título do resumo, use este modelo, salvando-o como

PADRONIZAÇÃO DO TEMPO DE METÁSTASE PULMONAR A PARTIR
DE TUMOR PRIMÁRIO DE MELANOMA CUTÂNEO
Rayane Louise dos Santos (Bolsista de Inclusão - Fundacação Araucária),
Gabriella Pasqual Melo, Alessandra Lourenço Cecchini Armani
(Orientadora), e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Ciências Patológicas
Medicina II, Anatomia Patológica e Patologia Clinica.
Palavras-chave: melanoma metastático, metástase pulmonar, progressão
tumoral
Resumo:
O melanoma é um tipo de câncer de pele com alta capacidade de formar
metástase e atualmente há poucas alternativas terapêuticas quando ocorre a
metástase da doença. O projeto visa auxiliar estudos posteriores para
melhor compreensão dos mecanismos de metástase, facilitando o
desenvolvimento de pesquisa para novos tratamentos através da
padronização do tempo de metástase pulmonar a partir de tumor primário de
melanoma cutâneo. Foram inoculadas células de melanoma da linhagem
B16F10 no tecido subcutâneo de camundongos C57BL/6 onde foi
acompanhada a evolução do tumor em 3, 5 e 9 dias a fim de determinar o
tempo necessário para o desenvolvimento de metástase pulmonar.
Introdução
O câncer de pele é a neoplasia mais comum em âmbito global, e com o
passar dos anos sua incidência tem aumentado em diversos países. O
melanoma corresponde a 4% das neoplasias malignas de pele, apesar de
raro, é a mais grave devido a sua característica altamente invasiva e
agressiva. Possui alta taxa de mortalidade, representando 79% das mortes
por neoplasias de pele. A estimava do INCA para 2014, no Brasil, foi de
2.960 casos novos em homens e 2.930 em mulheres.
A etiopatogênese do melanoma é multifatorial, incluindo fatores
genéticos e raciais. Dentre os principais fatores que levam ao aparecimento
deste tipo de câncer, se encontram a sensibilidade ao sol, pele clara,
tendência a sardas, história de melanoma na família, presença de nevos
displásicos, aumento no número de nevos típicos, nevos congênitos grandes
e imunossupressão.
Experimentalmente, o estudo do melanoma metastático é vantajoso,
pois permite esclarecer os mecanismos de metástase nesse tipo de câncer,
auxiliando também estudos posteriores visando a descoberta de novas
estratégias terapêuticas, e a melhora da qualidade de vida do paciente.
Levando-se em consideração os altos índices de metástase nos
pacientes com melanoma e a gravidade da doença em sua forma
metastática, o presente trabalho justifica-se ao visar a padronização de um
modelo de estudo de metástase pulmonar de melanoma em camundongos a
partir de tumor primário de melanoma cutâneo. A padronização desse
modelo auxiliará estudos posteriores visando a melhor compreensão dos
mecanismos de metástase dessa doença, o que facilitará a pesquisa de
novos fármacos para o tratamento dessa neoplasia.
Procedimentos metodológicos
1 Animais experimentais
Os camundongos C57BL6 foram acomodados em condições padronizadas
dentro de gaiolas coletivas contendo no máximo 6 animais, com alimentação
especial para camundongos (Nuvital CR1) e água ad libitum. Todos os
procedimentos foram realizados após aprovação do projeto pelo Comitê de
Ética e Pesquisa da Universidade Estadual de Londrina, de acordo com as
recomendações do Código Brasileiro para utilização de animais de
laboratório.
2 Manutenção da linhagem celular B16F10
As células de melanoma murino da linhagem B16 subtipo F10 foram
cultivadas em condições estéreis em garrafas de cultura celular de 25 cm 3
de área utilizando meio de cultura celular DMEM suplementado com 20mM
de bicarbonato de sódio, e 5% de soro fetal bovino. As garrafas foram
incubadas a 37ºC em estufa de CO2 5%, e o crescimento das células foi
acompanhado, sendo realizada a troca do meio de cultivo quando
necessário, até as células atingirem confluência de 80-100%. Após atingirem
crescimento adequado, as células aderidas na garrafa de cultura celular
foram descoladas por meio de tripsinização com tripsina-EDTA 0,1%. A
viabilidade celular foi analisada pela coloração com azul de tripan e em
seguida foi preparada uma suspensão de células em meio de cultivo DMEM
para inoculação nos animais de experimentação.
