
T
SI
T
SI
L
S
S
0.0
Grupos
Tempo Gasto no TE Final
40
***
Tempo (s)
30
20
***
**
**
10
T
SI
L
T
SI
L
S
S
0
Grupos
Figura 24: Capacidade física de ratos sedentários (S) e treinados (T) nos grupos Sedentário +
Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S SIL, n=8), Treinado + Placebo (T, n=10) e
Treinado + Sildenafila (T SIL, n=12).
103
Diante dos resultados apresentados, é possível afirmar que o treinamento aumenta
a velocidade atingida, a distância percorrida e o tempo gasto para atingir a exaustão no teste de
esforço fínal, ou seja, a capacidade física dos animais é aumentada quando são submetidos a
sessões frequentes de treinamento físico.
Particularmente, quanto à influência da administração oral de 1,5 mg/Kg de
sildenafila sobre a capacidade física dos animais é possível afirmar que a sildenafila, em
animais sedentários, não apresenta nenhuma influência significante, no entanto em animais
treinados a sildenafila melhora significantemente a capacidade física dos animais.
No capítulo anterior, foi sugerido que a sildenafila pode promover uma ativação do
núcleo accumbens, mediado por uma via dopaminérgica, gerando um aumento da atividade
motora nos animais. Esse aumento da atividade motora não possui relação com a
emocionalidade.
Quando o animal foi exposto à sildenafila, verificou-se que, caso o mesmo tenha
sido treinado, seu desempenho geral (distância percorrida, velocidade alcançada e tempo gasto)
foi superior aos animais expostos ao placebo, ou seja, tais dados sugerem que a sildenafila
promove uma melhora na capacidade física de animais treinados, pois a ativação do núcleo
accumbens gera um aumento da atividade motora (PULVIRENTI; SWERDLOW; KOOB,
1989), mas somente animais com condicionamento físico adequado conseguiram obter melhor
desempenho.
Os ratos treinados apresentaram uma capacidade física aumentada quando
comparados com os animais sedentários. O VO2 max em ratos apresenta correlação positiva
(r=0,83) com a velocidade máxima atingida no teste de esforço máximo em esteira, ou seja, os
dados de velocidade média obtidos no presente ensaio demonstram que o treinamento dos
animais contribuiu significantemente para o aumento da velocidade média obtida, assim, é
possível interpretar que o VO2 max também aumentou com o treinamento físico (RODRIGUES
et al., 2007).
Adicionalmente foi verificado que, entre os animais treinados, a velocidade média
atingida foi superior no grupo de animais expostos à sildenafila, ou seja, a sildenafila, contribuiu
significantemente no aumento da VO2 max nos ratos. O referido aumento foi superior ao
aumento causado pelo treinamento, assim é possível interpretar que a sildenafila aumenta os
níveis de VO2 max de indivíduos treinados, alavancando uma melhora na capacidade física dos
animais.
104
Extrapolando para as competições esportivas, nossos resultados possibilitam inferir
que o uso prolongado de sildenafila por atletas, pode melhorar a VO2 max dos mesmos,
possibilitando um melhor rendimento na competição.
A sildenafila, por ser um inibidor da PDE-5 promove aumento nos níveis celulares
de GMPc, um agente que promove diminuição da concentração de cálcio intracelular,
desencadeando o relaxamento da musculatura lisa, ou seja, a sildenafila desencadeia efeito
vasodilatador em órgãos ou sistemas onde a PDE-5 esteja presente (CAMPBELL, HELEN
ELOISE, 2005; KATZENSTEIN, 2001; ZHAO et al., 2001).
A PDE-5 é encontrada em altas concentrações nas células do músculo liso vascular
dos corpos cavernosos do pênis, nas células musculares lisas dos vasos, na circulação coronária,
nos pulmões e nas plaquetas (WALLIS et al., 1999), assim podem reduzir o tônus vascular na
circulação coronariana, pulmonar ou periférica. Em voluntários saudáveis, a administração oral
de sildenafila resultou na redução da pressão sistólica e pressão arterial diastólica por 7 – 10
mmHg (ZUSMAN et al., 1999).
Foi demonstrado o efeito vasodilatador da sildenafila e o acúmulo de GMPc em um
experimento realizado com anéis de aorta com a finalidade de comprovar a ação da sildenafila
na circulação periférica e coronária (WALLIS et al., 1999), num outro experimento, foi
demonstrado em pacientes com severa doença arterial coronariana que a sildenafila
desencadeou pequenas modificações nas pressões arteriais sistêmica e pulmonar, não
apresentando efeitos significantes sobre a pressão capilar pulmonar, pressão atrial direita,
batimento cardíaco ou débito cardíaco.
