Marcos Paulo Carrera Menezes
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA VARIABILIDADE E RELAÇÕES GENÉTICAS ENTRE RAÇAS CAPRINAS NATIVAS BRASILEIRAS, IBÉRICAS E CANÁRIAS Marcos Paulo Carrera Menezes AREIA – PARAÍBA – BRASIL MARÇO – 2005 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA VARIABILIDADE E RELAÇÕES GENÉTICAS ENTRE RAÇAS CAPRINAS NATIVAS BRASILEIRAS, IBÉRICAS E CANÁRIAS Marcos Paulo Carrera Menezes AREIA – PARAÍBA – BRASIL MARÇO – 2005 Marcos Paulo Carrera Menezes VARIABILIDADE E RELAÇÕES GENÉTICAS ENTRE RAÇAS CAPRINAS NATIVAS BRASILEIRAS, IBÉRICAS E CANÁRIAS Tese apresentada ao Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia da Universidade Federal da Paraíba, do qual participam a Universidade Federal Rural de Pernambuco e Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Zootecnia. Área de Concentração: Produção Animal Comitê de orientação: Profª. Dra Maria Norma Ribeiro Prof. Dr. Edgard Cavalcanti Pimenta Filho Dra. Amparo Martinez Martinez Prof. Juan Vicente Delgado Bermejo AREIA – PARAÍBA – BRASIL MARÇO – 2005 Ficha catalográfica elaborada na Seção de Processos Técnicos da Biblioteca Setorial de Areia-PB, CCA/UFPB. Bibliotecária: Márcia Maria Marques CRB4 – 1409 M543v Menezes, Marcos Paulo Carrera. Variabilidade e relações genéticas entre raças caprinas brasileiras, ibéricas e canárias./ Marcos Paulo Carrera Menezes. – Areia, PB: CCA/UFPB, 2005. 110 p.: il. Tese (Doutorado Integrado em Zootecnia) pela Universidade Federal da Paraíba, Universidade Federal Rural de Pernambuco e Universidade Federal do Ceará. Orientadora: Maria Norma Ribeiro. 1. Caprinos. 2. Conservação genética. 3. DNA. 4. Marcadores moleculares. I. Ribeiro, Maria Norma (orientadora). II. Título. CDU: 636.39:575.17(043.2) VARIABILIDADE E RELAÇÕES GENÉTICAS ENTRE RAÇAS CAPRINAS NATIVAS BRASILEIRAS, IBÉRICAS E CANÁRIAS MARCOS PAULO CARRERA MENEZES Tese defendida e aprovada pela banca examinadora em 31 de março de 2005. Banca examinadora: ___________________________________________ Dra. Amparo Martinez Martinez Avaliadora ____________________________________________ Profa. Dra. Luiza Suely Sêmen Martins Avaliadora ____________________________________________ Prof. Dr. Manuel Adrião Gomes Filho Avaliador ____________________________________________ Prof. Dr. Edgard Cavalcanti Pimenta Filho Avaliador ____________________________________________ Profa. Dra. Maria Norma Ribeiro Presidente AREIA – PARAIBA – BRASIL MARÇO – 2005 “Em verdade, em verdade te digo que se alguém não nascer de novo, não pode ver o reino de Deus”. (João 3, 3) “O vento sopra onde quer, ouves a sua voz, mas não sabes donde vem, nem para onde vai; assim é todo o que é nascido do Espírito”. (João 3, 5-8) ii Agradecimentos Inicialmente, agradeço aos criadores pela sensibilidade e persistência em conservar estes valiosos e escassos recursos genéticos, pois sem a existência dos caprinos nativos do Brasil este trabalho não poderia ser realizado. A professora, orientadora e amiga Maria Norma Ribeiro, muito obrigado pela presença na hora que necessitava e também pela ausência em momentos que foram importantes para o meu crescimento pessoal e profissional. Ao companheiro Edgard Cavalcanti Pimenta Filho, gostaria de agradecer pela nossa amizade, conversas, viagens e sobretudo por “comungar” com várias idéias e preocupações sobre a caprinocultura brasileira. Para o meu irmão Ariosvaldo Nunes de Medeiros, obrigado pelo seu exemplo como educador, acreditamos no ensino e temos a certeza que podemos contribuir com a formação dos nossos alunos. A Amparo y José Luis, gracias por la dedicación y competencia, vosotros fueron muy importantes en la mia formación profesional, agradezco de corazón por todo. A Esperanza y Juanvi (hermanos latinos), agradezco por la amistad y por todo el apoyo prestado en la mia estadía en España. A minha família, gostaria de expressar a minha eterna gratidão e dizer que apesar da distância geográfica, vocês estiveram sempre presentes nestes últimos anos. A todos os amigos que colaboraram direta e indiretamente com a realização deste trabalho, o meu sincero muito obrigado. A Universidade Federal da Paraíba, ao Departamento de Zootecnia e ao Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia. A CAPES pelo apoio financeiro durante o período de doutorado desenvolvido no Brasil e na Espanha. A EMBRAPA MEIO-NORTE, EBDA e UFRPE pela contribuição com o nosso trabalho. A Universidad de Córdoba, Departamento de Genética de la Facultad de Veterinaria, Diputación de Córdoba, RED CYTED, LABORATORIO DE GENETICA MOLECULAR del Servicio de Cría Caballar y Remonta y a todos los ganaderos que colaboraron con este trabajo. iii Índice Lista de Figuras ................................................................................................................... vii Lista de Tabelas.................................................................................................................. viii Resumo..................................................................................................................................ix Abstract ..................................................................................................................................x Introdução...............................................................................................................................1 Referencial Teórico ................................................................................................................3 1. Origem das cabras domésticas ...........................................................................................3 2. Origem das cabras Ibéricas ................................................................................................4 3. Raças nativas espanholas de fomento ..............................................................................16 3.1. Murciana-Granadina......................................................................................................17 3.2. Malagueña .....................................................................................................................18 4. Raças Canárias .................................................................................................................19 4.1. Majorera ........................................................................................................................19 4.2. Palmera..........................................................................................................................19 4.3. Tenerifeña......................................................................................................................20 5. Raças nativas espanholas de proteção especial ................................................................20 5.1. Branca Celtibérica .........................................................................................................20 5.2. Branca Andaluza ...........................................................................................................21 6. Raças nativas portuguesa e suíça .....................................................................................22 6.1. Serpentina......................................................................................................................22 6.2. Saanen ...........................................................................................................................23 7. Origem das raças caprinas brasileiras ..............................................................................24 8. Raças nativas brasileiras...................................................................................................25 8.1. Moxotó ..........................................................................................................................25 8.2. Canindé..........................................................................................................................26 8.3. Serrana Azul..................................................................................................................29 8.4. Repartida .......................................................................................................................27 8.5. Marota ...........................................................................................................................28 8.6. Graúna ...........................................................................................................................29 9. Conservação de recursos genéticos ..................................................................................29 9.1. Conservação de recursos genéticos no Brasil ...............................................................30 10. Caracterização genética..................................................................................................32 iv 10.1. Marcadores moleculares..............................................................................................33 10.2. RFLPs..........................................................................................................................34 10.3. RAPD ..........................................................................................................................35 10.4. AFLP ...........................................................................................................................36 10.5. SNPs ............................................................................................................................36 10.6. DNA mitocondrial (mtDNA) ......................................................................................37 10.7. Microssatélites.............................................................................................................38 10.7.1. Seleção de microssatélites........................................................................................39 10.7.2. Técnicas utilizadas para caracterização alélica dos microssatélites.........................40 10.7.2.1. Extração de ácidos nucléicos.................................................................................40 10.7.2.2. A técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR)............................................41 9.7.2.3. Amplificação das Sequências de microssatélites ....................................................42 10.7.2.4. PCR Multiples .......................................................................................................43 10.7.2.5. Métodos de eletroforese em gel ............................................................................44 10.7.2.6. Utilização de fluorocromos e sequeciamento automático.....................................44 10.7.3. Aplicação dos microssatélites .................................................................................45 10.7.3.1. Estudos de variabilidade genética .........................................................................45 10.7.3.2. Mapas genéticos ....................................................................................................46 10.7.3.3. Controle de paternidade ........................................................................................46 11. Análises estatísticas........................................................................................................47 11.1. Cálculo de frequências alélicas ...................................................................................47 11.2. Heterozigosidade.........................................................................................................48 11.3. Conteúdo de informação polimórfica (PIC)................................................................49 10.4. Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) .......................................................................49 10.5. Índices de fixação ou Estatisticas de F........................................................................50 10.6. Coeficiente de diferenciação genética (GST)..............................................................52 11. Distâncias genéticas .......................................................................................................52 11.1. Medidas de distâncias genéticas..................................................................................54 12. Árvores de distância genética.........................................................................................56 12.1. Árvores filogeneticas inidividuais...............................................................................57 12.2. Análises de correspondência .......................................................................................58 Referências Bibliográficas ...................................................................................................59 v Capítulo I..............................................................................................................................68 Painel de 27 Microssatélites para Caracterização Genética das Raças Caprinas Nativas Brasileiras.............................................................................................................................69 Resumo.................................................................................................................................69 Abstract ................................................................................................................................70 Introdução.............................................................................................................................71 Material e Métodos...............................................................................................................73 Resultados e Discussão ........................................................................................................76 Conclusões ...........................................................................................................................82 Referências Bibliográficas ...................................................................................................83 Capítulo II ............................................................................................................................86 Variabilidade Genética das Raças Caprinas Nativas Brasileiras Utilizando Marcadores Moleculares ..........................................................................................................................87 Resumo.................................................................................................................................87 Abstract ................................................................................................................................88 Introdução.............................................................................................................................89 Material e métodos ...............................................................................................................89 Resultados e discussão .........................................................................................................92 Conclusões .........................................................................................................................100 Referências Bibliográficas .................................................................................................100 Capítulo III .........................................................................................................................102 Distância Genética entre Raças Caprinas Nativas Brasileiras, Ibéricas e Canárias Usando Microssatélites....................................................................................................................103 Resumo...............................................................................................................................103 Abstract ..............................................................................................................................104 Introdução................................................................................................................................. Material e métodos .............................................................................................................107 Resultados e discussão .......................................................................................................109 Conclusões ............................................................................................................................... Referências Bibliográficas ....................................................................................................... Conclusões Gerais ..............................................................................................................123 vi Lista de Figuras Capítulo II ...................................................................................................................... 86 Figura 1 – Localização geográfica dos Estados onde foram coletadas amostras das raças caprinas brasileiras........................................................................................ 90 Figura 2 – Dendrograma de UPGMA das raças brasileiras, baseado na distância DA de Nei (1983) ..................................................................................................... 96 Figura 3 – Representação espacial das populações estudadas segundo as análises fatorial de correspondências ...................................................................................... 97 Capítulo III ................................................................................................................... 102 Figura 1 – Estatísticas de F (Fit, Fis e Fst) para todos os loci analisados .................... 112 Figura 2 – Dendrograma de NJ baseado na distância genética Da de Nei et al. (1983), com 1.000 permutações ...................................................................................... 115 Figura 3 - Representação espacial das raças caprinas estudadas segundo a análise fatorial de correspondência...................................................................................... 118 Figura 4 - Representação espacial dos indivíduos analisados segundo a análise fatorial de correspondência .......................................................................................... 118 vii Lista de Tabelas Referencial Teórico ..............................................................................................................14 Tabela 1 – Espécies e raças em núcleos de conservação de recursos genéticos ..................31 Tabela 2 – Alguns critérios para eleição da medida de distância genética apropriada ........55 Capítulo I 68 Tabela 1- Microssatélites analisados com as seqüências (direta e reversa) dos iniciadores 74 Tabela 2 - Multiplex dos loci, tamanhos dos fragmentos, fluorocromos e temperatura de anelamento utilizados..........................................................................................75 Tabela 3 - Número de alelos (NA), Heterozigosidade observada (Ho), Heterozigosidade esperada (He), Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC) em função dos loci analisados ............................................................................................................78 Tabela 4 – Relação dos loci desequilibrados (Hardy-Weinberg) de acordo com as raças caprinas estudadas...............................................................................................79 Tabela 5 - Coeficiente de diferenciação genética (Gst) e Testes de F (Fst, Fit e Fis) para cada locus analisado ....................................................................................................81 Capitulo II ............................................................................................................................86 Tabela 1 – Número de amostras (N), número médio de alelos (NA), heterozigosidade média observada (Ho) e heterozigosidade média esperada (He) das raças caprinas brasileiras ............................................................................................................94 Tabela 2 – Matriz de distâncias genéticas de Da de Nei et al. (1983) entre as raças caprinas brasileiras e os grupos controles analisados........................................................95 Capitulo III .........................................................................................................................102 Tabela 1 – Número de amostras (N), número de alelos (NA), heterozigosidade média esperada (He), heterozigosidade média observada (Ho), índice de fixação (Fis) e desviação do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) para todas as populações analisadas.110 Tabela 2 – Matriz de distância genética de Da de Nei et al. (1983) para todas as populações analisadas ..........................................................................................................112 viii Resumo A maioria dos caprinos brasileiros encontra-se em zonas semi-áridas com rebanhos formados por animais considerados “Sem Padrão de Raça Definida (SPRD)” ou “crioulos”, produto de cruzamentos indiscriminados entre raças exóticas e nacionais. A conservação desses recursos genéticos locais representa uma grande contribuição para manutenção da diversidade genética dos animais, que são extremamente adaptados às condições edafoclimáticas da região Nordeste do Brasil. O objetivo deste trabalho foi verificar a utilização de um painel de 27 microssatélites para estudar a variabilidade e diversidade genética das raças caprinas nativas brasileiras e analisar as relações genéticas entre as raças caprinas nativas Brasileiras, Ibéricas e Canárias. Foram coletadas amostras de pêlos e/ou sangue das raças brasileiras: Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida e Graúna; Espanholas: Murciana-Granadina, Malagueña, Blanca Andaluza e Blanca Celtibérica; Canárias: Majorera, Tenerifeña e Palmera; Portuguesa: Serpentina e Suíça: Saanen. Foram selecionados 27 microssatélites: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329 OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 e MAF65, amplificando-se mediante técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida, em seqüenciador automático ABI 377XL. Os microssatélites analisados mostraram-se polimórficos e os resultados obtidos demonstraram elevados níveis de variabilidade genética em raças caprinas Brasileiras, Ibéricas e Canárias. O coeficiente de diferenciação genética Fst para todos os loci indica que 13,3% da variabilidade genética total foi representada pela diferença entre populações, e que 86,7% correspondem à diferença entre indivíduos. Por intermédio da matriz de distância DA e o dendrograma UPGMA observou-se a formação de dois grupos geneticamente distintos, o primeiro formado por Moxotó, Canindé, Repartida e Marota, e o segundo por Serrana Azul e Graúna. As relações genéticas entre raças caprinas Ibéricas, Canárias e Brasileiras foram ilustradas em três agrupamentos geneticamente diferentes. ix Abstract The majority of Brazilian goats are in semi-arid region. Considered as non defined breed stand or crioulos, they are the result of uncontroled crossbreeding between exotic and national breeds. The conservation of the local genetic resources represents an important contribution for the genetic diversity of these animals, that are extremely adapted to the edaf-climatic conditions of Brazilian Northest region. The aim of this study was to establish a panel of 27 microsatellites to study genetic diversity and variability of the Brazilian breeds and evaluate the genetic relations between Brazilian, Iberian and Canary goat populations. Samples of hair and/or blood from Brazilian (Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida and Graúna), Spanish (Murciana-Granadina, Malagueña, Blanca Andaluza and Blanca Celtibérica), Canary (Majorera, Tenerifeña and Palmera), Portuguese (Serpentina) and Suisse (Saanen) goat breeds were collected. Twenty seven microsatellites (BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 e MAF65) were selected and amplified through polimerase chain reaction technic (PCR). The amplified fragments were separated using the method of polyacrilamide gel electroforesis, in an automatic sequencer ABI 377XL. The analyzed microsatellites were shown polymorphifics and the results obtained demonstrate levels elevated of genetic variability in Brazilian goats. The populations of Brazilian, Iberian and Canaries studied goats presented high values of intra-racial genetic variability. The genetic coefficient of differentiation Fst for all loci and populations analyzed, indicates that 13,3% of the genetic total variability was represented by the difference between populations, and that 86,7% correspond to differences between individuals. By using a matrix of distance DA and the dendrogram UPGMA, was observed that the breed Brazilian goats formed different groups, the first one formed by Moxotó, Canindé, Repartida and Marota, and the second one by Serrana Azul and Graúna. The genetic relationships between Iberian, Canaries and Brazilian breed goats were illustrated in three different genetic groups. x xi Introdução As primeiras cabras da América foram trazidas pelos colonizadores ibéricos no começo do século XVI (Primo, 1999). Na colonização americana, geralmente, as rotas dos colonizadores tinham parada obrigatória nas ilhas (Canárias, Madeira e Cabo Verde), antes de seguir viagem à América, contudo havia um intercâmbio de animais antes mesmo da chegada dos barcos ao novo mundo (Capote et al. 2002). No Brasil, o rebanho nacional de caprinos é de aproximadamente 10 milhões de cabeças FAOSTAT (2002), onde mais de 90% do rebanho encontram-se na região Nordeste, sobretudo, em zonas semi-áridas, com a maioria dos rebanhos de caprinos formados por animais considerados “Sem Padrão Racial Definido (SPRD)” ou “crioulos”, produto de cruzamentos indiscriminados entre raças exóticas e nacionais. Nos últimos anos, existe uma preocupação em conservar os recursos genéticos locais, com esforços aplicados na manutenção da variabilidade genética dos animais por várias organizações em diversos países do mundo (Egito et al. 2002). Atualmente, no Brasil existem alguns trabalhos isolados entre as Instituições de Pesquisas, Universidades e produtores privados para conservação das raças ameaçadas de extinção. A caracterização genética é uma alternativa para quantificar a variabilidade e diversidade genética dos animais, auxiliando os programas de conservação. O conhecimento da variação genética é de grande importância para conservação dos recursos genéticos a fim de evitar a erosão genética dentro das populações, assim como, conhecer relações genéticas entre populações para evitar a extinção desses valiosos recursos genéticos. Os microssatélites são marcadores moleculares que apresentam algumas vantagens como: elevado grau de polimorfismo, herança mendeliana, codominantes e facilidade na identificação. Desta forma, nos últimos anos, os microssatélites foram utilizados em diversos estudos de caracterização genética dos animais domésticos. Portanto, neste estudo pretende-se desenvolver um referencial teórico sobre a origem das cabras domésticas, origem das raças caprinas nativas Ibéricas, Canárias e Brasileiras, conservação de recursos genéticos, caracterização genética, marcadores moleculares e tratamentos estatísticos. Em seguida, serão desenvolvidos três capítulos em formato de artigos científicos, de acordo com as exigências da Revista Brasileira de Zootecnia. O capítulo I tratase da avaliação de um “Painel de 27 microssatélites para caracterização genética das raças caprinas nativas brasileiras”. Em seguida, no capítulo II, verifica-se a “Variabilidade genética das raças caprinas nativas brasileiras utilizando marcadores moleculares”. Enfim, no capitulo 1 III, analisou-se a “Distância genética entre raças caprinas nativas Brasileiras, Ibéricas e Canárias usando microssatélites”. Finalmente, baseados nos resultados deste estudo, realizouse as conclusões gerais. 