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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
NATÁLIA CASSETTARI DE CARVALHO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E ANTIGENOTÓXICO
DE Melissa officinalis
CRICIÚMA, JUNHO DE 2009.
NATÁLIA CASSETTARI DE CARVALHO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E ANTIGENOTÓXICO
DE Melissa officinalis
Projeto de trabalho de conclusão de curso,
apresentado para o curso de Farmácia da
Universidade
do
Extremo
Sul
Catarinense,
UNESC.
Orientador (a): Profª. Dra. Vanessa Moraes de
Andrade.
CRICIÚMA, JUNHO DE 2009.
1 INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais é uma prática generalizada na medicina
popular. É o resultado do acúmulo secular de conhecimentos empíricos sobre a
ação dos vegetais por diversos grupos étnicos (Simões et al., 1998).
Atualmente o Brasil é um dos países com maior diversidade genética
vegetal, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas, sendo assim a maior
cobertura vegetal em todo o globo (Corrêa, 2002).
No Brasil, a utilização de plantas medicinais teve origem na cultura dos
diversos grupos indígenas, como por exemplo, o jaborandi (Pilocarpus spp) e o
guaraná (Paullinia cupana). Muitas outras plantas foram trazidas pelos europeus,
como a camomila (Matricaria chamomila) a malva (Malva sylvestris) e a melissa
(Melissa officinalis); ou ainda aproveitadas de culturas de outros países sulamericanos, como o boldo (Peumus boldus) (Simões et al., 1998).
As plantas medicinais e suas formas derivadas (extratos, xaropes, etc.)
constituíram durante séculos a base da medicina terapêutica. O emprego correto de
plantas para estes fins pela população em geral, requer o uso de plantas medicinais
selecionadas por sua eficácia e segurança terapêutica, baseadas na tradição
popular ou cientificamente validadas como medicinais (Lorenzi e Matos, 2002).
A Organização Mundial da Saúde, desde 1977, tem encorajado o estudo
de plantas tradicionais com esperança de obter os benefícios que isso poderia
possivelmente fornecer, como evitar o uso irracional ou prejudicial destas plantas. E
esta havendo um grande interesse científico pelo desenvolvimento da pesquisa de
plantas utilizadas na medicina popular (Simões et al., 1998).
Recentemente interesses em compostos terapêuticos planta-específicos
têm sido reforçados devido aos conhecimentos de que químicos como proteases e
antioxidantes podem prevenir ou reduzir o desenvolvimento de câncer por
bloquearem o dano genético (Berhow et al., 2000; Hernández-Cereuelos et al., 2002;
de Souza et al., 2004).
Sabe-se que o excesso de espécies reativas de oxigênio pode levar ao
estresse oxidativo, resultando dessa forma em um dano oxidativo no DNA o qual
pode ser um grande fator de contribuição para o desenvolvimento de câncer
(Burcham, 1999).
Sistemas enzimáticos e não enzimáticos podem detoxificar esse excesso
de espécies reativas de oxigênio, modulando alguns dos seus efeitos deletérios. Por
outro lado, muitos compostos vegetais protegem contra xenobióticos tanto por
induzirem enzimas detoxificadoras, quanto por inibirem enzimas oxidativas (BellóKlein, 2002).
Muitos agentes potencialmente carcinógenos estão presentes na dieta
humana, e devido ao seu grande número e grande variedade, ele apenas podem ser
evitados em teoria. Uma estratégia alternativa atualmente utilizada é consumir
agentes anti-carcinógenos/ antigenotóxicos que podem prevenir ou reverter alguns
dos efeitos produzidos pelos carcinógenos. Contudo, o conhecimento dos
mecanismos específicos de ação de muitos anticarcinógenos, por exemplo,
fitoquímicos, ainda é pobre (Paolini & Nestlé, 2003).
Sabe-se que no Brasil as preparações usuais de plantas medicinais são
os chás ou infusões (Lorenzi & Matos, 2002). No entanto, pouco se sabe a respeito
do possível papel antigenotóxico destas plantas ingeridas desta forma.
Avaliar o papel antigenotóxico de extratos de plantas, de infusões e dos
principais componentes fitoquímicos é de suma importância, visto que substâncias
antimutagênicas presentes em algumas plantas já mostraram ajudar na prevenção
de câncer e outras doenças (Nishino, 1998; Berhow et al., 2000, Surh & Ferguson,
2003, Patel et al., 2007). Assim, estudos de genotoxicidade e antigenotoxicidade
podem ajudar a avaliar a segurança e a efetividade de muitas plantas utilizadas na
medicina popular.
Melissa officinalis, também conhecida como erva-cidreira, é uma planta
usada como aromatizante de alimentos e para fins medicinais. As suas folhas e
inflorescências são empregadas na forma de chá como calmante nos casos de
ansiedade e insônia e também como medicação contra cefaléias, enxaqueca,
problemas digestivos, dores de origem reumática e para normalizar as funções
gastrintestinais (Simões et al., 1998; Lorenzi e Matos, 2002).
Na sua composição química é registrada a presença de óleo essencial e
taninos, além de ácidos triterpenóides e flavonóides. Os taninos são derivados dos
ácidos rosmarínico e cafeico (Simões et al., 1998; Lorenzi e Matos, 2002).
Seu óleo essencial submetido a ensaios farmacológicos demonstrou ser
um bom agente antibacteriano e antifúngico (Mimica-Dukic et al., 2004) e é também,
o responsável pela propriedade ansiolítica atribuída a esta planta (Pereira et al.,
2005). Alguns trabalhos da literatura têm sugerido propriedades antioxidantes e
antitumorais
da
melissa,
trabalhos
estes
também
relacionados
aos
seus
componentes principais e não a extratos ou infusões (De Souza et al., 2004; Pereira
et al., 2005).
A respeito das propriedades antigenotóxicas desta planta, até o presente
momento nenhum dado foi publicado na literatura. Somente Pereira e colaboradores
(2005) trabalhando com o ácido rosmarínico demonstraram que em baixas doses
este composto não foi capaz de causar danos no DNA de cérebro de ratos expostos.
Avaliar o papel antigenotóxico de extratos de plantas, de infusões e dos
principais componentes fitoquímicos é de suma importância, visto que substâncias
antimutagênicas presentes em algumas plantas já mostraram ajudar na prevenção
de câncer e outras doenças (Nishino, 1998; Berhow et al., 2000, Patel et al., 2007).
Sendo assim, podemos observar uma escassez acerca dos estudos em
nível genético com esta planta medicinal bem utilizada na nossa medicina popular.
Vale ressaltar ainda que muitos estudos consideram apenas os efeitos de
fitoquímicos isoladamente e de misturas totais em testes in vitro. Na maioria dos
casos a ação antimutagênica atribuída a algumas plantas deve-se na verdade a
alguns compostos presentes nelas, principalmente flavonóides (Czeczot &
Kusztelak, 1993; Hernandez-Ceruelos et al., 2002; Gomes-Carneiro et al., 2005).
Contudo, existem poucos dados referentes à ação de misturas complexas como
infusões ou sucos de vegetais e frutas. É de grande importância considerar as
misturas complexas, uma vez que, é a forma predominante de ingestão em seres
humanos. Estes estudos controversos de genotoxicidade e ação anticarcinogênica
de flavonóides e de extratos de plantas compostos por muitos químicos justificam o
presente estudo, onde se pretende elucidar os mecanismos e as condições que
mediam os efeitos biológicos dos extratos de plantas antes de considerá-los agentes
terapêuticos.
Os testes citogenéticos in vitro e in vivo, juntamente com os testes de
mutação gênica em bactérias (teste de Ames) e em células de mamíferos têm
fornecido informações primárias fundamentais para o estabelecimento do potencial
mutagênico de agentes químicos e físicos, bem como, do potencial antimutagênico
de muitos compostos naturais. O estudo de danos no DNA em nível cromossômico é
uma parte essencial da Genética Toxicológica, uma vez que a mutação
cromossômica é um evento importante na carcinogênese (Albertini et al., 2000).