7.5.3 Variáveis Hemodinâmicas - Resultados
7.5.3.1 Sem o uso de placebo ou sildenafila
Os dados relativos às variáveis hemodinâmicas estão apresentados na tabela 23. Os
resultados apontam que a pressão arterial sistólica (PAS) dos animais sedentários expostos à
sildenafila foi significantemente maior quando comparados aos animais tratados com placebo.
Nos animais treinados a sildenafila contribuiu significantemente para aumentar a PAS quando
comparados com os animais tratados com placebo. Os animais treinados tratados com placebo
apresentaram significantemente uma PAS menor que os animais sedentários tratados com
105
sildenafila, ou seja, ser sedentário ou ser treinado não afetou a PAS mas o uso de sildenafila,
tanto nos animais sedentários quanto nos treinados, contribuiu para aumentar a PAS dos ratos.
Tabela 23: Variáveis hemodinâmicas avaliadas SEM o uso de Sildenafila ou Placebo nos
grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (SS, n=8), Treinado + Placebo
(T, n=10) e Treinado + Sildenafila (TS, n=12).
S
SS
T
TS
PAS (mmHg)
128±4
153±5*
116±3†
148±1*‡
PAD (mmHg)
95±5
100±5
87±4
102±1‡
PAM (mmHg)
109±6
126±4
104±5†
123±1‡
FC (bpm)
340±7
312±6
310±9*
318±5
RT (bpm/mmHg)
2,10±0,09
2,05±0,08
2,52±0,08*†
2,71±0,07*†
RB (bpm/mmHg)
-1,43±0,12
-1,62±0,31
-2,07±0,14*†
-2,08±0,30*†
Os valores representam média ± EPM. PAS – pressão arterial sistólica; PAD – pressão arterial
diastólica; PAM – pressão arterial média; FC – frequência cardíaca; RT – resposta taquicárdica;
RB – resposta bradicárdica . * P<0,05 vs. S; † P<0,05 vs. SS; ‡ P<0,05 vs. T.
Diferentemente da PAS, a pressão arterial diastólica (PAD) não foi alterada
significantemente em animais sedentários, independente de terem sido tratados com placebo ou
sildenafila. Nos animais treinados a PAD foi significantemente maior nos animais tratados com
sildenafila.
Ao analisar a pressão arterial média (PAM) verificou-se que entre os animais
sedentários, o uso do placebo ou da sildenafila não altera significantemente a PAM dos animais,
no entanto, entre os animais treinados a sildenafila contribui significantemente para o aumento
da PAM quando comparados ao placebo.
106
A frequência cardíaca (FC) não foi alterada nos animais sedentários tanto pelo uso
do placebo quanto pelo uso da sildenafila, entretanto nos animais treinados expostos ao placebo
a FC foi significantemente menor que a FC dos animais sedentários expostos ao placebo. A
administração de sildenafila não influenciou na FC dos animais.
Tanto na resposta taquicárdica (RT) quanto na resposta bradicárdica (RB), o uso da
sildenafila não apresentou interferência significante, no entanto o treinamento contribuiu para
um aumento significante nas respostas.
7.5.3.2 Com o uso de placebo ou sildenafila
Os dados relativos às variáveis hemodinâmicas estão apresentados na tabela 24. Os
resultados apontam que a pressão arterial sistólica (PAS) dos animais sedentários expostos à
sildenafila foi significantemente maior quando comparados aos animais tratados com placebo.
Nos animais treinados, a sildenafila contribuiu significantemente para aumentar a PAS quando
comparados aos animais tratados com placebo. Os animais treinados tratados com placebo
apresentaram significantemente uma PAS menor que os animais sedentários tratados com
sildenafila, ou seja, ser sedentário ou ser treinado não afetou a PAS mas o uso de sildenafila,
tanto nos animais sedentários quanto nos treinados, contribuiu para aumentar a PAS dos ratos.
Nos animais sedentários a pressão arterial diastólica (PAD) aumentou
significantemente em animais tratados com sildenafila quando comparada aos animais expostos
ao placebo. Nos animais treinados a PAD foi significantemente maior nos animais tratados com
sildenafila. Os animais treinados expostos à sildenafila PAD significantemente maior que os
animais sedentários expostos ao placebo.
Ao analisar a pressão arterial média (PAM) verificou-se que, entre os animais
sedentários, o uso da sildenafila aumentou significantemente a PAM quando comparado aos
animais expostos ao placebo.