2 Referencial Teórico 1. Origem das cabras domésticas As origens da Capra hircus ou cabra doméstica não são claras, mas evidências de restos arqueológicos sugerem que, provavelmente, foi domesticada há 10.000 anos, sendo o primeiro animal ruminante domesticado. Segundo Nozawa (1991), existiu um período de continuidade genética entre cabras selvagens e domésticas até se produzir o isolamento genético tal como o que conhecemos hoje, no qual se inclina a intervenção conjunta do Markhol e o Ibex abisínio na formação das cabras domésticas. Com base nesta teoria e, segundo as acusadas diferenças fenotípicas, este autor estabelece três categorias que seriam úteis para o seguimento e a classificação evolutiva das cabras históricas e pré-históricas do mundo: 1) Cabra tipo Benzoar: identifica-se com a cabra selvagem e considera um tipo não especializado com chifres em forma de cimitarra; 2) Cabra tipo Savana: com chifres em espiral e adaptadas a ambientes quentes e, 3) Cabra de tipo Nubiano: com orelhas grandes e caídas, estatura alta e perfil romano (convexo). A origem e a história filogenética das cabras domésticas foram estudadas por Luikart et al., (2001) sequenciando um segmento hipervariável do DNA mitocondrial (mtDNA) de 407 animais, de 80 raças caprinas. Segundo esses autores, os 331 tipos de mtDNA distribuem-se em três grupos altamente divergentes (Capra hircus 1, com 371 indivíduos; Capra hircus 2, com 25 indivíduos e Capra hircus 3, com 11 indivíduos). Considerou-se a Capra aegagrus como a progenitora da Capra hircus pela maior proximidade, assim como os tipos de DNA do cromossomo Y das Capra aegagrus eram idênticos aos das cabras domésticas. As sucessões da região de controle apresentavam uma estrutura geográfica definida: Capra hircus 1, encontra-se em todos os países e todas as raças; Capra hircus 2, encontra-se pela Ásia (da Malásia a Mongólia e Paquistão) e, finalmente, a Capra hircus 3, encontra-se na Eslovênia, Suíça e Mongólia. Os tipos de mtDNA bem relacionados encontram-se em países bem distantes (Dinamarca e Portugal; Mongólia e Ucrânia; Argélia e Turquia), estes resultados sugerem que as cabras eram transportadas por motivos comercias a vários lugares do mundo. 3 2. Origem das cabras Ibéricas Na Península Ibérica pode-se encontrar os três tipos de cabras descritos por Nozawa (1991): raças com chifres em forma de arco ou cimitarra, em espiral e perfil facial convexo. Historicamente, havia um fluxo das correntes migratórias humanas entre a Europa e África. No entanto, desde o Paleolítico Inferior a separação imposta pela formação do Estreito de Gibraltar confere à península um isolamento faunístico que não é comparável com outras zonas do continente europeu. Diante disso, caberia estabelecer duas grandes épocas que influenciaram a formação das cabras espanholas, uma antes e outra depois do Estreito de Gibraltar, tendo iniciado com a troca de material genético entre Europa e África e, posteriormente, com a separação dos dois continentes, favorecendo um isolamento das populações animais existentes na península, ainda que existia uma outra via de abertura pelo norte para seguir recebendo outras influências. Na formação das atuais raças caprinas espanholas, houve a influência de dois importantes tipos de cabras: Savana com características fiéis à raça Blanca Celtibérica, na qual está representado o fundo de perfil reto e chifres em espiral que aparece em outras raças espanholas. Assim como, a presença do tipo Savana com perfil convexo expresso na raça Branca Andaluza, com uma conjunção entre o tipo Savana e Nubiano. E, o tipo Benzoar que é o fundo mais amplamente difundido entre as etnias espanholas. Sua presença na península como derivada doméstica da Capra pyrinaica poderia datar desde os finais do Mesolítico. Segundo Gonzalo et al. (2002), atualmente, existem alguns tipos de cabras que descrevem o caprino europeu como: Tipo Alpino: de proporções médias, cabeça bem proporcionada, triangular, perfil côncavos, cornos aegagrus, orelhas de direção oblíquas ou vertical, orbitais salientes e grandes, tronco com linha dorso lombar ascendente para garupa, que é curta e caída, ventre bem desenvolvido e úbere abolsado. Extremidades fortes e medianas. Pêlo curto, pelagem com predomínio da cor negra e castanha com várias intensificações ou presença de manchas. Tipo Pirináico: de proporções alargadas, cabeça alargada, perfil subcôncavo ou reto, cornos aegagrus, orelhas oblíquas ou horizontal. A linha dorso lombar é reta, 4 ligeiramente ascendente à garupa e o tronco fino e ventre recolhido. Extremidades fortes e largas, pêlo fino e sedoso. Pelagem preta com gradações na parte inferior do corpo. O tronco alpino localiza-se em zonas de maior altitude (Alpina Francesa, Peaclk e Chamois Suíça) enquanto o pirináico apresenta maior capacidade de adaptação a zona mais próximas ao nível do mar (Poitevine francesa, Thuringian Alemanha, Pirináica espanhola). Com relação à raça Murciana-Granadina, verifica-se que a Murciana apresenta características semelhantes às pirináicas, enquanto que a Granadina assemelha-se às alpinas. Da união do tronco Pirináico e tipo Savana-Nubiano primário à raça Blanca Andaluza, e alguma semelhança com a Malagueña, pois conjugam os caracteres Pirináicos e algo de convexidade de Nubiano que, neste caso, só alcança a subconvexidade. Sobre as raças caprinas Canária, observa-se fundo Pirináico na Tenerifeña do Norte; alpino na Palmera e forte influência do tronco Nubiano na Majorera. 3. Raças nativas espanholas de fomento As raças caprinas de maior expansão da Espanha são a Murciana-Granadina e a Malagueña, possuem os maiores censos e aportam juntas a maior produção leiteira do país. Apresentam associações de criadores consolidadas, em que o melhoramento genético vem sendo desenvolvido através de livro genealógico e controle leiteiro periódico. As cabras produzem leite de elevada qualidade em proteína e gordura, sendo a grande maioria destinada à produção de queijos com diferentes denominações de origem e preços diferenciados para venda interna ou vendidos a laticínios franceses. Os rendimentos produtivos são claramente tributários à intensificação dos sistemas de produção, com médias de produção passando dos 500 litros por lactação em rebanhos especializados. Neste estudo de caracterização genética foram utilizadas cinco raças espanholas de fomento descritas a seguir, de acordo com Gonzalo et al. (2002): 3.1. Murciana-Granadina Com ascendência Alpina-Pirenaica, a Murciana-Granadina é a raça caprina que apresenta o maior efetivo da Espanha (400.000 cabeças). Originária da região de Andalucía Oriental e Levante, particularmente nas províncias de Murcia, Granada, 5 Almería e Alicante. Atualmente, é a raça caprina mais difundida pela Espanha, chegando a exportar exemplares para vários países (México, Brasil, Venezuela, Marrocos, Argélia, Portugal, Itália e França). O padrão racial da Murciana-Granadina apresenta características como: tamanho de pequeno a mediano (peso dos machos entre 50-60kg e fêmeas entre 40-50kg). Pelagem uniforme preta ou caoba, com mucosas escuras, pele fina e elástica, pêlo curto nas fêmeas e mais longo nos machos. Geralmente, não apresenta chifres, cabeça de tamanho médio de forma triangular, perfil subcôncavo, fronte ampla, orelhas medianas e retas, pescoço largo, fino e cônico nas fêmeas e mais curtos nos machos, com uma boa base de implantação. Tronco amplo e profundo, costelas arqueadas, linha dorso lombar reta, garupa ampla e inclinada. Ventre amplo, cauda curta e ereta. Úbere amplo, volumoso, com uma boa base de implantação e tetas simétricas. Raça de grande vocação leiteira, com produção média em cabras adultas de 513 litros de leite em 210 dias de lactação, com uma ordenha diária. O leite apresenta 5,3% (gordura), 3,7% (proteína) e 14,2% (extrato seco), destinado à elaboração de queijos frescos, semi-curados e curados, com denominação de origem. Quanto às características reprodutivas da raça, é poliéstrica contínua, elevada prolificidade, próximo a duas crias por parto, produzindo cabritos de 6-8kg aos 25-30 dias. A raça Murciana-Granadina possui duas associações de criadores. Uma em Murcia, denominada Associação Espanhola de Criadores da Cabra Murciano-Granadina e outra em Granada, denominada Associação Nacional de Criadores de Cabras de Raça Murciano-Granadina. 3.2. Malagueña Raça de aptidão leiteira derivada dos cruzamentos entre os troncos Pirináicos, Prisca e Ibex (Herrera, 2001). Encontra-se distribuída pela costa mediterrânea, nas províncias de Almería, Granada, Málaga e Cadiz. Sua maior concentração está em Axarquia, Vale do Guadalhorce, Antequera e Estepona (Málaga). Trata-se de uma raça com perfil reto ou subcôncavo, biótipo leiteiro, com fêmeas pesando entre 45-60kg e machos entre 60-75kg. Pelagem castanha com tonalidade de distintas intensidades, pêlos largos, pele fina e sedosa. Cabeça de forma triangular e bem proporcionada, com a fronte ligeiramente saliente, orelhas de pontas redondas, 6 largas e posição horizontal ou dirigida para cima e para frente. Pode apresentar chifres, tanto em machos e fêmeas. Pescoço largo, reto e fino, de ampla inserção no tronco, freqüentemente apresenta brincos. Tronco bem desenvolvido, linha dorso lombar reta, elevando-se ligeiramente para garupa, que é larga e caída. Costelas arqueadas de grande amplitude. Úbere bem desenvolvido, de forma abolsada e globulosa com ampla base de inserção e forte ligamento suspensor. É uma raça típica leiteira, de fácil ordenha. Poliéstrica permanente, com taxa de prolificidade de 1,9-2,0 crias por partos e elevada precocidade sexual. A produção de leite varia de acordo com o sistema de produção, com médias globais de 470 litros de leite por lactação, com 5,1% (gordura), 3,7% (proteína) e 14,3% (extrato seco). Também se destina à produção de cabritos de um mês de idade com 8-9kg e preço elevado no mercado. Possui livro genealógico desde de 1984 e conta com 24.000 animais (10% do censo total) integrados na associação de criadores, com controle leiteiro e estão inseridos no programa de melhoramento genético da raça. No ano de 2003, a Associação Espanhola de Criadores da Cabra Malagueña desenvolveu um esquema de seleção da raça com a participação efetiva de 42 dos 69 criadores, distribuídos em três comunidades autônomas, Andalucía (23.213), Extremadura (695) e Castilla-León (1.295). No mesmo ano, foi realizado um total de 293 controles leiteiros com a participação de 42 criadores, em que coletaram 47.831 amostras de leite para análises em laboratório. 4. Raças Canárias De acordo com Gonzalo et al. (2002), as raças Canárias são assim descritas: 4.1. Majorera A raça caprina Majorera, com aproximadamente 200.000 cabeças, encontra-se em todas as ilhas do Arquipélago, com sua maior parte distribuídas pelas ilhas orientais. Com presença no território peninsular, concentrando-se núcleos mais relevantes nas comunidades autônomas de Castilla-La Mancha e Andalucía. Perfil reto-subcônvexo, longilínea, com chifres Aegagrus e pelagem composta e pêlo curto. A produção leiteira média em 210 dias de lactação é de 551kg de leite com 3,4% (gordura), 3,9% (proteína), 4,5% (lactose) e 13,9% (extrato seco). 7 Leite de elevada qualidade, com conteúdo em proteína e caseína superior a de outras populações caprinas, o que constitui um aspecto importante para a elaboração de queijos frescos, semicurados e curados como o queijo Majorero de Fuerteventura, com denominação de origem e produção anual superior a 300.000 kg. Os sistemas de produção utilizados nas ilhas são o extensivo, semi-extensivo e atualmente, existe uma tendência ao sistema de produção intensivo para esta raça. 4.2. Palmera A raça Palmera encontra-se na Ilha Las Palmas, com aproximadamente 25.000 exemplares, especialmente nas comarcas montanhosas como Garafia e Punta Gorda. Estes animais são criados extensivamente nos montes, onde se alimentam basicamente de pastos. Apresenta características raciais como: perfil sub-côncavo, longilínea, com chifres em espiral, pelagem de tonalidade vermelha e pêlo largo. A produção leiteira é de 363 kg (210 dias de lactação), com 4,06% (gordura), 4,21% (proteína), 4,66% (lactose) e 13,75% (extrato seco). Está tramitando a Denominação de Origem Protegida (DOP) para o queijo Palmero. 4.3. Tenerifeña A raça Tenerifeña apresenta censo com aproximadamente 60.000 animais. Dentro da raça Tenerifeña poderia diferenciar dois subtipos: A Tenerifeña Norte e a Tenerifeña Sul, sendo o primeiro mais difundido. Geralmente, esses animais são criados em sistemas semi-extensivos. Apresentam perfil sub-cônvexo, longilínea, com chifres tipo Prisca e com dois tipos de pelagem e pêlos, em zonas áridas (pelagem composta e pelo curto) e úmidas (pelagem negra ou castanha e pelo largo). Produção leiteira de 347 kg de leite (210 dias de lactação) com 3,91% (gordura), 3,79% (proteína), 4,46% (lactose) e 13,13% (extrato seco). A produção cárnica das raças caprinas Canárias apresenta importância especial, tanto para produção de cabritos de leite (baifos) como para a produção de animais adultos, bastante apreciados no mercado consumidor do arquipélago por ser a base da gastronomia tradicional de origem Guanche. 8 Os cabritos de leite são produzidos com amamentação natural à vontade, sendo os machos sacrificados entre 25-30 dias de vida e as fêmeas, que não são utilizadas para reposição, são sacrificadas em média duas semanas mais tarde. Por outro lado, os animais adultos, independentes do sexo e da idade de sacrifício, denomina-se “carne de cabra” e são utilizados para a elaboração de pratos típicos. 5. Raças nativas espanholas de proteção especial Das raças caprinas que são consideradas de proteção especial na Espanha, duas foram utilizadas neste estudo, que são descritas a seguir, segundo Gonzalo et al. (2002): 5.1. Blanca Celtibérica A raça Blanca Celtibérica encontra-se situada nas províncias de Guadalajara, Teruel, Castellón e Albacete. Nesta última província estima-se um censo de 3.200 animais. Morfologicamente e segundo o Livro Genealógico da raça (DOCM nº 36 de 8 de agosto de 1997), trata-se de animais com estatura mediana (machos com 75-85 kg e fêmeas com 45-60 kg), proporções médias e pelagem branca. Apresenta perfil reto, orelhas grandes, ligeiramente caídas e dirigidas para frente. Chifres bem desenvolvidos em forma de espiral. Pescoço com brincos, grande e forte, com abundância de pêlos nos machos. Tronco amplo e profundo, linha dorso lombar reta, garupa curta, ventre amplo, cauda curta e erguida. Peito amplo e profundo. Extremidades fortes, altas e robustas articulações com úbere pequeno e recolhido. Raça fundamentalmente de corte, poliéstrica contínua e de baixa prolificidade (1,2 crias por parto), limitada por baixa disponibilidade de pastos de terrenos abruptos e de clima extremado, onde são criados em regime extensivo. Sua produção está baseada na produção de cabritos serranos de 10-12 kg de peso vivo e 40-60 dias de idade e em menor proporção, de animais com 30 kg em 5 meses. 9 5.2. Blanca Andaluza Raça caprina que recebeu clara influência do Tronco Africano pelo perfil convexo, de grande estatura e pêlos curtos. Está situada em Andalucía, nas províncias de Huelva, Sevilla, Córdoba, Jaén e Granada, com presença ao sul de Ciudad Real e Albacete. Trata-se de uma raça com estatura mediana (85 kg em machos e 60-65 kg em fêmeas) e proporções longilíneas. A pelagem branca ou branca cremosa, pêlos curtos e fortes, cabeça forte, cara curta com convexidade, orelhas grandes e caídas e presença de brincos. Os chifres em espiral aberto (tipo Prisca) e pescoço curto e forte nos machos e mais largos e delicados nas fêmeas. O tronco é amplo, linha dorso- lombar ligeiramente caída para garupa e extremidades fortes e altas, úbere recolhido e pouco desenvolvido. É uma raça serrana de aptidão de corte fundamentalmente, mantida em rebanhos puros ou mestiços desta raça com a Negra Serrana, como ocorre com freqüência na Serra de Cazorla (Jaén), onde convivem ambas as raças e os indivíduos berrendos resultantes de sua mestiçagem. Poliéstrica contínua, embora limitada pela baixa disponibilidade de pastos. O sistema de produção desta raça está baseada no pastoreio dos rebanhos, sendo mais freqüente a produção de cabritos, terminados após a desmama com rações à base de alfafa e concentrados, com pesos entre 20 kg a 2,5-3,0 meses de idade. 6. Raças nativas portuguesa e suíça Além das raças espanholas estudadas, verificou-se também a caracterização genética de uma raça portuguesa e outra suíça que serão descritas, a seguir. 6.1. Serpentina Antigamente, a cabra Serpentina era conhecida como Espanhola ou Castelhana, devido aos primeiros animais serem trazidos para Portugal pelos vizinhos espanhóis; posteriormente, pela presença fixada junto à fronteira passou a ser mais conhecida por Raiana, e, finalmente, dada a multiplicação dos seus efetivos, predominantemente na Serra de Serpa, passou a se chamar Serpentina Os caprinos da raça Serpentina encontram-se quase na sua totalidade (57.203 cabeças) em zonas 10 montanhosas e marginais, com incidência particular nas Serras D'Ossa e de Portel. Atualmente, a maioria dos rebanhos mantém-se em elevado grau de pureza. Morfologicamente, são animais longilíneos, perfil subcôncavo e, normalmente, de grande estatura (peso dos machos entre 60 a 75 kg e fêmeas entre 45 a 60 kg). A pelagem branca ou creme, com uma lista preta da cernelha até a cauda, com ventre preto, assim como a parte interna das orelhas, a face, o focinho e a extremidade dos membros, a partir do joelho e do jarrete. A pele é grossa e elástica, com pêlo curto e brilhante nas fêmeas, sendo mais espesso e comprido nos machos, sobretudo no dorso. A cabeça é grande, fronte larga e ligeiramente convexa, chanfro retilíneo, orelhas grandes e semipendentes, presença de barba nos machos, chifres largos e juntos na base, dirigidos para cima e para trás, divergentes nas extremidades e sensivelmente espiralados. O pescoço é médio, mais grosso nos machos, com presença de brincos, freqüentemente, em ambos os sexos. O tronco é bem desenvolvido, sendo amplo e profundo, sobretudo nos machos. A cernelha é ligeiramente destacada, com a linha dorso-lombar quase horizontal e a garupa é curta e caída, cauda curta e ereta, com inserção alta. O úbere é de tamanho médio, em forma de bolsa, com tetas bem diferenciadas e de tamanho variado. No início de 1991, com a homologação do respectivo regulamento, foi instituído o Registro Zootécnico da raça Serpentina visando particularmente à conservação da pureza desta raça, possibilitando o seu progresso zootécnico e favorecendo a difusão de bom material genético pela venda de reprodutores de qualidade. 6.2. Saanen Segundo Gonzalo e Sánchez (2002), a raça Saanen foi originária do vale do rio Saanen (Suíça), atualmente é considerada uma raça cosmopolita. A Saanen é uma excelente produtora de leite com produções médias de 786 kg de leite com 3,1% (proteína) e 3,3% (gordura), em 275 dias de lactação. Morfologicamente, é uma raça de biotipo leiteiro, estatura grande (60-90 kg nas fêmeas e 90-120 kg nos machos), sub-longilínea pelagem branca. Cabeça triangular, perfil côncavo e orbitais salientes. Orelhas erguidas e cônicas, possui chifres Aegagrus, fortes nos machos. Pescoço largo e bem inserido, sendo mais robusto nos machos. O tronco é amplo, profundo e musculoso. Peito arqueado, ventre bem proporcionado, linha dorso-lombar ascendente para o terço posterior, garupa curta e caída. Extremidades 11 finas, de longitude média, bem aprumada, pernas finas e arqueadas. Úbere abolsada e profunda, com bases anteriores e posteriores de inserção bem desenvolvidas, volumosas cisternas mamárias. A raça Saanen apresenta uma boa prolificidade, bem adaptada ao sistema produtivo intensivo e às zonas frias. A produção de cabritos de leite de excelente qualidade (10 kg aos 30 dias) e reprodutores para venda constituem outras fontes de renda aos produtores. 7. Origem das raças nativas brasileiras A partir da segunda viagem de Cristóvão Colombo à América, houve um fluxo intenso de animais da Península Ibérica que partia dos portos do sul da Espanha e dos principais portos portugueses. Geralmente, nessas viagens havia uma parada na ilha da Madeira e ilhas Canárias e daí, os espanhóis seguiam com destino às ilhas do Caribe, e os portugueses partiam diretamente às colônias brasileiras. Estas populações foram as precursoras que deram origem às principais raças ou grupos de animais domésticos do Brasil (Rodero et al., 1992; Primo, 1992). Nestas viagens, as principais espécies de animais domésticos introduzidos no Brasil foram os eqüinos e asininos, que eram utilizados nas guerras pela capacidade de trabalho. Enquanto que os caprinos e galinhas eram usados como fonte de alimentação da tripulação (Andrade, 1982). Capistrano (1982) cita que três séculos após o descobrimento do Brasil havia poucas cabras e ovelhas e só houve o aumento de seus efetivos quando se observou a superioridade de sua pele e o aumento do consumo de sua carne, devido às grandes secas observadas no século XVII. No início do século XX ocorreu aumento significativo dos produtos caprinos, principalmente a pele. A partir desse interesse houve algumas iniciativas para melhorar a situação em que estava a criação de caprinos no Brasil, por parte dos criadores e governo, através da introdução de caprinos de outros países (Pinheiro Junior, 1947). Nesta época, o mesmo autor já se preocupava com os resultados das importações e recomendava que, para o Nordeste, em vez de introduzir novas raças deveria ser feita a seleção nos grupos étnicos existentes. Segundo Domingues (1955), no início dos anos 50, eram encontrados mestiços das raças exóticas e nativas; entretanto, a predominância remanescente era dos ecotipos 12 nativos encontrados no sertão nordestino e era possível se deparar com formas étnicas distintas, capazes de servirem a um trabalho de seleção. Nesta época, foi feita a primeira tentativa de conservar as raças nativas de animais domésticos nordestinos, e dentre os caprinos estavam os da raça Moxotó e os tipos Marota e Repartida, que eram os mais comuns no Nordeste (Domingues et al., 1954). Esta tentativa não teve êxito, e a diluição do patrimônio genético dos caprinos nativos continuou. Atualmente, encontram-se poucos caprinos nativos distribuídos em rebanhos particulares e públicos, com destaque para as raças Moxotó e Canindé que são encontradas em maior quantidade (Ribeiro e Pimenta Filho, 2003). 8. Raças nativas brasileiras A maioria dos caprinos do Brasil são criadas em regime extensivo e mais de 90% do rebanho nacional encontram-se na região Nordeste do Brasil. Ao longo dos anos, essas raças foram desenvolvendo características de adaptação a ambientes como o semiárido nordestino. São animais que produzem peles de excelente qualidade, boa produção de carne e leite, compatíveis com o sistema de produção adotado, podendo ser considerados animais de múltipla função. Atualmente, as raças Moxotó e Canindé estão homologadas no Ministério da Agricultura, e o grupo Serrana Azul encontra-se em vias de homologação. Além dessas raças, existem mais três grupos raciais de cabras que são: Repartida, Marota e Graúna, que serão descritos a seguir, de acordo com Santos (2003): 8.1. Moxotó A raça Moxotó, originária do vale do Moxotó, em Pernambuco, encontra-se distribuída em vários Estados (Pernambuco, Paraíba, Ceará, Piauí e Bahia). É considerada uma raça de múltipla função (carne, pele e leite) e extremamente adaptada à região semi-árida do Nordeste brasileiro. Os animais apresentam estatura mediana, perfil levemente côncavo, orelhas médias, dirigidas lateralmente e um pouco acima da horizontal, chifres leves, de comprimento médio, saindo para trás para fora e para cima, em curvatura regular. Os machos comumente possuem barbas e excepcionalmente são mochos. A pelagem é baia ou mais clara, com uma lista preta que se estende do bordo superior do pescoço à base da cauda. Apresenta auréola preta em torno dos olhos e duas listas que descem até à 13 ponta do focinho, geralmente pretas. As orelhas, a face ventral do corpo e as extremidades são pretas, assim como as mucosas, as unhas e o úbere, com pêlos curtos, lisos e brilhantes. O tronco é amplo, linha dorso-lombar reto, garupa caída, membros fortes e úbere pouco desenvolvido. As fêmeas Moxotó são prolíficas, com a maioria dos partos duplos, poliéstricas durante todo o ano. São excelentes produtoras de pele, boas produtoras de carne e apresentam uma produção média de leite diária de 0,5 l / dia e duração de lactação de 120 dias. Atualmente, alguns trabalhos vêm sendo desenvolvidos pelas Instituições de Pesquisas, Universidades e produtores privados para conservação desses recursos genéticos. Com relação à raça Moxotó, verificam-se várias ações de conservação in situ por diversas instituições como: Embrapa – Caprinos, em Sobral - CE, Universidade Federal Rural de Pernambuco, em Serra Talhada - PE, Universidade Federal da Paraíba, em São João do Cariri - PB, Universidade Federal de Campina Grande, em Patos – PB, além de vários rebanhos particulares de criadores da raça Moxotó nos Estados de Pernambuco, Rio Grande do Norte e Paraíba. 8.2. Canindé Originada na Zona do Canindé, no Estado do Piauí. Atualmente, os rebanhos da raça Canindé encontram-se distribuídos pelo Ceará, Paraíba e Bahia. As cabras desta raça possuem aptidão leiteira acima da média das cabras nacionais, são boas produtoras de carne e pele. Os animais desta raça apresentam estatura mediana, (peso nas fêmeas 35-45 kg e nos machos 40-60 kg). A cabeça é de tamanho médio, perfil reto, olhos grandes e claros, orelhas eretas, estreitas e curtas, em forma de concha, direcionadas para frente, chifres largos e achatados na base, seguindo paralelamente para cima até cerca da metade do percurso total, voltando-se levemente para fora. Apresentam barba bem desenvolvida nos machos, pescoço longo, com ou sem brincos. A pelagem é preta, com ventre claro e extremidades escuras podendo apresentar manchas amarelas ou brancas em torno dos olhos, de onde descem duas listras dessa mesma coloração até a comissura labial. A parte distal dos membros e linha dorso-lombar são de cor clara. Os pêlos são macios, finos e brilhantes e relativamente curtos. Ancas bem ligadas ao corpo e bem espaçadas entre si, espáduas cheias e robustas, com peito largo e tórax profundo. O 14 corpo é longo, altura compatível com a profundidade corporal, membros fortes, costelas arqueadas e ventre profundo, amplo e firmemente sustentado. O dorso é reto e forte, garupa curta e inclinada, úbere bem implantado e volumoso, tetas simétricas, apontadas para baixo e levemente para frente. A Empresa de Pesquisas Agropecuária da Paraíba (Emepa) desenvolve um trabalho de conservação da raça Canindé, na Estação Experimental de Pendência, em Soledade - PB, assim como, a Embrapa – Caprinos, em Sobral - CE e alguns criadores na Bahia, Paraíba e Rio Grande do Norte. 8.3. Serrana Azul A cabra Azul é bem apreciada pelos criadores, rústica, boa produtora de leite, carne e pele. Animal do tipo pirenaico, com perfil semicôncavo ou retilíneo, crânio triangular alongado, orelhas pequenas, em concha voltada para cima ou para frente. Chifres distanciados um do outro saindo para cima e para dentro. No macho, os chifres nascem menos distanciados, muito largos na base. Pescoço muito forte no macho e mais delicado nas fêmeas, com ou sem brincos. Corpo retilíneo, garupa pouco inclinada. Altura média nas fêmeas: 60-65 cm e machos: 65-75 cm. Peso médio fêmeas: 45-55 kg; machos: 60-75 kg. Pêlos fortes e grossos nos machos, principalmente no dorso-lombo e mais delicado nas fêmeas. Pele é escura, as mucosas nasal e perineal são cinza-escuras ou tom cinza claro. Pelagem é azulada, ou cinza-azulada; mais escura no inverno. Os machos são mais escuros. Membros fortes, unhas escuras. Úbere bem inserido, com tetas voltadas para frente. 