O Ensaio Cometa vem sendo proposto para estudos de toxicogenética
devido a suas peculiaridades e vantagens quando comparado a outros testes para
detecção de substâncias genotóxicas. Ele combina a simplicidade da técnica
bioquímica de detecção de quebras no DNA com a utilização de poucas células e
corresponde a um ensaio citogenético. As vantagens dessa técnica incluem a
sensibilidade na detecção de dano no DNA; a coleta de dados em nível de célula
individual; o uso de um número pequeno de células para a análise e a possibilidade
de aplicação em qualquer população de células eucarióticas; e principalmente a
rapidez de resultados (importante para diagnósticos clínicos) (Burlinson et al., 2007).
O Ensaio Cometa não é utilizado para detectar mutações, mas sim lesões
genômicas que, após serem processadas, podem resultar em mutação. Diferente
das mutações, as lesões detectadas pelo Ensaio Cometa são passíveis de correção.
Assim sendo, o Ensaio Cometa pode ser também utilizado para estudos de reparo
do DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão
reparada, embora não possibilite inferir a fidedignidade do processo de reparo
(Albertini et al., 2000).
A técnica do Ensaio Cometa consiste em obter, a partir de células
individualizadas, colocadas em agarose, lisadas, submetidas à eletroforese e
coradas, uma matriz com um halo fluorescente, formado por DNA não danificado e
que não migrou. Células com DNA danificado formam um cometa, consistindo de
uma cabeça (matriz nuclear) e uma cauda (DNA quebrado). A extensão do DNA que
migrou está correlacionado com o dano ocorrido (Tice et al., 2000).
Dessa forma, considerando o forte uso terapêutico da Melissa (Melissa
officinalis) no trato das mais diversas afecções, principalmente no sul do Brasil, o
presente trabalho tem como objetivo verificar o comportamento em nível de danos
de DNA do extrato hidroalcoólico e infusão de Melissa officinalis, utilizando o Ensaio
Cometa. E ainda, analisar se estes mesmos extratos e/ou infusões podem modular a
ação de agentes mutagênicos como a ciclofosfamida (CP) e o metil metanosulfonato
(MMS) em células de camundongos através do Ensaio Cometa, buscando dessa
forma, fornecer informações quanto à segurança e efetividade das infusões e/ou
extratos desta planta medicinal.
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Avaliar in vivo a capacidade genotóxica e antigenotóxica do extrato e
infuso de Melissa officinalis através dos danos causados pelos agentes alquilantes
ciclofosfamida (CP) e/ou metil metanosulfonato (MMS) usando o Ensaio Cometa.
2.2 ESPECÍFICOS
Determinar
o
nível
basal
de
danos
de
Melissa
officinalis
em
camundongos.
Investigar a capacidade antigenotóxica de 2 concentrações diferentes do
extrato hidroalcoólico de Melissa officinalis, bem como da infusão desta mesma
planta para determinação da melhor forma de ingestão deste chá.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais e Comitê de Ética em Pesquisa
Serão utilizados camundongos CF1 machos provenientes do biotério da
Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais serão mantidos a
temperatura ambiente controlada (23±1 ºC) com ciclo claro-escuro de 12 horas,
água e comida serão oferecidas ad libitum. Este estudo será encaminhado ao
Comitê de Ética em Pesquisa da UNESC e os experimentos serão conduzidos de
acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal –
COBEA.
3.2 Coleta e Preparo da Amostra
A planta da espécie a ser estudada será adquirida no Município de GrãoPará e atestada quanto a sua espécie pela Prof. Dra. Vanilde Zanette do Herbário
Pe. Dr. Raulino Reitz da Universidade do Extremo Sul Catarinense de Criciúma,
Santa Catarina, Brasil. Os espécimes serão secos com ar seco em circulação (40°C)
por três dias.
3.3 Preparo do Extrato e Infusão
Depois de secas as folhas desta espécie serão moídas (maceradas) e
colocadas em um recipiente contendo uma solução hidroalcoólica (etanol 45%) por
um período de 21 dias, em temperatura ambiente, protegido da luz, com agitação
ocasional (uma vez ao dia) e sem renovação do líquido extrator. Este solvente é
suficientemente polar de forma a permitir a extração da maior parte das substâncias
presentes na planta (Simões, 2003). Após os 21 dias, o extrato fluido será seco em
rota vapor. Este extrato será diluído para que tenhamos 2 concentrações diferentes
a serem testadas (250 e 500mg/kg).
No caso das infusões, após a secagem do material será feito uma
infusão, usando 10g do farmacógeno adicionando-se 100mL água fervente e
posterior abafamento por 1h.
3.4 Ensaio Cometa in vivo
O Ensaio Cometa seguirá os protocolos internacionais já estabelecidos
para a sua realização (Tice et al., 2000) com adaptações de Silva et al. (2000).
Os animais inicialmente serão divididos em 7 grupos com 5 animais cada,
totalizando 35 animais.
Os grupos de tratamento serão os seguintes: grupo 1 (controle negativo),
os animais receberão água via oral durante um período de 14 dias, no 15° dia
receberão injeção de solução salina; grupo 2 (controle positivo), os animais
receberão água via oral durante um período de 14 dias, no 15° dia receberão injeção
de ciclofosfamida 25 mg/kg por via intraperitoneal; grupo 3 ao grupo 7 receberão 2
diferentes concentrações do extrato e a infusão por via oral durante 14 dias e no 15°
dia será administrado o agente alquilante em estudo.
Para o presente estudo, o sangue será coletado da veia caudal de cada
animal e serão feitas lâminas em duplicata.
3.5 Análises Estatísticas
A normalidade das variáveis será avaliada pelo teste KolmogorovSmirnov. As análises estatísticas para Índice de Dano e Frequência de Dano serão
feitas através de análise de variância de uma via (ANOVA) e quando o teste
apresentar diferença entre os grupos será aplicado o teste post-hoc de Tukey. Em
caso de dados não-paramétricos será utilizado o teste Kruskal-Wallis usando o teste
Dunn como post hoc. Uma diferença de P < 0.05 será considerada estatisticamente
significante. O pacote estatístico utilizado será o BioEstat 5.0.
P
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XX
4 CRONOGRAMA
Jun
Jul
Ago
Set
Out
Nov
5 ORÇAMENTO
Discriminação
1. Material de Consumo
Ponteira amarela cap 1-200uL . Pcte c/1000 um
Ponteira azul cap 100uL . Pcte c/1000 um
Ponteira nat cap 10uL . Pcte c/1000 um –0
Tubo de Reação (Eppendorf) com 500un –
Lâmina lapidada p/ microscopia ponta fosca 26x76mm
Ácido Acético Glacial- Nuclear
Ácido clorídrico -Merck
Ácido Tricloroacético 500g- Nuclear
Ácido Tungstosilicico 50g -Sigma Aldrich
Carbonato de Sódio 1kg –Quimex
Cloreto de Potássio 1kg- Nuclear
Cloreto de Sódio 1kg – Quimex
Dimetilsulfoxido 1L – Nuclear
EDTA Sal Dissodico 1L – Nuclear
Etanol 1L – Nuclear
Formaldeído 1L – Quimex
Fosfato de Sódio Dibásico 1kg- Nuclear
Fosfato de Sódio Monobásico 1kg- Nuclear
Glicerina Bidestilada (Glicerol) 1L - Nuclear
Hidróxido de Sódio 500g – Quimex
Metil Metano sulfonato (MMS) Sigma
Nitrato de Amônia 1kg – Quimex
Nitrato de Prata 100g – Quimex
Sulfato de Zinco – heptaidratado 1kg – Invitrogen
Tris Hidroximetil 1kg – Invitrogen
Triton X-100 1L – Nuclear
Total
Quantidade
1
1
1
4
20
1
1
1
1
2
2
4
3
4
1
2
2
1
2
6
1
2
1
2
2
2
Valor Unitário R$
60,00
74,00
68,00
38,00
5,80
13,00
248,70
75,00
407,00
15,50
14,00
8,30
34,00
43,70
9,50
11,97
16,60
32,00
22,00
8,30
554,00
44,50
261,40
23,04
280,00
108,50
Valor Total R$
60,00
74,00
68,00
38,00
116,00
26,00
248,70
75,00
407,00
31,00
28,00
33,20
102,00
174,80
9,50
23,74
33,20
32,00
44,00
49,80
554,00
89,00
261,40
46,08
560,00
217,00
3.401,42
6 REFERÊNCIAS
ALBERTINI, R.J.; ANDERSON, D.; DOUGLAS, G.R.; HAGMAR, L.; HEMMINKI, K.;
MERLO, F.; NATARAJAN, A.T.; NORPPA, H.; SHUKER, D.E.G.; TICE, R.;
WATERS, M.D.; AITIO, A. IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects
of carcinogens in humans. Mutation Research 463: 111-172. 2000.