Entre os animais treinados a sildenafila contribui significantemente para o aumento
da PAM quando comparados ao placebo. A PAM dos animais treinados expostos a sildenafila
é significantemente maior que a PAM dos animais sedentários expostos ao placebo.
107
Tabela 24: Variáveis hemodinâmicas avaliadas COM o uso de Sildenafila ( 1,5 mg/Kg) ou
Placebo nos grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (SS, n=8), Treinado
+ Placebo (T, n=10) e Treinado + Sildenafila (TS, n=12).
S
SS
T
TS
PAS (mmHg)
125±6
148±5*
119±4†
152±2*‡
PAD (mmHg)
89±4
108±3*
85±6†
109±2*‡
PAM (mmHg)
107±7
127±3*
102±4†
128±2*‡
FC (bpm)
348±6
349±8
317±5*†
351±7‡
RT (bpm/mmHg)
2,23±0,09
2,11±0,06
2,64±0,07*†
2,42±0,08†
RB (bpm/mmHg)
-1,52±0,13
-1,62±0,20
-2,15±0,12*
-1,94±0,16
Os valores representam média ± EPM. PAS – pressão arterial sistólica; PAD – pressão arterial
diastólica; PAM – pressão arterial média; FC – frequência cardíaca; RT – resposta taquicárdica;
RB – resposta bradicárdica . * P<0,05 vs. S; † P<0,05 vs. SS; ‡ P<0,05 vs. T.
A frequência cardíaca (FC) não foi alterada nos animais sedentários tanto pelo uso
do placebo quanto pelo uso da sildenafila. Entretanto, nos animais treinados expostos a
sildenafila, a FC foi significantemente maior que a FC dos animais expostos ao placebo. A FC
dos animais treinados expostos ao placebo foi significantemente menor que a FC dos animais
sedentários expostos ao placebo.
A
resposta
taquicárdica
(RT)
nos
animais
treinados
foi
aumentada
significativamente com o uso da sildenafila quando comparado ao uso do placebo.
A resposta bradicárdica (RB) não foi influenciada pelo uso da sildenafila tanto em
animais sedentários quanto em animais treinados, no entanto o uso do placebo nos animais
treinados contribuiu para um aumento da RB quando comparados aos animais sedentários
expostos ao placebo.
Com a administração da sildenafila a RT e a RB apresentaram resultados diferentes.
108
7.5.4 Modulação Autonômica - Resultados
7.5.4.1 Sem o uso de placebo ou sildenafila
Os resultados da avaliação da modulação autonômica cardiovascular sem o uso de
placebo ou sildenafila estão apresentados na Tabela 25.
Quanto à variabilidade do intervalo de pulso (IP), a variância do intervalo de pulso
(Var IP) nos animais treinados aumentou significantemente quando comparados aos animais
sedentários, independentemente de terem sido expostos ao placebo ou fármaco. Quanto à raiz
quadrada da média do quadrado das diferenças entre os intervalos RR normais adjacentes
(RMSSD), pode-se afirmar que somente nos animais sedentários expostos ao placebo a
RMSSD apresentou valores significantemente menores que em todos os outros grupos de
animais.
Na banda de baixa frequência (BF) não foi verificada diferença significante nos grupos
testados, mas quando os valores foram convertidos em porcentagem, o grupo de animais
treinados expostos à sildenafila apresentou valores significantemente menores que os grupos
dos animais sedentários expostos ao fármaco. Na banda de alta frequência (AF), o grupo de
animais treinados expostos à sildenafila apresentou valores significantemente maiores que os
grupo dos animais sedentários expostos ao placebo, mas quando os valores foram convertidos
em porcentagem, a diferença deixou de ser evidenciada.
Ao processarmos a relação entre BF e AF (BF/AF) não se verifica diferenças
significantes entre os grupos.
109
Tabela 25: Modulação autonômica cardiovascular SEM o uso de Sildenafila ou Placebo nos
grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (S Sil, n=8), Treinado + Placebo
(T, n=10) e Treinado + Sildenafila (T Sil, n=12).