8.4. Repartida Grupo de cabras de origem nordestina com um número reduzido de animais. Atualmente, existe um rebanho de cabras Repartidas mantida por um convênio entre a Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola (EBDA) em Jaguarari-BA e a Embrapa Caprinos. As cabras Repartidas são também conhecidas como “Surrão” cujo significado deve-se à mistura de pêlos claros e escuros de aspecto sujo. São animais com estatura mediana, com altura entre 65-70 cm nas fêmeas e 68-78 cm nos machos; peso entre 45-55 kg nas fêmeas e 55-70 kg nos machos. Pelagem repartida em duas cores, característica que originou o nome. Geralmente a parte anterior do corpo é negra e o restante claro, branco-sujo, baio, creme ou pardo. Admite-se a 15 pelagem invertida. Cabeça de tamanho médio, perfil reto, chifres para cima e para trás, orelhas medianas, pescoço fino e bem implantado no tronco, corpo alongado com abdômen amplo e linha dorso lombar reta, garupa curta e inclinada, cauda reta e ereta e úbere pouco desenvolvido. As cabras Repartidas são rústicas, resistentes a enfermidades e prolíficas. A principal finalidade é a produção de carne e pele. 8.5. Marota Originária da região Nordeste, as cabras Marota são procuradas por selecionadores pela rusticidade e a cor da pelagem (branca) para usar em cruzamentos diversos. Apresentam reduzido número de animais e são poucos os trabalhos de conservação desses animais. Segundo Carvalho (2000), a Embrapa Meio-Norte, desde 1980, mantém um núcleo de conservação de cabras Marota em Castelo do Piauí - PI. Animais de estatura média (altura média nas fêmeas entre 60-70cm e nos machos entre 65-80cm, com peso médio nas fêmeas entre 39-55kg e nos machos entre 55-75kg). Cabeça mediana, perfil reto, chifres bem desenvolvidos, voltados levemente para trás e para fora, pescoço fino, proporcionando ao animal um aspecto elegante, linha dorso lombar reta, garupa inclinada, membros alongados, fortes e bem aprumados sobre cascos claros. Pele e mucosas são claras, com pigmentação na cauda. Úbere bem conformado, porém pouco desenvolvido. As cabras Marota são produtoras de pele de excelente qualidade e carne. 8.6. Graúna Animal de tamanho mediano, altura média – fêmeas: 60-70 cm; machos: 65-78 cm. Peso médio – fêmeas: 40-60 kg; machos: 60-70 kg. Cabeça mediana, triangular, alongada, perfil semicôncavo. Orelhas curtas, lanceoladas, com concha para baixo. Pescoço forte nos machos com pêlos ásperos na parte dorsal, mais delicado nas fêmeas, com pêlos lisos, com ou sem brincos. Corpo forte, membros fortes e bem aprumados, cascos negros. Pele negra, pelagem com pêlos negros por todo o corpo; finos e curtos nas fêmeas; mais grossos e ásperos nos machos. Úbere bem formado, de bom porte, com tetas para baixo e para frente. 16 Assim como todas as raças caprinas nativas do Brasil, a cabra Graúna é rústica, prolífica, boa produtora carne, pele e leite. 9. Conservação de recursos genéticos O desconhecimento da espécie caprina no mundo representa um grande perigo para a sua conservação, podendo contribuir para a extinção de raças antes mesmo de serem caracterizadas (Vallejo e Delgado, 2004). A espécie caprina, comparada com outras espécies mais conhecidas, é a que possui o maior número de raças catalogadas pela FAO com situação desconhecida, evidenciando um verdadeiro descaso com este recurso genético. A nível mundial, verifica-se que a caracterização racial dos caprinos está mais desenvolvida na Europa e na América do Norte, pela maior quantidade de estudos realizados nesta área (Scherf, 2000). Atualmente, existem aproximadamente 4.500 raças distribuídas entre 40 ou mais espécies de animais em todo o mundo. Cerca de 30% dessas raças estão ameaçadas de extinção. Provavelmente, estes dados podem ser influenciados pelo direcionamento dado ao melhoramento animal, cujo enfoque é dirigido a algumas características de produção baseados fundamentalmente em raças desenvolvidas para ambientes produtivos menos estressantes e mais exigentes em insumos. Como conseqüência, raças com características importantes como adaptação a ambientes em condições específicas, com pouca e irregular distribuição de chuvas, baixa quantidade e qualidade de alimentos, vêm sendo substituídas por raças exóticas causando uma rápida erosão genética dos recursos genéticos locais (Mariante et al., 1999). A variabilidade genética é um parâmetro extremamente importante para conservação dos recursos genéticos, sendo importante para a adaptação animal às mudanças ambientais. O conhecimento da diversidade genética intra e inter-raciais poderá contribuir para evitar a erosão genética, assim como a extinção de raças (Gama, 2004). Segundo a FAO, biodiversidade é a variabilidade genética dos diferentes tipos de recursos genéticos animais a nível de raças, espécies e genes. Nos últimos anos, existe uma grande preocupação em conservar os recursos genéticos locais, com esforços aplicados na manutenção da diversidade genética dos animais por várias organizações em diversos países do mundo (Egito et al. 2002). 17 9.1. Conservação de recursos genéticos no Brasil Aliada a uma preocupação mundial de conservação de recursos genéticos locais, em 1974, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) criou o Centro Nacional de Recursos Genéticos (Mariante et al., 1999). Em 1983, transformado para Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), inicia o primeiro Programa de conservação de recursos genéticos animais do Brasil oficial, em parceria com Centros da EMBRAPA, Universidades, Empresas de Pesquisas Estaduais e criadores particulares. Cabe ressaltar que alguns produtores de maneira isolada e empírica há mais de 200 anos decidiram conservar seus animais em estado de pureza. Dessa forma, os produtores foram os pioneiros na conservação de recursos genéticos animais do país, disponibilizando excelente material para ser trabalhado posteriormente (Sereno e Sereno, 2000). Em 1994, em função das demandas, o programa teve seus objetivos ampliados, abrangendo a conservação e a utilização dos recursos genéticos. Os objetivos do programa de conservação e uso de recursos genéticos animais do Brasil são: - Manutenção e enriquecimento do Banco de Germoplasma Animal já existente no Cenargen, através da coleta e criopreservação de sêmen, ovócitos e embriões de raças de animais domésticos ameaçados de extinção; - Apoio à implantação de novos núcleos de conservação animal de populações ameaçadas de extinção, que venham a ser identificadas; - Orientação dos acasalamentos dos núcleos de conservação, com finalidade de minimizar a endogamia; - Conscientização da sociedade sobre a importância da conservação dos recursos genéticos animais, com a criação de um parque em Brasília, onde serão mostrados animais de raças ameaçadas de extinção; - Formação de um banco de amostras que fará parte do Banco Genômico Animal, visando o armazenamento de DNA e componente sanguíneos, bem como tecidos e células imortalizadas das diversas espécies em estudo. Na Tabela 1 encontra-se uma relação das espécies e raças que estão em núcleos de conservação no Brasil. Estes animais estão distribuídos pelas cinco regiões brasileiras, criados em ambiente naturais (conservação in situ), mantendo-os dentro dos sistemas de produção, assim como a conservação de sêmen, embriões, tecidos, células, amostras de DNA e componentes sanguíneos (Conservação ex situ) em bancos de germoplasma. 18 Segundo Mariante et al. (1999), o programa de conservação dos recursos genéticos animais inclui as seguintes etapas: (1) Identificação das populações através de levantamento do número efetivo dos rebanhos que se encontra em estado avançado de diluição genética, mediante questionários junto aos produtores; (2) Caracterização morfológica dos animais com características quantitativas (altura de cernelha, perímetro torácico, peso, etc.) e qualitativas (cor da pelagem, perfil cefálico, etc.), além da caracterização genética do germoplasma usando marcadores moleculares (RFLP, AFLP, RAPD, microssatélites e etc.), mensurando as diferenças entre e dentro das populações e por fim, (3) a avaliação do potencial produtivo dos rebanhos, com dados de produção (carne, leite, pele, pêlos, etc.). Tabela 1 – Espécies e raças em núcleos de conservação de recursos genéticos no Brasil Espécie Bovinos Raças Mocho Nacional Pantaneiro Curraleiro ou Pé-duro Crioulo Lageano Caracu Baio Carabao Jumento Nordestino Jumento Brasileiro Pantaneiro Lavradeiro Campeiro Marajoara Puruca Canindé Gurguéia Marota Moxotó Repartida Morada Nova Diversas raças Bubalinos Asininos Eqüinos Caprinos Ovinos Suínos Fonte: Mariante et al. (1999) 19 10. Caracterização genética A caracterização das diferentes raças de animais domésticos do Brasil, até pouco tempo, baseava-se apenas em dados fenotípicos (morfológicos e de produção), os quais podem ser insuficientes para distinguir raças puras, além de serem influenciados pelo meio ambiente (Egito et al. 1999). A caracterização genética dos animais é mais uma alternativa para quantificar a diversidade genética, assim como para auxiliar os programas de conservação. A variabilidade genética total de uma espécie resulta do conjunto representado pela contribuição da variabilidade inter-racial e intra-racial. O conhecimento desses dois fatores é de grande importância para conservação dos recursos genéticos, visando a manutenção da variabilidade genética e, desta forma, evitar a extinção dos animais ameaçados. 10.1. Marcadores moleculares Segundo Ferreira e Grattapaglia (1998), os marcadores moleculares são definidos como todo e qualquer genótipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA. A seqüência de nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou não ser conhecidas. Ao se verificar o seu comportamento de acordo com as leis básicas de herança de Mendel, um marcador molecular é considerado como um marcador genético. O desenvolvimento tecnológico na área de marcadores moleculares tem avançado bastante nos últimos anos, principalmente, com a tecnologia de DNA recombinante e a descoberta da amplificação de segmentos de DNA via PCR (Reação em Cadeia de Polimerase). Várias técnicas vêm sendo aprimoradas e as análises moleculares têm se mostrado acessíveis e eficientes, aliados ao desenvolvimento de métodos estatísticos que têm permitido a manipulação de grandes quantidades de dados. Os marcadores genéticos são loci que apresentam características detectáveis que podem diferir entre indivíduos, apresentando variação nas seqüências de DNA, podendo ser revelada mediante diferentes técnicas. Com o desenvolvimento das técnicas de eletroforese surgiram os polimorfismos protéicos. Basicamente, a técnica consiste na separação de moléculas, por sua carga 20 elétrica, tamanho e forma, através da migração em um meio de suporte e tampões adequados sob a influência do campo elétrico. O polimorfismo de proteínas foi bastante usado para identificar características específicas de indivíduos ou populações, com o objetivo de detectar determinados alelos restritos a uma população específica. No Brasil, alguns trabalhos foram desenvolvidos mediante polimorfismo protéico em estudos de caracterização genética de bovinos (Nelore, Gir, Curraleiro, Pantaneiro e Mocho Nacional), bubalinos (Murrah, Jafarabadi e Mediterrâneo) e ovinos (Santa Inês e Poll Dorset) por Lara et al. (1999). Em caprinos, Menrad et al. (2002) trabalharam com polimorfismo protéico em estudos de diversidade genética. Barker et al., (2001) efetuaram um estudo comparativo entre marcadores protéicos e microssatélites para analisar raças caprinas asiáticas e concluíram que os microssatélites apresentam um maior grau de polimorfismo. Os marcadores genéticos moleculares apresentam algumas vantagens sobre os marcadores bioquímicos como: tecnologias modernas relativamente fáceis de realizar e de interpretar, elevada heterozigosidade, necessidade de pequenas amostras de DNA que podem ser extraídas de qualquer tecido, provenientes de animais de qualquer idade e é possível conservar amostras de DNA por um longo período. Enquanto que os marcadores bioquímicos só podem ser estudados com tecidos frescos. Além do mais, os marcadores de DNA não são afetados por variações ambientais e permitem selecionar regiões específicas dentro da molécula de DNA para determinados estudos, dentre outras (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Contudo, com o advento das técnicas modernas de biologia molecular, surgiram diversos métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente em nível de DNA, comprovando que os estudos com o genoma possuíam níveis de variação genética superior se comparado com análises de proteínas. Conseqüentemente, o emprego de marcadores genético-bioquímicos perdeu parte de sua relevância e a identificação e utilização de marcadores moleculares de DNA transformou-se no principal objeto de estudo. Diversas técnicas vêm sendo desenvolvidas para detectar variabilidade genética nas seqüências de DNA, mediante marcadores moleculares como RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms), SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), mtDNA (DNA mitocondrial) e os STR (Short Tandem Repeats) ou microssatélites. 21 10.2. RFLPs O Polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA (RFLP) foi a primeira técnica utilizada para detecção de polimorfismo de DNA em estudos de caracterização do genoma. A técnica dos RFLP é baseada na digestão do DNA total de um indivíduo com diferentes enzimas de restrição, produzindo fragmentos de DNA que em seguida, são separados por eletroforese em gel de agarose e depois, transferidos por capilaridade a uma membrana de nylon, que é hibridizada com uma sonda (Southern, 1975). O produto da hibridação é visualizado por meio de uma autoradiografia, de acordo com o peso molecular de cada banda. De acordo com Bolstein et al. (1980), os RFLPs são numerosos, codominantes e herdados segundo as leis de Mendel. Este método apesar de ser bastante utilizado para revelar polimorfismo de DNA e para caracterizar populações de microorganismos, plantas e animais, sua utilização é considerada cara, lenta e laboriosa. 10.3. RAPD Desenvolvida por William et al. (1990), a técnica de DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD) é baseada na amplificação do DNA genômico com apenas um iniciador simples (10 pb) de seqüência de nucleotídeos conhecida e ponto de homologia arbitrária. O método de RAPD apresenta algumas vantagens como: detecção de polimorfismo na ausência de informações sobre a seqüência de nucleotídeos específicos, possui atributos como simplicidade e rapidez na execução. O uso da técnica de RAPD-PCR permite uma amplificação exponencial de um segmento de DNA pela enzima DNA polimerase. Em função da grande quantidade de DNA produzido, este segmento pode ser visualizado diretamente na forma de uma banda em um gel. A eletroforese é conduzida em gel de agarose e a visualização é feita com brometo de etídeo em luz ultravioleta. Alternativamente, géis de poliacrilamida de alta resolução podem ser utilizados por auto-radiografia ou coloração com nitrato de prata. As principais limitações dos marcadores RAPD são o baixo conteúdo de informação genética por locus. Apenas um alelo é detectado e os genótipos 22 heterozigotos não podem ser diretamente discriminados dos homozigotos pela técnica de RAPD, além da baixa repetibilidade desta técnica. Contudo, os marcadores de RAPD vêm sendo usados para estudos de caracterização genética em bovinos (Spritze et al. 2003), em ovinos (Paiva, 2004) e em caprinos (Oliveira, 2003; Xianglong et al. 2000), com bons resultados. 10.4. AFLP Descrita por Vos et al. (1995) a técnica de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados (AFLP) foi desenvolvida inicialmente para construção de mapas genéticos, principalmente em espécies de plantas cultivadas que apresentam uma baixa taxa de polimorfismo de DNA e, depois surgiu o interesse em estudos de identificação para elaboração de mapas genéticos e estabelecimento de relações genéticas em animais. A análise de AFLP consiste basicamente em quatro etapas: 1) clivagem do DNA genômico com duas enzimas de restrição; 2) ligação de adaptadores específicos aos terminais dos fragmentos genômicos gerados pela clivagem; 3) PCR seletiva de fragmentos com iniciadores específicos e bases arbitrárias nos terminais 3′; 4) eletroforese de fragmentos amplificados em gel de alta resolução. A maior vantagem desse método é o grande número de fragmentos de restrição que são gerados e analisados em um único gel, tornando possível cogitar a construção de um mapa genético com aproximadamente 200 a 300 marcadores com apenas 5 a 7 géis de eletroforese de alta resolução. Os polimorfismos detectados correspondem a mutações pontuais, inserções ou deleções que afetam as enzimas de restrição. Manifesta-se como ausência ou presença de bandas. Portanto, são marcadores dominantes e menos informativos (não diferencia heterozigoto e homozigoto). Contudo, alguns estudos de diversidade genética foram desenvolvidos com marcadores AFLP em caprinos (Ajmone-Marsan et al. 2001; Crepaldi et al. 2001). 10.5. SNPs Os SNPs são variações mais comuns no genoma humano, calcula-se que existem cada 100-300pb. Trata-se de pequenas mutações pontuais, como inserção ou deleção, que ocorrem no genoma. Encontram-se em posições definidas do genoma chamadas 23 “Sequence Tagged Sites” (STS) e são utilizados para elaboração de mapas genéticos, para medir a estrutura genética de populações ou para realizar estudos funcionais. Também pode ser uma ferramenta eficiente para identificação genética em aplicações legais e forenses, além de ser muito importante como marcadores genéticos, já que muitas doenças conhecidas (anemia falciforme) em humanos são produzidas por mutações simples. Os SNPs apresentam algumas vantagens comparadas com outros marcadores genéticos, pois estão distribuídos uniformemente pelo genoma e presentes também em regiões codificantes, em regiões que flanqueiam os genes. As técnicas empregadas para sua detecção são simples e produzem padrões de leitura não ambíguos, seguem uma herança mendeliana, baixa taxa de mutação e alta heterozigosidade em populações. 10.6. DNA mitocondrial (mtDNA) Trata-se de uma molécula circular que se encontra presente em uma das organelas subcelulares denominadas mitocôndrias. Existem dois domínios na região “D-loop” do mtDNA que são bastante polimórficos e produzem substituições de nucleotídeos em várias posições que proporcionam uma grande variabilidade. A região “D-loop” não tem nenhuma função conhecida. O mtDNA apresenta algumas vantagens comparadas com outros marcadores, pela sua facilidade de amplificação em situações críticas, em casos como: tecido de amostra antiga, pouca quantidade ou degradadas (restos de esqueletos, dentes e pêlo). Por esta razão, tem sido utilizado com frequencia em medicina forense (Junge et al. 2002; Andreasson et al. 2002). Outra característica importante do mtDNA é que se herda por via materna, não está submetida à recombinação. Portanto, as diferenças de nucleotídeos entre genomas mitocôndrias são reflexo direto da distância genética que os separa. As regiões de mtDNA mutam 5 a 10 vezes mais que o DNA nuclear e é homogêneo em todos os tecidos do mesmo indivíduo. Vários estudos com mtDNA foram desenvolvidos em diversas espécies de animais domésticos como: ovinos (Hiendleder et al. 1998) e em caprinos, Luikart et al. (2001), verificaram a origem filogenética da espécie, utilizando a região controle de mtDNA de 406 animais, distribuídos em 88 raças caprinas da Ásia, África e Europa. 24 10.7. Microssatélites O genoma dos mamíferos está formado por aproximadamente 3 x 109 pares de bases (pb) repartidos pelo número de cromossomos especifico de cada espécie. Cerca de 50-60% do DNA dos mamíferos são constituídos por DNA não-repetitivo (Lodish et al. 1999). A fração de DNA repetitivo é composta de seqüências de DNA presentes em mais de uma cópia no genoma, podendo ser dividido em DNA moderadamente repetido e DNA altamente repetitivo, de acordo com a freqüência de repetição. Seqüências repetidas em tandem são especializadas para permitir um alinhamento imperfeito durante o pareamento dos cromossomos e, portanto, o tamanho dos blocos de repetições tende a ser altamente polimórfico. Geralmente, as seqüências repetidas em tandem são divididas didaticamente em duas categorias: minissatélites e os microssatélites. Os minissatélites são marcadores polimórficos, descobertos por Jeffreys et al. (1985) em seres humanos e, posteriormente, descritos em outras espécies. Os minissatélites são repetições ao acaso em seqüências de 10 a 60 pares de bases (pb), altamente polimórficos e com elevadas taxas de heterozigosidade nas populações. Nesta técnica utiliza-se a tecnologia de DNA-DNA, considerada bastante trabalhosa, lenta e requer uma grande quantidade de DNA (fragmentos grandes e elevado número de repetições). Diante dessas dificuldades, os minissatélites têm sido pouco utilizado nos últimos anos. Descrito por Tautz (1989), os microssatélites são segmentos curtos de DNA de 1 a 6 pb, que se repetem em seqüência de forma aleatória por todo o genoma de todos os organismos eucariotas, abundantes, altamente polimórficos, herança mendeliana e as repetições específicas dos loci de microssatélites são facilmente detectados pelo uso da técnica de amplificação (PCR). Sua hipervariabilidade, codominância e dispersão pelo genoma são as principais razões para sua utilização em estudos genéticos. Nos indivíduos eucariotas pode-se encontrar uma seqüência de microssatélites a cada 10.000 pb, aproximadamente. Possivelmente, estão distribuídos uniformemente nos cromossomos (Tautz, 1989), embora sejam pouco observados nas regiões teloméricas e centroméricas, tanto no homem (Stalling et al., 1991) como em animais domésticos (Winter et al. 1992). Os microssatélites são porções de DNA que contêm repetições di-, tri-, e tetra-nucleotídicos, que são transcritas em RNA e sua função e mecanismo de formação são desconhecidos. A maioria dos microssatélites encontrado nas numerosas espécies são di-nucleotídeos (Wang et al. 1994; Schug et al. 1998). As 25 repetições (CA)n são as mais estudadas até agora, já que são as mais abundantes no genoma dos mamíferos. Em todos os genomas eucarióticos analisados observou-se pouca presença ou total ausência, de repetições tipo (CG)n e a média desta seqüência representa somente 0,2% de todas as repetições (Tautz, 1986). Os microssatélites, de acordo a sua estrutura, podem ser de três tipos: perfeitos, que contêm unicamente um nucleotídeo repetido n vezes, imperfeitos, que contêm uma seqüência não-repetitiva intercalada entre as repetições, e compostos, que estão constituídos por dois ou mais segmentos repetitivos diferentes (Weber, 1990). 10.7.1. Seleção de microssatélites Segundo a FAO, recomenda-se no mínimo 25 loci de microssatélites para estudos de distância genética das espécies domésticas, de acordo com os seguintes critérios: 1) Marcador de domínio público, previamente reportado em publicações científicas; 2) Não-ligados; 3) Exibir herança Mendeliana; 4) Cada microssatélite escolhido deve conter no mínimo quatro alelos; 5) Microssatélite que possui homologia em várias espécies relacionadas são preferíveis; 6) Possível de ser usado em qualquer seqüenciador automático, em multiplex e de fácil reprodutibilidade. Os microssatélites são conservados entre as espécies semelhantes (Stallings et al. 1991). Segundo Moore et al. (1991), alguns iniciadores “primers” que têm sido utilizados para amplificar uma determinada seqüência em uma espécie servem para amplificação de uma seqüência homologa em uma espécie próxima. A amplificação de microssatélites di-nucleotídeos em Chimpanzés, usando iniciadores humanos, indica que os microssatélites estão bem conservados quanto à sua localização cromossômica e esta conservação poderia sugerir uma conservação funcional. Pepin et al. (1995) tipificaram um painel de 70 microssatélites bovinos na espécie caprina e encontraram um total de 41 marcadores que podem ser susceptíveis de amplificar em espécies próximas. Segundo Vaiman et al. (1996), estudando homologias genéticas entre espécies de ruminantes, verificaram que 34% dos loci de microssatélites 26 de bovinos foram polimórficos em caprinos e ainda, no mesmo estudo, os microssatélites de ovinos, 43% foram amplificados e polimórficos em caprinos. 10.7.2. Técnicas utilizadas para caracterização alélica dos microssatélites 10.7.2.1. Extração de ácidos nucléicos Atualmente a extração de DNA ou RNA a partir dos distintos tecidos não apresenta grandes dificuldades. O protocolo a seguir varia de acordo com o material biológico disponível (sangue, sêmen, pêlo, tecido epitelial, fezes, etc.) assim como a utilização posterior do ácido nucléico obtido. A maioria dos protocolos de extração de DNA clássica tende a ser mais trabalhoso, mas obtém-se um material de grande qualidade e alto peso molecular, útil à análise da biologia molecular. A eleição do método a ser utilizado depende do material disponível e das possibilidades de desenvolver a técnica escolhida. Geralmente, os protocolos apresentam duas partes, na primeira pretende-se quebrar as células e solubilizar o DNA, e a segunda seria eliminar, por métodos enzimáticos e/ou químicos, as proteínas, o RNA e outras macromoléculas. Estas técnicas apresentam muitas vantagens, entre elas a eficácia com a obtenção de grandes quantidades de DNA de alto peso molecular a partir de pequenas amostras de tecido fresco ou congelado, assim como a possibilidade de manter conservado durante muito tempo o material obtido. Inicialmente, desenvolveram-se diversos métodos de extração de DNA submetendo amostras de tecidos a uma digestão com proteinase K em presença de SDS e EDTA, várias extrações com fenol e cloroformo e, finalmente, precipitação alcoólica em presença de sais (David et al. 1986). A partir daí, foram surgindo novos protocolos buscando reduzir o risco do manipulador, o tempo para obter o DNA purificado e, principalmente, os custos. Assim, foram desenvolvidas várias técnicas (Ciulla et al. 1988; Grobet et al. 1991). Para utilizar o DNA obtido exclusivamente para amplificar mediante a PCR, as exigências de purificação diminuem enormemente, havendo estratégias realmente simples para preparar as amostras. Kawasaki (1990) desenvolveu um método que consiste em digerir uma amostra de poucos microlitros de sangue com proteinase K e emprega diretamente o produto para digestão na PCR. 27 Classicamente, as amplificações mediante PCR são realizadas a partir de DNA purificado. No entanto, em determinadas circunstâncias, a extração de DNA pode não ser possível por não se dispor de uma fonte de qualidade suficiente, como ossos antigos, pêlo, manchas de sangue, saliva, etc. Também, existe, por parte dos pesquisadores, grande inquietude para simplificar a técnica e adequá-la para realizar amplificações a partir de material biológico diretamente e reduzir o trabalho de isolar o DNA das amostras, medida importante, sobretudo, em laboratórios que processam muitas amostras por dia. Geralmente, sangue e pêlo são as fontes de material genético a estudar. Vários métodos foram desenvolvidos para amplificar as amostras de sangue diretamente sem uma prévia extração de DNA, como submeter o material de origem a ciclos de aquecimento a 940C e esfriamento a 500C previamente à execução da PCR propriamente dita (Mercier et al., 1990). Também foram descritas técnicas para amplificar seqüências a partir de amostras de sangue e pêlo, utilizando resinas quelantes como Chelex 100® (Bio-Rad) para eliminar íons e metais (Walsh et al., 1991). 10.7.2.2. A técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) A partir da década de 80, a descrição da técnica revolucionária concebida por Kary Mullis, denominada reação em cadeia de polimerase – PCR (Polymerase Chain Reaction), facilitou o entendimento dos processos biológicos, assim como a aplicação em diagnósticos e em melhoramento genético de plantas e animais domésticos. A técnica de PCR tem sido utilizada com os mais diferentes propósitos: identificação de indivíduos a partir de restos mortais, análise de DNA pré-histórico, diagnóstico de doenças, auxílio em investigações policiais, caracterização genética de populações e determinação de paternidade, além de outras aplicações. A PCR é uma técnica rápida e versátil que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase. A reação de PCR se baseia no anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos (17-25 pares de bases) utilizados como iniciadores (primers) que delimitam a seqüência de DNA da fita simples, alvo da amplificação. Estes iniciadores são sintetizados artificialmente de maneira que suas seqüências de nucleotídeos sejam complementares a seqüências específicas que flanqueiam a região alvo. 28 A reação envolve ciclos seqüenciais completos compreendendo três etapas básicas: a) Desnaturação – compreende a dissociação das ligações que mantêm unida a dupla fita de DNA. Obtido tipicamente pela elevação para temperaturas entre 93-95°C; b) Reanelamento – Ligação das seqüências iniciadoras com a seqüência alvo. Nesse passo, normalmente, a temperatura é reduzida para 50-65°C, dependendo essencialmente do tamanho e seqüência dos iniciadores utilizados, permitindo a hibridização DNA-DNA de cada iniciador com as seqüências complementares que flanqueiam a região alvo; c) Síntese de DNA – A partir dos iniciadores já ligados à seqüência alvo inicia a síntese de uma nova seqüência complementar. As temperaturas que conferem maior eficiência nessa etapa estão entre 70-75°C. Geralmente, 30 a 35 ciclos são suficientes para produzir de 100 ng a 1µg de DNA a partir de uma cópia simples de DNA molde. 