BELLÓ-KLEIN, A. Dano oxidativo e Regulação Biológica pelos Radicais Livres. In:
MARRONI, N.P. Estresse Oxidativo e Antioxidantes. Canoas, RS: Editora da
Ulbra, 2002. p15- 19.
BERHOW, M.; WAGNER, E.; VAUGHN, S.; PLEWA, M. Characterization and
antimutagenic activity of soybean saponins. Mutation Research 448: 11-22.
2000.
BURCHAM, P.C. Internal hazards: baseline and damage by endogenous products of
normal metabolism. Mutation Research 443: 11-36. 1999.
BURLINSON, B.; TICE, R.R.; SPEIT, G.; AGURELL, E.; BRENDLER-SCHAAB, S.Y.;
COLLINS, A.R.; ESCOBAR, P.; HONMA, M.; KUMARAVEL, T.S.; NAKAJIMA, M.;
SASAKI, Y.F.; THYBAUD, V.; UNO, Y, VASQUEZ, M.; HARTMANN, A. Fourth
International Workgroup on Genotoxicity testing: Results of the in vivo Comet
assay workgroup. Mutation Research 627:31-35. 2007.
CORRÊA, Anderson Domingues; BATISTA, Rodrigo Siqueira; QUINTAS, Luis
Eduardo M. Plantas medicinais: do cultivo à terapêutica. 5.ed Petrópolis: Vozes,
2002. 247 p.
CZECZOT, H.; KUSZTELAK, J. A study of the genotoxic potential of flavonoids using
short-term bacterial assays. Acta Biochimica Polonica 40: 549-554. 1993.
DE SOUSA, A.C.; ALVIANO, D.S.; BLANK, A.F.; ALVES, P.B.; ALVIANO, C.S.;
GATTASS, C.R. Melissa officinalis L. essential oil: antitumoral and antioxidant
activities. Journal of Pharmacy and Pharmacology 56: 677-681. 2004.
GOMES-CARNEIRO,
M.R.;
DIAS,
D.M.M.;
DE
OLIVEIRA,
A.C.A.X.;
PAUMGARTTEN, F.J.R. Evaluation of mutagenic and antimutagenic activities of
-bisabolol in the Salmonella/microsome assay. Mutation Research 585: 105112. 2005.
HERNÁNDEZ-CERUELOS, A.; MADRIGAL-BUJAIDADAR, E.; DE LA CRUZ, C.
Inhibitory effect of chamomile essential oil on the sister chromatid exchanges by
daunorubicin and methyl methanesulfonate in mouse bone marrow. Toxicology
Letters 135: 103-110. 2002.
LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas.
Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2002. 512p.
MIMICA-DUKIC, N.; BOZIN, B.; SOKOVIC, M.; SIMIN, N. Antimicrobial and
antioxidant activities of Melissa officinalis L. (Lamiacea) essential oil. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 52: 2485-2489. 2004.
NISHINO, H. Cancer prevention by carotenoids. Mutation Research 402: 159-163.
1998.
PAOLINI, M. NESTLE, M. Pitfalls of enzymes-based molecular anticancer dietary
manipulations: food for thought. Mutation Research 543: 181-189. 2003.
PATEL, D.; SHUKLA, S.; GUPTA, S. Apigenin and cancer chemoprevention:
progress, potential and promise (review). International Journal of Oncology
30: 233-245. 2007.
PEREIRA, P.; TYSCA, D.; OLIVEIRA, P.; DA SILVA BRUM, L.F.; PICADA, J.N.;
ARDENGHI, P. Neurobehaviorak and genotoxic aspects of rosmarinic acid.
Pharmacology Research 52: 199-203. 2005.
SIMÕES, C.M.O.; MENTZ, L.A.; SCHENKEL, E.P.; IRGANG, B.E.; STEHMANN, J.R.
Plantas da Medicina Popular no Rio Grande do Sul. 50 ed. Porto Alegre, RS:
UFRGS, 1998. 172p.
SURH,
Y.
FERGUSON,
L.R.
Dietary
and
medicinal
antimutagens
and
anticarcinogens: molecular mechanisms and chemopreventive potential –
highlights of a symposium. Mutation Research 485: 1-8. 2003.
TICE, R.R.;
AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.; HARTMANN, A.;
KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J.C.; SASKI, Y.F. Single Cell
Gel/Comet Assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
Environmental Molecular Mutagenesis 35: 306-221. 2000.
Normas para Publicação na Revista de Saúde Pública
Artigos Originais
Incluem
estudos
observacionais,
estudos
experimentais
ou
quase-
experimentais, avaliação de programas, análises de custo-efetividade, análises de
decisão e estudos sobre avaliação de desempenho de testes diagnósticos para
triagem populacional. Cada artigo deve conter objetivos e hipóteses claras, desenho
e métodos utilizados, resultados, discussão e conclusões. Incluem também ensaios
teóricos (críticas e formulação de conhecimentos teóricos relevantes) e artigos
dedicados à apresentação e discussão de aspectos metodológicos e técnicas
utilizadas na pesquisa em saúde pública. Neste caso, o texto deve ser organizado
em tópicos para guiar os leitores quanto aos elementos essenciais do argumento
desenvolvido.
Informações complementares:
Devem ter até 3.500 palavras, excluindo resumos, tabelas, figuras e
referências. As tabelas e figuras, limitadas a 5 no conjunto, devem incluir apenas os
dados imprescindíveis, evitando-se tabelas muito longas. As figuras não devem
repetir dados já descritos em tabelas. As referências bibliográficas, limitadas a cerca
de 25, devem incluir apenas aquelas estritamente pertinentes e relevantes à
problemática abordada. Deve-se evitar a inclusão de número excessivo de
referências numa mesma citação. Os resumos devem ser apresentados no formato
estruturado, com até 300 palavras, contendo os itens: Objetivo, Métodos, Resultados
e Conclusões. Excetuam-se os ensaios teóricos e os artigos sobre metodologia e
técnicas usadas em pesquisas, cujos resumos são no formato narrativo, que, neste
caso, terão limite de 150 palavras.
A estrutura dos artigos originais de pesquisa é a convencional: Introdução,
Métodos, Resultados e Discussão, embora outros formatos possam ser aceitos. A
Introdução deve ser curta, definindo o problema estudado, sintetizando sua
importância e destacando as lacunas do conhecimento que serão abordadas no
artigo. As fontes de dados, a população estudada, amostragem, critérios de seleção,
procedimentos analíticos, dentre outros, devem ser descritos de forma compreensiva
e completa, mas sem prolixidade. A seção de Resultados deve se limitar a descrever
os resultados encontrados sem incluir interpretações/comparações. O texto deve
complementar e não repetir o que está descrito em tabelas e figuras. A Discussão
deve incluir a apreciação dos autores sobre as limitações do estudo, a comparação
dos achados com a literatura, a interpretação dos autores sobre os resultados
obtidos e sobre suas principais implicações e a eventual indicação de caminhos para
novas pesquisas. Trabalhos de pesquisa qualitativa podem juntar as partes
Resultados e Discussão, ou mesmo ter diferenças na nomeação das partes, mas
respeitando a lógica da estrutura de artigos científicos.
Autoria
O conceito de autoria está baseado na contribuição substancial de cada uma
das pessoas listadas como autores, no que se refere sobretudo à concepção do
projeto de pesquisa, análise e interpretação dos dados, redação e revisão crítica. A
contribuição de cada um dos autores deve ser explicitada em declaração para esta
finalidade. Não se justifica a inclusão de nome de autores cuja contribuição não se
enquadre nos critérios acima. A indicação dos nomes dos autores logo abaixo do
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devem explicitar em Métodos que a pesquisa foi conduzida dentro dos padrões
exigidos pela Declaração de Helsinque e aprovada pela comissão de ética da
instituição onde a pesquisa foi realizada.