S
S Sil
T
T Sil
80±5
78±6
112±5*†
115±10*†
RMSSD (ms2)
5,5±0,2
8,1±0,6*
7,8±0,8*
7,9±0,3*
BF (ms2)
5,3±1,1
9,2±1,6
5,9±0,9
7,9±1,1
BF (%)
19,8±2,8
29,7±3,1
20,5±3,3
15,3±2,2†
AF (ms2)
12,3±1,1
21,4±3,3
17,2±2,1
21,8±2,2*
AF (%)
75,9±3,9
70,2±3,1
65,9±4,1
69,5±3,9
BF/AF
0,46±0,02
0,44±0,07
0,37±0,03
0,38±0,08
29±4
35±4
33±3
37±4
4,0±0,9
10,4±1,1*
3,8±0,7†
8,1±0,8*‡
0,92±0,05
0,93±0,04
1,15±0,07
1,02±0,07
Variabilidade do IP
Var IP (ms)
Variabilidade da PAS
Var PAS (mmHg2)
BF (mmHg2)
Índice α (ms/mmHg)
Os valores representam média ± EPM. IP – intervalo de pulso; Var IP – variância do intervalo
de pulso; RMSSD - raiz quadrada da média do quadrado das diferenças entre os intervalos RR
normais adjacentes; BF – banda de baixa frequência; AF – banda de alta frequência; PAS –
pressão arterial sistólica; Var PAS – variância da pressão arterial sistólica; Índice α –
representativo do barorreflexo espontâneo. * P<0,05 vs. S; † P<0,05 vs. SS; ‡ P<0,05 vs. T.
Quanto à Variabilidade da Pressão Arterial Sistólica, a variância da pressão arterial
sistólica (Var PAS) e o Índice α – representativo do barorreflexo espontâneo (Índice α) não
apresentaram diferenças significativas entre os grupos testados. No entanto, a BF dos animais
sedentários foi significantemente maior nos animais expostos à sildenafila. Nos animais
treinados expostos ao placebo, a BF foi significantemente menor que os animais sedentários
110
expostos ao placebo e nos animais treinados expostos à sildenafila BF foi significantemente
maior que a BF dos animais sedentários e treinados expostos ao placebo.
7.5.4.2 Com o uso de placebo ou sildenafila
Os resultados da avaliação da modulação autonômica cardiovascular com o uso de
sildenafila ou placebo estão apresentados na tabela 26.
Quanto à variabilidade do intervalo de pulso, a variância do intervalo de pulso Var
IP nos animais treinados aumentou significantemente quando comparados aos animais
sedentários, independentemente de terem sido expostos ao placebo ou fármaco. Quanto à raiz
quadrada da média do quadrado das diferenças entre os intervalos RR normais adjacentes
(RMSSD), não foram evidenciadas diferenças significativas entre os grupos testados.
Na banda de baixa frequência (BF) nos animais sedentários expostos à
sildenafila a BF foi significantemente maior nos animais sedentários expostos ao placebo. Nos
animais treinados a sildenafila não interferiu na resposta, no entanto é evidenciado uma grande
redução na resposta quando comparados os animais treinados expostos ao placebo aos animais
sedentários expostos à sildenafila. Quando os valores foram convertidos em porcentagem, o
grupo de animais treinados expostos ao placebo apresentou valores significantemente menores
que os grupos dos animais sedentários expostos ao placebo e ao fármaco.
Na banda de alta frequência (AF), o grupo de animais treinados expostos à
sildenafila apresentou valores significantemente maiores que os grupo dos animais sedentários
expostos ao placebo e ao fármaco. Quando os valores foram convertidos em porcentagem, o
grupo de animais treinados expostos ao placebo apresentou valores significantemente maiores
que os grupo dos animais sedentários expostos ao placebo e ao fármaco.
Ao processarmos a relação entre BF e AF (BF/AF) nos animais sedentários a
administração de sildenafila contribuiu para o aumento na relação BF/AF e, os grupos de
111
animais treinados expostos ao placebo e ao fármaco apresentaram uma relação BF/AF
significantemente menor que os animais do grupo sedentários expostos à sildenafila e ao
placebo.
Tabela 26: Modulação autonômica cardiovascular COM o uso de Sildenafila ou Placebo nos
grupos Sedentário + Placebo (S, n=8), Sedentário + Sildenafila (SS, n=8), Treinado + Placebo
(T, n=10) e Treinado + Sildenafila (TS, n=12).