10.7.2.3. Amplificação das seqüências de microssatélites As concentrações de DNA molde e polimerase podem afetar a eficiência de amplificação. Quantidade elevada de DNA pode inibir a reação por si mesmo ou até por possíveis substâncias que podem ser arrastadas ao final da purificação. Por outro lado, quantidade reduzida de uma só cópia pode ser amplificada. A concentração da polimerase varia de 0,50 e 2 U para uma reação de 50 μl. Uma concentração baixa limitará a quantidade de produtos obtidos e uma alta produzirá amplificações inespecíficas (Saiki et al., 1989). As concentrações de íons de magnésio afetam a reação de tal forma que em quantidade baixas reduzem drasticamente o rendimento desta e quantidades altas diminuem a especificidade da amplificação. A concentração ótima de MgCl2 varia entre 0,5 e 10 mM. Os desoxinucleósideos (dNTPs) captam íons de magnésio. Portanto, qualquer ajuste em sua concentração na reação requer uma compensação na concentração de MgCl2. Para os dNTPs, usam-se normalmente concentrações variando entre 50-200 μM de cada um deles. Concentrações mais elevadas facilitam que a polimerase possa cometer erros (Innis et al., 1988). 29 10.7.2.4. PCR Múltiples As análises de seqüências de DNA específicas tornaram-se mais rápidas e eficazes com o advento da PCR. A maioria dos protocolos de PCR estão desenhados para amplificar uma seqüência molde com um par de iniciadores. No entanto, muitos estudos experimentais requerem análises de várias seqüências de DNA e é necessário realizar sucessivas reações da mesma amostra. Assim, o desenho de PCR múltiples realiza a amplificação de várias seqüências simultaneamente em uma só reação. Desta forma, reduz o tempo, trabalho e custos (Chamberlain et al., 1988; Chamberlain et al., 1989). Um fator importante na obtenção de produtos de PCR é a correta eleição dos iniciadores que devem estar enfocados na especificidade e eficiência da amplificação. Para isso, deve-se utilizar iniciadores com mínima longitude, evitando que os oligonucleotídeos sejam complementares uns com outros (Rychlik et al., 1990). Com a PCR múltiples, aumenta a probabilidade de obter produtos de amplificação inespecíficos. Este problema pode ser evitado substituindo qualquer iniciador que gere produtos indesejáveis. A otimização de uma PCR múltiples requer provar distintas condições de reação. Os iniciadores devem ter temperaturas de acoplamento similares e devem amplificar fragmentos por suas diferenças de tamanho. Além disso, deve-se procurar ajustar as concentrações dos iniciadores, o tampão, a enzima, assim como, o tempo das distintas etapas da PCR, até conseguir uma amplificação equilibrada das distintas amplificações e ausência de produtos inespecíficos. 10.7.2.5. Métodos de eletroforese em gel A eletroforese em gel é a técnica mais utilizada para detecção de variantes de microssatélites. Para localizar as bandas de migração do DNA nos géis, classicamente revelam-se os mesmos em soluções de brometo de etídio ou por meio da impressão de placas radiográficas pela emissão de isótopos radiativos (Weber, 1990; Moore et al., 1991; Arranz, 1994). Pode-se usar tinção de prata como método alternativo pela sua simplicidade e segurança (Heukeshoven e Dernick, 1985). A partir daí, realizam-se algumas técnicas com marcadores fluorocromos em distintos tipos de trabalhos com estudos de paternidade (Bates et al. 1996) e em genética de populações (MoazamiGoudarzi et al., 1997). 30 10.7.2.6. Utilização de fluorocromos e sequenciamento automático A detecção das bandas pode ser feita também com iniciadores marcados com substâncias fluorescentes, emissores de raio laser e fotodetectores de fluorescência, o que apresenta grande vantagem em relação aos outros métodos, pois as amostras são detectadas em tempo real por intermédio de sofisticados programas de densiométria. Cada banda determina o tamanho de forma praticamente automática, porém a introdução desta técnica necessita de um seqüenciador automático. Os seqüenciadores automáticos são sistemas capazes de determinar as seqüências, tamanhos de fragmentos quantificando a fluorescência emitida por oligonucleotídeos ou dNTPs marcados com fluorocromo. Os marcadores emitem uma fluorescência quando se excitam com um laser. Cada um deles tem seu máximo de emissão de fluorescência num determinado intervalo de comprimento de onda. Pode-se marcar o microssatélite com fluorocromo tanto no extremo 5` de um dos iniciadores como nos dNTPs. No caso, usando-se um iniciador marcado, apenas um de seus extremos marca com o fluorocromo e os produtos se formam com uma fita marcada e outra não, detectando-se pelo seqüenciador só a que possui o fluorocromo. Para calcular o tamanho dos fragmentos de DNA desconhecido utiliza-se um padrão formado por fragmentos marcados com diversas longitudes conhecidas. As informações são transferidas a um computador para serem processadas e se apresentam em forma de eletroferograma, em que cada pico representa um fragmento. Os picos que aparecem apresentam cores diferentes, dependendo do fluorocromo utilizado e possibilita conhecer o tamanho dos pares de bases de cada pico, sua altura e sua área, que serão reflexos da quantidade de cópias amplificadas. Esta técnica apresenta algumas vantagens como: possibilidade de trabalhar em múltiples, maior automatização dos resultados pelo uso de software específico para interpretar os eletroferogramas, maior sensibilidade nos resultados com menores quantidades de produtos amplificados. 31 10.7.3. Aplicações dos microssatélites 10.7.3.1. Estudos de variabilidade genética Os microssatélites têm sido amplamente utilizados em estudos genéticos, já que permite estimar os níveis de variabilidade genética dentro das populações e analisar as relações genéticas existentes entre elas. Este tipo de estudo é de grande importância para estimar a diversidade genética existente em populações de animais domésticos ameaçados de extinção. A maioria dos microssatélites são neutros com respeito à seleção e isto os torna úteis para realizar estudos de variação genética. Estes marcadores permitem a identificação de cada alelo por locus, a obtenção de dados populacionais e o cálculo de freqüências alélicas. Assim, podemos estimar as distâncias genéticas entre populações ou entre indivíduos (Bowcock et al., 1994). De acordo com Kumar (2000), os marcadores de microssatélites estão bem descritos na literatura em algumas espécies, podendo ser usados para caracterização de rebanhos, além de estabelecer as relações filogenéticas entre as diversas raças. Nos últimos anos, diversos estudos foram desenvolvidos para analisar a diversidade genética na espécie caprina utilizando microssatélites (Yang et al., 1999; Saitbekova et al., 1999; Barker et al., 2001; Li et al., 2002; Ouafi et al., 2002). Assim como, em bovinos (Moazami-Goudarzi et al., 1997; Martín-Burriel et al., 1999), ovinos (Buchanan et al., 1994; Arranz et al., 1998; Diez-Tascón et al., 2000), em suínos Martinez (2000) e em eqüinos (Sereno, 2002). 10.7.3.2. Mapas genéticos Os primeiros mapas de ligamentos desenvolvidos foram para a espécie humana, facilitados pela identificação de milhares de polimorfismos de DNA altamente informativos, o que contribuiu para o avanço da genética molecular. O desenvolvimento de vários programas estatísticos permitiram estabelecer a ordem e as distâncias entre os genes. Os microssatélites foram utilizados de forma massiva para construção de mapas de ligamento de várias espécies de mamíferos. 32 Atualmente existem no banco de dados da espécie caprina (http://locus.jouy.inra.fr) 727 loci descritos, sendo 303 genes e 424 referentes a loci de microssatélites. No Goatmap foram identificados 123 loci homólogos a ovinos e 275 homologias com bovinos. O mapeamento genético é uma ferramenta muito importante para se determinar a localização de genes de interesse. Do ponto de vista da produção animal, os genes mais interessantes são os responsáveis por caracteres produtivo (QTLs), assim como, os da sanidade animal que são genes que determinam certas patologias. 10.7.3.3. Controle de paternidade Os marcadores protéicos e os grupos sanguíneos constituíam o padrão de teste de paternidade para diversas espécies (humanos, bovinos e eqüinos). A partir da década de 1980, os marcadores bioquímicos foram sendo substituídos pelos marcadores de DNA para teste de paternidade. De acordo com Bowling (2001), os testes de paternidade necessitam de algumas características essenciais como: acurácia, efetividade, baixo custo, rapidez de resposta, padronização de referência e fácil transferência de informações entre laboratórios. O alto grau de polimorfismo observado nos microssatélites está possibilitando sua utilização com grande eficiência nos testes de paternidade em distintas espécies de animais domésticos como: caprinos (Luikart et al., 1999; Araújo, 2004); bovinos (Heyen et al. 1997; Usha et al. 1995); asininos (Arranguren-Méndez, 2001) e equinos (Binns et al., 1995). 11. Análises Estatísticas Nos últimos anos, as análises de polimorfismo de microssatélites têm sido utilizadas em diversos estudos de variabilidade genética para verificar a variação genética intra e interpopulacional, além de determinar a distância ou similaridade genética entre populações. Para análises com marcadores moleculares, o número de amostras e o número de marcadores estudados são de extrema importância para acurácia dos resultados. Segundo Barker (1994), a precisão da estimativa de diversidade genética depende do 33 número de loci analisados, a heterozigosidade dos loci e o número de amostras de cada população. Os parâmetros estatísticos mais usados em estudos genéticos de populações são: freqüências alélicas, heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He), conteúdo de informação polimórfica (PIC), desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), estatísticas de F (Fst, Fit e Fis), coeficiente de diferenciação genética (Gst) e distâncias genéticas. 11.1. Cálculo de freqüências alélicas O cálculo das freqüências alélicas é feito com base na contagem direta dos alelos encontrados. As observações com apenas um alelo são considerados homozigotos. Assumindo que existe um estado ideal de equilíbrio Hardy-Weinberg (HWE), a variância de uma freqüência alélica pode ser descrita pela expressão binominal: σ x2 = x(1− x ) 2n x: freqüência alélica e n: número de indivíduos das amostras Segundo Nei (1987), o erro padrão da freqüência alélica obtém-se por meio da raiz quadrada da variância. Para uma determinada freqüência alélica, o erro padrão diminui à medida que aumenta o número das amostras. Considera-se uma amostra ideal aquela constituída de 30 a 60 indivíduos. De acordo com a FAO (1998), o tamanho mínimo da amostra deve ser de 25 animais para estudos de variabilidade e diversidade genética intra e interpopulacional. 11.2. Heterozigosidade A heterozigosidade pode ser considerada uma medida de variabilidade genética. Considera-se um locus polimórfico quando o alelo mais comum tem uma freqüência inferior a 0,95. A heterozigosidade de um marcador é a probabilidade de um indivíduo ser heterozigoto no locus marcador, este parâmetro depende do número de alelos e da freqüência deste na população. Segundo Ott (1992), um marcador é considerado altamente informativo com heterozigosidade maior que 70%. 34 A heterozigosidade observada é a proporção de indivíduos heterozigotos observada nas amostras da população. Calcula-se diretamente a partir dos genótipos encontrados na população para todos os loci mediante a aplicação do programa informático Genetix v. 4.0.4 (Belkhir et al., 1999). Segundo Hedrick (1983), o erro padrão é a raiz quadrada da variância expressa pela seguinte fórmula: σ H2 = H (1− H ) nr n: número de indivíduos (tamanho das amostras) e r: número de loci estudados O cálculo da heterozigosidade média observada depende do número de amostras e loci estudados. A heterozigosidade média esperada ou diversidade genética de um locus calculase (Nei, 1973) por: k He = 1 − ∑ xi 2 i=1 xi: freqüência do alelo i e k: número de alelos Este parâmetro é equivalente à heterozigosidade observada, considerando-se apenas que as populações estão em completo equilíbrio. 11.3. Conteúdo de informação polimórfica (PIC) Descrito por Botstein et al. (1980), o conteúdo de informação polimórfica é um indicador da qualidade do marcador em estudos genéticos (segregação, identificação de populações e controle de paternidade). No entanto, é um parâmetro que apresenta uma dependência do número de alelos e suas freqüências. Desta forma, a informação que aporta não deve ser utilizada exclusivamente para eleger um marcador ou descartá-lo (Moazami-Goudarzi et al., 1994). Calcula-se de acordo com a seguinte fórmula: ⎛ k 2 ⎞ k −1 k 2 2 PIC = 1− ⎜⎜ ∑ xi ⎟⎟ − ∑ ∑ 2x i x j ⎝ i=1 ⎠ i =1 j= i +1 35 Segundo a classificação de Botstein et al. (1980), marcadores com valores de PIC superiores a 0,5 são considerados muito informativos, valores entre 0,25 e 0,50 mediamente informativos e valores inferiores a 0,25 pouco informativos. 10.4. Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) A lei de Hardy-Weinberg foi verificada por Hardy e Weinberg independentemente em 1908. Segundo esses autores, em uma população grande, com acasalamento aleatório, sem seleção, mutação ou migração, as freqüências alélicas e genotípicas permanecem constantes de geração à geração, considerando-se uma população em completo equilíbrio. A constituição genética de uma população é descrita pela especificação dos alelos e a proporção dos diferentes alelos em cada locus. Os desvios do EHW podem ter sua origem em diversos fatores como: acasalamentos direcionados; subdivisões dentro das populações; coancestrais e antepassados comuns; seleção natural; migração ou fluxo de genes a partir de uma população externa; técnica de amostragem incorreta, além da presença de alelos nulos não detectáveis experimentalmente. Qualquer desvio significativo do EHW indicará que a população está subdividida, que existe uma consangüinidade significativa ou que existe fluxo de genes de outra população. Estas circunstâncias podem ser verificadas usando o teste de qui-quadrado, teste exato de Fisher ou procedimentos de proporção de verossimilhança. Os testes mais comuns para o EHW são os testes de qui-quadrado para as proporções esperadas e observadas de heterozigotos. Geralmente, são recomendadas para análises preliminares, pois estes testes produzem resultados imprecisos quando existe um ou mais genótipos raros (Weir,1996). O teste exato de Fisher para análise do EHW para cada locus/população foi descrito por Guo e Thompson (1992) usando o algoritmo em cadeia de Monte Carlo (poucos dados) ou cadeia Markov (muitos dados) para obter amostras aleatórias a partir dos dados originais (permutação), utilizando o programa informático GENEPOP versão 3.1c (Raymond e Rousset, 1996). 36 10.5. Índices de fixação ou Estatísticas de F Nas décadas de 40 e 50, Sewall Wright descreveu a teoria dos índices de fixação ou estatísticas de F, posteriormente desenvolvida por outros autores (Chakraborty e Danker-Hopfe, 1991; Weir e Cockerham,1984; Weir,1996). Essa teoria propõe medir os desvios de freqüências genotípicas em populações subdividas usando três parâmetros: Fis (subdivisão intrapopulacional), Fit (endogamia total) e Fst (subdivisão geográfica). Segundo Weir e Cockerham (1984), as estatísticas de F representam uma maneira de sumarizar a estrutura de uma população. Estes parâmetros são obtidos de acordo com as seguintes fórmulas: FST = 1 − (1− FIT ) (1 − FIS ) O cálculo das estatísticas de F tem sido utilizado em vários estudos de comparação de populações. Para um conjunto de t populações com freqüências alélicas para cada alelo xi (i= 1,2,3,...k), a estatística FST define-se como: ∑ (x i FST = − x) 2 i (t − 1) = σ 2 x (1 − x ) x (1− x ) onde x = ∑ix i t é a freqüência média na amostra de todos os alelos e todas as amostras, e σ2 é a variância da amostra. De acordo com Nei (1977), as três estatísticas de F podem ser calculadas usando a heterozigosidade observada e esperada. FIS = 1 − H HeS , FIT = 1 − HeS H FST = 1 − H eT y H eT Onde H é a freqüência observada de heterozigotos, HeS e H eT são a heterozigosidade esperada em equilíbrio Hardy-Weinberg ou a medida de diversidade genética nas subpopulações e população total, respectivamente. 37 A medida FST padrão não pode ser considerada como uma medida de distância genética, sendo que o FST se aplica a várias populações e a distância genética se aplicaria para um par de populações. Segundo Nei (1987), o FST pode ser usado como medida de distância genética considerando-se duas populações. O FST para distância genética define-se como FSTi: 2 xi − yi ) ( FSTi = 2zi (1 − zi ) xi, yi: frequências de um alelo de um locus em duas populações zi: média de xi e yi FSTi pode ser calculado para cada alelo, com a média para cada locus e depois para todos os loci. O erro padrão do FSTi é: ⎛ 2 ⎞⎛ 1⎞ ⎟ ⎜ FSTi + ⎟ ⎝ rk ⎠ ⎝ n⎠ σF = ⎜ STi r: número de loci estudados k: média do número de alelos em cada locus n: número de indivíduos estudados Verifica-se que o erro padrão é mais influenciado pelo número de loci utilizado do que pelo tamanho da amostra. Então, em amostra com no mínimo 20 indivíduos, o efeito sobre o erro padrão é irrelevante. 10.6. Coeficiente de diferenciação genética (GST) De acordo com Nei (1973), para analisar a subdivisão de populações não é necessário conhecer as freqüências genotípicas, pois este autor propõe trabalhar diretamente com freqüências alélicas utilizando as heterozigosidades esperadas (diversidade genética) intra e interpopulacional. Este método não é influenciado pelo número de alelos por locus nem pelo modelo de evolução (mutação, seleção e migração). Assim, a magnitude relativa da diferenciação genética entre subpopulações pode ser medida pelo coeficiente de diferenciação genética: 38 GST = H eS HeT H eS : diversidade genética média entre subpopulações. HeT : diversidade genética média na população total. 11. Distâncias Genéticas Segundo Nei (1987), a distância genética é reflexo das diferenças entre os genes (diferenças genômicas), populações e espécies. Em genética de populações uma população pode ser definida mediante as freqüências alélicas das variantes que segregam nesta população. As distâncias genéticas apresentam propriedades matemáticas, assim como um significado biológico. Uma função deve ter algumas propriedades para ser considerada distância: a) a distância entre uma população X e ela mesma deve ser zero: d(X,X)=0; b) a distância entre duas populações X e Y deve ser simétrica: d(X,Y)=d(Y,X). Se a distância está de acordo com essas duas propriedades anteriores, denomina-se distância semimétrica. E além disso, apresenta uma desigualdade triangular que (d(X,Y)≤[d(X,Z)+d(Y,Z)] ), denomina-se distância métrica (Katz, 1986). As distâncias métricas são mais utilizadas que as semimétricas em estudos de populações. Em estudos evolutivos e para a construção de árvores filogenéticas não é necessário apresentar desigualdade triangular. A distância natural entre dois vetores X e Y no espaço k-dimensional é a distância euclidiana: k ∑ (x d(X,Y ) = i − yi ) 2 i=1 onde xi e yi correspondem às freqüências do alelo i nas populações X e Y respectivamente. Esta distância satisfaz às três propriedades anteriores. Assim como a distância genética de Rogers (1972), que se deriva da distância euclidiana. DRogers = 2 1 k (xi − yi ) ∑ 2 i=1 39 k 2 A raiz quadrada da distância euclidiana: d (X,Y ) = ∑ (xi − yi ) 2 satisfaz às duas i=1 primeiras propriedades, mas não à desigualdade triangular, assim como, as distâncias derivadas desta expressão (distância mínima de Nei, distância de Reynolds, etc.), que são consideradas semi-métricas. Outro fator que se deve levar em consideração é a interpretação biológica das distâncias genéticas, pois depende do modelo de divergência utilizado. Na teoria da genética de populações existem quatro forças evolutivas que podem modificar a estrutura genética das populações: deriva genética, mutação, seleção e migração. A diversidade genética observada é determinada principalmente pela deriva genética e mutação, uma vez que a migração é ignorada após a separação das populações e assume-se que os loci em estudo são seletivamente neutros, da mesma forma que a seleção não afeta as mudanças nas freqüências alélicas destes marcadores. Em estudos envolvendo um período relativamente curto de tempo (divergência de raças), o efeito da mutação pode ser ignorado e assume-se o modelo evolutivo de deriva genética (Reynolds et al., 1983). No entanto, para estudos de divergência genética envolvendo períodos mais longos (relação entre espécies) a mutação não deve ser excluída e adota-se o modelo de evolução deriva-mutação. 11.1. Medidas de distâncias genéticas As medidas de distâncias genéticas são indicadores da proximidade entre populações e são úteis para reconstrução das relações históricas e filogenéticas entre grupos. Segundo Eding e Laval (1999), são várias as medidas que podem ser utilizadas para o cálculo da distância genética dependendo do objetivo de estudo. Nas seguintes fórmulas os valores de xi e yi são as freqüências do alelo i nas populações X e Y respectivamente. Para simplificar, as fórmulas são dadas para apenas um locus. Para ampliar as expressões para vários loci, deve-se somar todas as distâncias para cada locus e dividir pelo número de loci cujos alelos aparecem nas expressões: 40 ⎛ ⎜ Distância Padrão de Nei (D): D = − ln ⎜⎜ ⎜ ⎝ Distância de Goldstein: ⎞ ⎟ i ⎟ 2 2⎟ ∑ xi ∑ yi ⎟⎠ i i ∑x y i i (δμ )2 = (μX − μY ) 2 μX = ∑ i ixi e onde onde: μY = ∑ i iyi são os tamanhos médios dos alelos de cada população. Distância média ao quadrado (ASD): ASD = ∑ i,i' (i − i' ) x i yi' 2 i, i’ são os tamanhos dos alelos de um locus. Distância de Shriver (DSW): DSW = WXY − (WX + WY ) 2 onde: WX = ∑ i − i' xi x i' , i≠ i' WY = ∑ i − i' yi yi' , WXY = ∑ i − i' xi yi' i ≠i' i≠ i' ⎛ ⎞ Distância de Cavalli-Sforza (DC): DC = (2 π ) 2⎜⎜1 − ∑ xi yi ⎟⎟ ⎝ ⎠ i Distância de Nei (DA): DA = 1 − ∑ xi yi i Distância mínima de Nei (Dm): Dm = 2 1 ( x − y ) ∑ i i 2 i 1 ∑i (xi − yi ) = 2 1 − ∑i x i yi 2 Distância de Reynolds (DReynolds): DRe ynolds Não existe um consenso sobre qual das distintas medidas de distâncias genéticas é a mais apropriada para análises de populações dentro de espécies, especialmente no caso de raça de animais domésticos e menos ainda entre variedades dentro de raças. Segundo Nei (1983), existem altas correlações entre as várias medidas de distâncias, particularmente quando se aplicam a populações comerciais. Na Tabela 2, encontra-se o uso das distâncias genéticas de acordo com o recomendado com o tempo de divergência das populações estudadas (Eding e Laval, 1999). 41 Tabela 2 – Alguns critérios para eleição da medida de distância genética apropriada Tempo de divergência Modelo aplicado DC DA D (δμ)2 Dm DReynolds Curto (Raças no continente) Deriva genética +/+ Intermediario (Raças no mundo) Mutação e deriva + + + + - Longo (Espécies) Mutação e deriva + + + + - Na prática, recomenda-se calcular duas ou mais distâncias genéticas e avaliar as similaridades e diferenças entre elas, considerando as propriedades matemáticas e biológicas, para eleger uma distância genética apropriada com a realidade e assim obter resultados mais confiáveis. A distância padrão de Nei (D) é a medida mais utilizada e sua distância tem um valor linear proporcional ao tempo de divergência e nas árvores construídas com esta distância espera-se obter a filogenia das espécies. A distância mínima de Nei (Dm) mede o número mínimo de alelos diferentes de cada locus. Esta medida de distância está sendo utilizada em estudos de polimorfismo genético já que sua utilidade é limitada quando se comparam populações intraespecíficas (Nei, 1987). A distância de Nei (DA) tem demonstrado ser linear com o tempo. No entanto, apresenta um problema com dados de microssatélites de populações divergentes, devido à alta proporção de mutação e grande número de alelos. As distâncias de Cavalli-Sforza (DC) e de Reynolds (DReynolds) assumem que não existem mutações e todas as mudanças nas freqüências são produzidas por deriva genética. No entanto, assumem que o tamanho da população continua constante e igual em todas as populações. A medida de Cavalli-Sforza modificada está sendo recomendada como medida alternativa para uso em populações próximas em que a deriva genética é o determinante primário para a diferenciação da evolução (Eding e Laval, 1999). A distância de Nei e Goldstein (δμ)2 é mais apropriada que outras distâncias para calcular o tempo de evolução. O problema com os loci de microssatélites é que o padrão mutacional é freqüentemente irregular. Alguns loci de microssatélites são altamente polimórficos em algumas populações e espécies, no entanto são mais monomórficos em outras, também não se conhece as razões das diferenças de polimorfismo entre populações. Outro fator limitante para o uso de loci de microssatélites é que a proporção 42 de mutação pode mudar de locus a locus e aumentar a variação dos valores da distância (Goldstein et al. 1995). 12. Árvores de distância genética As matrizes de distância genética oferecem toda a informação dos marcadores genéticos com relação às diferenças entre as raças estudadas. No entanto, como são muitos dados torna-se difícil a interpretação das matrizes de distância sem análises adicionais. Segundo Eding e Laval (1999), as árvores de distância são representações gráficas ou mapas da matriz de distância que em alguns casos podem representar a filogenia. Existem diferentes métodos para construção de árvores a partir de uma matriz de distância e os mais utilizados são UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic means) e NJ (Neighbor-joining). O método de UPGMA descrito por Sneath e Sokal (1973) baseia-se no agrupamento sucessivo de pares de táxons de acordo com o nível de similaridade. O algoritmo opera da seguinte forma: a) o par de táxons mais semelhante (menor distância) é unido e um nó é posicionado exatamente na metade da distância que separa os dois; b) a distância entre o par de táxons unidos e o táxon ao qual ele está sendo comparado. Novamente a menor distância na nova matriz determina quais táxons devem ser unidos e um novo nó é posicionado como anteriormente descrito; c) esse procedimento é repetido até que todos os táxons tenham sido incorporados ao dendrograma. Nei et al. (1983), em estudos de simulação, compararam diferentes métodos para construir árvores filogenéticas e observaram que o UPGMA comportavase bem quando as taxas de substituição eram as mesmas para todas as árvores. Deve-se assumir que as taxas de substituição sejam iguais para que o método possa ser aplicado. Desenvolvido por Saitou e Nei (1987), o método de NJ é utilizado para identificar os pares de vizinhos mais próximos, populações ou grupos de populações (unidades taxonômicas), de forma que se minimize a longitude total da árvore. Um par de vizinhos é conectado por um simples nó em uma árvore sem raiz e com duas ramas que se unem em um nó interior. Em geral, é possível definir a topologia de uma árvore pela união sucessiva de pares de vizinhos para formar novos pares de vizinhos. A princípio formase uma figura em forma de uma estrela, em que todas as ramas partem do mesmo ponto. Consideram-se vizinhos um par de grupos que, quando se juntam, produzem uma árvore cuja longitude total mais curta se unem para formar uma unidade combinada. O 43 procedimento é usado para identificar os vizinhos mais próximos entre um número reduzido de unidades e repetido até que restem apenas três unidades e, assim, obtém-se uma árvore sem raiz. NJ é um método aplicado para dados puramente aditivos em que a distância entre cada par de unidades taxonômicas é a soma das longitudes das ramas que as unem na árvore. No caso aditivo, o NJ seria uma árvore de mínima evolução, ou seja, a soma dos desvios entre as distâncias de pares de taxas e as longitudes de cada passo da árvore é mínima. O “Bootstrap” é uma técnica estatística de reamostragem que permite um ganho de informação sobre os parâmetros de distribuição em um conjunto de dados. Sua principal função é avaliar a magnitude dos erros amostrais sobre inferências (Weir, 1996). A técnica de reamostragem é utilizada na construção de árvores para obter valores de confiança dos nóis da árvore. Os valores de reamostragem podem ser obtidos dos dados de freqüências de alelos de loci, tomados aleatoriamente. As freqüências dos loci em cada amostra são utilizadas para o cálculo da nova matriz que, posteriormente, será utilizada para construção da árvore proporcionando dados que indicam a proporção ou porcentagem de vezes que cada nó formado em todas as árvores calculadas na reamostragem (Eding e Laval, 1999). 