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aqueles submetidos em português oferece-se a opção de tradução do texto
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apresentada.
g) Se foi apresentado em reunião científica, indicar o nome do evento, local e data
da realização.
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"Descritores em Ciências da Saúde" (DeCS), quando acompanharem os resumos
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Se não forem encontrados descritores disponíveis para cobrirem a temática do
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colaboração intelectual ao trabalho, desde que não preencham os requisitos para
participar da autoria. Deve haver permissão expressa dos nomeados (ver
documento Responsabilidade pelos Agradecimentos). Também podem constar
desta parte agradecimentos a instituições quanto ao apoio financeiro ou logístico.
Referências
As referências devem ser ordenadas alfabeticamente, numeradas e
normalizadas de acordo com o estilo Vancouver. Os títulos de periódicos devem ser
referidos de forma abreviada, de acordo com o Index Medicus, e grafados no
formato itálico. No caso de publicações com até 6 autores, citam-se todos; acima de
6, citam-se os seis primeiros, seguidos da expressão latina “et al”.
Exemplos:
Fernandes LS, Peres MA. Associação entre atenção básica em saúde bucal e
indicadores socioeconômicos municipais. Rev Saude Publica. 2005;39(6):930-6.
Forattini OP. Conceitos básicos de epidemiologia molecular. São Paulo: Edusp;
2005.
Karlsen S, Nazroo JY. Measuring and analyzing "race", racism, and racial
discrimination. In: Oakes JM, Kaufman JS, editores. Methods in social epidemiology.
San Francisco: Jossey-Bass; 2006. p. 86-111.
Yevich R, Logan J. An assessment of biofuel use and burning of agricultural waste in
the
developing
world.
Global
Biogeochem
Cycles.
2003;17(4):1095,
DOI:10.1029/2002GB001952. 42p.
Zinn-Souza LC, Nagai R, Teixeira LR, Latorre MRDO, Roberts R, Cooper SP, et al .
Fatores associados a sintomas depressivos em estudantes do ensino médio de São
Paulo, Brasil. Rev Saude Publica. 2008; 42(1):34-40.
Para
outros
exemplos
recomendamos
consultar
o
documento
"Uniform
Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals: Writing and Editing
for Medical Publication" (http://www.icmje.org).
Comunicação pessoal, não é considerada referência bibliográfica. Quando
essencial, pode ser citada no texto, explicitando em rodapé os dados necessários.
Devem ser evitadas citações de documentos não indexados na literatura científica
mundial e de difícil acesso aos leitores, em geral de divulgação circunscrita a uma
instituição ou a um evento; quando relevantes, devem figurar no rodapé das
páginas que as citam. Da mesma forma, informações citadas no texto, extraídas de
documentos eletrônicos, não mantidas permanentemente em sites, não devem fazer
parte da lista de referências, mas podem ser citadas no rodapé das páginas que as
citam.
Citação no texto: Deve ser indicado em expoente o número correspondente à
referência listada. Deve ser colocado após a pontuação, nos casos em que se
aplique. Não devem ser utilizados parênteses, colchetes e similares. O número da
citação pode ser acompanhado ou não do(s) nome(s) do(s) autor(es) e ano de
publicação. Se forem citados dois autores, ambos são ligados pela conjunção "e"; se
forem mais de dois, cita-se o primeiro autor seguido da expressão "et al".
Exemplos:
Segundo Lima et al9 (2006), a prevalência se transtornos mentais em estudantes de
medicina é maior do que na população em geral.
Parece evidente o fracasso do movimento de saúde comunitária, artificial e
distanciado do sistema de saúde predominante.12,15
A exatidão das referências constantes da listagem e a correta citação no texto são
de responsabilidade do(s) autor(es) do manuscrito.
Tabelas
Devem ser apresentadas separadas do texto, numeradas consecutivamente
com algarismos arábicos, na ordem em que foram citadas no texto. A cada uma
deve-se atribuir um título breve, não se utilizando traços internos horizontais ou
verticais. As notas explicativas devem ser colocadas no rodapé das tabelas e não no
cabeçalho ou título. Se houver tabela extraída de outro trabalho, previamente
publicado, os autores devem solicitar autorização da revista que a publicou, por
escrito, para sua reprodução. Esta autorização deve acompanhar o manuscrito
submetido à publicação.
Quadros são identificados como Tabelas, seguindo uma única numeração em todo o
texto.
Figuras
As ilustrações (fotografias, desenhos, gráficos, etc.), devem ser citadas como
figuras. Devem ser numeradas consecutivamente com algarismos arábicos, na
ordem em que foram citadas no texto; devem ser identificadas fora do texto, por
número e título abreviado do trabalho; as legendas devem ser apresentadas ao final
da figura; as ilustrações devem ser suficientemente claras para permitir sua
reprodução, com resolução mínima de 300 dpi.. Não se permite que figuras
representem os mesmos dados de Tabela. Não se aceitam gráficos apresentados
com as linhas de grade, e os elementos (barras, círculos) não podem apresentar
volume (3-D). Figuras coloridas são publicadas excepcionalmente.. Nas legendas
das figuras, os símbolos, flechas, números, letras e outros sinais devem ser
identificados e seu significado esclarecido. Se houver figura extraída de outro
trabalho, previamente publicado, os autores devem solicitar autorização, por escrito,
para sua reprodução. Estas autorizações devem acompanhar os manuscritos
submetidos à publicação.
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
NATÁLIA CASSETTARI DE CARVALHO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E ANTIGENOTÓXICO
DE Melissa officinalis
CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2009.
NATÁLIA CASSETTARI DE CARVALHO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO E ANTIGENOTÓXICO
DE Melissa officinalis
Trabalho de conclusão de curso apresentado para
a obtenção do grau de Farmacêutico no curso de
Farmácia
da
Universidade
do
Extremo
Catarinense - UNESC.
Orientador (a): Profª. Dra. Vanessa Moraes de
Andrade.
CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2009.
Sul
Avaliação do Potencial Genotóxico e Antigenotóxico de Melissa officinalis
(Melissa)
Genotoxic and Antigenotoxic evaluation of Melissa officinalis
Natália Cassettari de Carvalho1, Ângela Erna Rossatto2, Patrícia de Aguiar Amaral3,
Jeverson Moreira3, Vanessa Nicolau3, Vanessa de Andrade1
1
Laboratório de Imunologia e Mutagênese - LABIM, Universidade do Extremo Sul
Catarinense (UNESC) – Criciúma, SC – Brasil.
2
Professora do Curso de Farmácia da Unesc- UNA de Ciências da Saúde.
3
Laboratório de Estudos Etnofarmacológicos - G-FITO, Universidade do Extremo Sul
Catarinense (UNESC) – Criciúma, SC – Brasil.
Autor Correspondente:
Prof. Vanessa Moraes de Andrade, M.Sc., Ph.D.
Laboratório de Imunologia e Mutagênese– PPGCS - UNASAU
Universidade do Extremo Sul Catarinense
88806-000, Criciúma, SC, Brazil
Phone: + 55 48 3431 2758
E-mail: [email protected]
A ser enviado para a Revista de Saúde Pública
Resumo
Objetivos: Avaliar in vivo a capacidade genotóxica e antigenotóxica do extrato e
infuso de Melissa officinalis através dos danos causados pelo agente alquilante
metilmetanosulsfonato (MMS) usando o Ensaio Cometa. Metodologia: Os animais
foram divididos em 7 grupos com 5 animais cada, totalizando 35 animais. Os grupos
de tratamento foram os seguintes: grupo 1 (controle negativo), os animais
receberam água por via oral durante um período de 14 dias, no 15° dia receberam
injeção de solução salina por via intraperitoneal (IP); grupo 2 (controle positivo), os
animais receberam água por via oral durante um período de 14 dias, no 15° dia
receberam injeção de metilmetanosulsfonato (MMS) 40 mg/kg (IP); grupo 3 ao grupo
7 receberam 2 diferentes concentrações do extrato e o infuso por via oral durante 14
dias e no 15° dia foi administrado o agente alquilante em estudo. Após o período de
tratamento, sangue foi coletado da veia caudal dos animais para a execução do
Ensaio Cometa. Resultados: Em relação à análise da genotoxicidade baixos níveis
de danos foram observados, sendo este semelhante aos danos dos grupos tratados
com água, e com um valor significativamente baixo em comparação com o grupo
tratado com MMS, ou seja, nas condições deste estudo, a Melissa officinalis não
mostrou atividade genotóxica. Os resultados referentes à antigenotoxicidade
demonstram que o pré-tratamento efetivado com extrato de Melissa officinalis
reduziu significativamente, cerca de 53,39%, os induzidos pelo MMS. Conclusão:
Estes resultados mostraram que o extrato e o infuso de Melissa officinalis não
tiveram ação genotóxica e que o uso do extrato na concentração de 500mg/kg teve
efeito protetor parcial em relação aos danos causados pelo agente mutagênico
MMS.