S
SS
T
TS
77±6
57±6
110±4*†
115±10*†
RMSSD (ms2)
5,3±0,5
5,7±0,3
7,3±0,6
7,6±0,9
BF (ms2)
5,9±2,2
16,7±3,0*
6,5±1,3†
13,2±2,2
BF (%)
47±5
50±4
27±4*†
40±5
AF (ms2)
10,1±0,9
11,9±1,6
18,5±2,1
25,8±5,0*†
AF (%)
48±6
49±4
68±3*†
57±4
BF/AF
0,61±0,06
1,44±0,11*
0,34±0,07†
0,53±0,08†
33±5
55±8
30±2†
37±7
5,1±0,5
44,2±5,1*
4,4±0,3†
13,5±2,0†‡
0,81±0,02
0,48±0,07*
0,92±0,04†
0,88±0,08†
Variabilidade do IP
Var IP (ms)
Variabilidade da PAS
Var PAS (mmHg2)
BF (mmHg2)
Índice α (ms/mmHg)
Os valores representam média ± EPM. IP – intervalo de pulso; Var IP – variância do intervalo
de pulso; RMSSD - raiz quadrada da média do quadrado das diferenças entre os intervalos RR
normais adjacentes; BF – banda de baixa frequência; AF – banda de alta frequência; PAS –
pressão arterial sistólica; Var PAS – variância da pressão arterial sistólica; Índice α –
representativo do barorreflexo espontâneo. * P<0,05 vs. S; † P<0,05 vs. SS; ‡ P<0,05 vs. T.
Quanto à Variabilidade da Pressão Arterial Sistólica, a variância da pressão arterial
sistólica (Var PAS) dos animais treinados expostos ao placebo foi significantemente menor que
nos animais sedentários expostos ao fármaco.
112
A BF dos animais sedentários foi significantemente maior nos animais expostos à
sildenafila e nos animais treinados expostos ao placebo, a BF foi significantemente menor que
os animais sedentários expostos à sildenafila. Nos animais treinados expostos à sildenafila a BF
foi significantemente maior que a BF dos animais sedentários e treinados expostos ao placebo.
O Índice α dos animais sedentários expostos ao fármaco foi significantemente
menor que nos animais expostos ao placebo e, nos animais treinados expostos ao placebo e ao
fármaco o Índice α foi significantemente maior que nos animais sedentários expostos à
sildenafila.
7.5.5 Variáveis Hemodinâmicas e Modulação Autonômica - Discussão
O exercício físico promove benefícios tanto na redução da pressão arterial quanto
na modulação autonômica cardiovascular, pois promove redução da pressão arterial pósexercício em relação aos níveis pré-exercício (HALLIWILL, 2001; PESCATELLO et al.,
2004). Cabe ressaltar que o efeito protetor do exercício físico também está associado à redução
dos fatores de risco cardiovasculares e à menor morbimortalidade, quando comparadas pessoas
ativas com indivíduos de menor aptidão física, o que explica a recomendação deste na
prevenção primária e no tratamento da hipertensão (FAGARD, 2006; MYERS et al., 2002;
NOGUEIRA et al., 2010).
O sistema nervoso autônomo é um importante neuromodulador dos sistemas
cardiovascular e metabólico em humanos, permitindo que o sistema nervoso central mantenha
a homeostase diante das alterações, tanto agudas quanto crônicas, em estados fisiológicos e
patológicos. O sistema nervoso autonômico influencia tônica e reflexamente o sistema
cardiovascular, uma vez que tanto a noradrenalina quanto a acetilcolina liberadas no coração
modificam o débito cardíaco, por alterar a força de contração das fibras miocárdicas, bem como
a FC. Nos vasos de resistência da circulação sistêmica, a liberação de noradrenalina modifica
o estado contrátil do músculo liso vascular e, assim, a resistência vascular periférica (DAVID
ROBERTSON, 2004; MOSTARDA, C; et al., 2009).
A FC é controlada primariamente pela atividade direta do Sistema Nervoso
Autônomo, por meio dos seus ramos simpático e parassimpático sobre a auto-ritmicidade do
nódulo sinusal, com predominância vagal (parassimpática) em repouso, que é progressivamente
113
inibida com o exercício e simpática quando do posterior incremento da intensidade do esforço
(ALMEIDA; ARAÚJO, 2003; EKBLOM; HERMANSEN, 1968).
Nos primeiros quatro segundos do exercício físico, ocorre um aumento da FC quase
que exclusivamente mediado pela inibição vagal sem participação vagal expressiva, em parte
decorrente dos diferentes tempos de latência do simpático e do parassimpático a esse estresse
fisiológico, o exercício físico (ALMEIDA; ARAÚJO, 2003)(EKBLOM; HERMANSEN,
1968).
O treinamento aeróbio tende a proporcionar melhoras no consumo máximo de
oxigênio (ALMEIDA; ARAÚJO, 2003; BLOMQVIST; SALTIN, 1983; SEALS; CHASE,
1989) provocadas, pelo menos em parte, por um aumento do débito cardíaco, principalmente à
custa de um aumento do volume sistólico. Já a FC máxima não tende a se alterar, enquanto
valores menores podem ser vistos em repouso e, principalmente, durante um exercício
submáximo (FOX et al., 1975), provavelmente relacionados a mecanismos como aumento do
retorno venoso e da contratilidade miocárdica (YOSHIGA; HIGUCHI, 2002).