3 Modelo experimental de melanoma murino cutâneo
Foram inoculadas, via subcutânea, no dorso de camundongos C57Bl6, 1 x
105 células B16/F10 em 50 µL de DMEM. Os animais foram divididos em
três grupos experimentais: melanoma 5 dias (M5), melanoma 7 dias (M7) e
melanoma 9 dias (M9). Os animais foram acompanhados durante 14 dias
após a inoculação das células tumorais no dorso do animal e então foram
eutanasiados.
Resultados e Discussão
Os grupos experimentais foram observados diariamente, a fim de
acompanhar o desenvolvimento da massa tumoral. Todos os animais
apresentaram boa aparência e não foram observados sinais sugestivo de
desenvolvimento massa tumoral, depois de 3, 5 e 9 dias após inoculação
das células. Os três grupos experimentais foram acompanhados por 14 dias
após a inoculação das células, porém não foi observado o desenvolvimento
de massa tumoral.
No 15º dia após a inoculação, os animais foram anestesiados com
quetamina/xilazina (18μl de xilazina, 8 μl de quetamina, diluídas em 24 μl de
salina, por animal) a fim de verificar possíveis alterações macroscópicas no
local onde as células foram implantadas. Entretanto, não foi observada
nenhuma alteração nos animais. Os animais foram eutanasiados após este
processo.
Considerando a situação, pode-se inferir que houve contaminação
das células B16/F10 utilizadas para este projeto, uma vez que diversos
trabalhos da equipe do laboratório no qual foi feito este experimento
demonstraram a eficácia desta linhagem celular.
Experimentos nos quais utiliza-se cultura de células exigem uma série
de cuidados para evitar os riscos de contaminação, tendo em vista que as
células são cultivadas em meios ricos em nutrientes, que oferecem um meio
rico para a proliferação de microorganismos. A contaminação pode ocorrer
durante o cultivo das células, bem como durante a utilização das mesmas
nas técnicas in vivo, sendo esta a possível causa do não desenvolvimento
do tumor, uma vez que houve confluência das células durante o cultivo.
Conclusões
A linhagem celular selecionada para o experimento apresenta rápido
crescimento e é facilmente transplantada em camundongos C57BL/6N, com
alta capacidade de disseminação metastática. Entretanto, nas condições
deste experimento não ocorreu implantação das células, e portanto não foi
possível observar desenvolvimento de massa tumoral nos animais utilizando
um inóculo de 1 x 105 células B16/F10 em 50 µL de DMEM, nos grupos
experimentais M5, M7 e M9, bem como 14 dias após a inoculação das
células.
Uma nova padronização do modelo deve ser feita, considerando os
cuidados que se deve ter com a cultura de células, a quantidade de células
inoculadas, assim como os tempos experimentais.
Agradecimentos
Á bolsa de inclusão social da Fundação Araucária, aos Laboratórios de
Patologia Molecular e de Fisiopatologia e Radicais Livres, aos alunos
Gabriella Pasqual Melo, Iriana Moratto Carrara, aos técnicos Pedro Dionísio
Sebastião Filho e Jesus Antonio Vargas.
Referências
CHAMMAS, Roger; ODONE FILHO, Vicente; NOVIS, Yana Sarkis.Tratado
de Oncologia. 1° Ed. São Paulo: Atheneu, 2013.
KUMAR,Vinay; ABBAS, Abul K.; FAUSTO, Neuson. Robbins & Cotran:
Patologia - Bases patológicas das doenças. 7ª Ed. Rio de Janeiro: Elsevier,
2004.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA.
Pele melanoma, 2014. Disponível em:
<http://www2.inca.gov.br/wps/wcm/connect/tiposdecancer/site/home/pele_m
elanoma/>. Acesso em 7/8/2015.