Sistemas de clonagem em eucariotos e - Stoa Social
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Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos Profa. Dra. Irene Soares ([email protected]) FCF/USP - 2010 Isolamento de DNA Clonagem de DNA Transformação pelo DNA Seleção e análise de recombinantes Expressão de proteínas recombinantes Purificação de proteínas recombinantes Aplicações da tecnologia do DNA recombinante Ferramentas básicas • Gene de interesse • Célula hospedeira (bactérias) • Vetores de clonagem e expressão • DNA ligases • Enzimas de restrição • Aparato de eletroforese de DNA • Sondas de DNA, Primers Isolamento de DNA • DNA genômico • cDNA • Produto de PCR • Gene sintético Podem ser utilizados para construção de Bibliotecas de DNA Vetores de clonagem • Plasmídios: fragmentos de até 10 Kb • Fago lambda: fragmentos de 5-20 Kb • Cosmídios: fragmentos de 20-50 Kb • BAC (Bacterial Artificial Chromosomes): 100-500 Kb • YAC (Yeast Artificial Chromosomes): 100 Kb – 1Mb Componentes de um plasmídio Região promotora DNA exógeno DNA genômico, cDNA, Produto de PCR, Gene sintético Sítio de Clonagem Plasmídios comerciais pUC pGEM pMOS De 1.000 até 20.000 pares de bases Gene que codifica resistência a antibiótico Origem de replicação Plasmídio para clonagem de produtos de PCR Sítio de Clonagem (polilinker) Ligação Plasmídio linearizado Gene a se clonado DNA ligase Transferência do plasmídio para uma linhagem de bactéria DNA cromossômico Plasmídios recombinantes Métodos de Transformação pelo DNA Bactérias (Escherichia coli) Tratamento com Cloreto ou Fosfato de Cálcio E. coli competente + DNA plasmidial Incubação no gelo Choque térmico (42ºC) Transformação direta por eletroporação Métodos de seleção de recombinantes (bactérias transformadas) Bactérias: Baseado na resistência a antibiótico Bactéria SEM DNA plasmidial Bactéria COM DNA plasmidial Plasmídio religado (sem inserto) Plasmídio com inserto Seleção azul e branca Gene lacZ Gene lacZ Inserto IPTG + X-gal Expressão da -galactosidase Não há expressão da -galactosidase Colônias azuis Colônias brancas Seleção com sondas de DNA Obtenção de DNA plasmidial Cultura bacteriana: E. coli contendo o plasmídio Fase estacionária (overnight) Lise alcalina: Análise de restrição Enzima Sítio de restrição Fonte EcoRI G AATT C C TTAA G Escherichia coli RY13 NcoI C CATG G G GTAC C Nocardia corallina XbaI T CTAG A AGATC T Xantomonas badrii SmaI CCC GGG GGG CCC Serratia marcescens 5 - fosfato 3 - OH 5 - fosfato 3 - OH Gel de agarose Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo (exposto a luz UV) Eletroforese em gel de agarose HindIII (-) Plasmídio Inserto Plasmídio não digerido Mapeamento de restrição BstF5I SfaNI BbvI HpyCH4III TseI Fnu4HI BseMII MnlI AvaII EcoO109I BstYI PpuMI Sau3AI Sau96I DpnI NlaIV BsmFI Bsu36I Hpy188I DdeI AlwI ATGAGGGCATCCATCTTTCTCGCTCTTGCCATTCTCGTTATTACCGTTGTCGCTGCCCCTACCGATGATAAGGGACCTGAGGATCTGAAG TACTCCCGTAGGTAGAAAGAGCGAGAACGGTAAGAGCAATAATGGCAACAGCGACGGGGATGGCTACTATTCCCTGGACTCCTAGACTTC È Ò Å Î ˜ É Â Å Â Å ˜ Â Ê È Ñ Ê Ê Å Å Ì Ñ Í Í Ò Ö Ì Í Í Â Ï Ó Ö Ç Ì Î É ‰ Í É Ì ˆ ‰ ˆ ˆ Ì ˆ Î Í Ì Â Ì È È Ò Í Â Ò È Œ Ò Í Ö ˜ „  ‰  ‰ Œ „ ‰  † †  Œ  Œ Ì † Â Ó Á Ö Ñ Œ Ö Î Í Í 90 Sequenciamento do DNA T G G G G G T A C A T G C T C T C A C G T G T T G CT GCA G T C A T G G C A T C C C G C A A A C A C A 40 50 60 70 80 90 Expressão de proteínas recombinantes Transformação Produção do antígeno in vitro Bactérias, leveduras ou baculovirus Purificação Sistemas heterólogos de expressão • Bactérias: Escherichia coli • Leveduras: Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris • Células de inseto (infectadas com baculovirus) • Células de mamíferos • Plantas • Animais