efeito do gossipol sobre o desenvolvimento embrionário precoce

Anais do VII CONERA – Biotécnicas Fundamentais
Acta Veterinaria Brasilica, v.8, Supl. 2, 2014
EFEITO DO GOSSIPOL SOBRE O DESENVOLVIMENTO
EMBRIONÁRIO PRECOCE EM RATAS
[Effect of gossypol on early embryonic development in rats]
Ivana Cristina Nunes Gadelha1*, Valesca Barreto Luz2, Luiz Augusto Vieira Cordeiro3, Nayanna Brunna
da Silva Fonsêca1, Michelly Fernandes de Macêdo3, Benito Soto-Blanco4
1
Aluno de pós graduação da Universidade Federal Rural do Semi-Árido. *Autor para correspondência. E-mail:
[email protected].
2
Bolsista PNPD-CAPES.
3
Professor (a) da Universidade Federal Rural do Semi-Árido.
4
Professor Adjunto II da Universidade Federal Minas Gerais.
ABSTRACT-The toxic effects of gossypol causes a decline in reproductive performance in both males and
females of various animal species. This study aimed to determine whether gossypol affects the survival of mouse
embryos. Embryos derived from superovulated nulliparous females were cultured in HTF medium microdroplets
(30 µl) supplemented with 10 µg/ml of gossypol (10% of total medium) and 10% fetal bovine serum in 5% CO2
at 37 ºC for 24 hours. Another group without gossypol were performed, named as control. After the cultivation,
the embryos were incubated for 15 minutes in 100 µL solution of a Lucifer Yellow, Calcein and Hoechst
fluorescent dye. The embryos from gossypol incubated groupshowed necrotic pattern, indicating a relation
between gossypol dose/effect damaging the rat embryo survival.
Keywords: gossypol; embryo; toxicity.
Palavras-Chave: gossipol; embrião; toxicidade.
INTRODUÇÃO
MATERIAL E MÉTODOS
O gossipol é um pigmento amarelo presente em
plantas da família Malvaciae, especialmente nas
sementes das plantas do gênero Gossypium. Na
alimentação animal, o farelo e a torta (resultante da
prensa da semente do algodão), representa a
segunda fonte de proteína para a alimentação
animal. Já foi verificado que os efeitos tóxicos do
gossipol representam um declínio no desempenho
reprodutivo, tanto em machos como em fêmeas de
várias espécies animais. Em fêmeas os efeitos
metabólicos incluem anorexia, redução da taxa de
crescimento, aumento dos níveis séricos de FSH,
aumento de LH, redução de estrógeno, redução de
progesterona, aumento do tempo do ciclo estral,
ciclos estrais irregulares (Adams, 1995; Gadelha et
al., 2011, Gu et al, 1990; Soto-Blanco, 2008). No
entanto, ainda não foram verificados seus efeitos
nocivos em embriões de ratas, modelo experimental
de escolha por homologia à fisiologia humana.
Foram utilizadas seis fêmeas nulíparas Wistar,
previamente superovuladas com 40 UI de
gonadrotrofina coriônica equina e 40UI de
gonadotrofina coriônica humana, após 48 a 52
horas,
administradas
intraperitonealmente.
Imediatamente após a administração de hCG, as
fêmeas foram alojadas nas gaiolas dos machos na
proporção de 1:1. Na manhã seguinte, as fêmeas
que apresentavam espermatozóides no lavado
vaginal foram consideradas prenhes e no dia 0 da
gestação (D0). No dia 2 (D2), as fêmeas prenhes
foram anestesiadas (xilazina e quetamina), as tubas
uterinas foram removidas por laparotomia e
imediatamente imersas em meio Human Tubal
Fluid modificado (HTFm) com 25mM HEPES e
20% soro bovino fetal, para a colheita de embriões
nas fases de 2-8 células e em seguida, sacrificadas
por deslocamento cervical.
Diante disto, este trabalho teve por objetivo
verificar se o gossipol afeta a integridade e a
viabilidade celular em embriões de ratas.