As adaptações no comportamento da FC advindas do treinamento físico,
especialmente o aeróbico, podem ser decorrentes de modificações no balanço simpático-vagal
ou mesmo de adaptações intrínsecas como melhora no sistema de condução atrioventricular
(STEIN et al., 2000).
Uma única sessão de exercício físico provoca diminuição na pressão arterial no
período pós-exercício e essa queda perdura por 24 horas, tendo, portanto, importância clínica.
Essa diminuição da pressão arterial está diretamente relacionada à duração do exercício físico,
mas não à sua intensidade (NEGRÃO; URBANA; RONDON, 2001). O treinamento físico de
baixa intensidade (~50% a 55% do consumo de oxigênio de pico) provoca atenuação na
hipertensão arterial, tanto em ratos espontaneamente hipertensos como em pacientes
hipertensos. No rato espontaneamente hipertenso, o treinamento físico melhora o controle
barorreflexo (KRIEGER; BRUM; NEGRÃO, 1999), o que é decorrente de uma maior
sensibilidade do nervo depressor aórtico. Essa melhora no controle barorreflexo pode estar
associada à atenuação do tônus simpático no coração que determina a diminuição da frequência
cardíaca de repouso. Essa alteração no cronotropismo cardíaco de repouso tem grande
importância, porque reduz o débito cardíaco e, em consequência, a pressão arterial, em ratos
espontaneamente hipertensos (NEGRÃO; URBANA; RONDON, 2001).
114
Vários são os métodos invasivos e não invasivos utilizados para avaliar a função
autonômica, tanto em seres humanos quanto em animais de experimentação. Entre eles, a
medida das catecolaminas, a microneurografia, a sensibilidade barorreflexa, a variabilidade da
frequência cardíaca (VFC) e da pressão arterial (VPA) nos domínios do tempo e da frequência
(análise espectral) podem ser considerados os mais utilizados. O estudo no domínio da
frequência ou a análise espectral têm alcançado considerável interesse por ser método não
invasivo que estima atividade neural e não neural por meio de oscilações a curto e longo prazos
da PA e da FC. Por intermédio da análise espectral é possível “separar” um sinal em seus
componentes frequenciais e quantificar a potência desses componentes (MOSTARDA,
CRISTIANO; WICHI; et al., 2009)
Estudos clínicos e experimentais têm demonstrado que o componente espectral de
alta frequência (AF) da VFC reflete a modulação parassimpática, enquanto o componente de
baixa frequência (BF) corresponde, principalmente, à modulação simpática, embora com a
presença de um componente parassimpático (MALLIANI et al., 1991). Além disso, o
componente de BF da VPA reflete também a modulação simpática, dessa vez para o vaso.
Adicionalmente, o controle da PA, por meio do barorreflexo, modulando a
atividade do sistema nervoso simpático e parassimpático para o coração e vasos, parece estar
envolvido na gênese dos diversos componentes da VPA e da FC (MOSTARDA, CRISTIANO;
WICHI; et al., 2009).
Comparando os resultados apresentados nas avaliações hemodinâmicas no primeiro
momento (sem a adição de placebo ou sildenafila) com o segundo momento (com a adição de
placebo ou sildenafila 1 hora antes da avaliação), é possível verificar que o aumento da PAS
nos animais treinados ou sedentários que foram expostos por um tempo prolongado ao fármaco
independe da presença do fármaco na corrente sanguínea, ou seja, a sildenafila, possivelmente
promoveu uma alteração no organismo dos ratos, capaz de aumentar a pressão arterial sistólica
dos animais, independentemente da presença do fármaco no momento da avaliação
hemodinâmica. O mesmo padrão foi percebido na PAD dos animais treinados, no entanto, nos
animais sedentários, a sildenafila aumentou a PAD somente no segundo momento.
A PAM, no primeiro momento, não foi afetada nos animais sedentários, mas no
segundo momento, a sildenafila contribuiu para o aumento da PAM. Entretanto, nos dois
momentos, em animais treinados a sildenafila aumentou a PAM.
115
De uma maneira geral, era de se esperar que durante a ação da sildenafila no
organismo ocorresse uma diminuição pressão arterial dos animais, visto que a sildenafila
promove vasodilatação.
