caracterização fisiológica de bactérias diazotróficas isoladas de

CARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS
ISOLADAS DE MILHO EM VITÓRIA DA CONQUISTA-BA
Santos, J. da S.1*; Sousa, F. G1.; De Oliveira, T. V.2; Moreira, G. L. P1.; Baldani, V. L. D3.;
Ferreira, J. S.4
1Universidade
Estadual do Sudoeste da Bahia - (UESB)
Estadual Norte Fluminense - (UENF)
3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA Agrobiologia.
4
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB.
2Universidade
*Autor de contacto: E-mail: [email protected] Estrada do Bem Querer, km 04, Caixa Postal 95, CEP 45083-900,
Vitória da Conquista, Bahia, Brasil. 55-77-3425-9380
RESUMO
Este trabalho teve o objetivo de avaliar as características fisiológicas de estirpes de bactérias
diazotróficas isoladas de planta de milho no município de Vitória da Conquista - BA. O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Foram testadas 32 bactérias
sendo, 30 isolados obtidos das plantas de milho e duas estirpes padrão, uma da espécie
Herbaspirillum seropedicae (estirpes ZAE94) e a outra espécie Azospirillum brasilense (estirpe Sp
245). Os testes foram realizados em condições in vitro no Laboratório da Embrapa Agrobiologia,
sendo feito três repetições para cada bactéria utilizada. Das 30 estirpes isoladas, somente três
não apresentaram taxa na atividade de redução de acetileno. Todos os isolados expressaram
valores de síntese de ácido indol acético. Nenhuma das estirpes isoladas apresentou habilidade
para solubilizar fosfato. A estirpe N15 apresentou a maior atividade de redução de acetileno. As
estirpes N13 e ZAE94 de H. seropedicae apresentaram as maiores valores de síntese de ácido
indol acético. As estirpes nativas N15 e N13 demostraram resultados promissores, com potencial
para serem utilizadas na inoculação de plantas de milho.
PALAVRAS-CHAVE
Bactérias Diazotróficas; FBN; Estirpes Nativas.
INTRODUÇÃO
Nos últimos anos a busca por tecnologias que visem favorecer a sustentabilidade da produção
agrícola tem sido almejada, como a redução do consumo de fertilizantes químicos e da poluição
ambiental. Dentre os adubos químicos, os nitrogenados são aplicados em maiores quantidades
nas culturas anuais. Dessa forma, processos biológicos que permitam reduzir a dependência por
insumos químicos como a fixação biológica de nitrogênio (FBN) realizada por procariotos
diazotróficos vem sendo amplamente estudados.
Nesse sentido, a associação de cereais e gramíneas com bactérias diazotróficas endofíticas pode
representar uma das alternativas mais promissoras para promoção do crescimento de plantas,
manejo do solo e qualidade ambiental (Roesch et al. 2007).
Entretanto, a perda de diversidade de microrganismos do solo, principalmente dos diazotróficos,
pode alterar a estrutura populacional de outros organismos situados ao longo da cadeia trófica.
Processos vitais do solo como a decomposição de matéria orgânica e a ciclagem de nutrientes,
podem sofrer impactos levando o sistema agrícola à maior dependência por fertilizantes (Moreira
et al. 2010).
Assim, o isolamento e a seleção de bactérias diazotróficas in loco desenvolvem o conhecimento
da interação bactéria-genótipo permitindo obter melhores resultados na eficiência da FBN e
produtividade das plantas. Diante do atual cenário, vem se buscando a utilização de práticas
agrícolas que reduzam os custos de produção, e sua aplicação em diversas regiões do país.
Nesse sentido, a utilização de microrganismos diazotróficos vem sendo investigada em diversas
culturas de grande importância comercial como o milho, trigo, arroz, cana-de-açúcar, sorgo dentre
outras. Dessa forma, a aplicação de novas técnicas biotecnológicas de fácil acesso ao pequeno
produtor pode contribuir para um maior rendimento na agricultura familiar e comercial, em todas
as regiões, sobretudo no nordeste do Brasil. Diante desse contexto, este estudo teve como
objetivo avaliar as características fisiológicas de bactérias diazotróficas isoladas de plantas de
milho cultivada no município de Vitória da Conquista - Bahia.
MATERIAIS E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no laboratório de gramíneas da EMBRAPA Agrobiologia, situado em
Seropédica – RJ. As plantas de milho cultivar AG 1051 foram cultivadas em vasos com
capacidade para 9 dm3 de solo que foi retirado da camada 0 - 20 cm do horizonte A de um
Latossolo Amarelo, coletado no campo experimental da Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia - UESB, em Vitória da Conquista, localizada na região Sudoeste do Estado da Bahia, tendo
928 metros de altitude média e com precipitação total anual é de 750 mm (BRASIL, 1992).