12.1. Árvores filogenéticas individuais Descrito por Bowcock et al. (1994), as árvores individuais são um tipo de análise que avalia a tendência dos animais se agruparem por população. Caso os animais amostrados de uma mesma raça não se agrupem juntos, pode ser um sinal de que existe um problema na definição da raça ou na amostragem. A possibilidade de avaliação da relação genética interindividual de uma população baseada em genótipos de vários loci sugere novos avanços em análises de genéticas de populações. Esta análise elimina a necessidade a priori de definir cada população e facilita a detecção de recentes migrações (Ruiz-Linares,1999). Os microssatélites têm um grau relativamente alto de heterozigosidade e muitos alelos para cada locus. Assim, cada indivíduo pode ser definido de forma quase inequívoca. Isto implica que se podem obter resultados significativos de alelos compartilhados entre indivíduos membros das populações estudadas e, podem-se construir árvores filogenéticas usando os indivíduos como unidades taxonômicas. 44 12.2. Análises de correspondência Aplicada a uma análise clássica multivariante fatorial, a análise de correspondência é uma medida de diversidade genética básica, na qual permite estudar uma variável qualitativa (raça) em função de outras variáveis qualitativas (alelos) e em um termo clássico de inércia pode ser assimilado à diversidade. Assim, a análise de correspondência estabelece relações entre categorias de variáveis, definindo similaridades ou diferenças entre elas, o que permite depois seu agrupamento, caso exista “correspondência” entre elas. Esta aproximação foi desenvolvida por CavalliSforza et al. (1994), aplicada a dados de várias populações humanas. A análise efetua-se a partir de uma tabela de contingência por raça em que as linhas estão constituídas pela variável a explicar (raça) e as colunas contêm o conjunto de variáveis explicativas (alelos). Tratando-se da modalidade de correspondência múltipla no caso que os diferentes loci consideram-se não ligados (Lebart et al., 1995), os resultados permitem obter a importância relativa (inércia) tanto das populações quanto dos alelos com uma representação gráfica mediante um sistema de pontos situados no espaço euclidiano e a verificação de seu grau de robustez. Na literatura pode-se encontrar vários trabalhos com animais domésticos que utilizam esta análise (MacHaugh et al., 1998; Cymbron et al., 1999; Yang et al., 1999; Hanslik et al., 2000; Wimmers et al., 2000). 45 Referências Bibliograficas Ajmone-Marsan, P.; Negrini, R.; Crepaldi, P. et al. Assessing genetic diversity in Italian goat populations using AFLP markers. Animal Genetics, v. 32, p. 281-288, 2001. Anderson, S.; Bruijn, M. H. L.; Coulson, A. R. et al. Complete sequence of bovine mitochondrial DNA: conserved features of the mammalian mitochondrial genome. Journal of Molecular Biology. v. 156, p. 683-717, 1982. Andrade, M.C.. Áreas de Domínio da Pecuária Extensiva e Semi-intensiva na Bahia e Norte de Minas gerais. Recife: SUDENE, 1982. p: 221-223. (Serie Estudos Regionais). Andreasson, H.; Asp, A.; Alderborn, A. et al. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. Biotechniques, v. 32, n. 1, p. 124-133, 2002. Aranguren-Méndez, J.; Jordana, J.; Gomez, M. et al. Genetic diversity in Spanish donkey breeds using microsatellite DNA markers. Genetics Selection and Evolution, v. 33, p. 433-442, 2001. Araújo, A. M. Paternidade e diversidade genética em caprinos no Brasil por meio de microssatélites de DNA. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa, 2004. 90p. Tese (Doutorado em Genética e melhoramento). Universidade Federal de Viçosa, 2004. Arranz, J. J.; Bayón, Y.; San Primitivo, F. Genetic relationships among Spanish sheep using microsatellites. Animal Genetics, v. 29, p. 435-40, 1998. Arranz, J. J. Estudio genético en poblaciones bovinas mediante polimorfismos bioquímicos y de DNA (Variaciones puntuales y microssatélites). León: Universidad de León, 1994. Tese (Doutorado em Veterinaria), 1994. Barker, J. S. F.; Tan, S. G.; Moore, S. S. et al. Genetic variation within and relationship among populations of Asian goats (Capra hircus). Journal of Animal Breeding Genetics, v.118, p. 213-233, 2001. Barker, J. S. F. A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds. In : WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5.1994, Guelph. Proceedings... Guelph: [s.m], 1994. v. 21, p.501-508. Bates, S., Peterson-Knabe, C., Holm, T., Van Haeringen, H., Lange, K., Ziegle, J., Heyen, D., Da, Y. & Lewin, H. (1996). In: XXVth INTERNATIONAL CONFERENCE ON ANIMAL GENETICS, Tours. Belkhir, K. Genetix: Logiciel sous WindowsTM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions. CNRS UPR 9060, 1999. Binns, M. M.; Holmes N. G.; Holliman, A. et al. The identification of polymorphic microsatellite loci in the horse and their use in thoroughbred parentage testing. British Veterinary Journal, v.151, p. 9-15, 1995. Bowling, A. T. Historical development and application of molecular genetic test for horse identification and parentage control. Livestock Production Science, v. 72, p. 111-116, 2001. 46 Botstein, D.; White, R. L.; Skolmick, H. et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lenght polymorphisn. American Journal of Human Genetics, v. 32, p. 314-331, 1980. Bowcock, A. M.; Ruiz-Linares, A.; Tomfohrde, J. et al. High resolution of human evolution with polymorphic microsatellites. Nature, v. 368, p. 455-457, 1994. Buchanan, F. C.; Adams, L. J.; Littlejohn, R. P. et al. Determination of evolutionary relationships among sheep breeds using microsatellites. Genomics, v. 22, p. 397403, 1994. Capristano, A.J. Capítulo da história colonial: 1500-1800 e os caminhos antigos e povoamento do Brasil. Ed. Universidade de Brasília, Brasília.. 1982. p. 133 Capote, J.; Arguello, A.; Lopez, J. L. et al. Introducción de caprinos en las islas Canarias y América: una visión desde punto de vista etnológico e histórico. In: XXVII JORNADAS CIENTÍFICAS Y VI JORNADAS INTERNACIONALES DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE OVINOTECNIA Y CAPRINOTECNIA. Valencia-ES. 2002. Anais... Valencia. 2002. Carvalho, J. H. Conservação de Recursos Genéticos de animais domésticos do Nordeste. In: VIII SIMPÓSIO NORDESTINO DE ALIMENTAÇÃO DE RUMINANTES. Teresina-PI, 2000. Anais... Teresina, 2000. Cavalli-Sforza, L. L.; Menozzi, P.; Piazza, A. The History and Geography of Human Genes, Princeton University Press, Princeton, 1994. Chakraborty, R.; Danker-Hopfe, H. Analisys of population structure: a comparative study of different estimators of Wright´s fixation indices. Handbook of Statistics, 1991. Chamberlain, J. S. ; Gibbs, R. A. ; Ranier, J. E. et al. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular distrophy. PCR protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M., Gelfand, D., Sninski, J., White, T., Eds. Orlando. 272-281, 1989. Chamberlain, J. S.; Gibbs, R. A.; Ranier, J. E. et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acid Research, v. 16, p.11141-11156, 1988. Ciulla, T. A.; Sklar, M.; Hauser, S. L. A simple method for DNA purification from peripherical blood. Analytical Biochemistry, v. 174, p. 485-488, 1988. Crepaldi, P.; Negrini, R.; Milanesi, E. et al. Diversity in five goat populations of the Lombardy Alps: comparison of estimates obtained from morphometric traits and molecular markers. Journal Animal Breeding and Genetics, v. 118: p. 173-180, 2001. Cymbrom, T. ; Loftus, R. T. ; Malheiro, M. I. et al. Mitochondrial sequence variation suggests an African influence in Portuguese cattle. Proceedings of the Royal Society of London. Biological Sciences, v. 22, p. 597-603, 1999. David, L. G.; Dibner, M. D.; Battey, J. F. Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier. New York, 1986. Díez-Tascón, C.; Littlejohn, R. P.; Almeida, P. A. R. Genetic variation within the Merino sheep breed: analisys of closely related populations using microsatellites. Animal Genetics, v. 31 p. 243-251, 2000. 47 Domingues, O. A Cabra na Paisagem do Nordeste. Ceará: S.F.A, 1955. Domingues,O.; Sanford, P.; Melo, J.M. et al. Preservação e Seleção de Raças Nativas de Gado do Nordeste. Fortaleza. Seção de fomentos da Agricultura. (Boletim técnico), 1954, 28 p. Eding, J. H.; Laval, G. Measuring genetic uniqueness in livestock. In: Genebanks and the conservation of farm animal genetic resources, Lelystad: Ed. J.K. Oldenbroek. ID.DLO, 1999, p. 33-58. Egito, A. A.; Mariante, A. S.; Albuquerque M. S. M. Programa brasileiro de conservação de recursos genéticos animais. Archivos de Zootecnia, v. 51, p. 39-52, 2002. Egito, A. A.; Albuquerque, M. S. M.; Mariante, A. S. Situação atual da caracterização genética animal na EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia. In: II SIMPOSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE – SIRGEALC. Brasilia, 1999. Procceding... Brasília, 1999. CD-ROM. FAOSTATS..http://apps1.fao.org, (2002) FAO. Secondary Guidelines for Development of National Farm Animal Genetic Resources Management Plans: Managemen of small populations at risk, FAO. Rome, 1998. Ferreira, M. E., Grattapaglia, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análises genéticas. 3ª Ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998. pp. 220. Gama, L. T. Manutenção da variabilidade genética em programas de seleção. In: I SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE CONSERVAÇÃO DE RECURSOS GENÉTICOS (RAÇAS NATIVAS PARA O SEMI-ÁRIDO). Recife- PE. Anais… 38-44. 2004. Ghivizzani, S. C.; Mackay, S. L. D.; Madsen, C. S. et al. Transcribed heteroplasmic repeated sequences in the porcine: mitochondrial DNA D-loop region. Journal of Molecular Evolution, v. 37, p. 36-47, 1993. Goldstein, D. B.; Ruiz Linares, A.; Cavalli-Sforza, L. L. et al. An evaluation of genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics, v. 139. p. 463-71, 1995. Gonzalo, G.; Barba, C.; Gómez-Moya, J. D. Razas caprinas autóctonas de fomento. Ovis- AULA DE VETERINÁRIA. Razas caprinas. v. 83, p. 25-35, 2002. Gonzalo, G.; Roz-Perez.; Machuca-Peralta, M. Razas caprinas autóctonas de protección especial. Ovis- AULA DE VETERINÁRIA. Razas caprinas. v. 83, p. 37-54, 2002. Gonzalo, G.; Sánchez, J. M. Razas caprinas foráneas: lecheras, de pelo y de otras aptitudes. Ovis- AULA DE VETERINÁRIA. Razas caprinas. v. 83, p. 55-64, 2002. Grobet, L.; Schwers, A.; Roupain, J. et al. Les empreintes génétiques et autres marqueurs dans les contrôles de filiation chez les animaux domestiques. Annales de Médecine Vétérinaire, v. 135, p. 245-253, 1991. Guo, S. W.; Thompson, E. A. Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportions for multiple alleles. Biometrics, v. 48 p. 361-372, 1992. Hanslik, S.; Harr, B.; Brem, G. et al. Microsatellite analysis reveals substantial genetic differentiation between contemporary New World and Old World Holstein Friesian populations. Animal Genetics, v. 31, p. 31-38, 2000. 48 Hedrick, P. W. Genetics of Populations. Science Books International. Boston, 1983. Heyen, D. W.; Beever, J. E.; Da, Y., et al. Exclusion probabilities of 22 bovine microsatellite markers in fluorescent multiplexes for semi-automated parentage testing. Animal Genetics, v. 28, p. 21-27, 1997. Herrera, M.; Peña, F.; Rodero, E. et al. Sobre los orígenes de las razas caprinas españolas. Pequeños Ruminantes, v. 2, n. 1, p. 30-34, 2001. Heukeshoven, J.; Dernick, R. Simplified method for silver staining of proteins in polyacrylamide gels and the mechanism of silver staining. Electroforesis, v. 6, p. 103-112, 1985. Hiendleder, S.; Mainz, K.; Plante, Y. et al. Analysis of mitochondrial DNA indicates that domestic sheep are derived from two different ancestral maternal sources: no evidence for contributions from urial and argali sheep. The Journal of heredity, v. 89, p. 357-363, 1998. Honeycutt, R. L.; Nedbal, M. A.; Adkins, R. M. et al. Mammalian mitochondrial DNA evolution: a comparison of the cytochrome b and cytochrome c oxidase II genes. Journal of Molecular Evolution, v. 40, p. 260-272, 1995. Innis, M. A.; Myambo, K. B.; Gelfand, D. H. et al. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reactionamplified DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. v. 85, p. 9436-9440. 1988. Irwin, D. M.; Kocher, T. D.; Wilson, A. C. Evolution of the cythocrome b gene of mammals. Journal of Molecular Evolution, v. 32, p. 128-144, 1991. Jandurová, O. M.; Koot, T.; Kottová. et al. Seven microsatellites markers useful for determining genetic variability in White and Brown Short-Haired goat breeds. Small Ruminant Research. Article in press, 2003. Jeffreys, A. J.; Wilson, V.; Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature, v. 314, p. 67-73, 1985. Junge, A.; Sttevens, M.; Madea, B. Successful DNA typing of a urine sample in a doping control case using human mitochondrial DNA analysis. Journal of Forensic Science, v. 47, n. 5, p. 1022-1024, 2002. Kumar, D. DNA markers for the differentiation of farm animal breeds. In: SAHAI, R.; VIJH, R. K. (Ed.) Domestic Animal Diversity: Conservation and sustainable development, Karnal: SI Publications. 2000, p.305-312. Katz, M. Etude des propiétés de certains indices de distance génétique et de leurs estimateurs. Doctoral thesis. Université Paris. Paris, 1986. Kawasaki, E. Sample preparation from blood, cells and other fluids. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., New York, 1990, p.146152. Lara, M. A. C.; Cunha, E. A.; Bufarah, G. et al. Situação da caracterização genética animal no Instituto de Zootecnia. In: SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE, 2., 1999, Brasília. Anais... Ed. Mariante, A. S., Bustamenate, P. G. Brasília: Embrapa. CD-Rom. Lebart, L. ; Morineau, A. ; Piron, M. Statistique exploratoire multidimensionnelle. Dunod, Paris, 1995. p. 95-96. 49 Li, M. H.; Zhao, S. H.; Bian, C. et al. Genetic relationships among twelve Chinese indigenous goat populations based on microsatellite. Genet. Sel. Evol, v. 34, p. 729744, 2002. Lodish, H.; Berk, A.; Zipursky, S. L. et al. J. Molecular Cell Biology. W.H. Freeman and Company, 4. ed., 1999, 1084 p. Luikart, G. ; Biju-Duval, M-P. ; Ertugrul, O. et al. Power of 22 microssatelite markers in fluorescent multiplexes for parentage testing in goats (Capra hircus). Animal Genetics, v. 30, p. 431-438, 1999. Luikart, G.; Gielly, L.; Excoffier, L. et al. Multiple maternal origins and weak phylogeographic structure in domestic goats. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 98, n.10 p. 5927-5932, 2001. MacHugh, D. E.; Loftus, R. T.; Cunningham, P. et al. Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers. Animal Genetics, v. 29, p. 333-340, 1998. Mariante, A. S. Situação atual da conservação de recursos genéticos animais no Brasil. In: Simpósio de recursos genéticos para América latina e Caribe – SIRGEALC, 2., Brasília. Mesa redonda... Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 1999. CD-ROM. 5p. Martín-Burriel, I.; García-Muro, E.; Zaragoza, P. Genetic diversity analisys of six Spanish native cattle breeds using microsatellites. Animal Genetics, v. 30, p.177182, 1999. Mercier, B. ; Gaucher, C. ; Feugeas, O. et al. Direct PCR from whole blood, without DNA extraction. Nucleic Acid Research, v. 18, p. 5908, 1990. Martínez, A. M.; Delgado, J. V.; Rodero, A. et al. Genetic structure of the Iberian pig breed using microsatellites. Animal Genetics, v. 31, p. 295-301, 2000. Menrad, M.; Stier, C. H.; Geldermann, H. et al. A study on the Changthangi pashmina and the Bakerwali goat breeds in Kashmir I. Analysis of blood protein polymorphisms and genetic variability within and between the populations. Small Ruminant Research, v. 43, p. 3-14, 2002. Moazami-Goudarzi, K. ; Laloe, D. ; Furet, J. P. et al. Analysis of genetic relationships between 10 cattle breeds with 17 microsatellites. Animal Genetics, v. 28, p.338345, 1997. Moazami-Goudarzi, K.; Vaiman, D.; Mercier, D. et al. Emploi de microsatellites pour l'analyse de la diversité genétique des races bovines francaises: premiers resultants. Genetics Selection and Evolution. v. 26, p. 155-165. 1994. Moazami-Goudarzi, K.; Vaiman, D.; Mercier, D. et al. The conservation of dinucleotide microsatellite among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primers pairs in closely related species. Genomics, v. 10, p. 654-660, 1991. Moore, S. S.; Sargeant, L. L.; King, T. J. et al. The conservation of dinucleotide microsatellite among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primers pairs in closely related species. Genomics. v. 10, p. 654-660. 1991. Nagylaki, T. Fixation indices in subdivided populations. Genetics, v. 148, p.1325-1332, 1998. 50 Nei, M. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press. New York, 1987. Nei, M.; Tajima, F.; Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. Journal of Molecular Evolution, v. 19: p. 153-70, 1983. Nei, M. Genetic polymorphism and the role of mutation in evolution. Evolution of genes and proteins (Nei, M. and. Khoen., R. Ed.), 1983. p. 165-190, Sunderland. Nei, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, v. 89, p.583-592, 1978. Nei, M. F-statistics and analysis of gene diversity in subdivided populations. Ann. Human Genetics, v. 41, p.225-233, 1977. Nei, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 70, p.3321-3323, 1973. Nozawa, K. Domestication and History of goats. In: Maijala E. Genetics Resources of Pig, Sheep and Goat. Word Animal Science B, v. 8, Cap 25, p. 391-412, 1991. Oliveira, R. R. Caracterização genética de populações de caprinos da raça Moxotó usando marcadores moleculares. Areia-Paraíba: Centro de Ciências Agrárias, 2003. 59p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) – Centro de Ciências Agrárias/Universidade Federal da Paraíba. 2003. Ott, J. Strategies for characterizing highly polymorphic markers in human gene mapping. American Journal of Human Genetics, v. 51, p. 283-290, 1992. Ouafi, A. T.; Babilliot, J. M.; Leroux, C. et al. Genetic diversity of the two main Moroccan goat breeds: phylogenetic relationships with four breeds reared in France. Small Ruminant Research, v. 45, p. 225-233, 2002. Paiva, S. R.; Silvério, V. C.; Egito, A. A. et al. Caracterização Genética da Raça Santa Inês. In: 2º SINCORTE, João Pessoa-PB. Anais..., 2004, p. 487-499. Pepin, L.; Amigues, Y.; Lepingle, A. et al. Sequence conservation of microsatellites between Bos taurus (cattle), Capra hircus (goat) and related species. Examples of use in parentage testing and phylogeny analysis. Heredity, v. 74, p. 53-61,1995. Pinheiro Junior, G.C. Caprinos No Brasil. 2. ed. São Paulo: Chácaras e Quintais. 1947. 112 p. Primo, A. T. Introdução de animais domésticos no novo mundo. In: II SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE – SIRGEALC. Brasília, 1999. Procceding... Brasília, 1999. CD-ROM. Primo, A. T. El ganado bovino ibérico en las Américas: 500 años después. Archivos de Zootecnia, v. 41(extra): p. 421-432, 1992. Raymond, M.; Rousset, F. An exact test for population differenciation. Evolution, v. 49, p. 1280-1283, 1996. Reynolds, J. Estimation of the coancestry coefficient basis for a short-term genetic distance. Genetics, 105: 767-779. 1983. Ribeiro, M.N.; Pimenta Filho, E.C.; Impacto de la Introduccíon de Razas Europeas a Brasil sobre la Producción Caprina. In: REUNION NACIONAL SOBRE 51 CAPRINOCULTURA, XVIII., 2003, Puebla. Memorias… Puebla: BENEMÉRITA UNIVERSIDADE AUTONOMA DE PUEBLA, 2003, p. 215-223. Rodero, A.; Delgado, J. V.; Rodero, E. Primitive Andalusian livestoch and their implications in the discovery of America. Archivos de Zootecnia, v. 41(extra), p. 383-400, 1992. Roger, J. S. Measures of genetic similarity and genetic distance. In: Studies in Genetics VII. University of Texas Publication 7213. University of Texas, Austin, p. 145-153. 1972. Ruiz-Linares, A. Microsatellites and the reconstruction of the history of human populations. Microsatellites. Schlötterer, D. Ed. Oxford University Press. Oxford. 1999. p. 83-197. Rychlik, W.; Spencer, W. J.; Rhoads, R. E. Optimization of annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acid Research, v. 18, p. 6409-6412, 1990. Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with termostable DNA polymerase. Science, v. 239, p. 487-491, 1989. Saitbekoba, N.; Gaillard, C.; Obexer-Ruff, G. et al. Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatellite analysis. Animal Genetics, v. 30, p. 36-41, 1999. Saitou, N.; Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Ecology, v. 4, p. 406-25, 1987. Santos, R. A cabra e a ovelha no Brasil. Editora Agropecuária Tropical. Uberaba. MG. 2003, 650p. Scherf, B. World Wotch List for domestic animals diversity (3ª Edição). FAO. Roma. 2000, 729p. Schug, M. D.; Wetterstrand, K. A.; Gaudette M. S. et al. The distribution and frequency of microsatellite loci in Drosophila melanogaster. Molecular Ecology, v. 7, p.5770, 1998. Sereno, J. R. B. Status-Quo de la conservación genética de los caballos y bovinos pantaneiros en Brasil. Archivos de Zootecnia, v. 51, p. 65-82, 2002. Sereno, J. R. B.; Sereno, F. T. P. S. Recursos genéticos animales brasileños y sus sistemas tradicionales de explotación. Archivos de Zootecnia, v. 49, p. 405-414, 2000. Sneath, P. H. A.; Sokal, H. H. Numerical taxomomy. Freeman Ed. San Francisco. 1973. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology, v. 98, p. 503-510, 1975. Spritze, A.; Egito, A. A.; Mariante, A. S. et al. Caracterização genética da raça Crioulo Lageano por marcadores moleculares RAPD. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 38 n. 10, p. 1157-1164, 2003. Stallings, R. L.; Ford, A. F.; Nelson, D. et al. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes. Genomics, v. 10, p. 807-815, 1991. Tautz, D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acid Research, v. 17, p. 6463-6471, 1989. 52 Tautz, D.; Trick, M.; Dover, G. A. Cryptic simplificity in DNA is a major source of genetic variation. Nature, v. 322, p. 652-656, 1986. Usha, A. P.; Simpson, S. P.; Williams, J. L. Probability of random sire exclusion using microsatellite markers for parentage verification. Animal Genetics, v. 26, p. 155161, 1995. Vaiman D.; Schibler.; Bourgeois, F. et al. A genetic linkage map of the male goat genome. Genetics, v. 144, p. 279-305, 1996. Vallejo, M. E. C.; Bermejo, J. V. D. Conservación y mejora de genotipos ovinos y caprinos en el semi-árido. In: I SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE CONSERVAÇÃO DE RECURSOS GENÉTICOS (RAÇAS NATIVAS PARA O SEMI-ÁRIDO) Recife- PE. Anais… 2004, p. 25-37. Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research, v. 23, p. 4407-4414, 1995. Xianglong, L. ; Yaping, Z. ; Shengou, C. et al. Study on genetic relationship among main native goats breeds in China using random amplified polymorphic DNA. In: 7th INTERNATIONAL CONFERENCE ON GOATS, France, 15-21, may, 2000. Proceeding… France, 2000. Walsh, P. S.; Metzger, D. A.; Higuchi, R. Chelex® 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques, v. 10, p. 506-513, 1991. Wang, Z. ; Weber, J. L. ; Zhong, G. et al. Survey of plant short tandem repeats. Theoretical and Applied Genetics, v. 88, p. 1-6, 1994. Weber, J. L. Informativeness of human DNA (dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms. Genomics, v. 7, p. 524-530, 1990. Weir, B. S. Genetic data analisys II. Sinauer Ed. Sunderland, 1996. Weir, B. S.; Cockerham, C. Estimating F-statistics for analysis of population structure. Evolution, v. 36, p. 1358-1370, 1984. Williams, J. G. K.; Kubelik, A. R.; Livak, J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Research, v. 18, p. 6531-6535, 1990. Wimmers, K.; Ponsuksili, S.; Hardge, T. et al. Genetic distinctness of African, Asian and South American local chickens. Animal Genetics, v. 31, n. 3, p. 159-165, 2000. Winter, A. K.; Fredholm, M.; Thomsen, P. D. Variable (dG-dT)n.(dC-dA)n sequences in the porcine genome. Genomics, v. 12, p. 281-288, 1992. Yang, L.; Zhao S. H. ; Li, K. et al. Determination of relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers. Animal Genetics, v. 30, p. 452-456, 1999. 53 Capítulo I Painel de 27 microssatélites para caracterização genética das raças caprinas nativas brasileiras 54 Painel de 27 Microssatélites para Caracterização Genética das Raças Caprinas Nativas Brasileiras Resumo - O objetivo deste trabalho foi verificar a utilização de um painel de 27 microssatélites para caracterização genética das raças caprinas nativas do Brasil. Foram coletadas amostras de pêlos de 332 animais, sendo 60 Moxotó, 50 Canindé, 55 Serrana Azul, 68 Marota, 52 Repartida e 47 Graúna. Selecionou-se um painel de 27 microssatélites que foram amplificados mediante à técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Para realizar a separação por tamanhos de fragmentos, obtidos mediante a PCR, submeteram-se estes produtos amplificados a uma eletroforese em gel de poliacrilamida, em um seqüenciador automático ABI 377XL. Todos os microssatélites analisados mostraram-se polimórficos para o estudo de caracterização genética das raças nativas brasileiras. O número de alelos encontrado variou de três (MAF209) até vinte e três (CSSM66). A heterozigosidade média esperada foi de 0,672 e a observada de 0,582. Todos os microssatélites analisados foram informativos, com exceção do marcador MAF209 (PIC: 0,042). Os microssatélites analisados mostraramse polimórficos e os resultados obtidos demonstram a capacidade desses marcadores em identificar a variabilidade genética em raças caprinas nativas brasileiras. Palavras-chave: caprinos, conservação genética, marcadores moleculares, variabilidade genética 55 Panel of 27 Microsatellites for Genetic Characterization of the Breeds Native BrazilianGoats1 Abstract - The objective of this work was to study the use of a panel of microsatellites for genetic characterization of the breeds native of Brazil goats. Samples of hair of 332 animals, being 60 Moxotó, 50 Canindé, 55 Serrana Azul, 68 Marota, 52 Repartida and 47 Graúna were collected. A panel of 27 microsatellites was selected, amplified by polymerase chain reaction (PCR). To stablish the separation of fragments obtained by PCR, these amplified products were submitted to electrophoreses in poliacrylamide gel using an ABI 377XL automatic sequencer. All the 27 analyzed microsatellites were polymorphic for studies of characterization of the Brazilian breeds. The number of alleles found varied between three (MAF209) and twenty-three (CSSM66). The expected mean heterozigosity was 0,672 and the observed was 0,582. All the analysed microsatellites were informative, except for the marker MAF209 (PIC: 0,042). The microsatellites analysed were polymorphic and the results found demonstrate the capacity of those markers in identifying the genetic variability in breeds brazilian goats. Keywords – goats, genetic conservation, molecular markers, genetic variability 56 native Introdução As raças caprinas nativas do Brasil estão localizadas na região nordeste, onde os animais são criados em sistemas extensivo e semi-extensivo para produção de carne, pele e leite. São caprinos bem adaptados à região semi-árida, resistentes a doenças e parasitas. Porém, poucos trabalhos vêm sendo desenvolvidos com esses animais, que se encontram ameaçados de extinção. Para minimizar esse problema, um programa de conservação foi estruturado e uma das prioridades do programa é o estudo de caracterização genética que poderá oferecer um maior nível de conhecimento sobre esse patrimônio genético. Segundo Gama (2004), a variabilidade genética total das espécies está representada pela contribuição da variabilidade inter-racial e intra-racial. Diante disso, verifica-se a importância de medir a variabilidade genética dos animais, já que a conservação dos recursos genéticos estão efetivamente relacionados com a manutenção da variabilidade inter-racial evitando a extinção das raças, assim como a manutenção da variabilidade intra-racial, evitando a erosão genética. A caracterização genética pelo uso de marcadores moleculares tem demostrado ser uma ferramenta eficaz para quantificar a diversidade genética de animais domésticos. Os marcadores genéticos são loci que apresentam características detectáveis que diferenciam os indivíduos de uma determinada população, demonstrando variações entre indivíduos e grupos de animais. Os microssatélites são pequenas sequências repetidas (1 a 6 nucleótidos), abundantes, distribuídos ao acaso por todo genoma. Apresentam grande polimorfismo, são fáceis de se identificar e vêm sendo utilizados em mapas de ligação em mamíferos, identificação individual em controle de paternidade e caracterização genética de populações. Microssatélites de bovinos e ovinos estão sendo testados em caprinos, por estes serem bem conservados em espécies próximas. Tipificando um painel de 70 microssatélites bovinos em outras espécies, Pepin et al. (1995) encontraram um total de 41 microssatélites que podem ser susceptíveis a amplificar em outras espécies. Gotari et al. (1997) verificaram que 39% dos microssatélites de bovinos analisados por esses autores podem ser amplificados em ovinos. Segundo a FAO, os microssatélites que possuem homologia em várias espécies relacionadas são preferíveis, pois facilitam o trabalho nos laboratórios além de economizar tempo e reduzir custos. 