A FC, no primeiro momento, não foi alterada nos animais sedentários tanto pelo
uso do placebo quanto pelo uso da sildenafila. Todavia, nos animais treinados expostos ao
placebo, a FC foi significantemente menor que a FC dos animais sedentários expostos ao
placebo. No segundo momento, a FC nos animais treinados expostos à sildenafila foi maior que
a FC dos animais expostos ao placebo, ou seja, a presença da sildenafila aumenta a FC somente
em animais treinados.
A relação entre a sildenafila e o sistema cardiovascular tem sido investigada em
diversos estudos. Alguns dados disponíveis na literatura existem acerca dos efeitos
hemodinâmicos da sildenafila e indicam uma ligeira diminuição da pressão arterial e nenhuma
alteração na frequência cardíaca. Entretanto, estudos mais detalhados dos efeitos circulatórios
neurais da sildenafila eram escassos, ainda mais sobre o sistema nervoso simpático. PHILLIPS
et al., (2000), num ensaio randomizado duplo-cego cruzado, avaliaram o efeito da sildenafila
na hemodinâmica e tráfego do simpático em repouso e durante condições estressantes e
encontraram que a sildenafila provocou um aumento na atividade simpática.
O referido aumento foi constatado pelos registros da atividade nervosa simpática
muscular e pelos níveis de catecolamina no plasma. Foi relatado que a ativação simpática foi
seletiva para a unidade simpática vascular, pois a frequência cardíaca não se alterou e as ligeiras
alterações na pressão arterial, frequência cardíaca ou pressão venosa central sugeriram que as
respostas barorreflexas arteriais e cardiopulmonares isoladas não explicavam a excitação
simpática. Assim, ficou reforçada a possibilidade de que existia uma interação entre a
modulação do óxido nítrico e a ativação do simpático. Esta hipótese de que a ativação simpática
central é induzida pela PDE-5 pode ser reforçada pelo fato de que a sidenafila atravessa a
barreira hemato-encefálica e a PDE-5 é encontrada no cérebro, ou seja, a inibição da PDE-5
pela sildenafila é possível de acontecer no SNC (VOBIG, 2016).
Um outro estudo, mais recente, desenvolvido por DOPP et al., (2013) revelou que
a sildenafila aumenta significativamente as concentrações plasmáticas de norepinefrina,
confirmando as afirmações de PHILLIPS et al., (2000).
Uma correlação positiva observada entre as concentrações plasmáticas de
norepinefrina e a vasodilatação promovida pela infusão de fentolamina forneceu suporte
116
adicional para essa ideia e sugeriu que a ativação simpática induzida pela PDE-5 foi direcionada
para o sistema vascular. O aumento do tônus vascular simpático após a inibição da PDE-5 não
pode ser explicado pelas diferenças na sensibilidade dos alfa-receptores porque respostas à NE
intra-arterial foram similares após a administração da sildenafila e do placebo (DOPP et al.,
2013). Nesse estudo ficou notória a ativação simpática após a administração aguda de um
inibidor da PDE-5, mas levantou uma dúvida se a inibição da PDE-5 manteria a ativação
simpática caso o uso da sildenafila fosse crônico.
O nosso experimento avaliou o efeito do uso prolongado da sildenafila e, os efeitos
hemodinâmicos e autonômicos encontrados reforçaram a ideia de que a inibição da PDE-5 leva
a uma ativação simpática central e, associando com os resultados do experimento discutido no
capítulo anterior, que sugeriu que o aumento da atividade motora estivesse relacionada à
ativação do núcleo accumbens, fica reforçada a afirmativa de que a sildenafila de fato
desempenha sua ação em nível central.
Analisando os resultados apresentados no presente estudo, podemos sugerir que os
grupos de animais treinados que foram expostos à sildenafila durante os 60 dias do treinamento
físico, foram expostos à ação vasodilatadora do fármaco e, consequentemente, essa
vasodilatação constante levou a um aumento na frequência cardíaca e nos níveis de
norepinefrina e dopamina circulantes. Os níveis elevados desses neurotransmissores podem ter
induzido as células a expressarem mais receptores para essas substâncias como resultado de
uma tolerância dinâmica. Como os ensaios de esforço físico aconteceram após um período de
wash out , é possível que o período sem o fármaco no organismo tenha desencadeado no animal
um aumento na pressão arterial e aumento na frequência cardíaca, tanto no primeiro momento
(sem sildenafila) quanto no segundo momento (com sildenafila) em função do aumento da
modulação simpática para a periferia.
