MIB3- fermentação láctica

LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA
Fermentação Láctica
As bactérias do ácido láctico são bastonetes (ex. Lactobacillus sp.) ou cocos (ex.
Streptococcus sp.) Gram positivos anaeróbios aerotolerantes. Como estes microrganismos
não possuem citocromos, não efectuam fosforilação oxidativa, e obtém energia unicamente
através de fosforilação ao nível de substrato. A designação de bactérias do ácido láctico
advém do facto destes microrganismos fermentarem com produção de lactato como produto
final ou como produto maioritário através de vias homo- ou heterofermentativas,
respectivamente.
A maioria das bactérias do ácido láctico utiliza unicamente açúcares como fonte de energia,
e por isso podemos isolá-los de locais onde existam hidratos de carbono em elevadas
concentrações. Outra particularidade dos organismos deste grupo metabólico, é o facto de
apresentarem capacidades biossintéticas limitadas, e deste modo necessitarem de meios de
cultura complexos contendo vitaminas, aminoácidos e bases nitrogenadas.
A produção do iogurte é efectuada através da fermentação homoláctica do leite utilizando
uma mistura simbiótica de duas bactérias do ácido láctico: Streptococcus thermophilus e
Lactobacillus bulgaricus.
Pretende-se com este trabalho medir a taxa de formação de ácido láctico a partir de
glucose por uma cultura mista das bactérias do ácido láctico isoladas de iogurte
comercial. A produção de ácido é seguida por titulação periódica da suspensão de
células com uma solução alcalina.
PARTE EXPERIMENTAL
A. Preparação da cultura de inoculo:
1. Agite um iogurte natural (ex. Clesa), e com uma pipeta de vidro estéril, adicione 10 mL a
150 mL de meio líquido MRS, num matraz de 250 mL;
2. Incube a cultura de inóculo a 30°C durante 48 h.
Cândida Manuel e Olga Nunes
1
3. Transfira a cultura para meio fresco utilizando 50 mL da cultura anterior para 400 mL
(num matraz de 1000 mL) de meio líquido MRS; Incube a cultura a 30°C.
B. Preparação das células:
4. Retire a cultura da incubadora. Centrifugue a cultura a 9000 rpm durante 10 minutos;
5. Lave o sedimento com solução salina estéril;
6. Ressuspenda as células em 45 mL de solução salina estéril. Dilua uma pequena amostra
para ler a D.O. (610 nm) da suspensão. A suspensão deverá ter uma D.O. de cerca de
3;
7. Retire uma amostra de 1 mL para um tubo Eppendorf previamente pesado para
determinar o peso húmido da biomassa. Centrifugue a 14 000 rpm durante 10 min.
Remova o sobrenadante com cuidado para não ressuspender as células. Pese o tubo
Eppendorf para obter o peso da biomassa húmida.
8. Coloque 40 ml de suspensão num copo (nº 1).
C. Ensaio:
9. Adicione 5 gotas do indicador púrpura de bromocresol à suspensão do copo (nº 1). Retire
20 ml para outro copo (nº 2).
COPO 1: titule com solução NaOH 0,01 M até a cor ficar ligeiramente violeta. Faça a
leitura do volume da bureta. Este copo irá servir de controlo para o ponto de viragem
do indicador pretendido.
-
COPO 2: titule com NaOH 0,01 M até a cor ser semelhante à obtida no copo 1 (o
volume usado deve ser aproximado do que usou para o copo 1). Faça a leitura do
volume da bureta ou ajuste o volume novamente ao zero.
-
Adicione 1 mL de uma solução de glucose 0,05 M e accione simultaneamente o
cronómetro. Agite manualmente o copo 2. Quando a suspensão estiver amarelada,
titule com NaOH para manter o pH da suspensão constante. Cada vez que efectue uma
titulação, registe o tempo de incubação e o volume de líquido na usado. Repita esta
operação periodicamente.
Cândida Manuel e Olga Nunes
2
10. Resultados e discussão:
10.1 Construa o gráfico correspondente à experiência de modo a que se observe a variação
da produção de ácido ao longo do tempo.
10.2 Determine a velocidade inicial de consumo de glucose e de produção de ácido láctico
(moles/min) por g de biomassa.
10.3 Considerando a reacção global da fermentação da glucose, determine o rendimento da
reacção em relação ao rendimento teórico.
Cândida Manuel e Olga Nunes
3