Palavras-chave: Melissa officinalis; Melissa; Plantas medicinais; Ensaio cometa.
Abstract
Objectives: To evaluate the in vivo genotoxic and antigenotoxic of the Melissa
officinalis extract and infusion through the DNA damage caused by alkylating agent
Methyl Methanesulfonate (MMS) using Comet assay. Methodology: The animals
were divided into 7 groups with 5 animals each, totaling 35 animals. The treatment
groups were as follows: group 1 (negative control) animals received water orally over
a period of 14 days, on day 15 received injection of saline intraperitoneally (IP),
group 2 (positive control), the animals received water orally over a period of 14 days,
on day 15 injected with metilmetanosulsfonato (MMS) 40 mg / kg (IP), group 3 to
group 7 received 2 different concentrations of the extract and infused orally for 14
days and on day 15 was administered alkylating agent under study. After treatment
period, blood was collected from the tail vein of animals for implementation of the
Comet Assay. Results: For the analysis of genotoxicity low levels of damage were
observed, which is similar to the damage of groups treated with water, and with a
relatively low value compared with the group treated with MMS, or the conditions of
this study, Melissa officinalis showed no genotoxic activity. The results concerning
antigenotoxicidade show that pre-treatment effected with extract Melissa officinalis
significantly reduced, about 53.39%, the induced MMS. Conclusion: These results
showed that the extract and Melissa officinalis infused had no genotoxicity and the
use of the extract at a concentration of 500mg/kg was a protective factor in relation to
damage caused by mutagen MMS.
Key words: Melissa officinalis; Melissa; Medicinal plants; Comet Assay.
1 INTRODUÇÃO
O uso de plantas na arte de curar é uma forma de tratamento com raízes
muito antigas, relacionada aos primórdios da medicina. A utilização das plantas é o
resultado do acúmulo secular de conhecimentos empíricos sobre a ação dos
vegetais por diversos grupos étnicos através de sucessivas gerações.7,33
No Brasil, a utilização de plantas medicinais teve origem na cultura dos
diversos grupos indígenas, como por exemplo, o jaborandi (Pilocarpus spp) e o
guaraná (Paullinia cupana). Muitas outras plantas foram trazidas pelos europeus,
como a camomila (Matricaria chamomila) a malva (Malva sylvestris) e a melissa
(Melissa officinalis); ou ainda aproveitadas de culturas de outros países sulamericanos, como o boldo (Peumus boldus).33
As plantas medicinais e suas formas derivadas (extratos, xaropes, etc.)
constituíram durante séculos a base da medicina terapêutica. O emprego correto de
plantas para estes fins pela população em geral, requer o uso de plantas medicinais
selecionadas por sua eficácia e segurança terapêutica, baseadas na tradição
popular ou cientificamente validadas como medicinais. 22
Recentemente interesses em compostos terapêuticos planta-específicos têm
sido reforçados devido aos conhecimentos de que químicos como proteases e
antioxidantes podem prevenir ou reduzir o desenvolvimento de câncer por
bloquearem o dano genético. 2,17,10.
Sabe-se que no Brasil as preparações usuais de plantas medicinais são os
chás ou infusões.22 No entanto, pouco se sabe a respeito do possível papel
antigenotóxico destas plantas ingeridas desta forma. Deste modo, estudos de
genotoxicidade e antigenotoxicidade podem ajudar a avaliar a segurança e a
efetividade de muitas plantas utilizadas na medicina popular.
Melissa officinalis, também conhecida como erva-cidreira, é uma planta usada
como aromatizante de alimentos e para fins medicinais.32,22 Esta planta é conhecida
por seus múltiplos usos populares, entre as afecções tratadas têm-se: dores de
cabeça, enxaqueca, dores de dente, dores de ouvido, flatulência, indigestão, cólica,
náuseas, nervosismo, anemia, vertigens, síncope, asma, bronquite, amenorréia,
insuficiência cardíaca, hipertensão arterial, arritmias, insônia, epilepsia, depressão,
psicose, histeria, desordens estomacais, úlceras, feridas, reumatismos e torcicolos.
6,18,30,9
Na sua composição química é registrada a presença de óleo essencial e
taninos, além de ácidos triterpenóides e flavonóides. Os taninos são derivados dos
ácidos rosmarínico e cafeico. 32,22
Seu óleo essencial submetido a ensaios farmacológicos demonstrou ser um
bom agente antibacteriano e antifúngico
23
propriedade ansiolítica atribuída a esta planta.
e é também, o responsável pela
28
Alguns trabalhos da literatura têm
sugerido propriedades antioxidantes e antitumorais da melissa, trabalhos estes
também relacionados aos seus componentes principais e não a extratos ou infusões.
10,28
A respeito das propriedades antigenotóxicas desta planta, até o presente
momento nenhum dado foi publicado na literatura. Somente Pereira e colaboradores
28
(2005) trabalhando com o ácido rosmarínico demonstraram que em baixas doses
este composto não foi capaz de causar danos no DNA de cérebro de ratos expostos.
Sendo assim, podemos observar uma escassez acerca dos estudos em nível
genético com esta planta medicinal bem utilizada na nossa medicina popular. 8,17,15
Contudo, existem poucos dados referentes à ação de misturas complexas como
infusões ou sucos de vegetais e frutas. É de grande importância considerar as
misturas complexas, uma vez que, é a forma predominante de ingestão em seres
humanos.
Dessa forma, considerando o forte uso terapêutico da Melissa (Melissa
officinalis) no trato das mais diversas afecções, principalmente no sul do Brasil, o
presente trabalho tem como objetivo verificar o comportamento em nível de danos
de DNA do extrato hidroalcoólico e infusão de Melissa officinalis, utilizando o Ensaio
Cometa. E ainda, analisar se estes mesmos extratos e/ou infusões podem modular a
ação de agente mutagênico como o metil metanosulfonato (MMS) em células de
camundongos através do Ensaio Cometa, buscando dessa forma, fornecer
informações quanto à segurança e efetividade das infusões e/ou extratos desta
planta medicinal.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Animais e Comitê de Ética em Pesquisa
Foram utilizados camundongos CF1 machos provenientes do biotério da
Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais foram mantidos a
temperatura ambiente controlada (23±1 ºC) com ciclo claro-escuro de 12 horas,
água e comida foram oferecidas ad libitum. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da UNESC sob o protocolo 043/2008 e os experimentos foram
conduzidos de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal – COBEA.
2.2 Coleta e Preparo da Amostra
A planta da espécie estudada foi adquirida no Município de Grão-Pará e
atestada quanto a sua espécie pela Prof. Dra. Vanilde Zanette do Herbário Pe. Dr.
Raulino Reitz da Universidade do Extremo Sul Catarinense de Criciúma, Santa
Catarina, Brasil, sob o número CRI 7379. Os espécimes foram secos com ar seco
em circulação (40°C) por três dias.
2.3 Preparação do Extrato e Infusão
Foram utilizados 200g de farmacógeno seco e moído em moinho de facas,
solubilizados em 1000mL de solvente (solução hidroalcoólica de etanol 45%) e
deixou-se em contato por aproximadamente 15 dias em temperatura ambiente,
protegido da luz, com agitação ocasional (uma vez ao dia) e sem renovação do
líquido extrator. Logo após o líquido foi coado por expressão com auxílio de
compressas de gaze, depois filtrou-se em papel filtro, e completou-se o volume para
chegar a 1000mL com o mesmo solvente. Em seguida o solvente foi evaporado em
rota vapor e o extrato seco foi dissolvido posteriormente em água destilada.