Ao extrapolarmos esses dados para atletas, podemos sugerir que, caso a sildenafila
seja utilizada durante um período prolongado de tempo pelos atletas, poderá ocorrer um
aumento na capacidade física dos indivíduos, porém à custa de um aumento da modulação
simpática para a periferia e, provavelmente por uma resposta pressórica exacerbada, ficando a
ressalva de que tal comportamento pode promover picos hipertensivos em atletas tornando-os
suscetíveis à eventos cardiovasculares indesejáveis durante uma prova ou competição.
117
7.6 Conclusão
O presente trabalho descreve pela primeira vez a influência da administração oral
prolongada de sildenafila sobre a capacidade física, sobre o sistema cardiovascular e sobre a
modulação autonômica de ratos treinados.
Os principais achados do presente estudo foram:
1) A administração oral prolongada de sildenafila (1,5 mg/Kg) por 60 dias não
influencia no ganho de peso nem de animais treinados e nem de animais sedentários, ou seja, o
uso prolongado da sildenafila (60 dias) não interfere no peso corpóreo dos animais;
2) Quanto à influência da administração oral de 1,5 mg/Kg de sildenafila sobre a
capacidade física dos animais é possível afirmar que a sildenafila, em animais sedentários, não
apresenta nenhuma influência significante. Entretanto, em animais treinados, a sildenafila
melhora significantemente a capacidade física dos animais;
3) A sildenafila contribui significantemente
para o aumento da capacidade
aeróbica nos ratos. O referido aumento foi superior ao aumento causado pelo treinamento per
se. No entanto, a administração prolongada ao fármaco conduziu a um aumento da pressão
arterial de repouso, possivelmente associada à elevação da modulação simpática vascular.
Extrapolando para as competições esportivas, nossos resultados possibilitam inferir
que o uso prolongado de sildenafila por atletas, pode melhorar a capacidade aeróbica dos
mesmos, possibilitando um melhor rendimento na competição, ficando a ressalva de que tal
comportamento pode promover elevação dos níveis pressóricos em atletas, tornando-os
suscetíveis a eventos cardiovasculares indesejáveis durante uma prova ou competição.
118
Considerações Finais
As contribuições do presente trabalho, de uma maneira geral foram:
Desenvolver e validar um método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,
simples, rápido, específico, linear, preciso e exato para identificar e quantificar sildenafila em
plasma de ratos.
Conhecer os parâmetros farmacocinéticos da sildenafila administrada pela via oral
a ratos machos saudáveis. O fármaco apresentou uma rápida absorção, atingindo a
Concentração Máxima – Cmax de 6,4121 m µg/mL em um tmax de 40 min. O volume de
distribuição foi de 1,93 mL, indicando uma alta ligação às proteínas plasmáticas. O clearance
ou depuração calculado foi de 1,36 horas e a Área Sob a Curva foi de 801,21, em consequência
ao tempo de meia-vida calculado foi de 88,8 min (1,48 h).
Concluir que a dose de 1,5 mg/Kg de sildenafila, no comportamento de ratos,
promoveu aumento da atividade motora e impediu a habituação dos animais além de promover
efeito ansiogênico e estimulante motor sugerida por efeitos motores e não efeitos emocionais.
Concluir que a sildenafila não interfere no peso corpóreo dos animais, mas o uso
prolongado em doses orais diárias de 1,5 mg/Kg em animais sedentários não apresenta nenhuma
influência significante. Todavia, em animais treinados, a sildenafila melhora significantemente
a capacidade física dos animais. O fármaco também contribui significantemente no aumento da
capacidade aeróbica nos ratos, no entanto, a administração prolongada do fármaco conduziu a
um aumento da pressão arterial de repouso, possivelmente associada à elevação da modulação
simpática vascular. Assim, ao extrapolar para as competições esportivas, nossos resultados
possibilitam inferir que o uso prolongado de sildenafila por atletas, pode melhorar a capacidade
aeróbica dos mesmos, possibilitando um melhor rendimento na competição, ficando a ressalva
de que tal comportamento pode promover elevação dos níveis pressóricos em atletas, tornandoos suscetíveis a eventos cardiovasculares indesejáveis durante uma prova ou competição.
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136
ANEXOS
Anexo 1
Parecer da CEUA/USJT – Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade São Judas
Tadeu
137
Anexo 2
Parecer 010/2013 da CEUA/USJT – Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
São Judas Tadeu
138
Anexo 3
Parecer 012/2014 da CEUA/USJT – Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
São Judas Tadeu
139
Anexo 4
PUBLICAÇÕES
140
Anexo 5
PUBLICAÇÕES
141