efeito do gossipol sobre o desenvolvimento embrionário inicial em

Anais do VII CONERA – Biotécnicas Fundamentais
Acta Veterinaria Brasilica, v.8, Supl. 2, 2014
EFEITO DO GOSSIPOL SOBRE O DESENVOLVIMENTO
EMBRIONÁRIO INICIAL EM CAMUNDONGOS FÊMEAS
[Effect of gossypol on early embryonic development in female mice]
Valesca Barreto Luz1*, Ivana Cristina Lelis Gadelha2, Benito Soto-blanco5, Mikael Almeida Lima3,
Marcelo Barbosa Bezerra4, Luiz Augusto Vieira Cordeiro4
1
Bolsista PNPD-CAPES. *Autor para correspondência. E-mail: [email protected].
Aluna de pós graduação da Universidade Federal Rural do Semi-Árido.
3
Aluno de graduação da Universidade Federal Rural do Semi-Árido.
4
Professor da Universidade Federal Rural do Semi-Árido.
5
Professor Adjunto II da Universidade Federal Minas Gerais.
2
ABSTRACT: It is known that some plant toxins affect the reproductive performance of females among these
stands out gossypol. This study aimed to determine whether gossypol affects the survival of mouse embryos.
Embryos derived from superovulated nulliparous females were cultured in HTF medium microdroplets (30 µl)
supplemented with 10 µg/ml of gossypol (10% of total medium) and 10% fetal bovine serum in 5% CO2 at 37
ºC for 24 hours. Another group without gossypol were performed, named as control. After the cultivation, the
embryos were incubated for 15 minutes in 100 µL solution of a Lucifer Yellow, Calcein and Hoechst fluorescent
dye. The embryos from gossypol incubated group showed disuniform and degenerated blastomeres. In
conclusion, gossypol (10 µg / ml) affects embryonic survival and cell viability of female mice.
Keywords: gossypol; embryo toxicity; female mice.
Palavras-Chave: gossipol; toxicidade embrionária; camundongos fêmeas.
INTRODUÇÃO
O resíduo da extração do óleo do algodão é um
importante alimento para animais, por ser uma
fonte de proteína de alta qualidade e de outros
componentes importantes, como o cálcio, fósforo,
ferro e vitaminas, além do seu valor energético. No
entanto, estes subprodutos possuem um fator
antinutricional, o gossipol. Este é um pigmento
fenólico de coloração amarelada, produzido pelas
glândulas de pigmento encontradas nas raízes, talos,
folhas e sementes das plantas pertencentes ao
gênero Gossypium. Os efeitos do gossipol são
cumulativos, e podem surgir abruptamente após um
período variável de ingestão. Especificamente sobre
a reprodução animal seus efeitos incluem a redução
na qualidade do sêmen, interferência no ciclo estral
das fêmeas e interrupção do desenvolvimento
embrionário precoce (Soto-Blanco et al., 2008).
Além disso, o gossipol reduz a ovulação e a
concentração
de
progesterona
circulante,
provavelmente devido à capacidade dessas toxinas
de inibir a resposta dos ovários às gonadotrofinas
hipofisárias (Soto-Blanco et al., 2008; Gadelha et
al., 2011). Apesar destes estudos, ainda não foi
verificado se o gossipol afeta o desenvolvimento de
embriões de camundongos fêmeas cultivados in
vitro. Portanto, o objetivo deste trabalho foi
verificar o efeito do gossipol sobre o
desenvolvimento in vitro de embriões de
camundongos fêmeas.
MATERIAL E MÉTODOS
Para tanto, fêmeas nulíparas foram anteriormente
superovuladas, utilizando-se o seguinte protocolo:
20 UI de gonadrotrofina coriônica equina (eCG).
Em seguida, 48 a 52 horas após, 20UI de
gonadotrofina coriônica humana (hCG), ambas
administradas intraperitonealmente. Imediatamente
após a administração de hCG, as fêmeas foram
alojadas nas gaiolas dos machos na proporção de
1:1. Na manhã seguinte, as fêmeas que
apresentavam espermatozóides no lavado vaginal
foram consideradas prenhes e no dia 0 da gestação
(D0). No dia 2 (D2), as fêmeas prenhes foram
anestesiadas (xilazina e quetamina) e sacrificadas
por deslocamento cervical para a colheita de
embriões nas fases de 2-8 células. Após necropsia
para remoção das tubas, estas foram imersas em
meio Human Tubal Fluid modificado (HTFm) com
25mM HEPES e 20% soro fetal bovino (SFB). Os
embriões foram retirados da tuba por meio de
lavagens sequenciais com o auxílio de uma seringa
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de 5 mL acoplada a agulha 30G contendo meio de
cultura HTFm suplementado com SBF e HEPES. O
líquido perfundido pelas tubas foi recolhido em
placas de Petri de 60x10 mm estéreis e examinado
sob microscopia de luz invertida, para a seleção e
coleta dos embriões. Os embriões selecionados
quanto ao número de blastômeros e qualidade
morfológica de suas células, foram transferidos
para novo meio de cultivo HTF sem HEPES
suplementado com 10% de soro fetal bovino. Para o
cultivo, lotes de 3 embriões foram recolhidos e
depositados em microgotas (30 µl) de meio
suplementado em placas de 35x10 mm. Foram
testadas para nesses embriões somente o meio sem
a adição de gossipol (grupo controle), e a
concentração 10 µg/ml de gossipol (grupo gossipol)
adicionada à gota. Estas gotas, foram imersas em
óleo mineral e cultivados em estufa com 5% de CO2
a 37 °C, por 24 horas. Após o cultivo, os embriões
foram incubados por 15 minutos em gotas de 100 µl
com os fluoróforos Yellow Lucifer (90 µl) e
Calceína (5 µl) para a detecção de membranas
rompidas, e de células em processo de morte
celular, respectivamente. Além disso, foi utilizado o
corante Hoechst 33342 (5 µl) para verificar a
configuração da cromatina.
(2008) também observaram que o gossipol afetou o
desenvolvimento embrionário de vacas leiteiras
tanto in vivo como in vitro após o consumo deste
presente no algodão pima (Gossypium barbadense).
Outro estudo mostrou, que novilhas alimentadas
com gossipol possuíam menos blastômeros e o
tempo de desenvolvimento destes era mais
prolongado, comprovando sua ação tóxica
embrionária (Lin et al., 1994).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Evidenciou-se a presença de blastômeros nos
embriões incubados e corados do grupo controle,
sendo visualizadas também as cromatinas. No
grupo tratamento (10 µg/ml de gossipol) os
embriões corados apresentaram blastômeros
morfologicamente irregulares e degenerados,
tipicamente característicos do padrão necrótico.
Não foi observada condensação da cromatina e
formação dos corpos apoptóticos, descartando desta
forma a possibilidade de um processo apoptótico.
Semelhante ao presente trabalho, Villaseñor et al.
CONCLUSÃO
O gossipol (10 µg/ml) afeta a viabilidade e a
sobrevivência de embriões de camundongos
fêmeas.
AGRADECIMENTOS
Ao técnico Francisco Alexandre de Araújo Almeida
e a doutoranda Gabriela Liberalino Lima pelo
suporte técnico.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Gadelha, I. C. N.; Nascimento, A. H.; Rangel, A.H.N.; Silva, A.
R.; Soto-Blanco B. Efeitos do gossipol na reprodução animal.
Acta Veterinaria Brasilica, v.5, n. 2, p.129-135, 2011.
Soto-Blanco, B. Gossipol e fatores anti-nutricionais da soja. In:
SPINOSA, H. S.; GÓRNIAK, S.L.; PALERMO NETO, J. (eds.)
Toxicologia aplicada à veterinária. São Paulo: Manole, 2008. p.
531-545.
Lin, Y. C.; Coskun, S.; Sanbuissho, A. Effects of in vitro bovine
oocyte maturation and steroidogenesis in bovine granulosa cells.
Theriogenology, v. 41, p. 1601-1611, 1994.
Villaseñor, M.; Coscioni, A.C.; Galva, K. N.; Chebel, R. C.;
Santos, J. E. P. Gossypol disrupts embryo development in
heifers. Journal of Dairy Science, v. 91, p. 3015-3024, 2008.
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