57 Yang et al. (1999) analisaram 6 microssatélites em 4 raças de caprinos chineses, demonstrando que os microssatélites de ovinos (OarFCB11, OarFCB20, OarFCB304, OarFCB48 e Oar FCB34) e de bovino (BM4621) são eficientes para detectar polimorfismo em raças caprinas. Ainda com caprinos nativos chineses, Li et al. (2002) tipificaram 16 microssatélites recomendados pela EU Sheep and Goat Biodiversity Project. A variabilidade genética intra e inter-racial em caprinos asiáticos nativos foi verificada por Barker et al. (2001), com um painel de 25 microssatélites. Saitbekova et al. (1999) realizaram um estudo sobre a diversidade genética entre raças de caprinos suíças, mediante análise com 20 microssatélites de bovinos. O objetivo deste trabalho foi verificar a utilização de um painel de 27 microssatélites para caracterização genética das raças caprinas brasileiras. 58 Material e Métodos Amostras e extração de DNA Foram coletados um total de 332 amostras casualizadas de pêlos de caprinos das raças: Moxotó (60), Canindé (50), Serrana Azul (55), Marota (68), Repartida (52) e Graúna (47), de vários produtores e Estados distintos da região Nordeste do Brasil (Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Bahia e Piauí). O DNA das amostras foi extraído de 10 pêlos selecionados, segundo a metodologia estabelecida por Walsh et al. (1991). Microssatélites e PCR Na Tabela 1 estão apresentados os 27 microssatélites analisados com a sequência direta e reversa dos iniciadores (Primers). Os multiplex, os tamanhos dos fragmentos, os fluorocromos, a temperatura de anelamento dos loci encontram-se na Tabela 2. Os microssatélites foram amplificados mediante a técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR), com 25 μL de volume final de uma reação: 5 μL de DNA, 2,5 mM de cloreto de magnésio, 1 unidade de Taq Polimerase, 200 mM de dNTPs e 0,25 mM de primers. Preparadas as reações, foram levadas a um termociclador e submetidas às seguintes condições de amplificação: 10 minutos a 94°C, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30'', 55°C para a maioria dos marcadores e a 60ºC (CSRM60 e INRA23) por 45'' e 72°C por 30'', finalmente, após os 35 ciclos, acrescentou-se 10' a 72°C. Desenvolveram-se vários experimentos de reações de amplificação múltiplas de microssatélites para reduzir o número de reações, tempo e custos. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida, em um seqüenciador automático ABI 377XL (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Os resultados das análises de fragmentos e a tipificação alélica realizaram-se mediante os programas informáticos Genescan Analisys v. 3.7 e Genotyper 2.5, respectivamente. 59 Análises estatísticas Calcularam-se as frequências alélicas e as heterozigosidades por intermédio do programa informático Genetix versão 4.01, proposto por Belkhir et al. (1999). O conteúdo de informação polimórfica (PIC) foi obtido mediante fórmula proposta por Botstein et al. (1980). Para o teste de equilibrio de Hardy-Weinberg, utilizou-se o programa informático Genepop v. 3.4, aplicando-se o método de cadeia de Markov. Os estatísticos F (Fst, Fit e Fis) segundo Weir e Cockerham (1984) e o Gst foram calculados pelo programa informático Genetix versão 4.01, de acordo com Belkhir et al. (1999). 60 Tabela 1. Microssatélites analisados com as respectivas seqüências (direta e reversa) dos iniciadores Table 1. Analyzed Microsatellites, with the sequence (direct and reverse) of primers locus Direta Reversa BM6506 BM8125 BM1818 CSRD247 ETH225 HAUT27 ILSTS011 INRA63 INRA5 SPS115 TGLA122 BM6526 CSRM60 CSSM66 ETH10 INRA6 MM12 HSC McM527 SRCRSP8 OarFCB48 BM1329 OarFCB11 OarFCB304 INRA23 MAF209 MAF65 GCACGTGGTAAAGAGATGGC CTCTATCTGTGGAAAAGGTGGG AGCTGGGAATATAACCAAAGG GGACTTGCCAGAACTCTGCAAT GATCACCTTGCCACTATTTCCT TTTTATGTTCATTTTTTGACTGG GCTTGCTACATGGAAAGTGC ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC TTCAGGCATACCCTACACCACATG AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC CATGCCAAACAATATCCAGC AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA ACACAAATCCTTTCTGCCAGCTGA GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA AGGAATATCTGTATCAACCTCAGTC CAAGACAGGTGTTTCAATCT CTGCCAATGCAGAGACACAAGA GTCCATTGCCTCAAATCAATTC TGCGGTCTGGTTCTGATTTCAC GAGTTAGTACAAGGATGACAAGAGGCAC TTGTTTAGGCAAGTCCAAAGTC GGCCTGAACTCACAAGTTGATATATCTATCAC CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC GATCACAAAAAGTTGGATACAACGTGG AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG AGCAACTTGAGCATGGCAC GGGGGTTAGACTTCAACATACG AGTGCTTTCAAGGTCCATGC CACTGTGGTTTGTATTAGTCAGG ACATGACAGCCAGCTGCTACT AACTGCTGAAATCTCCATCTTA CTAAAATGCAGAGCCCTACC AAACCACAGAAATGCTTGGAAG AAATATTAGCCAACTGAAAACTGGG AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG AATCACATGGCAAATAAGTACATAC TGAAGGTAGAGAGCAAGCAGC AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG AATTTAATGCACTGAGGAGCTTGG CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC CTGAGCTGGGGTGGGAGCTATAAATA ATCGACTCTGGGGATGATGT GTCTGTCTCCTGTCTTGTCATC AAACCACTTGACTACTCCCCAA CCTGCATGAGAAAGTCGATGCTTAG GACTCTAGAGGATCGCAAAGAACCAG AACACCGCAGCTTCATCC GCAAGCAGGTTCTTTACCACTAGCACC CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC TCATGCACTTAAGTATGTAGGATGCTG CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG 61 Tabela 2 - Múltiples dos loci, tamanhos dos fragmentos, fluorocromos e temperatura de anelamento utilizados Table 2 – Loci multiplex, size range, fluorescence and annealing temperature used Multiplex locus Tamanhos (pb) Fluorocromo Temp. anelamento (ºC) Size Fluorescence Annelingtemperature References M1 BM6506 INRA63 CSRD247 ETH225 TGLA122 190-228 153-185 208-250 130-165 130-180 HEX HEX FAM NED FAM 55 Bishop et al. ,1994 Vaiman et al., 1994 FAO, 2004 Barendse et al., 1994 Georges et al., 1992 M2 INRA5 HAUT27 BM8125 125-155 125-160 100-128 HEX NED FAM 55 Vaiman et al., 1994 Thieven et al., 1997 Bishop et al., 1994 M3 ILSTS011 SPS115 BM1818 253-295 235-265 250-290 HEX NED FAM 55 Luikart et al,. 1999 Moore et al., 1993 Li et al., 2002 M4 CSSM66 BM6526 175-265 145-195 HEX FAM 55 Barendse et al., 1994 Bishop et al., 1994 M5 INRA6 MM12 100-130 85-135 HEX NED 55 Bishop et al., 1994 Mommens et al., 1994 M6 OarFCB304 OarFCB11 MAF209 MAF65 BM1329 130-180 120-160 100-125 110-152 153-185 HEX FAM HEX N ED NED 55 Yang et al., 1999 Yang et al., 1999 Luikart et al., 1999 Luikart et al., 1999 Bishop et al., 1994 M7 HSC McM527 SRCRSP8 270-306 150-190 210-260 HEX NED NED 55 ISAG, 2002 ISAG, 2002 Luikart et al,. 1999 M8 INRA23 CSRM60 185-230 75-110 HEX FAM 60 Li et al., 2002 Moore et al., 1994 M9 ETH10 OarFCB48 200-230 140-170 FAM FAM 55 Solinas et al., 1993 Yang et al., 1999 62 Referências Resultados e Discussão Os valores de polimorfismo dos loci analisados encontram-se na Tabela 3. Os marcadores (TGLA122, MM12, CSSM60, BM6526, HSC e BM8125) apresentaram um elevado grau de heterozigosidade média observada com valores superiores a 0,7. No entanto, os marcadores (MAF209, BM6506, SPS115, ETH225, INRA63, HAUT27, ETH10 e INRA23) apresentaram um nível reduzido de heterozigosidade com valores inferiores a 0,5. Para heterozigosidade média esperada, a maioria dos loci (85%) apresentaram valor superior a 0,5, indicando uma elevada diversidade genética dos marcadores analisados. A qualidade dos marcadores foi verificada pelo conteúdo de informação polimórfica que apresentaram valores superiores a 0,5, em mais de 75% dos loci analisados. Todos os 27 microssatélites analisados foram polimórficos para caracterização genética das raças caprinas brasileiras. Os resultados de número de alelos obtidos por locus analisado revelaram coerência com o número mínimo de alelos sugerido por Barker (1994), à exceção do MAF209. Segundo esse autor, o número inferior a quatro alelos por locus reduz o efeito sobre o erro padrão para cálculos de distância genética entre populações. O locus MAF209 é um marcador de ovinos e apesar de amplificar bem em caprinos, este locus tem-se mostrado pouco polimórfico para essa espécie como encontrado neste estudo com apenas 3 alelos, resultado condizente com os encontrados por Luikart et al., (1999) em cabras espanholas. Possivelmente, este locus se encontra em uma zona com baixa variabilidade genética em caprinos. Por outro lado, o marcador CSSM66 apresentou um elevado número médio de alelos (23). Essa quantidade elevada pode ser considerada um número excessivo de alelos, que não é interessante, do ponto de vista prático, em análise de tificação alélica, dificultando a interpretação dos resultados. Possivelmente, este locus encontra-se em uma zona hiperváriavel do DNA no genoma dos caprinos. Os valores encontrados de número médio de alelos estão de acordo com os reportados por alguns autores que estudaram diversidade genética em caprinos (Araújo, 2004; Saitbekova et al., 1999; Li et al., 2002; Yang et al., 1999), demonstrando alto nível de polimorfismo dos loci analisados. Em contraste, Maudet et al. (2002), trabalhando com microssatélites em cabras Alpina Ibex, verificaram número médio de alelos por loci variando entre dois (ILSTS029) e seis (SR-CSRP-24), mostrando um baixo nível de polimorfismo dos loci em cabras selvagens. 63 Em uma análise global, os valores obtidos de heterozigosidade média observada por locus revelaram elevado grau de polimorfismo, apresentando valores superiores a 0,5 em mais de 70% dos loci analisados. Em estudos de diversidade genética em cabras asiáticas, Barker et al. (2001) verificaram alto nível de heterozigosidade em 17 microssatélites analisados. Enquanto Saitbekova et al. (1999) encontraram heterozigosidade total variando de 0,15 (ETH225) a 0,87 (ILSTS030) em cabras Suíças, Ibex e Benzoar, apresentando uma elevada variação entre loci (possivelmente, os valores de heterozigosidade das cabras selvagens influenciaram nestes resultados). Por outro lado, Li et al. (2002) observaram heterozigosidade média total variando entre 0,65 (ILSTS005) e 0,88 (BM2113), apresentando menor variação entre loci, demostrando altos níveis de heterozigosidade em cabras chinesas. O marcador CSSM66 pode ser considerado altamente informativo (PIC=0,908), no entanto, o PIC depende do número de alelos e suas freqüências. Desta forma, como foi comentado anteriormente, o locus com número médio de 23 alelos pode diminuir a eficiência das análises, enquanto que para classificação de Botstein et al., (1980) este marcador seria considerado o mais informativo. Portanto, a informação que este parâmetro produz não deve ser o único aspecto usado para eleger um marcador ou descartá-lo (Moazami-Goudarzi et al., 1994). Apenas seis marcadores apresentaram valores de PIC inferior a 0,5, com cinco microssatélites considerados medianamente informativos (ETH225; BM6506; SSP115; HAUT227 e INRA63) e apenas um microssatélite foi considerado pouco informativo (MAF209). Estes valores de PIC são condizentes com os encontrados por Yang et al. (1999); Li et al. (2002) e Jandorová et al. (2004). O equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) dos loci para cada população de cabras brasileiras foi apresentado na Tabela 4. A raça Moxotó foi a população que apresentou o maior número de locus em desequilíbrio (11), seguidos por Serrana Azul, Marota e Repartida (9), Canindé (8) e Graúna (7). No geral, verificou-se diferença de apenas 4 loci em desequilíbrio entre as raças estudadas, demonstrando reduzida amplitude dos desvios do EHW para o painel de microssatélites analisados. Diante disso, tal fato pode ser explicado pela estrutura genética das populações, devido a vários fatores como: acasalamentos dirigidos, subdivisões dentro das populações, antepassados comuns, seleção natural, migração ou fluxo de genes a partir de população externa. No entanto, 64 estes resultados podem ser esperados tanto em raças comercias como em raças ameaçadas de extinção. Tabela 3 - Número de alelos (NA), Heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), em função dos loci analisados Table 3 – Alelle number (AN), observed heterozygosity (Ho), expected herozygosity (He), Polymorphyc Information content (PIC) in function of analyzed Loci Locus NA Ho He PIC CSSM66 OarFCB304 MM12 BM6526 INRA6 HSC BM1329 OarFCB11 MAF65 CSRM60 BM6506 BM1818 TGLA122 CSRD247 HAUT27 SRCRSP8 INRA23 INRA5 OarFCB48 ILSTS011 McM527 BM8125 INRA63 SPS115 ETH10 ETH225 MAF209 23 16 14 14 13 11 11 11 11 10 10 10 10 09 09 09 09 08 08 07 07 06 06 05 05 04 03 0,680 0,669 0,733 0,716 0,638 0,731 0,678 0,659 0,508 0,720 0,371 0,671 0,754 0,666 0,461 0,675 0,495 0,623 0,598 0,524 0,631 0,713 0,454 0,412 0,493 0,416 0,037 0,819 0,795 0,752 0,744 0,847 0,789 0,741 0,687 0,717 0,755 0,406 0,761 0,829 0,748 0,479 0,776 0,666 0,709 0,632 0,786 0,699 0,769 0,572 0,503 0,650 0,483 0,043 0,908 0,777 0,724 0,724 0,830 0,761 0,698 0,643 0,675 0,718 0,391 0,737 0,807 0,717 0,436 0,742 0,612 0,667 0,572 0,752 0,651 0,733 0,480 0,398 0,576 0,383 0,042 Em uma análise global, verificou-se que o desequilíbrio de Hardy-Weinberg para os marcadores alternaram-se dentro das populações e que a maioria dos marcadores (cerca de 70%) estão equilibrados, demonstrando a capacidade dos loci em identificar e avaliar a diversidade genética nas raças caprinas brasileiras. 65 Tabela 4 – Relação dos loci desequilíbrados (Hardy-Weinberg) nas populações estudadas Table 4 - Relation between desequilibrated Hardy-Weinberg loci in the population studied S. Azul Moxotó Marota Canindé Repartida Graúna BM6506 BM8125 BM1818 1,000 0,209 0,627 1,000 0,145 0,181 0,762 0,230 0,209 0,378 0,866 0,844 0,238 0,618 0,130 0,275 0,603 0,322 CSRD247 ETH225 HAUT27 ILSTS011 INRA63 0,295 0,596 0,745 0,258 0,079* 0,248 0,461 0,294 0,000* 0,518 0,346 1,000 0,173 0,922 0,827 0,776 0,658 0,169 0,000* 0,006* 0,099* 0,000* 0,024* 0,943 0,094* 0,436 0,053* 0,106 0,248 0,233 INRA5 SPS115 TGLA122 BM6526 CSRM60 0,014* 0,072* 0,130 0,000* 0,369 0,420 0,000* 0,311 0,080* 0,841 0,087* 0,750 0,200 0,923 0,039* 0,905 0,002* 0,220 0,138 0,071* 0,606 0,005* 0,273 0,311 0,771 0,914 0,773 0,130 0,357 0,392 CSSM66 ETH10 INRA6 MM12 HSC 0,133 1,000 0,000* 0,560 0,230 0,596 0,107 0,062* 0,025* 0,013* 0,364 0,386 0,231 0,298 0,047* 0,032 0,170 0,065* 0,734 0,874 0,001* 0,019* 0,664 0,273 0,086* 0,002* 0,067* 0,000* 0,842 0,185 McM527 SRCRSP8 OarFCB48 BM1329 OarFCB11 0,594 0,106 0,056* 0,951 0,206 0,026* 0,022* 0,403 0,347 0,032* 0,686 0,093* 0,043* 0,849 0,085* 0,606 0,075* 0,307 0,419 0,174 0,047 0,869 0,355 0,574 0,718 0,662 0,012* 0,468 0,160 0,127 OarFCB304 INRA23 MAF209 MAF65 0,636 0,016* 0,000* 0,000* 0,500 0,137 0,000* 0,000* 0,001 0,000* 0,000* 0,003* 0,161 0,000* 1,000 0,204 0,298 0,240 0,051* 0,148 0,337 0,000* 0,000* 0,017* 9 11 9 7 9 7 locus Total (P>0,10)* Na Tabela 5, verificam-se valores dos parâmetros da estrutura genética das raças brasileiras, com base nos loci analisados. Os resultados de Gst variaram de 0,023 (MAF209) a 0,235 (ILSTS011). De acordo com Nei (1973), na estimativa deste parâmetro leva-se em consideração diretamente a heterozigosidade esperada. Os resultados deste parâmetro não são influenciados pelo número de alelos por locus, assim como o modelo de evolução (mutação, seleção e migração). O valor médio de Gst foi de 0,075 para todos os loci analisados, o que representa baixa proporção relativa da variação genética inter-populações. Tal fato pode ser 66 explicado, provavelmente, pela história evolutiva em comum dos caprinos analisados, assim como pelo uso em comum de reprodutores na formação dessas raças. Em estudos de diversidade genética, Saitbekova et al., (1999) encontraram diferenças entre nove raças caprinas suíças de 17%, possivelmente, são populações mais heterogêneas, com maior troca de genes entre os rebanhos. Geralmente, os resultados de Gst e Fst são similares como se verifica neste trabalho (0,075 e 0,079), respectivamente. No entanto, o Fst é um parâmetro mais preciso, pois leva-se em consideração tanto as frequências alélicas quanto as genotípicas. Para todos os loci, o Fst foi relativamente baixo, indicando que apenas 7,9% (Tabela 5) da variabilidade genética total foi explicado pelas diferenças entre raças e 92,1% correspondem a diferença entre indivíduos. Li et al. (2002), avaliando a diversidade genética em caprinos chineses, encontraram Fst de 10,5% para todos os loci analisados. Já Barker et al. (2001), encontraram valor médio de Fst de 14,3%, demonstrando uma maior diferenciação genética entre as raças asiáticas, comparados aos resultados encontrados neste estudo. A origem e a estrutura filogeográfica da cabra doméstica, mediante DNA mitocondrial, foram estudadas por Luikart et al. (2001), encontrando pouca diferença genética entre raças de caprinos da Ásia, África e Europa, de 10,70%, valor considerado relativamente baixo, quando comparado aos encontrados em bovino (84%). Esses autores relataram que há muitos anos existia um maior fluxo de caprinos entre os continentes, justificado pela facilidade relativa de transporte, animais de menor preço e adaptabilidade. No entanto, em tempos mais recentes, existe menor interesse econômico e comercialização de caprinos, comparados com bovinos, assim como menor utilização da inseminação artificial e transferência de embriões nesta espécie. Provavelmente, esta seria a explicação para pouca diferença genética entre as raças de caprinos do mundo, ou seja, já existia pouca diferença genética entre as raças de caprinos que deram origem às raças nativas brasileiras. O valor médio de Fit para todos os loci foi de 14,8%, verificando o índice de fixação dos indivíduos referente à população global. Enquanto, o Fis médio para todos os loci foi de 7,4%, demonstrando moderada deficiência de indivíduos heterozigóticos dentro das subpopulações analisadas. 67 Tabela 5 - Coeficiente de diferenciação genética (Gst) e estatísticas de F (Fst, Fit e Fis) para cada locus analisado Table 5 - Coefficient of genetic differentiation (Gst) and statistical of F (Fst, Fit and Fis) for each analyzed locus Locus Gst Fst Fit Fis BM6506 BM8125 BM1818 CSRD247 ETH225 HAUT27 ILSTS011 INRA63 INRA5 SPS115 TGLA122 BM6526 CSRM60 CSSM66 ETH10 INRA6 MM12 HSC McM527 SRCRSP8 OarFCB48 BM1329 OarFCB11 OarFCB304 INRA23 MAF209 MAF65 Media/average 0,056 0,064 0,070 0,095 0,033 0,041 0,235 0,043 0,140 0,041 0,053 0,042 0,035 0,098 0,141 0,086 0,026 0,042 0,063 0,061 0,075 0,045 0,066 0,079 0,123 0,023 0,050 0,075 0,080 0,080 0,079 0,078 0,080 0,080 0,071 0,080 0,076 0,080 0,080 0,081 0,081 0,078 0,076 0,078 0,082 0,081 0,080 0,080 0,079 0,081 0,079 0,079 0,077 0,079 0,080 0,079 0,149 0,150 0,148 0,149 0,148 0,150 0,138 0,146 0,148 0,147 0,150 0,152 0,152 0,146 0,143 0,142 0,153 0,151 0,149 0,148 0,151 0,150 0,151 0,147 0,142 0,148 0,141 0,148 0,075 0,076 0,075 0,076 0,073 0,076 0,072 0,071 0,077 0,072 0,075 0,077 0,076 0,073 0,072 0,069 0,077 0,075 0,075 0,074 0,077 0,075 0,078 0,073 0,070 0,074 0,066 0,074 Li et. al., (2002) reportaram valor de Fit de 13,2% e Fis de 3%, com menor deficiência de heterozigotos em raças caprinas chinesas. Enquanto, Barker et al., (2001) verificaram Fit de 34% e Fis de 23%, demonstrando extrema deficiência de indivíduos heterozigotos nas raças asiáticas. Segundo esses autores, estes resultados podem ser explicados por vários fatores: presença de alelos nulos, efeito de Wahlund (subdivisão das populações) e seleção contra heterozigotos. Geralmente, é difícil distinguir qual o fator mais importante. No entanto, as informações descritas pelos autores é que existe uma forte endogamia dentro das raças nativas asiáticas sul-oriental, com acasalamentos não orientados em populações com número reduzido de indivíduos. 68 Conclusões Os microssatélites analisados são polimórficos, demonstrando alta capacidade em identificar variabilidade e diversidade genética em caprinos, com exceção dos marcadores MAF209 e CSSM66. Este painel de microssatélites pode ser utilizado para caracterização genética das raças caprinas brasileiras, auxiliando os programas de conservação de recursos genéticos do País. 69 Referências Bibliográficas Araújo, A. M. Paternidade e diversidade genética em caprinos no Brasil por meio de microssatélites de DNA. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa. 2004. 90p. Tese (Doutorado em genética e melhoramento). Universidade Federal de Viçosa. 2004. 90p. Arranz, J. J.; Bayón, Y.; San Primitivo, F. Genetic relationships among Spanish sheep using microsatellites. Animal Genetics, v. 29, p. 435-440, 1998. Barker, J. S. F. A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds. In: WORLD CONGRESS ON GENETICS APPLIED TO LIVESTOCK PRODUCTION, 5., 1994, Guelph. Proceedings... Guelph: [s. n.], 1994, v. 21, p. 501-508. Barker, J. S. F.; Tan, S. G.; Moore, S. S. et al. Genetic variation within and relationship among populations of Asian goats (Capra hircus). Journal of Animal Breeding Genetics, v. 118, p. 213-233, 2001. Barendse, W.; Armitage, S.M. A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genetics, v. 6, p. 227-235, 1994. Belkhir, K. Genetix: Logiciel sous WindowsTM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions. CNRS UPR 9060, 1999. Bishop, M.D.; Kappes, S.M. A genetic linkage map for cattle. Genetics, v. 136, p. 619639, 1994. Botstein, D.; White, R. L.; Skolmick, H. et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lenght polymorphisn. American Journal of Human Genetics, v. 32, p. 314-331, 1980. FAO. Secondary Guidelines for Developmen of National Farm Animal Genetic Resources Management Plans: Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers, FAO. Rome, 2004. Gama, L. T. Manutenção da variabilidade genética em programas de seleção. In: I SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE CONSERVAÇÃO DE RECURSOS GENÉTICOS (RAÇAS NATIVAS PARA O SEMI-ÁRIDO) Recife- PE. Anais… p. 38-44, 2004. Gotari M. J. ; Freking B. A. ; Kappes S. M. et al. Extension genomic conservation of cattle microsatellite heterozygosity in sheep. Animal Genetics, v. 28, p. 279-290, 1997. Georges, M.; Massey, J.M. Polimorphic DNA markers in Bovidae. 92/13102, 1992. Patent WO ISAG. http://www.isag.org.uk 2002. Jandurová, O. M.; Koot, T.; IKottová, B. et al. Seven microsatellites markers useful for determining genetic variability in White and Brown Short-Haired goat breeds. Small Ruminant Research. Article in press, 2004. Li, M. H.; Zhao, S. H.; Bian, C. et al. Genetic relationships among twelve Chinese indigenous goat populations based on microsatellite. Genetics Selection and Evolution, v. 34, p. 729-744, 2002. 70 Luikart, G.; Biju-Duval, M-P.; Ertugrul, O. et al. Power of 22 microssatelite markers in fluorescent multiplexes for parentage testing in goats (Capra hircus). Animal Genetics. v. 30, p. 431-438. 1999. Maudet, C. ; Miller, C. ; Bassano, B. et. al. Microsatellite DNA and recent statistical methods in wildlife conservation management: applications in Alpine ibex (capra ibex ibex). Molecular Ecology, v. 11, p. 421-436, 2002. Moazami-Goudarzi, K.; Vaiman, D.; Mercier, D. et al. Emploi de microsatellites pour l'analyse de la diversité genétique des races bovines francaises: premiers resultants. Genetics Selection and Evolution, v. 26, p. 155-165, 1994. Mommens, G.W.; Coppieters, A. Dinucleotide repeat polymorphism at the bovine MM12E6 and MM8D3 loci. Animal Genetics, v. 25, p. 368, 1994. Moore, S. S.; Byrne, K. Dinucletotide polymorphism at the bovine calmodulin independent adenylcyclase locus. Animal Genetics, v. 24, p. 150, 1993. Moore, S.S.; Byrne, K. Characterization of 65 bovine microsatellites. Mammalian Genome, v. 5, p. 84-90, 1994. Nei, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. v. 70, p.3321-3323, 1973. Pepin, L.; Amigues, Y.; Lepingle, A. et al. Sequence conservation of microsatellites between Bos taurus (cattle), Capra hircus (goat) and related species. Examples of use in parentage testing and phylogeny analysis. Heredity, v. 74, p.53-61, 1995. Saitbekova, N.; Gaillard, C.; Ruff, G. O. et al. Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatellite analysis. Animal Genetics, v. 30, p.36-41, 1999. Solinas-Toldo, S.; Fries, R. Physically mapped, cosmid-derived microsatellite markers as anchor loci on bovine chromosomes. Mammalian Genome, v. 4, p. 720-727, 1993. Thieven, U.; Solinas-Toldo, S. Polymorphic CA-microsatellites for the integration of the bovine genetic and physical map. Mammalian Genome, v. 8, p. 52-55, 1997. Vaiman, D.; Mercier, D. A set of 99 cattle microsatellites: characterisation, synteny mapping, and polymorphism. Mammalian Genome, v. 5, p. 288-297, 1994. Yang, L.; Zhao S. H.; Li, K. et al. Determination of relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers. Animal Genetics, v. 30, p. 452-456, 1999. Walsh, P. S.; Metzger, D. A.; Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for a simple extraction of DNA for PCR-based typins from forensic material. Biotecchniques, v. 10, p. 506-513, 1991. Weir, B. S.; Cockerham, C. Estimating F-statistics for analysis of population structure. Evolution, v. 36, p. 1358-1370, 1984. 