Elementos genéticos essenciais em um vetor de expressão Vetores indutíveis por IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Operon Lac Na ausência de IPTG Na presença de IPTG Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com GST Promotor Lac: Expressão em bactéria na presença de IPTG Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com His-tag Expressão de proteínas recombinantes em bactérias Considerações gerais: • Bactéria: Escherichia coli (diversas linhagens) • Vantagens: fácil manipulação, rápido crescimento, alto rendimento de proteínas e baixo custo • Otimização da expressão: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de indução - Utilização de cepas de bactérias códon plus Expressão de proteínas recombinantes em bactérias Considerações gerais: • Desvantagens: Formação de corpos de inclusão proteínas insolúveis e não funcionais - Solubilização Proteínas solúveis - “Refolding” de proteínas • Proteínas de fusão - Melhoram a solubilidade - Facilitam a purificação Corpos de inclusão Cultura de bactérias (E. coli) Indução com IPTG Fase log: DO=0,4-0,6nm Padronizar: Tempo, temperatura, curva-dose resposta de IPTG Expressão da Proteína recombinante Lise (cong./descong., sonicação, French press) Avaliar em SDS-PAGE: extrato total, precipitado e sobrenadante Purificação Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida Análise da expressão da proteína recombinante em SDS-PAGE PM 1 2 3 116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 1. Extrato total (lisado bacteriano) 2. Sobrenadante 3. Precipitado (corpos de inclusão) Métodos de detecção de clones recombinantes • Reconhecimento por anticorpos específicos (ou anti-GST, anti-His) • Função da proteína (ensaio enzimático) • Seleção por PCR Métodos de purificação de proteínas recombinantes • • • • Afinidade Troca iônica Fase reversa Gel filtração Etapas de purificação de proteínas recombinantes Extrato bacteriano Etapa final de purificação 1ª. Etapa de purificação Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em leveduras (Pichia pastoris) Expressão de proteínas recombinantes em leveduras Considerações gerais: • Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris • Otimização da expressão: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de indução - Otimização do códon: mutagênese • Vantagens (Pichia pastoris): altos níveis de expressão, modificações pós-traducionais (glicosilação, pontes dissulfeto), secreção da proteína Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: terapêutica - Hormônio de crescimento humano e bovino (somatotrofina); - Insulina humana; - Calcitonina; - LH-RH - Somatostatina; - Gonadotrofina coriônica (HCG) e sérica (PMSG); - LH - Hormônio luteinizante bovino e suíno; - FSH – Hormônio folículo estimulante humano e bovino; - IGF-I (Fator de crescimento insulina dependente); - Interferon alfa, Interferon beta e Interferon gama -Toxina Botulinica; - Eritropoietina; - Glucagon - Fatores de coagulação: VIII e IX Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: diagnóstico laboratorial - HIV, HCV, HBV, HEV, HTLV, EBV, CMV, Rubéola - H. pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, Chlamydia - Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas Hepatite B Purificação Gene Ag S Vacina Vetor Proteína Antígeno S Levedura Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas Engerix-B SmithKline Beecham/US Recombivax HB Merck/USA GenHevac B Pasteur/France Instituto Butantan Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas HPV HPV Os subtipos 16 e 18 estão implicados como causa de 70% dos cânceres de colo de útero Dept. of Immunology Walter Reed Army Institute of Research Washington, DC