12
Este
extrato foi então diluído para que tivéssemos duas doses diferentes para serem
testadas (500 e 250mg/kg). 24
No caso da infusão foram utilizados 0,6g do farmacógeno seco em 20mL de
água destilada fervente. Verteu-se a água fervente sobre o farmacógeno, agitou-se a
mistura com bastão de vidro, fechou-se o recipiente com vidro relógio deixando em
contado a água e o farmacógeno por aproximadamente por 1h. Em seguida esta
mistura foi coada por expressão e filtrada.
12
A dose do infuso foi baseada no cálculo
dos sólidos totais, onde obteve-se 100mg/kg.35
2.4 Triagem Fitoquímica
A triagem fitoquímica preliminar de Melissa officinalis foi realizada seguindo
os procedimentos padrões descritos pela Farmacopéia Brasileira. 12
2.5 Desenho Experimental
Os animais foram inicialmente divididos em 7 grupos com 5 animais cada,
totalizando 35 animais. Os grupos de tratamento foram os seguintes (Figura 1):
Grupo 1 (controle negativo): os animais receberam água por via oral (volume
de 0,1mL/10g peso corporal) durante um período de 14 dias, no 15° dia receberam
por via intraperitoneal (IP) uma injeção de solução salina (NaCl 0,9%);
Grupo 2 (controle positivo): os animais receberam água por via oral durante
um período de 14 dias, no 15° dia receberam injeção (IP) de metil metanosulfonato
(MMS – de ação direta) 40mg/kg;
Grupo 3 e 4: os animais receberam durante um período de 14 dias as
diferentes concentrações do extrato de M. officinalis (250mg/kg e 500mg/kg) por via
oral e no 15° dia receberam injeção (IP) de MMS (40mg/kg);
Grupo 5: os animais receberam durante um período de 14 dias a maior
concentração do extrato, ou seja, 500mg/kg e no 15° receberam injeção (IP) de
solução salina (NaCl 0,9%);
Grupo 6: os animais receberam durante um período de 14 dias a infusão
(100mg/kg) e no 15° dia receberam injeção (IP) de solução salina (NaCl 0,9%);
Grupo 7: os animais receberam durante um período de 14 dias a infusão
(100mg/kg) e no 15° dia receberam injeção (IP) de MMS (40mg/kg);
Após a administração do agente genotóxico e da solução salina, foram
coletadas amostras de sangue na região caudal de todos os animais para a
realização do Ensaio Cometa e prepararam-se as lâminas em duplicata.
2.6 Ensaio Cometa
O Ensaio Cometa seguiu os protocolos internacionais já estabelecidos para a
sua realização.
34
com adaptações de Silva et al.31 (2000). As lâminas foram
preparadas através da mistura de 5µL de sangue periférico total com 95µL de
agarose de baixo ponto de fusão (0,75%), onde essa mistura (células+agarose) foi
depositada sobre uma lâmina de microscopia previamente coberta por uma película
de 500µL de agarose de ponto de fusão normal (1,5%) e adicionado uma lamínula
sobre a mistura e colocadas em geladeira por 5 a 10 minutos para solidificação da
amostra. Após a solidificação, as lamínulas foram suavemente removidas e as
lâminas submersas em solução de lise (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA e 10 mM Tris,
pH 10.0-10.5), para exposição do núcleo celular, por tempo mínimo de 1 hora e
máximo de 1 semana. Sequencialmente, as lâminas foram incubadas em molho de
tampão alcalino (pH > 13) por 20 minutos, com temperatura aproximada de 4ºC.
Após isso, as lâminas passaram por uma eletroforese durante 15 minutos a 25 volts
(0.90 V/cm) e 300mA, e então neutralizadas com 0,4M Tris (pH 7,5). Após a
neutralização, as lâminas foram colocadas na estufa à 37ºC para posterior secagem
durante 1 hora e 30 minutos para iniciar-se a coloração com nitrato de prata. Após a
secagem, as lâminas foram distribuídas em cubetas com solução fixadora (ácido
tricloroacético 15% p/v, sulfato de zinco 5% p/v, glicerol 5% v/v) por 10 minutos e
então, colocadas novamente em estufa à 37ºC por 1 hora e 30 minutos. As lâminas
foram hidratadas durante 5 minutos com água destilada, e em seguida coradas com
a solução de coloração (carbonato de sódio 5% p/v, nitrato de amônio 0,1% p/v,
nitrato de prata 0,1% p/v, ácido tungstosílico 0,25% p/v, formaldeído 0,15% v/v,
preparada no escuro), onde as cubetas foram mantidas em banho-maria à 37ºC por
15 minutos. As lâminas foram lavadas 3 vezes com água destiladas e depois foram
submersas em solução stop (ácido acético 1% v/v) durante 5 minutos, e então
lavadas novamente por 3 vezes com água destilada e colocadas novamente na
estufa à 37ºC por 1 hora e 30 minutos para posterior análise. Imagens de 100
células selecionadas ao acaso foram analisadas de cada indivíduo usando-se
microscópio óptico em aumento de 100x ou 400x. O dano apresentado foi avaliado
classificando-se cada célula de acordo com as cinco classes de dano existentes,
que inicia em dano 0 (= ausência de dano) e vai até dano 4 (= máximo de dano)
identificados através do tamanho e forma da cauda. Então, os valores obtidos para
cada indivíduo foram agrupados em escala de 0 (0x100) a 400 (4x100). Embora o
dano identificado seja subjetivo, ele é altamente fiel quando comparado com
imagens em computador. A Frequência de dano (FD) foi calculada para cada
indivíduo baseada no número de células com dano.
2.7 Análises Estatísticas
A normalidade das variáveis foi avaliada pelo teste Kolmogorov-Smirnov. As
análises estatísticas para Índice de Dano e Frequência de Dano foram feitas através
do teste t-Student para se fazer a comparação dos parâmetros com distribuição
normal em relação às comparações de tratamento. Uma diferença de P < 0.05 foi
considerada estatisticamente significante. O pacote estatístico utilizado foi o BioEstat
5.0.
O percentual da redução de dano ao DNA induzidos pelo agente alquilante
em estudo (MMS) foi calculado através de fórmula padrão (Figura 2).
3 RESULTADOS
O conteúdo dos principais constituintes químicos presentes na Melissa
officinalis estão apresentados na tabela 1.
A análise fitoquímica preliminar de
Melissa officinalis revela principalmente a presença de compostos fenólicos, taninos,
alcalóides, antraquinonas, cumarinas e saponinas. A presença e o teor de
flavonóides também foram analisados, e os resultados estão apresentados na
Tabela 1.
Em relação à análise da genotoxicidade de Melissa officinalis, neste trabalho
foram avaliados danos causados em DNA das células do sangue periférico de
camundongos, submetidos à exposição à água, ao agente mutagênico (MMS), ao
extrato hidroalcoólico de Melissa officinalis na concentração de 500mg/kg e ao
infuso.
A Figura 3 apresenta a detecção da genotoxicidade do extrato hidroalcoólico
de Melissa officinalis. A avaliação demonstrou baixos índices e frequência de dano
(ID e FD) nas células sanguíneas dos animais tratados com água, extrato de Melissa
officinalis (500mg/kg) e infuso (100mg/kg) e danos significativamente elevados no
controle positivo, onde foram tratados com o MMS. A média dos índices de danos no
DNA foi de 14,8 para o grupo tratado com a infusão e 13,8 para o grupo tratado com
extrato de melissa, enquanto que para o agente alquilante MMS foi de 134,4.
Em relação à análise da antigenotoxicidade do extrato hidroalcoólico de
Melissa officinalis, pode ser observada uma diminuição de dano em DNA
estatisticamente significativa quando comparados os valores dos animais que
receberam pré-tratamento com o extrato nas doses de 250mg/kg e 500mg/kg e uma
administração do agente mutagênico (MMS) em relação aos que receberam prétratamento com salina e a mesma administração de MMS (P <0,05; P <0,001 Teste
t-Student). Quando feito a comparação com o infuso, nenhuma redução
estatisticamente significativa foi observada.