71 Capítulo II Variabilidade genética das raças caprinas nativas brasileiras utilizando marcadores moleculares 72 Variabilidade Genética das Raças Caprinas Nativas BrasileirasUtilizando Marcadores Moleculares Resumo - O objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade genética das raças caprinas nativas brasileiras usando marcadores moleculares. Foram coletadas amostras de pêlos de 332 caprinos das raças: Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida e Graúna, de vários estados do nordeste do Brasil (Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Bahia, Piauí). Foram selecionados 27 microssatélites: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 e MAF65, que foram amplificados mediante técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). O número médio de alelos variou entre 6,07 para raça Marota e 6,76 para raça Repartida. A heterozigosidade observada variou entre 0,53 para raça Serrana Azul e 0,62 para raça Repartida. Verificou-se, pelo dendrograma UPGMA, que as raças brasileiras formaram dois grupos distintos: um grupo formado por Moxotó, Canindé, Repartida e Marota e outro formado por Serrana Azul e Graúna. Os resultados encontrados para número médio de alelos e heterozigosidade média observada indicaram que existe variabilidade genética intra-racial nas raças brasileiras. Considerando a estrutura genética da espécie caprina, pode-se considerar que existe uma boa diferenciação genética entre as raças brasileiras. Palavras-chave: caprinos, conservação genética, microssatélites, diversidade genética 73 Genetic Variability in breeds Native Brazilian Goats Using Molecular Markers Abstract - The objective of this work was to verify the genetic variability of the Brazilian native goats using molecular markers. Samples of hair of 332 animals were collected: Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida and Graúna, of several states of the northeast of Brazil (Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Bahia, Piauí). A panel of 27 microssatélites was Selected: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 and MAF65, were amplified the microsatellites by using the Polimerasa Chain Reaction (PCR) technique. The average number of alelos varied among 6,07 for Marota breed and 6,76 for Repartida breed. The heterozygosity observed varied between 0,53 for Serrana Azul breed and 0,62 for Repartida breed. It was verified through the dendrograma UPGMA that the Brazilian goats formed two different groups, a group of Moxotó, Canindé, Repartida and Marota and another one formed by Serrana Azul and Graúna. The results found for the average number of alleles and observed average heterozygosity indicated that a intra-racial genetic variability exists in the Brazilian breeds. Considering the genetic structure of the bovid species, it can be considered that a good genetic differentiation exists among the Brazilian races. Keywords – goats, genetic conservation, microsatellites, genetic diversity 74 Introdução A maioria dos animais domésticos do Brasil foram trazidos pelos colonizadores e, ao longo de 500 anos, foram se diferenciando e formaram várias raças de animais adaptados às diversas regiões do país, desenvolvendo características únicas como rusticidade, prolificidade e resistência a enfermidades (Mariante,1999). O Brasil possui cerca de 9,8 milhões de cabeças de caprinos, segundo a FAOSTAT (2002). Aproximadamente, 90% do rebanho nacional é formado por animais Sem Padrão de Raça Definida (SPRD), oriundos dos cruzamentos indiscriminados entre as raças exóticas e nacionais. Nos últimos anos, a introdução de raças exóticas, altamente especializadas, nos rebanhos brasileiros tem provocado rápida substituição e erosão genética das raças nativas. De acordo com Egito et al. (2002), existe uma grande preocupação e esforços têm sido feito através de programas de conservação de recursos genéticos para manter a variabilidade genética destes animais, sobretudo, aqueles que estão ameaçados de extinção. A perda de um único tipo ou raça compromete o acesso a seus genes e essas combinações genéticas podem ser úteis em ambientes específicos. O conhecimento da variabilidade genética destes animais domésticos é fundamental para conservação e utilização desses recursos. Para isso, a caracterização genética dos animais através dos marcadores moleculares tem se mostrado bastante eficaz para quantificar a variabilidade genética em caprinos (Araújo, 2004; Li et al., 2002; Barker et al., 2001; Saitbekova et al., 1999; Yang et al., 1999). Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade intra-racial e a diversidade genética inter-racial das raças caprinas nativas brasileiras utilizando microssatélites. 75 Material e métodos Amostras e extração de DNA Foram coletadas amostras de pêlos de forma casualizadas de 332 animais: 60 Moxotó, em duas propriedades privadas e duas Universidades (UFPB e UFCG); 50 Canindé, em duas propriedades privadas; 55 de Serrana Azul, em uma propriedade privada; 68 Marota, em uma Instituição de Pesquisa (Embrapa Meio-Norte); 52 Repartida, em uma Instituição pública, (EBDA) e 47 Graúna, em uma propriedade privada. Na Figura 1, encontra-se marcado em vermelho os Estados da região Nordeste do Brasil onde foram coletadas as amostras. Utilizaram-se amostras da raça MurcianaGranadina como grupo controle. O DNA das amostras foi extraído de 10 pêlos selecionados de cada animal, segundo a metodologia proposta por Walsh et al. (1991). Figura 1 – Localização geográfica dos Estados onde foram coletadas as amostras das raças caprinas brasileiras. Figure 1 – Geographic localization of the States where samples of brasilian goats were colected 76 Microssatélites e PCR Foram selecionados 27 microssatélites: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 e MAF65 para posteriormente, serem amplificados mediante a técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR), 25 μL de volume final de uma reação com: 5 μL de DNA, 2,5 mM de cloreto de magnésio, 1 unidade de Taq Polimerase, 200 mM de dNTPs e 0,25 mM de primers. Preparadas as reações, foram levadas a um termociclador e submetidas às seguintes condições de amplificação: 10 minutos a 94°C, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30'', 55°C para a maioria dos marcadores e a 60ºC (CSRM60 e INRA23) por 45'' e 72°C por 30'', finalmente, após os 35 ciclos, acrescentou-se 10' a 72°C. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida, em um seqüenciador automático ABI 377XL (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). As análises de fragmentos e a tipificação alélica realizaram-se com auxílio dos programas computacionais Genescan Analisys v. 3.7 e Genotyper 2.5, respectivamente. Análises estatísticas As frequências alélicas, heterozigosidades, índice de fixação (Fis) e o coeficiente de diferenciação genética (Fst), proposto por Weir e Cockerham (1984) foram calculados usando o programa computacional Genetix v.4.01 (Belkhir et al., 1999). As distâncias genéticas entre cabras brasileiras foram calculadas de acordo com DA de Nei et al. (1983), usando o programa informático Populations v.1.2.28 (Langela, 1999). Os dendrogramas gerados a partir das matrizes de distância genética foram determinados por agrupamentos pelo método de agrupamento com média aritmética não ponderada (UPGMA). Utilizou-se o programa PHYLIP versão 3.57c (Felsenstein, 1995), aplicando-se TREEWIEW (Page, 1998). Para estudo da associação entre as diferentes subpopulações analisadas e distribuição das freqüências alélicas dos diferentes marcadores utilizados, realizou-se uma análise fatorial de correspondência, que é um tipo de análise canônica, particularmente adaptado para descrever associações entre duas variáveis qualitativas 77 (análise de uma tabela de contingência). Para esta análise utilizou-se o programa computacional Genetix v.4.01 (Belkhir et al., 1999). 78 Resultados e discussão A variabilidade genética intra-racial e o índice de fixação (Fis) das raças caprinas nativas brasileiras são apresentados na Tabela 1. Todas as populações estudadas apresentaram número médio de alelos superior a seis. A população que apresentou o maior polimorfismo foi a Repartida e o menor foi a Marota. A heterozigosidade média observada das raças brasileiras foi superior a 0,5. Estes resultados demonstram que existe elevada variabilidade genética dentro das populações analisadas, com valores variando entre 0,53 (Serrana Azul) e 0,62 (Repartida). Os valores de heterozigosidade média esperada seguiram a mesma tendência, variando entre 0,58 (Serrana Azul) e 0,65 (Repartida). O Fis das populações estudadas foi relativamente reduzido, com valores inferiores a 10%, à exceção do obtido para raça Moxotó (13%). A ocorrência do elevado nível de polimorfismo (6,70) e heterozigosidade média observada (0,62) para Repartida pode ser atribuído pela forma como se originou esta população. Segundo informações da Instituição pública (EBDA) de onde se obteve os dados, este rebanho foi formado a partir da compra na região de animais que apresentavam pelagem característica da raça, de diferentes criadores, proporcionando um aumento da variabilidade genética da raça Repartida. Supõe-se que esses animais não se encontravam em estado de pureza racial. A proporção de indivíduos heterozigotos dentro das populações caprinas brasileiras foi considerada relativamente alta (superior a 0,5), demonstrando que existe elevado nível de heterozigosidade nas raças caprinas nativas brasileiras. Neste estudo, verificou-se heterozigosidade média observada de 0,55 para raça Moxotó, enquanto Araújo (2004) encontrou heterozigosidade média observada para a raça Moxotó de apenas 0,44. Possivelmente, este resultado superior pode ser atribuído ao maior tamanho de amostra utilizado neste trabalho. Barker et al. (2001), estudando raças caprinas asiáticas, verificaram heterozigosidade média observada inferior a 0,5; segundo esses autores, algumas justificativas podem explicar esses valores reduzidos, como: rebanhos com acasalamentos descontrolados, em que existem reprodutores dominantes que, presumidamente, procriam a maioria da descendência, conduzindo a um efeito de Wahlund (subdivisão das populações); outro fator seria o tamanho reduzido das populações de cabras asiáticas. 79 Por outro lado, Li et al. (2002), estudando raças nativas chinesas, verificaram heterozigosidade média observada superior a 0,6, mostrando elevado grau de heterozigosidade nestas populações. De acordo com os autores, a causa pode estar relacionada com o maior número de indivíduos dentro dos rebanhos, a área de distribuição e uma maior troca de genes entre as populações. Diante de uma análise global, os valores de número médio de alelos e heterozigosidade média observada encontrados neste trabalho sugerem que existe elevada variabilidade genética intra-racial nas raças caprinas nativas brasileiras. Contudo, ainda existe uma preocupação com a erosão genética desses animais, pelo reduzido número de indivíduos dentro de algumas poupulações. Assim, uma gestão de população eficiente é extremamente necessária para conservação desses recursos genéticos, evitando acasalamentos entre indivíduos aparentados dentro das populações, como também pela introdução de indivíduos de outras raças. De acordo com os loci estudados, observou-se que existe elevado nível de diversidade genética nas populações caprinas brasileiras, com heterozigosidade média esperada (He) superior a 0,5. A heterozigosidade média esperada de 0,62 para raça Moxotó foi superior ao encontrado por Araújo (2004), estudando diversidade genética para raça Moxotó (He < 0,5). Enquanto, Yang et al. (1999) verificaram alto nível de diversidade genética em raças chinesas com valores superiores a 0,7. As populações da raça Moxotó apresentaram Fis de 13%, indicando desequilíbrio entre as freqüências alélicas e genotípicas devido ao nível elevado (acima de 10%) dos indivíduos homozigotos intra-populacional. Barker et al. (2001) verificaram Fis variando entre 9% para raça Medan e 33% para raça Ujung pandang. Segundo esses autores, o alto nível de consangüinidade dentro das populações de caprinos nativos sulorientais asiáticos que são promovidos por acasalamentos descontrolados e indiscriminados em populações reduzidas e utilização de poucos reprodutores. Elevado valor de Fis pode ser causado por meio de diversos fatores: acasalamentos direcionados, subdivisões dentro das populações, coancestrais e antepassados comuns, seleção natural, migração ou fluxo de genes de uma população externa, amostragem incorreta ou presença de alelos nulos não detectáveis experimentalmente. Provavelmente, exista uma subdivisão dentro das populações da raça Moxotó, devido ao reduzido fluxo de genes entre os rebanhos; geralmente essas populações são fechadas com reduzido número de reprodutores, favorecendo a endogamia. Entretanto, 80 faz-se necessário realizar novos trabalhos, com maior número de rebanhos para verificar a estrutura genética da raça Moxotó. Tabela 1 – Número de amostras (N), número médio de alelos (NA), heterozigosidade média observada (Ho), heterozigosidade média esperada (He) e índice de fixação (Fis) das raças brasileiras Table 1 - Number of samples (N), average number of alleles (NA), average observed heterozygosity (Ho), average expected heterozygosity (He) and fixation index (Fis) of the Brazilian breeds Populações N NA Ho He Fis Serrana Azul 55 6,22 0,53 0,58 0,08 Moxotó 60 6,29 0,55 0,62 0,13 Marota 68 6,07 0,58 0,61 0,04 Canindé 50 6,15 0,60 0,64 0,06 Repartida 52 6,70 0,62 0,65 0,07 Graúna 47 6,56 0,61 0,62 0,03 Populations A matriz de distâncias genéticas DA de Nei et al., (1983) entre as raças caprinas nativas brasileiras, encontram-se na Tabela 2. A menor distância genética foi observada entre a raça Serrana Azul e Graúna (0,082). Por outro lado, a maior distância genética foi observada entre a raça Serrana Azul e Canindé (0,145). Quanto ao grupo controle Murciana-Granadina, a população mais divergente foi a Serrana Azul, com valores de 0,313. O coeficiente de diferenciação genética entre as raças caprinas nativas brasileiras (Fst) foi relativamente baixo, indicando que apenas 7,9% da variabilidade genética total foi explicado pelas diferenças entre raças e 92,1% correspondem a diferenças entre indivíduos. Li et al. (2002), avaliando a diversidade genética em caprinos chineses, encontraram Fst de 10,5% para todos os loci analisados. Já Barker et al. (2001), encontraram valor médio de Fst de 14,3%, demonstrando uma maior diferenciação genética entre as raças asiáticas, comparados aos resultados encontrados neste estudo. A diversidade genética inter-populações das raças brasileiras são ilustradas no dendrograma da matriz obtida pelo método de UPGMA (Figura1). Pode-se identificar que foram formados dois grupos distintos: o primeiro, formado por Repartida, Moxotó, Canindé e Marota e o segundo agrupamento, formado por Serrana Azul e Graúna. O grupo controle Murciana-Granadina formou um grupo distinto do agrupamento das 81 raças brasileiras. Os elevados valores de “Bootstrap” (acima de 50) demonstram o grau de confiança na formação dos nóis do dendrograma apresentado. 82 Tabela 2 – Matriz de distâncias genéticas DA entre as raças caprinas nativas brasileiras Table 2 – Matrix of distance genetics DA between the breeds native Brazilian goats Populações Populations S. Azul Moxotó Marota Canindé S. Azul *** Moxotó 0,124 *** Marota 0,143 0,110 *** Canindé 0,100 0,144 *** 0,145 Repartida 0,140 0,086 0,121 0,097 Graúna 0,130 0,130 0,144 0,082 M.Granadina 0,313 0,312 0,288 0,265 Números em negrito sao os menores e maiores valores para DA Repartida Graúna *** 0,139 0,259 *** 0,246 M.Granadina *** Numbers in bold face are lowest and values of DA No primeiro grupo formado, verifica-se uma maior proximidade entre as raças Repartida, Moxotó e Canindé. Este resultado pode ser explicado pela formação do rebanho Repartida que se originou com base exclusivamente na cor da pelagem, em uma região do Estado da Bahia, onde a ocorrência da raça Canindé era relativamente alta. Possivelmente, no passado existia troca de genes entre esses animais, pois os acasalamentos eram descontrolados, o que pode ter contribuído para a similaridade observada entre essas populações. Por outro lado, apesar da distância geográfica em que se encontram esses rebanhos da raça Moxotó (Paraíba e Rio Grande do Norte), Repartida (Bahia) e Canindé (Rio Grande do Norte), provavelmente estas três raças caprinas foram originadas de animais com história evolutiva comum. A raça Marota apresentou maior distância genética dentre as raças desse grupo (Figura 2). Este resultado pode estar relacionado ao isolamento genético desta população através de acasalamentos controlados, possivelmente, causando efeito de deriva genética. Além da distância geográfica entre a raça Marota e os demais, pois encontra-se no Piauí, com mais de 1000 km de distância dos demais rebanhos estudados. Para o segundo grupo, verifica-se elevado grau de similaridade entre as raças Serrana Azul e Graúna. Estes rebanhos pertencem ao mesmo criador e possivelmente, houve troca de genes entre os rebanhos, favorecendo a menor distância genética entre as populações analisadas. 83 A raça Murciana-Granadina mostrou-se um grupo geneticamente distinto das cabras brasileiras, contribuindo efetivamente para a interpretação das distâncias genéticas dos grupos de cabras analisadas. Murciana-Granadina 100 Serrana AzulL 98 Graúna 84 Marota 58 Canindé 60 Moxotó 78 Repartida Figura 2 – Dendrograma de UPGMA das raças brasileiras, baseado na distância DA de Nei (1983). Figure 2 – UPGMA dendrogram of brasilian breeds, based on Neis’s DA distance (1983). Na Figura 3 encontra-se a análise fatorial de correspondência das populações estudadas. Os três eixos responderam por mais de 70% da variação total, mostrando alto grau de confiança da análise, distinguindo claramente as relações genéticas entre as populações. 84 Serrana Azul Graúna Moxotó Repartida Marota Canindé Figura 3 – Representação espacial das raças estudadas segundo a análise fatorial de correspondências. Figure 3 - Spatial representation of studied breeds using factorial correpondence analysis. Verificou-se que a raça Marota foi o grupo mais distinto, apresentando-se como uma população geneticamente controlada. Este rebanho está sob a responsabilidade de uma empresa de pesquisa, fruto de um trabalho de mais de 20 anos de conservação, um exemplo de trabalho a ser aplicado às demais raças caprinas brasileiras. A raça Canindé mostrou-se isolada das demais. Possívelmente, tal fato pode ser explicado pelo manejo destes rebanhos com acasalamentos controlados, pois estes pertencem a selecionadores da raça com tendência em manter esses animais em estado de pureza racial. As raças Repartida e Moxotó encontram-se mais próximas, fato que pode ser atribuído pela forma como o rebanho foi originado, pela compra de animais, tomando 85 basicamente como referência a cor da pelagem; provavelmente, eram indivíduos mestiços com estreita relação genética proporcionada por história evolutiva comum. Por outro lado, observa-se uma nítida separação das raças Serrana Azul e Graúna das demais e uma elevada correspondência entre essas duas populações. Este resultado pode ser explicado por acasalamentos entre indivíduos desses rebanhos, permitindo maior troca de genes entre eles, pois os rebanhos pertencem a um mesmo criador. A análise fatorial de correspondência para todos os indivíduos encontra-se na Figura 4. Este tipo de análise permite uma melhor visualização da distribuição dos indivíduos dentro das populações estudadas. Pode-se verificar que os indivíduos Marota e Canindé são os que apresentaram maior distinção dos demais. Enquanto, os indivíduos Moxotó e Repartida apresentaram maior correspondência entre eles, o que foi observado também com os indivíduos Serrana Azul e Graúna. Com esta perspectiva, pode-se observar que cada raça caprina nativa brasileira apresenta algumas particularidades e que, a partir daí, a gestão de população deve ser determinada pelos programas de conservação de recursos genéticos com bastante critério, levando-se em consideração o tamanho efetivo da população, grau de variabilidade genética e a finalidade específica de cada raça. 86 Serrana Azul Graúna Moxotó Repartida Marota Canindé Figura 4 – Representação espacial de todos os indivíduos analisados segundo a análise fatorial de correspondências. Figure 4 - Spatial representation of individuals analysed factorial correpondence analysis. 87 Conclusões Os resultados de polimorfismo genético indicaram que existe elevada variabilidade genética intra-racial nas populações caprinas estudadas. Considerando a estrutura genética da espécie caprina, pode-se considerar que existe uma boa diferenciação genética entre as raças brasileiras. 88 Referências Bibliográficas Araújo, A. M. Paternidade e diversidade genética em caprinos no Brasil por meio de microssatélites de DNA. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa. 2004. 90p. Tese (doutorado). Universidade Federal de Viçosa. 2004. 90p. Barker, J. S. F.; Tan, S. G.; Moore, S. S. et al. Genetic variation within and relationship among populations of Asian goats (Capra hircus). Journal of Animal Breeding Genetics, v. 118, p. 213-233, 2001. Belkhir, K. Genetix: Logiciel sous WindowsTM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions. CNRS UPR 9060. 1999. Egito, A. A.; Mariante, A. S.; Albuquerque M. S. M. Programa brasileiro de conservação de recursos genéticos animais. Archivos de Zootecnia, v. 51, p. 39-52, 2002. FAOSTATS. http://apps1.fao.org , 2002. Felsestein, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.5c. University of Washington. 1995. Langela O. Populations 1.2.28 CNRS gif.fr/pge/bioinfo/populations/index.php , 1999. UPR9034 http://www.cnrs- Li, M. H.; Zhao, S. H.; Bian, C. et al. Genetic relationships among twelve Chinese indigenous goat populations based on microsatellite. Genet. Sel. Evol, v. 34, p. 729744, 2002. Luikart, G.; Gielly, L.; Excoffier, L. et al. Multiple maternal origins and weak phylogeographic structure in domestic goats. Pnas, v. 98, n. 10, p. 5927-5932, 2001. Mariante, A. S. Situação atual da conservação de recursos genéticos animais no Brasil. In: SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE – SIRGEALC, 2., Brasília. Mesa redonda... Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 1999. CD-ROM. 5p. Nei, M.; Tajima, F.; Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. Journal of Molecular Evolution, v. 19, p. 153-70, 1983. Page R.D.M. Tree drawing software for Apple Macintosh and Microsoft Windows. In: htpp://taxonomy.zoology.gla.uk/rod/rod.htlm. Divisiont of Enviromental and Evolutionary Biology, Institute of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow G128QQ, Scotland, UK. 1998. Saitbekova, N.; Gaillard, C.; Ruff, G. O. et al. Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatellite analysis. Animal Genetics, v. 30, p. 36-41, 1999. Yang, L.; Zhao S. H.; Li, K. et al. Determination of relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers. Animal Genetics, v. 30, p. 452-456, 1999. Walsh, P. S.; Metzger, D. A.; Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for a simple extraction of DNA for PCR-based typins from forensic material. Biotecchniques, v. 10, p.506-513, 1991. 89 Weir, B. S.; Cockerham, C. Estimating F-statistics for analysis of population structure. Evolution, v. 36, p.1358-1370, 1984. 90 Capítulo III Distância genética entre raças caprinas nativas brasileiras, ibéricas e canárias usando microssatélites 91 Distância Genética entre Raças Caprinas Nativas Brasileiras, Ibéricas e Canárias Usando Microssatélites Resumo - O objetivo deste trabalho foi verificar a diversidade genética entre raças caprinas nativas brasileiras, ibéricas e canárias usando microssatélites. Foram coletadas amostras de pêlos e/ou sangue das raças brasileiras: Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida e Graúna; das raças espanholas: Murciana-Granadina, Malagueña, Blanca Andaluza, Blanca Celtiberica; das raças canárias: Majorera, Terifenha e Palmera; da raça portuguesa: Serpentina e da raça suiça: Saanen. Foram selecionados 27 microssatélites: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 e MAF65, amplificando-se mediante técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). As populações analisadas apresentaram elevados valores de variabilidade genética intra-racial. O valor de Fit foi de 19,9%. O coeficiente de diferenciação genética Fst para todos os loci analisados indica que 13,3% da variabilidade genética total foi representada pela diferença entre populações e que 86,7% correspondem às diferenças entre os indivíduos. As relações genéticas entre raças caprinas brasileiras, ibéricas e c anárias permitiram a formação de três agrupamentos geneticamente distintos. Palavras-chave: caprinos, conservação genética, marcadores moleculares, diversidade genética 92 Genetic Distance Among Native Brazilian Breeds, Ibericas, and Canaries Using Microsatellites Abstract - The objective of this work was to verify the genetic diversity between brazilian, iberians and canaries breeds goats using microsatellites. Samples of hair and/or blood were collected of brazilian breeds: Moxotó, Canindé, Serrana Azul, Marota, Repartida and Graúna; Spanish Breeds: Murciana-Granadina, Malagueña, Blanca Andaluza and Blanca Celtiberica; Breeds Canaries: Majorera, Tenerifeña and Palmera; Portuguese Breed: Serpentina and breed Swizo: Saanen. A panel of 27 microsatellites were selected: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 and MAF65, being amplified by the polimerase chain reaction (PCR). The goat populations showed high values of intraracial genetic variability. The value of Fit was of 19,9%. the coefficient of genetic differentiation Fst for all of the analyzed loci indicated that 13,3% of the genetics total variability were represented by the difference among populations, and that 86,7% corresponded to the difference among individuals. The genetic relationships among Iberian, Canaries and Brazilian breeds goats were illustrated, by the formation of three groupings genetically different. Keywords – goats, genetic conservation, molecular markers, genetic diversity 93 Introdução De acordo com restos arqueológicos, a origem das cabras domésticas (Capra hircus) sugere que sua domesticação foi por volta de 10.000 anos atrás. Segundo Luikart et al. (2001), existem origens maternas múltiplas, sendo três linhagens distintas de (Capra hicus) com possível centro de origem na Ásia. A partir daí, pela facilidade relativa de transporte e adaptabilidade, as cabras acompanhavam os homens em suas viagens, sendo levadas para Europa e África e, posteriormente, repartidas pelo mundo. O processo de conquista do novo mundo pode ser dividido em três fases: inicialmente pela fase de descobrimento e exploração, em que os animais eram indispensáveis na alimentação dos colonizadores. Em seguida, a fase de conquista, com a utilização de animais para guerra, sobretudo o cavalo como elemento principal e suíno para alimentação. E finalmente, a fase de colonização com a introdução de animais domésticos, promovendo mudanças na fauna do novo mundo (Rodero et al., 1992). Segundo Primo (1992), a distribuição e as características dos rebanhos crioulos na América são, em parte, conseqüência de sua história. De acordo com Mariante e Cavalcante (2000), diferentes agrupamentos de caprinos procedentes da Espanha, de Portugal e da África teriam sido levados nas viagens do descobrimento, formando os rebanhos iniciais do Brasil. Na colonização americana, geralmente, as rotas dos colonizadores tinham parada obrigatória nas ilhas Canárias, Madeira e Cabo Verde, antes de seguir viagem à América. Contudo, havia um intercâmbio de animais antes mesmo da chegada dos barcos ao novo mundo (Capote et al. 2002). Atualmente, existem poucos estudos genéticos em caprinos no Brasil. Oliveira (2003) verificou a variabilidade genética em populações da raça Moxotó, utilizando marcadores RAPD. Enquanto Araújo (2004), em populações das raças Saanen, Alpina e Moxotó, analisou a diversidade genética, usando marcadores microssatélites. Em estudos de relações genéticas, Machado et al. (2000) avaliaram a distância e árvore taxonômica das cabras crioulas do Brasil, comparando as cabras européias e africanas mediante freqüências alélicas em cada população para algumas características morfológicas e verificaram que as cabras crioulas são mais próximas às cabras européias do oeste do continente do que às cabras norte-africanas, balcânicas ou mediterrâneas insulares. O objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade e as relações genéticas entre raças caprinas nativas Brasileiras, Ibéricas e Canárias utilizando microssatélites. 