Foram utilizados cinco vasos para o cultivo do milho, semeando quatro sementes por recipiente.
Aos 18 dias após a emergência foi realizado o desbaste mantendo duas plantas por vaso. As
plantas foram coletadas aos 45 dias após a emergência e transportadas para a EMBRAPA
Agrobiologia. Para o isolamento das bactérias diazotróficas, o material vegetal foi fragmentado
parte aérea (colmo e folhas) e raízes de plantas de milho. Para a inoculação foram utilizados os
meios de cultura semi-sólidos e semi-específicos NFb, JNFb, JMV e LGI para Azospirillum sp.,
Herbaspirillum sp., Burkholderia sp. e Azospirillumamazonense, respectivamente, conforme
metodologia descrita por Döbereiner et al. (1995).
Após a obtenção de isolados purificados foram realizadas as caracterizações fisiológicas para
determinação da atividade de redução do acetileno (ARA), síntese de ácido indol acético (AIA) e
solubilização de fosfato. A ARA foi realizada conforme Boddey et al. (1987) e Bradford (1976), a
AIA desenvolvida de acordo Sarwar e Kremer (1995) e a solubilização de fosfato conforme
Nautiyal et al. (1999). O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente ao acaso, com 32
bactérias (30 isolados nativos e 2 padrões) com três repetições. Para a análise estatística, utilizouse o programa Sisvar 5.0. (FERREIRA, 2003). Os dados obtidos foram submetidos à teste de
homogeneidade e normalidade e análise de variância e as médias comparadas pelo teste de
Skott-Knott a 5% de significância.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram isolados bactérias nos meios NFb, JNFb e LGI. No meio JMV não houve formação de
películas característica. Entretanto, as bactérias estocadas do meio LGI não foi possível reativálas. Dessa forma, foi possível testar 15 isolados do meio NFb e 15 isolados do meio JNFb, além
de duas estirpes padrão Sp 245 (Azospirillum brasilense) e ZAE94 (Herbaspirillum seropedicae).
Os resultados de ARA e AIA para os isolados nos meios NFb e JNFb são demonstrados na
Tabela 1.
Tabela 1. Atividade de redução de acetileno (ARA), síntese de ácido indol acético (AIA) por estirpes nativas isoladas de
plantas de milho AG 1051 e bactérias padrão.
Isolados
ARA
AIA
mmol h-1 mg-1
proteína
ug mg-1
Parte da planta
Meio de cultura
proteína
N1
1,7084 c
5,3923 d
Raiz
NFb
N2
2,1438 c
5,5390 d
Raiz
NFb
N3
1,3153 c
6,5483 c
Raiz
NFb
N4
2,1017 b
2,9423 e
Raiz
NFb
N5
0,0428 c
1,2343 e
Parte aérea
NFb
N6
Nda
1,9773 e
Parte aérea
NFb
N7
2,8579 b
7,0870 c
Raiz
NFb
N8
2,6939 b
6,7760 c
Parte aérea
NFb
N9
2,7339 b
7,3426 c
Parte aérea
NFb
N10
1,5782 c
4,5596 d
Parte aérea
NFb
N11
Nd
15,6496 d
Parte aérea
NFb
N12
0,9145 c
11,7833 b
Raiz
NFb
N13
2,3515 b
14,2116 a
Raiz
NFb
N14
0,3577 c
9,5226 b
Raiz
NFb
N15
4,3543 a
3,6013 e
Raiz
NFb
J1
0,8599 c
5,9120 d
Raiz
JNFb
J2
0,8894 c
6,5533 c
Raiz
JNFb
J3
Nd
0,2686 e
Raiz
JNFb
J4
0,8643 c
8,6676 c
Parte aérea
JNFb
J5
0,7939 c
5,3703 d
Raiz
JNFb
J6
1,2948 c
5,8583 d
Raiz
JNFb
J7
0,8713 c
6,9230 c
Raiz
JNFb
J8
1,0889 c
9,7990 b
Raiz
JNFb
J9
0,7362 c
11,2463 b
Raiz
JNFb
J10
1,0767 c
6,4453 c
Raiz
JNFb
J11
0,9493 c
8,4286 c
Raiz
JNFb
Continuação…
J12
0,8922 c
5,8163 d
Raiz
JNFb
J13
0,7470 c
4,3853 d
Raiz
JNFb
J14
0,6195 c
4,9546 d
Raiz
JNFb
J15
0,7288 c
7,7493 c
Raiz
JNFb
Sp 245
0,6431 c
-
Padrão
NFb
ZAE 94
-
15,7853 a
Padrão
JNFb
Letras iguais na mesma coluna não diferem significativamente, entre si, pelo teste Skott-Knott a 5% de significancia. Nd
= não detectado.