Os embriões foram retirados da tuba por meio de
lavagens sequenciais com o auxílio de uma seringa
de 5mL acoplada a uma agulha 30G – BD contendo
meio de cultura HTF suplementado com SBF e
HEPES. O líquido perfundido pelas tubas foi
recolhido em placas de Petri de 60X10 mm estéreis
e examinado sob microscopia de luz invertida, para
70
Anais do VII CONERA – Biotécnicas Fundamentais
a seleção e coleta dos embriões. Os embriões
selecionados quanto ao número de blastômeros e
qualidade morfológica de suas células, foram
transferidos para novo meio de cultivo HTF sem
HEPES suplementado com 10% de soro fetal
bovino. Para o cultivo, lotes de 3 embriões foram
recolhidos e depositados em microgotas (30 µl) de
meio suplementado em placas de 35 x 10 mm.
Foram testadas para essa espécie somente o meio
constituindo o grupo controle e a concentração de
gossipol a 10% (SIGMA) adicionada a gota. Estas
gotas foram imersas em óleo mineral e cultivados
em estufa com 5% de CO2 a 37°C, por 24 horas.
Após o cultivo, os embriões foram incubados por
15 minutos em gotas de 100 µl com os fluoróforos
Yellow Lucifer (90 µl) e Calceína (5 µl) para a
detecção de membranas rompidas, e de células em
processo de morte celular, respectivamente. Além
disso, foi utilizado o corante Hoechst 33342 (5 µl)
para verificar a para evidenciar ácidos nucleicos.
Acta Veterinaria Brasilica, v.8, Supl. 2, 2014
barbadense) por vacas leiteiras reduziu
desenvolvimento de embriões in vivo e in vitro.
o
CONCLUSÕES
Este trabalho evidenciou o efeito deletério do
gossipol na performance reprodutiva dos animais,
afetando a viabilidade e a sobrevivência dos
embriões de ratas, o que pode ser uma evidência de
uma ação similar em humanos e que deve ser mais
profundamente explorado.
AGRADECIMENTOS
Ao técnico Francisco Alexandre de Araújo Almeida
e a doutoranda Gabriela Liberalino Lima pelo
suporte técnico e Kizzy Millenn de Freitas
Mendonça Costa responsável pelo Biotério de ratas
da Universidade do Estado do Rio Grande do
Norte.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Os cinco embriões do grupo controle, incubados e
corados apresentaram evidência dos padrões dos
blastômeros, sendo visualizadas também as
cromatinas,
desta
forma,
os
embriões
apresentavam-se normais. No grupo incubado na
presença de gossipol 10% (4 embriões), podemos
observar que todos os embriões sofreram
degeneração, apresentando padrões necróticos. Não
foram observadas outras alterações como
relacionadas à apoptose como formação de
blebbings, apenas o padrão típico de degeneração
da organização morfológica e lise celular,
condizentes com o processo necrótico. Nossos
resultados estão de acordo com os de Villaseñor et
al., 2008 os quais verificaram que o consumo de
gossipol presente no algodão pima (Gossypium
Adams, N. R. Detection of the effects of phytoestrogens on
sheep and cattle. Journal of Animal Science, v.73, p.1509-1515,
1995.
Gadelha, I. C. N.; Nascimento, A. H.; Rangel, A.H.N.; Silva, A.
R.; Soto-Blanco B. Efeitos do gossipol na reprodução animal.
Acta Veterinaria Brasilica, v.5, n. 2, p.129-135, 2011.
Gu, Y.; Lin. Y. C.; Rikihisa, Y. Inhibitory effect of gossypol
steroidogenesis pathways in cultured bovine and luteal cells.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 169,
1990.
Soto-Blanco, B. Gossipol e fatores anti-nutricionais da soja. In:
SPINOSA, H. S.; GÓRNIAK, S.L.; PALERMO NETO, J. (eds.)
Toxicologia aplicada à veterinária. São Paulo: Manole, p. 531545, 2008.
Villaseñor, M.; Coscioni, A.C.; Galva, K. N.; Chebel, R. C.;
Santos, J. E. P. Gossypol disrupts embryo development in
heifers. Journal of Dairy Science, v. 91, p.3015-3024, 2008.
71