94 Material e métodos Amostras e extração de DNA Foram coletadas amostras de pêlos e/ou sangue das raças caprinas brasileiras: Moxotó (Paraíba e Rio Grande do Norte), Canindé (Rio Grande do Norte), Serrana Azul (Paraíba), Marota (Piauí), Repartida (Bahia) e Graúna (Paraíba); Raças espanholas: Murciana-Granadina (Murcia e Granada), Malagueña (Malága), Blanca Andaluza (Córdoba), Blanca Celtiberica (Albacete); Raças Canárias: Majorera (Fuerteventura e Tenerife), Terifeña (Tenerife) e Palmera (Las Palmas); Raça Portuguesa: Serpentina (Alentejo) e Raça Suiça: Saanen (Córdoba-ES e Recife-PE). Neste estudo foram utilizados duas populações de cabras selvagens: Creta e Ibice, além de uma população de ovino como grupo controle. O DNA das amostras foi extraído segundo a metodologia proposta por Walsh et al. (1991). Microssatélites e PCR Foram selecionados 27 microssatélites: BM6506, BM8125, BM1818, CSRD247, ETH225, HAUT27, ILSTS011, INRA63, INRA5, SPS115, TGLA122, BM6526, CSRM60, CSSM66, ETH10, INRA6, MM12, HSC, McM527, SRCRSP8, OarFCB48, BM1329, OarFCB11, OarFCB304, INRA23, MAF209 e MAF65 para, posteriormente, serem amplificados mediante a técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR), com 25 μL de volume final de uma reação com: 5 μL de DNA, 2,5 mM de cloreto de magnésio, 1 unidade de Taq Polimerase, 200 mM de dNTPs e 0,25 mM de primers. Preparadas as reações, foram levadas a um termociclador e submetidas às seguintes condições de amplificação: 10 minutos a 94°C, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30'', 55°C para a maioria dos marcadores e a 60ºC (CSRM60 e INRA23) por 45'' e 72°C por 30'', finalmente, após os 35 ciclos, acrescentou-se 10' a 72°C. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida em um seqüenciador automático ABI 377XL (Applied Biosystems, Foster City CA, USA). As análises de fragmentos e a tipificação alélica realizaram-se com auxílio dos programas informáticos GeneScan Analisys v. 3.7 e Genotyper v. 2.5, respectivamente. 95 Análises estatísticas As frequências alélicas e heterozigosidades e índices de fixação (Fis) foram calculados com o auxílio do programa informático Genetix versão 4.0.4, proposto por Belkhir et al. (1999). As distâncias genéticas entre as populações foram calculadas de acordo com a DA de Nei et al. (1983), usando o programa computacional POPULATIONS v. 1.2.28 (Langella, 1999). Os dendrogramas gerados a partir das matrizes de distância genética foram determinados por agrupamentos pelo método de NEIGHBOR, modelo de PHYLIP v. 3.57c, com o pacote computacional (Felsentein, 1995) e foi utilizado o software TREEWIEN (Page, 1996). Para construir as árvores filogenéticas com indivíduos como unidades taxonômicas operativas (OTU), utilizou-se o programa informático MICROSAT v.1.5b desenvolvido por Minch (1998) para calcular os pares de distâncias genéticas entre indivíduos, baseados na proporção de alelos compartilhados DSA (Bowcock et al. 1994). As árvores filogenéticas foram construídas mediante o modelo NEIGHBOR do programa PHYLIP versão 3.57c (Felsenstein, 1995), aplicando-se TREEWIEW (Page, 1998). Para estudos de associação entre as diferentes subpopulações analisadas e a distribuição das frequências alélicas dos diferentes marcadores utilizados, realizou-se análise fatorial de correspondência, que é um tipo de análise canônica particularmente adaptada para descrever as associações entre duas variáveis qualitativas (análise de uma tabela de contingência), utilizando o programa computacional Genetix v. 4.0.4 software (Belkhir et al., 1996). 96 Resultados e discussão Na Tabela 1, são apresentados os valores de variabilidade genética intra-racial, o índice de fixação (Fis) e o desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) para todas as raças caprinas estudadas. A Blanca Celtibérica foi a raça que apresentou o maior número médio de alelos (7,96). Por outro lado, o menor valor encontrado foi para raça Palmera (4,29). Os valores de heterozigosidade média esperada seguiram a mesma tendência para essas duas raças, com maior diversidade genética para a raça Blanca Celtibérica (0,69) e a menor para a raça Palmera (0,53). Para os valores de heterozigosidade média observada, a maior variabilidade genética encontrada foi para a raça Saanen (0,65) e a menor para a raça Serrana Azul (0,52). O maior valor de Fis foi obtido para a raça Moxotó (0,13) e o menor para a raça Palmera (–0,02). Apenas as raças Majorera e Moxotó apresentaram desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P>0,10). Os elevados valores de variabilidade genética intrapopulacional para as raças Blanca Andaluza e Blanca Celtibérica, valores de Fis de (0,09 e 0,07), respectivamente, e o desequilíbrio de Hardy-Weinberg significativo (P>0,05) sugerem que, possivelmente, tenham ocorrido acasalamentos com reprodutores de outras raças nestes rebanhos, permitindo maior variabilidade genética, pois são raças nativas consideradas de proteção especial e os rebanhos são relativamente reduzidos. Apesar dos valores de Fis inferiores a 10%, verifica-se tendência de possível subdivisão dentro destas populações com altas diferenças entre indivíduos, confirmado pelo desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Portanto, esta prática é um perigo para conservação destas raças. Com a criação recente da Associação de Criadores da Raça Blanca Celtibérica, espera-se, em um futuro próximo, rebanhos mais controlados. Com relação à raça Blanca Andaluza, atualmente existem alguns projetos de conservação que também podem contribuir com a manutenção desta raça. Para as raças Murciana-Granadina e Malagueña, os resultados seguem a mesma tendência, porém, são raças de fomento, com rebanhos maiores que permitem uma maior troca de genes dentro de cada raça, permitindo valores de Fis relativamente altos (0,08 e 0,09), respectivamente, provocando desequilíbrio nas populações, com maiores diferenças entre indivíduos dentro das populações. Como são raças comerciais, estes resultados são previsíveis. 97 A raça Palmera apresenta número médio de alelos e heterozigosidade esperada mais reduzidos, porém o valor de heterozigosidade observada (0,55) foi superior à esperada (0,53), demonstrando que, apesar do elevado valor de heterozigosidade, não houve diferenças significativas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Provavelmente, este fato pode ser explicado pelo menor número de indivíduos desta raça, assim como pelo reduzido fluxo gênico intra-rebanhos e entre outras raças. Conseqüentemente, existe menor diferença entre os indivíduos dentro dessas populações. Para as raças Serrana Azul, Moxotó, Marota, Canindé, Repartida e Graúna, verifica-se níveis elevados de variabilidade genética intra-racial, apesar do reduzido número de animais destas populações e do manejo reprodutivo aplicado com a utilização de poucos reprodutores. Estes valores estão de acordo com vários estudos na espécie caprina (Yang et al., 1999; Saitbekova et al., 1999; Barker et al., 2001; Li et al., 2002; Araújo, 2004). Tabela 1 – Número de amostras (N), número de alelos (NA), heterozigosidade média esperada (He), heterozigosidade média observada (Ho), índice de fixação (Fis) e deviação do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) para todas as raças caprinas analisadas Table 1 - Number of samples (N), average number of alleles (NA), average observed heterozygosity (Ho) average expected heterozygosity (He), average inbreeding coefficient(Fis) and deviations from Hardy-Weinberg equilibrium(HW) for all analysed breeds goats Populações Populations Majorera Palmera Tenerifeña Serrana azul Moxotó Marota Canindé Repartida Graúna Malagueña Branca Andaluza Murciana-Granadina Branca Celtibérica Saanen Serpentina ** (P>0,05), *** (P>0,10) N NA Ho He Fis HW 40 34 40 40 40 40 40 40 39 40 40 40 40 36 40 6,85 4,29 5,66 5,85 5,70 5,80 5,88 6,51 6,52 7,18 7,11 7,11 7,96 6,81 7,29 0,59 0,55 0,59 0,52 0,53 0,59 0,60 0,61 0,61 0,64 0,64 0,62 0,64 0,65 0,63 0,65 0,53 0,60 0,57 0,61 0,61 0,63 0,64 0,62 0,69 0,68 0,67 0,69 0,66 0,66 0,10 -0,02 0,04 0,08 0,13 0,04 0,06 0,07 0,03 0,09 0,09 0,08 0,07 0,03 0,05 *** ns ns ** *** ns ** ** ns ** ** ** ** ns ** As raças Saanen e Serpentina apresentaram grau de variabilidade genética intraracial alto, demonstrados pelos elevados valores de número médio de alelos e heterozigosidade observada, assim como pelo nível de diversidade genética verificado através do valor de heterozigosidade esperada de 0,66 para as duas raças. Estes valores 98 podem ser atribuídos à gestão destas populações, pois são raças comerciais, com um número elevado de animais, em que ocorre maior fluxo de animais entre os respectivos rebanhos. Os resultados elevados de Fis de 0,13 e 0,10 para as raças Moxotó e Majorera, respectivamente, é um indicativo de populações heterogêneas. Possivelmente, este fato pode ser reflexo de vários fatores como: subdivisão das populações, presença de alelos nulos não identificados ou consanguinidade, proporcionando maiores diferenças entre os indivíduos dentro das populações. Consequentemente, ocorreu desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg para essas duas populações. A partir dos dados de microssatélites, obteve-se os resultados da estrutura das populações, de acordo com as Estatísticas de F, apresentados na Figura 1. O valor de Fit foi de 19,9%. O coeficiente de diferenciação genética Fst para todos os loci analisados indica que 13,3% da variabilidade genética total foi representada pela diferença entre populações, e que 86,7% correspondem a diferença entre indivíduos. Este resultado sugere uma elevada diversidade genética entre as raças estudadas, valor relativamente alto para a espécie caprina. Li et al. (2002) verificaram Fst de 10,5%, em caprinos chineses. Enquanto que, Barker et al. (2001) reportaram Fst de 14,3%, em cabras asiáticas. O Fis de 6,6% para todos os loci demonstra que existem moderadas diferenças entre os indivíduos dentro das subpopulações. Este resultado pode ser atribuído a uma troca de genes equilibrada, em que não há excesso ou deficiência de indivíduos heterozigotos. Li et al. (2002), estudando diversidade genética em raças caprinas chinesas, encontraram Fis de 3%, resultado inferior ao encontrado neste trabalho. Ao contrário, Barker et al. (2001), estudando diversidade genética, em caprinos asiáticos, verificaram altos valores de Fis 23%. Segundo esses autores, este resultado pode ser explicado por alguns fatores como: presença de alelos nulos ou alelos mal tipificados, efeito de Wahlund (população subdividida) ou seleção contra heterozigotos. 99 Valores (%) para todos os loci 25 20 19,9 13,3 15 10 6,6 5 0 Fit Fis Fst Estatisticos de F Figura 1 – Estatísticas de F (Fit, Fis e Fst) para todos os loci analisados. Figure 1 – F- Statistics (Fit, Fis e Fst) for all analysed loci. A matriz de distância genética DA, proposta por Nei et al., (1983), encontra-se na Tabela 2. Os resultados da Matriz de DA demonstraram as maiores diferenças genéticas para as populações de cabras selvagens e de ovino, comparando-se com as populações de cabras domésticas estudadas. Verificou-se que as raças Moxotó e Repartida são as populações geneticamente mais similares, enquanto, as raças Palmera e Serrana Azul são as mais distintas. Na Figura 2, encontra-se o dendrograma baseado no método de agrupamento de Neighbor–Joining (NJ), com 1.000 permutações para reamostragem dos loci para todas as populações analisadas. Verificou-se neste dendrograma apenas os valores de bootstrap acima de 50. No entanto, pode-se verificar claramente a formação de três agrupamentos geneticamente distintos. O grupo das raças caprinas Ibéricas formou-se com uma estreita relação entre Malagueña e Blanca Andaluza, seguidas por MurcianaGranadina e Blanca Celtibérica, e a Serpentina e Saanen aparecem um pouco mais distante das raças espanholas. No grupo das raças Canárias, verificou-se uma maior proximidade entre as raças Tenerifeña e Majorera, enquanto a raça Palmera encontra-se um pouco mais distante. E finalmente, o grupo formado pelas raças brasileiras, demonstrando maiores relações genéticas entre Moxotó, Repartida e Canindé. Assim como, para raças Serrana Azul e Graúna, distintas das demais. Para raça Marota demonstra-se ser uma população mais isolada das demais. 100 Tabela 2 – Matriz de distâncias genéticas DA para todas as raças caprinas estudadas Table 2 – Matrix of distance genetics DA for all breeds goats estudieds S.A MO MA CA RE GR MJ PA TN BA BC ML S.A * MO 0,126 * MA 0,162 0,118 * CA 0,158 0,106 0,160 * RE 0,155 0,092 0,137 0,104 * GR 0,097 0,133 0,134 0,154 0,149 * MJ 0,314 0,291 0,251 0,277 0,254 0,244 * PA 0,389 0,368 0,307 0,334 0,344 0,330 0,130 * TN 0,349 0,343 0,288 0,303 0,315 0,293 0,115 0,124 * BA 0,298 0,301 0,245 0,261 0,258 0,225 0,207 0,265 0,217 * BC 0,296 0,305 0,261 0,248 0,267 0,239 0,229 0,285 0,234 0,107 ML 0,298 0,274 0,265 0,230 0,241 0,237 0,204 0,266 0,215 0,099 0,104 * MG 0,353 0,335 0,299 0,277 0,280 0,275 0,235 0,282 0,235 0,117 0,111 0,123 MG SN SE CR OV IB * * SN 0,250 0,247 0,239 0,228 0,221 0,178 0,257 0,323 0,267 0,138 0,151 0,157 0,168 * SE 0,275 0,275 0,262 0,221 0,243 0,234 0,236 0,308 0,256 0,110 0,098 0,118 0,133 0,130 CR 0,577 0,596 0,538 0,543 0,596 0,517 0,468 0,510 0,442 0,392 0,382 0,416 0,418 0,531 0,418 * OV 0,664 0,707 0,673 0,683 0,691 0,648 0,710 0,723 0,710 0,644 0,657 0,710 0,683 0,668 0,668 0,690 * IB 0,583 0,581 0,561 0,532 0,550 0,541 0,497 0,542 0,510 0,479 0,487 0,483 0,509 0,554 0,512 0,607 0,768 * * SA- Serrana Azul; MO- Moxotó; MA- Marota; CA- Canindé; RE- Repartida; GR- Graúna; MJ-Majorera; PA- Palmera; TNTenerifeña; BA- Blanca Andaluza; BC- Blanca Celtibérica; ML- Malagueña; MG- Murciana-Granadina; SN- Saanen; SESerpentina; CR- Creta; OV- Ovis e IB- Ibice Números em negrito sao os menores e maiores valores para DA Numbers in bold face are lowest and highest values for DA Utilizaram-se, neste estudo, amostras de duas populações de cabras selvagens (Creta e Ibice) e uma raça ovina como grupo controle, verificando-se distintas relações genéticas com os grupos das raças domésticas estudadas. A utilização de um grupo controle com uma espécie próxima como, neste caso, a ovina, contribui com a interpretação dos resultados filogenéticos e oferece uma idéia ao longo do tempo como foi a distribuição genética das raças estudadas. Em uma análise global, de acordo com a história evolutiva das raças, verificou-se que, apesar das diferenças genéticas atuais entre as raças Ibéricas, Canárias e Brasileiras, no passado remoto, houve uma influência genética de cabras selvagens, neste caso, Creta e Ibice na formação das raças caprinas Ibéricas e Canárias, posteriormente, contribuíram geneticamente com a origem das raças brasileiras. Estes resultados corroboram com a história sobre a introdução dos animais domésticos à América, descrita por Rodero et al. (1992), em que estes autores afirmam que as populações de animais da Península Ibérica e Canárias influenciaram na 101 formação da maioria das raças crioulas, já que as rotas dos navegantes da época iniciavam-se nos portos de Portugal e Espanha com escalas nas ilhas Madeira e Canárias, respectivamente, e daí seguiam viagem com destino ao novo mundo. Alguns aspectos devem ser ressaltados para esta época quanto à formação dos animais ibero-americanos. Primeiro, que neste momento não existia um conceito de raça definido, segundo informou Rodero et al. (1992). Apenas no final do último século foram considerados o cavalo (Raça Pura Espanhola), o carneiro (Merino Espanhol), o touro (Lidia) e a cabra (Murciana-Granadina) como raças. Nesta época, os animais eram definidos pela identificação geográfica ou pela cor da pelagem. No entanto, os animais que foram levados ao novo continente eram procedentes de várias cores de pelagem e distintos tipos de estruturas morfológicas. Ao longo dos tempos, através de sucessivos acasalamentos entre indivíduos desses rebanhos, formaram-se diferentes raças caprinas brasileiras que, atualmente, apresentam uma identidade genética, distinta das raças Ibéricas e Canárias e totalmente adaptadas aos sistemas ecológicos naturais. Este fato pode ser explicado por motivos históricos e genéticos. Antigamente, devido às dificuldades de transporte de animais vivos, o cavalo era um animal que apresentava prioridades nas tripulações pela necessidade desses animais nas guerras. Assim, a maioria das outras espécies eram levadas desde escalas posteriores nas Ilhas Canárias e em Cabo Verde e não partiam da Península Ibérica. Geralmente, as embarcações não podiam levar muitos animais e algumas espécies eram utilizadas na alimentação dos navegadores (caprinos e galinhas). Contudo, pode-se verificar que, do ponto de vista genético, as populações caprinas atuais formaram-se a partir de um reduzido número de animais fundadores e que no processo de expansão destas populações, apresentavam uma constituição genética distinta das originais, possivelmente pelo efeito de deriva genética, aliado a uma seleção natural devido às condições ambientais. Para Mariante e Cavalcante (2000), o longo processo de seleção natural a que estiveram submetidos os caprinos do Nordeste, resultou na formação de animais de pequeno porte, com alta fertilidade e rusticidade adaptados às condições da região semi-árida do país. 102 Ovis Ibice Saanen Serpentina B. Celtibérica M.Granadina Malaguenha B. Andaluza 68 68 Creta 86 57 86 Majorera Tenerifenha Moxotó 59 Palmera Repartida Canindé Marota Graúna S. Azul 0.1 Figura 2 – Dendrograma de NJ baseado na distância genética Da de Nei et al. (1983), com 1.000 permutações. Figure 2 – Dendrogram of relations between studied populations using neighbour-joining method based on the Da genetic distance of Nei et al. (1983), with 1000 permutations. 103 De acordo com Primo (1999), os caprinos do Brasil são derivados de animais do Sul da Espanha, além de uma possível influência de caprinos da África (1532 a meados de 1850), com alguns animais utilizados para alimentação nas tripulações dos navios negreiros. Enquanto, Mariante e Cavalcante (2000) reportaram que as primeiras cabras brasileiras originaram-se de animais das atuais raças portuguesas (Alentejana, Ribatejana e Serrana), com datas da época do governo geral de Tomé de Souza (1549). Segundo Tudela (1987), citado por Rodero et al. (1992), os caprinos do novo continente apresentavam uma adaptação e dispersão por todo o continente, desde áreas quentes a frias. Possivelmente, esses animais são procedentes das Canárias, Andaluzia e outras populações de Cabo Verde e Guinea. As características morfológicas similares entre as populações atuais e as populações originais são evidentes. Entretanto, pode-se verificar, pelos resultados deste estudo com marcadores moleculares, que a caracterização genética baseada exclusivamente em caracteres morfológicos não é suficiente para identificar e definir as raças. Tal fato pode ser verificado neste trabalho, que apesar da semelhança das cores da pelagem das raças Moxotó e Serpentina, são duas raças geneticamente diferentes, possivelmente pelo efeito de deriva genética. Por outro lado, as raças Serrana Azul e Graúna possuem pelagem distintas; no entanto, apresentam estreitas relações genéticas, possivelmente, houve uma troca de genes entre essas populações, pois esses dois rebanhos pertencem ao mesmo criador. Este resultado é interessante para mostrar que, em geral, na seleção de indivíduos, deve-se levar em consideração outros critérios, além da cor da pelagem. Na Figura 3, encontra-se o dendrograma de indivíduos como unidade taxonômica, em que a maioria dos indivíduos se agrupou com as respectivas raças caprinas; no entanto, verifica-se intercâmbio entre indivíduos de algumas raças como Blanca Celtibérica, Blanca Andaluza, Malagueña, Serpentina, Serrana Azul e Graúna; possivelmente, estas raças apresentam alguns alelos em comum ou também podem existir animais dentro das raças caprinas citadas que não apresentam pureza racial. 104 Blanca Celtibérica Blanca Andaluza Murciana Granadina Malagueña Saanen Serpentina Palmera Tenerifeña Majorera Serrana Azul Graúna Marota Moxotó Canindé Repartida 0. Figura 3 – Dendrograma de indivíduos baseada pelo método de UPGMA. Figure 3 - Dendrogram of relations between individuals based on UPGMA method.. 105 As análises das relações genéticas entre populações podem ser representadas graficamente no espaço bidimensional canônico pela análise fatorial de correspondência, apresentadas na Figura 4. Serrana Azul Graúna Moxotó Repartida Marota Canindé Tenerifeña Majorera Palmera Serpentina Saanen Murciana-Granadina Malagueña Blanca Celtibérica Blanca Andaluza Figura 4 - Representação espacial das populações de cabras estudadas segundo a análise fatorial de correspondência. Figure 4 - Spatial representation of the studied goat populations using factorial correpondence analysis. 106 Os três eixos formados representam apenas 55% da variação total da análise de correspondência, porém, pode-se observar claramente a separação dos grupos, formada pelas cabras Ibéricas, Canárias e Brasileiras. E os resultados são semelhantes aos verificados pela árvore de distância genética pelo método de agrupamento de NJ, utilizada neste estudo. Pode-se verificar que, no grupo Ibérico, as raças Serpentina e Saanen apresentamse mais distantes das raças espanholas, e que há uma estreita relação genética entre as raças Malagueña, Murciana-Granadina, Blanca Celtibérica e Blanca Andaluza. Para raças Canárias, verifica-se uma maior afinidade genética entre as raças Tenerifeña e Palmera, enquanto que a raça Majorera encontra-se um pouco mais distante dentro deste grupo. As raças Brasileiras apresentaram claramente subgrupos distintos, o primeiro formado pelas raças Moxotó, Repartida e Canindé, e o segundo pelas raças Serrana Azul e Graúna. A raça Marota apresentou-se distinta das demais. 107 Conclusões As raças caprinas Ibéricas, Canárias e Brasileiras estudadas apresentam elevados níveis de variabilidade genética intra-racial. As raças caprinas Ibéricas e Canárias são as possíveis progenitoras das raças brasileiras, mas estas últimas apresentam uma identidade genética distinta das demais. A caracterização genética dos animais não deve ser baseada exclusivamente em caracteres morfológicos. Atualmente, os marcadores moleculares são ferramentas úteis para identificar e caracterizar a estrutura genética das populações. 108 Referências bibliográficas Araújo, A. M. Paternidade e diversidade genética em caprinos no Brasil por meio de microssatélites de DNA. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa. (2004). 90p. Tese (Doutorado em genética e melhoramento). Universidade Federal de Viçosa. 2004. 90p. Barker, J. S. F.; Tan, S. G.; Moore, S. S. et al. Genetic variation within and relationship among populations of Asian goats (Capra hircus). Journal of Animal Breeding Genetics, v. 118, p. 213-233, 2001. Belkhir, K. Genetix: Logiciel sous WindowsTM pour la génétique des populations, Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UPR 9060, 1999. Bowcock, A. M.; Ruiz-Linares, A.; Tomfohrde, J. et al. High resolution of human evolution with polymorphic microsatellites. Nature. (1994). v. 368, p. 455-457. 1994. Capote, J.; Arguello, A.; Lopez, J. L. et al. Introducción de caprinos en las islas Canarias y América: una visión desde punto de vista etnológico e histórico. In: XXVII JORNADAS CIENTÍFICAS Y VI JORNADAS INTERNACIONALES DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE OVINOTECNIA Y CAPRINOTECNIA. Valencia-ES. 2002. Anais... Valencia. 2002. Egito, A. A.; Mariante, A. S.; Albuquerque, M. S. M. Programa brasileiro de conservação de recursos genéticos animais, Archivos de Zootecnia, v. 51, p. 39-52, 2002. FAO. Secondary Guidelines for development of national farm animal genetic resources management plans: Management of small populations at site. Rome: FAO. 1998. 215 p. FAOSTATS. http://apps1.fao.org 2002. Felsestein, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.5c. University of Washington. 1995. Langela O. Populations 1.2.28 CNRS gif.fr/pge/bioinfo/populations/index.php , 1999. UPR9034 http://www.cnrs- Li, M. H.; Zhao, S. H.; Bian, C. et al. Genetic relationships among twelve Chinese indigenous goat populations based on microsatellite. Genet. Sel. Evol, v. 34, p. 729744, 2002. Luikart, G.; Gielly, L.; Excoffier, L. et al. Multiple maternal origins and weak phylogeographic structure in domestic goats. Pnas, v. 98, n. 10, p.5927-5932, 2001. Machado, M. A.; Schuster, I.; Martinez, M. L. et al. Genetic Diversity of Four Cattle Breeds Microsatellite Markers. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 32 , n.1, p.9398, 2003. Mariante, A. S. Situação atual da conservação de recursos genéticos animais no Brasil. In: SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE – SIRGEALC. 2. Brasília, Mesa redonda... Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 1999. 5p. CD-ROM. 109 Mariante, A. S.; Cavalcante, N. Animais do descobrimento Raças domésticas da história do Brasil. Brasilia- DF: EMBRAPA Sede/ EMBRAPA Recursos genéticos e Biotecnología. 2000. 232p.: il. Minch, E. MICROSAT Version 1.5b (Macintosh). University of Standford. Standford. 1998. Nei, M.; Tajima, F.; Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data. Journal of Molecular Evolution, v. 19, p.153-70, 1983. Oliveira, R. R. Caracterização genética de populações de caprinos da raça Moxotó usando marcadores moleculares, Areia-Paraíba: Centro de Ciências Agrárias, 2003. 59p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) – Centro de Ciências Agrárias/Universidade Federal da Paraíba. 2003. 59p. Page R.D.M. Tree drawing software for Apple Macintosh and Microsoft Windows. In: htpp://taxonomy.zoology.gla.uk/rod/rod.htlm. Divisiont of Enviromental and Evolutionary Biology, Institute of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow G128QQ, Scotland, UK. 1998. Paiva, S. R.; Silvério, V. C.; Egito, A. A. et al. Caracterização Genética da Raça Santa Inês, In: 2º SINCORTE, João Pessoa-PB. Anais... p. 487-499, 2004. Primo, A. T. Introdução de animais domésticos no novo mundo. In: II SIMPOSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINA E CARIBE – SIRGEALC. Brasilia, 1999. Procceding... Brasília, 1999. CD-ROM. Primo, A. T. El ganado bovino ibérico en las Américas: 500 años después. Archivos de Zootecnia, v. 41(extra), p. 421-432, 1992. Rodero, A.; Delgado, J. V.; Rodero, E. Primitive Andalusian livestoch and their implications in the discovery of America. Archivos de Zootecnia, v. 41(extra), p. 383-400, 1992. Saitbekova, N. ; Gaillard, C.; Ruff, G. O. et al. Genetic diversity in Swiss goat breeds based on microsatellite analysis, Animal Genetics, v. 30, p. 36-41, 1999. Yang, L.; Zhao S. H.; Li, K. ; et al. Determination of relationships among five indigenous Chinese goat breeds with six microsatellite markers. Animal Genetics, v. 30, p.452-456, 1999. Walsh, P. S.; Metzger, D. A.; Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for a simple extraction of DNA for PCR-based typins from forensic material. Biotecchniques, v. 10, p.506-513, 1991. Weir, B. S.; Cockerham, C. Estimating F-statistics for analysis of population structure. Evolution, v. 36, p.1358-1370, 1984. 110 Conclusões Gerais Os microssatélites podem ser utilizados em estudos de variabilidade genética das raças caprinas nativas brasileiras, auxiliando os programas de conservação de recursos genéticos do País. Os marcadores moleculares são ferramentas úteis para estabelecer a estrutura genética das populações e que a caracterização genética dos animais deve ser baseada em caracteres morfológicos associados à genética molecular. As raças caprinas brasileiras estudadas apresentam uma elevada variabilidade genética intra-racial. Porém, algumas raças necessitam de uma gestão de população eficiente para manter a variabilidade e evitar a erosão genética. Há pouca diferenciação genética entre as populações caprinas brasileiras estudadas; no entanto, são níveis aceitáveis de distância genética para espécie caprina e que podem ser consideradas raças geneticamente distintas. As raças caprinas nativas Ibéricas, Canárias e Brasileiras apresentaram níveis elevados de variabilidade genética intrapopulacional. As raças Ibéricas e Canárias são as possíveis progenitoras das raças caprinas nativas brasileiras, de acordo com a história do descobrimento das Américas, em que a maioria dos animais domésticos do Brasil foram trazidos pelos portugueses e espanhóis. Atualmente, as raças brasileiras apresentam uma identidade genética. Esses recursos genéticos são patrimônios genéticos distintos dos demais e devem ser conservados e utilizados como uma alternativa adequada à realidade do sistema de produção agropecuário da região Nordeste do Brasil. Diante destas conclusões, espera-se que este estudo possa contribuir com a sociedade, oferecendo aos criadores, técnicos e responsáveis políticos, valiosas informações sobre a origem e relações genéticas das raças caprinas nativas brasileiras. 111