4 DISCUSSÃO
As plantas têm sido utilizadas com eficácia em toda a história para tratar uma
variedade de doenças, uma prática que tem favorecido a síntese de compostos
terapêuticos plantas específicos. 2
A Melissa officinalis é conhecida na literatura por possui óleos essenciais,
compostos fenólicos, ácido caféico e ácido rosmarínico.1, sendo estes utilizados
como antioxidantes29, 18 antiespasmódicos e contra os distúrbios gastrintestinais e do
sono6. Outros estudos mostram que entre os inúmeros compostos que foram
isolados a partir do extrato de Melissa officinalis, os mais importantes são os
compostos polifenólicos (ácido rosmarínico e ácido cafeico), óleos essenciais (citral),
aldeídos monoterpenóides, sesquiterpenos, flavonóides (luteolina) e taninos.
6,16,20,30,9
Neste estudo, a triagem fitoquímica da Melissa officinalis foi avaliada e
forneceu o indicativo da presença de compostos fenólicos, taninos, alcalóides e
cumarinas, respectivamente, comprovando a existência dos costituíntes químicos
relatados anteriormente, ou seja, estão de acordo com a literatura.
Avaliar o papel antigenotóxico de extratos de plantas, de infusões e dos
principais componentes fitoquímicos é de suma importância, visto que substâncias
antimutagênicas presentes em algumas plantas já mostraram ajudar na prevenção
de câncer e outras doenças. 25,2,27
Neste trabalho a atividade genotóxica de Melissa officinalis, avaliada pelo
Ensaio Cometa, apresentou baixos níveis de danos nas células sanguíneas dos
camundongos tratados com diferentes concentrações de extrato, bem como o infuso
desta planta. O nível de dano foi semelhante aos grupos tratados com água, e com
um valor significativamente baixo em comparação com o grupo tratado com MMS
(Gráfico 1). Dessa forma é possível demonstrar que Melissa officinalis não é
genotóxica para células na dose utilizada. Resultados semelhantes foram
encontrados por Parra et al.26 (2000), que não detectaram, in vitro e in vivo, aumento
significativo de dano em DNA de ratos submetidos ao tratamento com extratos desta
planta, utilizando o teste de micronúcleos.
A atividade antigenotóxica de Melissa officinalis foi avaliada frente à sua
capacidade de prevenir os danos causados pelo agente alquilante MMS. O MMS é
um agente mutagênico de ação direta que metila regiões nucleofílicas do DNA. A
genotoxicidade deste agente é mediada por modificações de base, as quais
enfraquecem as ligações N-glicosídicas, levando a depurinação/depirimidinação das
fitas de DNA e favorecendo o surgimento de sítios AP. A remoção destes sítios AP
pelas AP endonucleases cliva DNA adjacentes a esses sítios e gera quebras na
molécula de DNA.19,3
Os resultados demonstram que o pré-tratamento efetivado com extrato
hidroalcoólico de Melissa officinalis reduziu significativamente o índice e a frequência
de danos induzidos pelo MMS (tabela 2), apontando o efeito preventivo parcial da
planta contra eventuais danos genotóxicos. O extrato da planta numa concentração
de 500mg/kg apresentou uma redução significativa de 53,39% do dano em DNA,
enquanto a dose de 250mg/kg reduziu o dano em apenas 19,29%, confirmando que
a atividade antigenotóxica de Melissa officinalis depende diretamente da dose em
que será utilizada.
O provável efeito antigenotóxico da Melissa officinalis parece estar
relacionado a alguns dos seus constituintes químicos. Relatos prévios apontam os
flavonóides como possíveis agentes protetores contra tumores, através do
mecanismo que envolve a liberação do fator de necrose tumoral alfa (TNF- ), ou a
citotoxidade contra células tumorais humanas.33 A atividade antioxidante dos
flavonóides que compõe a Melissa officinalis também já foi relatada, conforme
estudo realizado por Canadanovic-Brunet et al.5 (2008). Além dos flavonóides, os
taninos presentes na Melissa officinalis possuem a capacidade de proteger a célula
contra o estresse oxidativo e suprimir a mutagenicidade e a clastogenicidade de
agentes alquilantes, como o MMS, atuando na captura e neutralização de espécies
oxidantes como o ânion superóxido, radicais hidroxila ou radicais peróxido, atuando
ainda em sinergismo com outros antioxidantes como as vitaminas C e E, ou pelo fato
de serem capazes de ligarem-se a íons metálicos, impedindo-os de atuarem como
catalisadores na produção de radicais livres. 33
Compostos fenólicos, de forma geral, podem estimular o sistema de reparo de
DNA, através da regulação transcricional ou estabilização do mRNA.
alcalóides
também
apresentam
atividade
antioxidante,
especialmente eficientes contra o radical hidroxila.
14
sendo
Cumarinas e
os
últimos
21,13
Já o infuso não apresentou atividade antigenotóxica estatisticamente
significativa, permitindo a expressão de danos basais semelhante aos do controle
negativo.
Concluindo, a administração do extrato hidroalcoólico e do infuso de Melissa
officinalis não apresenta atividade genotóxica. Já o extrato desta planta administrado
em diferentes concentrações evidencia a capacidade da melissa de proteger células
sanguíneas de camundongos contra danos induzidos por agentes alquilantes. Estes
resultados demonstram também a habilidade do ensaio cometa em detectar a
modulação in vivo da genotoxicidade do MMS pelo extrato hidrolacoólico de Melissa
officinalis.
Com isso demonstra-se a necessidade de prosseguir com os estudos sobre a
ação genotóxica e antigenotóxica da planta no que diz respeito à ação farmacológica
e principalmente sobre os danos no DNA causados por outros agentes mutagêncios
no sentido de se entender o verdadeiro mecanismo de ação desta planta.
5 AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi financiado pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde - Universidade do Extremo Sul Catarinense (PPGCS-UNESC).
6 TABELAS E GRÁFICOS
Tabela 1. Triagem fitoquímica
Teste
Compostos fenólicos
W-Ext + KOH 3%
W-Ext + FeCl3 1%
Taninos
W-Ext + gelatina
W-Ext + FeCl3 3%
Flavonóides (qualitativa)
W-Ext + MgO/HCl
Flavonóides (quantitativa UV 425 nm)
CH3OH-Ext
Alcalóides
W-Ext + Reagente de Mayer´s
W-Ext + Reagente de Bertrand’s
W-Ext + Reagente de Dragendorff’s
W-Ext + Reagente de Bouchard’s
Antraquinonas
W-Ext + KOH 3%
Cumarinas
CH3CH2OH-Ext + KOH/UV 365 nm
Saponinas
W-Ext + HCl (persistent foam)
Melissa officinalis
+
+
+
+
0.572
+
+
-
W-Ext – extrato água/ CH3OH-Ext – extrato metanólico/ CH3CH2OH-Ext – extrato etanólico/
(-) negativo / (+) positivo.
Tabela 2. Detecção de lesões no DNA (média ± D.P.) pelo ensaio cometa (FD e ID) em células do sangue periférico
de camundongos expostos ao metil metanosulfonato (MMS) e diferentes doses de Melissa officinalis (EMO).
Ensaio Cometa
Tratamento
Número de animais
FD
% redução
ID
% redução
Controle negativo
5
10,2 ± 2,58
−
10,2 ± 2,58
−
Controle positivo
5
83,8 ± 9,44
−
134,4 ± 29,03
−
a
91,2 ± 13,84
34,78
c
b
EMO 250mg + MMS
5
69,6 ± 6,84
19,29
EMO 500mg + MMS
5
44,5 ± 15,41
53,39
77 ± 36,09
46,21
EMO 500mg + salina
5
10 ± 2,54
−
13,8 ± 2,68
−
Infuso + salina
5
12,4 ± 2,7
−
14,8 ± 3,42
−
Infuso + MMS
5
a
−
−
172 ± 101,36
68,4 ± 20,5
a
DP= Desvio Padrão; ID = Índice de Dano; FD = Frequência de Dano; EMO= Extrato de Melissa officinalis. Valores
b
c
significativos em relação ao controle positivo, P <0,05 (Teste t-Student); P <0,01; P <0,001.
Figura 1. Desenho experimental
C= Ensaio Cometa;
Figura 2. Fórmula para calcular o percentual da redução de dano
A= grupo controle positivo tratado com MMS; B= grupo tratado com diferentes concentrações do
extrato e infuso de melissa + MMS; C= grupo controle negativo.