Das 30 estirpes isoladas, apenas sete foram isoladas da parte aérea da planta. Este fato
demonstra que a maior população de bactérias diazotróficas são encontradas nas raízes.
Nas condições testadas os isolados similares ao gênero Herbaspirillum sp, obtiveram valores de
ARA entre 0,6196 a 1,2949 nmolC2H4/h/mg de proteína. Já os similares ao gênero Azospirillum os
valores variaram entre 0,013 a 4,354 nmolC2H4/h/mg de proteína.
Das estirpes similares ao gênero Hesbaspirillum sp, destacaram-se os isolados J06, J08 e J10.
Entre os similares ao gênero Azospirillum sp, a estirpe N15 apresentou a maior ARA em
comparação com as outras bactérias. Os isolados N4, N7, N8, N9 e N13 foram inferiores a N15,
entretanto superiores as demais. A N15 apresentou o maior potencial para contribuição de FBN
em condições in vitro.
Estudando a capacidade da ARA de bactérias isoladas de plantas de milho PEDRINHO (2009),
obteve valores de ARA entre 0,1 a 0,64 nmol C2H4 cultura-1h-1, de bactérias dos gêneros
Pseudomonas sp, Herbaspirillum sp, Burkholderia sp e Sphingomonas sp.
É comum notar na literatura uma grande variabilidade na atividade da enzima nitrogenase pela
técnica da ARA. Uma vez que, essa técnica possui uma metodologia simples e apresenta uma
alta sensibilidade para detectar a atividade da enzima nitrogenase, representando assim um forte
indício da contribuição da FBN para os vegetais. As bactérias isoladas neste trabalho por serem
nativas podem apresentar maior interação com as plantas de milho cultivadas in loco, permitindo
maior contribuição da FBN para a cultura.
Quanto a AIA, nas condições testadas todos os isolados foram capazes de produzir ácido indol
acético, pelo método colorimétrico de Salkowski. A produção de AIA dos isolados similares ao
gênero Herbaspirillum sp, variaram entre 0,269 a 11,246 μg AIA mg proteína-1. Entre os isolados
similares ao gênero Azospirillum sp., os valores variaram entre 1,234 a 15,649 μg AIA mg
proteína-1. Os isolados N11 e N13 e a estirpe padrão Herbaspirillum seropedicae ZAE94 foram
superiores as demais. As estirpes N14, J8 e J9 foram inferiores a N13 e ZAE94, entretanto
superiores as demais.
Estes resultados demonstram a importância de isolar novas estirpes em ambientes novos,
possibilitando a descoberta de isolados que apresentem potencial para inoculação nas culturas
anuais. A espécie H.seropedicae estirpe ZAE94 foi testada em vários ambientes e culturas,
apresentando resultados promissores para produção de inoculante comercial.
Dentre as diversas espécies de Bactérias diazotróficas, Herbaspirillum seropedicae trouxe nova
dimensão aos estudos das associações dos microrganismos com as plantas não leguminosas, já
que tem maior especificidade de interação com as plantas, uma vez que são endófitos obrigatórios
com baixa sobrevivência no solo (Baldani et al. 1987).
Nesse sentido, a estirpe N13 e J10 que apresentam alta taxa de AIA e ARA, respectivamente,
podem possibilitar resultados promissores na cultura do milho. O AIA é essencial para promover a
divisão das células meristemáticas na parte aérea e nas raízes, favorecendo o crescimento da
planta.
Nenhuma das estirpes isoladas apresentaram habilidade para solubilizar fosfato.
CONCLUSÕES
No isolamento foram obtidos 30 isolados diazotróficos provavelmente pertencentes aos gêneros
ou espécies de Herbaspirillum e Azospirillum, e apresentaram portencial diferenciado nas
variáveis testadas.
Dentre os isolados obtidos as estirpes N15, N13 e J10 demostraram resultados promissores, com
potencial para serem utilizadas na inoculação de plantas de milho.
AGRADECIMENTOS
A Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – (UESB), ao Programa de Pós-Graduação da
Agronomia, a UESB pela concessão da bolsa e a Embrapa Agrobiologia pelo apoio no
desenvolvimento desse trabalho de pesquisa.
REFERÊNCIAS
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CRC Criticas Rewiews in Plant Science, Boca Raton 6:209-266.
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MA/SNI/INMET, 1992. 84 p.
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