180
*
160
140
120
Índice de dano
Frequência de dano
*
100
80
60
40
20
0
água
MMS
500mg + salina
infuso + salina
Figura 3: Índice e frequência de dano em DNA induzidos por água, pelo MMS, pelo extrato e infuso
de Melissa officinalis (melissa) avaliados através do Ensaio Cometa. * Valores significativos em
relação aos demais grupos de tratamento (P <0,05 Teste t-Student).
7 REFERÊNCIAS
1. Barnes, J; Anderson, LA; Phillipson, JD. Plantas medicinales: guía para los
profesionales de la salud. Barcelona 1ª ed. 2005: Pharma editors, 568. P
2. Berhow, M; Wagner, E; Vaughn, S; Plewa M. Characterization and antimutagenic
activity of soybean saponins. Mutat Res. 2000;448:11-22.
3. Boiteux, S; Guillet, M; Abasic sites in DNA: Repair and biological consequences in
Saccharomyces cerevisae. DNA repair. 2004;3: 1-12.
4. Burcham, PC. Internal hazards: baseline and damage by endogenous products of
normal metabolism. Mutat Res. 1999.443: 11-36.
5. Canadanovic-Brunet, J; Cetkovic, G; Djilas, S; Tumbas, V; Bogdanovic´, G;
Mandic´, A; Markov, S; Cvetkovic´, D; Canadanovic, V. Radical scavenging,
antibacterial, and antiproliferative activities of Melissa officinalis L. Extracts. J Med
Food. 2008;11:133–143.
6. Carnat, AP; Carnat, A; Fraisse, D; Lamaison, JL. The aromatic and polyphenolic
composition of lemon balm (Melissa officinalis L. subsp. Officinalis) tea.
Pharmaceutica Acta Helvetiae. 1998, 72: 301-5.
7. Correa, AD; Batista, RS; Quintas, LEM. Plantas medicinais: do cultivo à
terapêutica. 5.ed Petrópolis: Vozes, 2002.
8. Czseczot, H; Kusztelak, J. A study of the genotoxic potential of flavonoids using
short-term bacterial assays. Acta Biochimica Polonica.1993;40:549-554.
9. Dastmalchi, K; Dorman HJD; Oinonen, PP; Darwis, Y; LAAKSO, I; Hiltunen, R.
Chemical composition and in vitro antioxidative activity of a lemon balm (Melissa
officinalis L.) extract. LWT – Food sci tech. In press, 2007.
10. De Sousa, AC; Alviano, DS; Blank, AF; Alves, PB; Alviano, CS; Gattass, CR.
Melissa officinalis L. essential oil: antitumoral and antioxidant activities. J Pharm
Pharmacol. 2004;56:677-681.
11. Drozd J, Anuszewska E. The effect of the Melissa officinalis extract on immune
response in mice. Acta Poloniae Pharmaceutica. 2003;60(6):467-70.
12. Farmacopéia Brasileira. 4.ed. São Paulo: Atheneu, 2000. Parte I e II ISBN
8574540862 Número de Chamada: 615.1181 F233.
13. Fragoso, V. Alcalóides de Psychotria: Fotorregulação e propriedades
antioxidantes e antimutagências. Porto Alegre 2007.
14. Franke, SIR; PRA, D; Erdtmann, B; Henriques, JAP; Silva, J. Influence of orange
juice over the genotoxicity induced by alkylating agents: na in vivo analysis.
Mutagenesis 20: 279-283. 2005.
15. Gomes-Carneiro, MR; Dias, D.M.M.; De oliveira, A.C.A.X.; Paumgartten, F.J.R.
Evaluation of mutagenic and antimutagenic activities of
-bisabolol in the
Salmonella/microsome assay. Mutat Res. 2005;585:105-112.
16. Heitz, A.; Carnat, A.; Fraisse, D.; Carnat, A.P.; Lamaison, J.L. Leotelin 3’glucoronide, the major flavonoid from Melissa officinalis subdp. officinalis. Fitoterapia.
2000;71:201-202.
17. Hernández-Ceruelos A, Madrigal-Bujaidadar E, De La Cruz C. Inhibitory effect of
chamomile essential oil on the sister chromatid exchanges by daunorubicin and
methyl methanesulfonate in mouse bone marrow. Toxicol Lett. 2002;135:103-110.
18. Herodez SS, Hadolin M, Skerget M, Zeljko K. Solvent extraction study of
antioxidants from balm (Melissa officinalis L.) leaves. Food Chemistry. 2003;80:27582.
19. Horváthova, E.; Slamenová, D.; Hlincikova, L.; Mandal, T.K. Gábelová, A.;
Collins, A.R. The nature and origin of DNA single-strand breaks determined with the
comet assay. Mutat Res. 1998;409: 163-171.
20. Kennedy, DO.; Scholey, AB.; Tildesley, NTJ.; Perry, EK.; Wesnes, KA.
Modulation of mood and cognitive performance following administration of Melissa
officinalis (lemon balm). Pharmacol Biochem Behav. 2002;72:953-964.
21. Lo, Shu-Fung; Mulabagal, V; Chen, CL; Kuo, CL; Tsay, HS. Bioguided
Fractionation and Isolation of Free Radical Scavenging Components from in Vitro
Propagated
Chinese
Medicinal
Plants
Dendrobium
Dendrobium moniliforme SW. Journal of
tosaense
Makino
and
Agricultural and Food Chemistry.
2004;(52)23:6916-6919.
22. Lorenzi H, Matos FJA. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova
Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2002. 512p.
23. Mimica-dukic, N; Bozin, B; Sokovic, M; Simin, N. Antimicrobial and antioxidant
activities of Melissa officinalis L. (Lamiacea) essential oil. Jof Agricultural and Food
Chemistry. 2004;52: 2485-2489.
24. Müzell, D P; Propriedades biológicas de extratos de melissa officinalis l.
(lamiaceae) em ratos wistar. Porto Alegre 2006.
25. Nishino, H. Cancer prevention by carotenoids. Mutat Res.1998;402:159-163.
26. Parra, AV; Ruiz, AR; González, AV; Michelena, MD; Badell, JB. Evaluación del
efecto genotóxico en extractos fluidos de Plantago lanceolata L. (llantén menor) y
Matricaria recutita L. (Manzanilla). Revista Cubana de Plantas Medicinales
2000;5:59-63.
27. Patel, D; Shukla, S; Gupta, S. Apigenin and cancer chemoprevention: progress,
potential and promise (review). International Journal of Oncology 30: 233-245. 2007.
28. Pereira, P; Tysca, D; Oliveira, P; Da silva brum, L.F; Picada, J.N; Ardenghi, P.
Neurobehaviorak and genotoxic aspects of rosmarinic acid. Pharmacology Research.
2005;52: 199-203.
29. Ribeiro, LR. Teste do micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo. In:
Mutagênese Ambiental (Ribeiro LR, Salvadori DMF, Marques EK, eds). Canoas, RS:
Editora da Ulbra. 2003. p173-200.
30. Salah, SM; Jager, AK. Screening of traditionally used Lebanese herbs for
neurological activities. J Ethnopharmacol 2005; 97: 145-149.
31. Silva, J; Freitas, TRO; Marinho, JR; Speit, G; Erdtmann B. An alkaline single-cell
gel eletrophoresis (comet) assay for environmental biomonitoring with native rodents.
Genet. Mol. Biol. 2000;23:241-245.
32. Simões, CMO; Mentz, LA; Schenkel, EP; Irgang, BE; Stehmann, JR. Plantas da
Medicina Popular no Rio Grande do Sul. 50 ed. Porto Alegre, RS: UFRGS, 1998.
172p.
33. Simões, CMO. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5.ed. rev. ampl.
Porto Alegre: UFRGS, 2003. 1102 p. ISBN 8570256825
34. Tice, RR; Agurell, E; Anderson, D; Burlinson, B; Hartmann, A; Kobayashi, H;
Miyamae ,Y; Rojas, E; Ryu, JC; Saski, YF. Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines
for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen 2000;35:306221.
35. WHO. Folium Melissae. WHO monographs on selected medicinal plants. 2001,
Vol. II, pp. 180-187.