UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO SILVANA COELHO DE ARRUDA BARBOSA ESTUDO DA AÇÃO SINÉRGICA DE NOVOS COMPOSTOS NA DOENÇA DE CHAGAS EXPERIMENTAL SÃO PAULO 2015 SILVANA COELHO DE ARRUDA BARBOSA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA E INOVAÇÃO EM SAUDE ESTUDO DA AÇÃO SINERGICA DE NOVOS COMPOSTOS NA DOENÇA DE CHAGAS EXPERIMENTAL Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Biotecnologia e Inovação em Saúde da Universidade Anhanguera de São Paulo, como requisito parcial à obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Márcia Regina Machado dos Santos SÃO PAULO 2015 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a DEUS, pois sem Ele nada seria. Ele o autor da minha fé, razão da minha esperança. Só tenho a agradecer por tudo que tenho e por tudo que sou. Maravilhoso és Tu em minha vida. AGRADECIMENTOS Não é fácil mais considero a elaboração de uma dissertação de mestrado um produto coletivo embora sua redação, responsabilidade e estresse sejam predominantemente individuais. Várias pessoas contribuíram para que este trabalho chegasse a bom termo. A todas elas registro minha gratidão. Foi há dois anos que comecei algo... Algo que agora apresento com um sentimento de alívio como há muito não sentia! Hoje eu sei que a aprendizagem é muito importante... e aprender o que ainda não sei é uma tarefa árdua e incessante. Ah! E como existem coisas a serem aprendidas! E por isso serei sempre aprendiz. Eu creio que esta parte de agradecimentos é uma tarefa difícil, pois muitas vezes cometemos injustiças e por esquecimento não mencionamos nomes de pessoas que também contribuíram para o trabalho. Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras pessoas para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto pode mudar a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso. Meus sinceros e eternos agradecimentos... A Deus Deus por sempre me iluminar, guiar e principalmente proteger... graças a ele... mesmo quando penso ter tomado decisões erradas, tudo acabava dando certo. À minha família A você mãe Judith Deboletto, minha rainha que esteve comigo a todo o momento, incentivando e sempre acreditando que eu poderia mais. Sonhou junto comigo e hoje compartilha este momento de conquista comigo, te amo mãe. Ao meu marido, que me apresentou o mundo como um universo de conhecimentos, deixando como meta a sede de buscar sempre mais e mais. Não tenho palavras! Obrigado por tudo! Guilherme, filho amado, “Teu lábio sorriu para todos os ventos e o mundo inteiro ficou feliz” (Cecília Meireles). Sempre será assim. Sou grata pela compreensão. Amor infinito! Minha orientadora Minha gratidão especial á você professora Dra Márcia Regina Machado dos Santos, anjo que me acolheu com muito carinho. Só foi possível completar esse caminhar porque você me motivou, apoiou, me ensinou. Quando meus olhos percorrem este estudo, não sei onde começa o meu falar e inicia-se o seu. Isso me agrada porque “juntas” concretizamos esta dissertação, por isso, esse trabalho e tão meu quanto seu. Que este trabalho represente mais um passo na nossa caminhada profissional e pessoal. Saiba que nessa vida eu encontrei pessoas queridas uma delas foi você. A minha amiga especial Irmã para todas as horas, companheira de laboratório, Dra. Norma Andrade Ikeda, a gota de água que faltava. Obrigada amiga pela dedicação, profissionalismo, apoio, compreensão e principalmente, pela amizade, e descontração indispensável durante a realização deste trabalho. Valeu florzinha foi um prazer inenarrável! Aos docentes A todos os docentes do programa de pós graduação em Biotecnologia e inovação e saúde, que participaram ativamente do desenvolvimento deste trabalho, fornecendo todo seu conhecimento para a conclusão desta pesquisa e sempre me encorajaram para continuar, mesmo diante das dificuldades. Norma Andrades Ikeda, Suzana Nogueira Diniz, Camillo Anauate Netto, Fábio Dupart Nascimento, Hugo Roberto Lewgoy, Marcia Regina Machado dos Santos, Marcela Rocha de Oliveira Carrilho, Maria Cristina Marcucci Ribeiro , Niraldo Paulino , Paulo Celso Pardi, José Agustín Pablo Quincoces Suárez, Luis Carlos Marques, Regina Mara Silva Pereira, Claudete Justina Valduga, Sérgio de Mendonça, Andréa Anido Anido de Carvalho. Aos amigos e colegas de trabalho Meu muito obrigado por toda a força e apoio, que somente os reais amigos são capazes de oferecer, sem pedir nada em troca, apenas pelo simples prazer de me ver vencer. Cristina Santos, Ècio Veríssimo, Artur de Castro, Janaina Iannicelli, Hebert Ricci, Caroline Stoppa, Ivair Donizete, Patricia Benvenuti, Bianca Oliveira, Sandra Aparecida, Lucineide da Silva, João Barbosa Lima, Benvinda Ferreira, Maricéu Cunha, Alfredo Ribeiro, Manoela Leão, José Raimundo, Marcos José da Silva. "A melhor de todas as coisas é aprender. O dinheiro pode ser perdido ou roubado, a saúde e força podem falhar, mas o que você dedicou á sua mente é seu para sempre" Louis L. Amour SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15 2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 17 2.1 A doença de chagas ................................................................................................ 17 2.2 Transmissão ........................................................................................................... 18 2.3 Taxonomia ............................................................................................................. 19 2.4 Formas evolutivas .................................................................................................. 20 2.5 Ciclo evolutivo ....................................................................................................... 21 2.6 Fases da doença de chagas ...................................................................................... 23 2.6.1 Fase aguda ..................................................................................................... 23 2.6.2 Fase crônica ................................................................................................... 24 2.6.3 Fase latente ou indeterminada ........................................................................ 25 2.7 Mecanismos de invasão celular............................................................................... 25 2.8 Tratamento ............................................................................................................. 27 2.9 Cumarinas .............................................................................................................. 28 2.10 Complexos metálicos............................................................................................. 30 3 OBJETIVOS ............................................................................................................... 32 3.1 Objetivo geral......................................................................................................... 32 3.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 32 4 METODOLOGIA ....................................................................................................... 33 4.1 Material biológico .................................................................................................. 33 4.2 Compostos utilizados ............................................................................................. 33 4.3 Avaliação da citotoxidade em células vero ............................................................. 33 4.3.1 Infecção das células vero com T. cruzi........................................................... 34 4.4 Avaliação da atividade dos compostos contra as formas amastigotas das cepas G, CL e Esmeraldo do T. cruzi .......................................................................................... 35 4.5 Avaliação da atividade antiparasitária in vivo ......................................................... 37 4.5.1 Procedência dos animais ................................................................................ 37 4.5.2 Infecção dos animais com T. cruzi ................................................................. 37 4.5.3 Grupos de tratamento .................................................................................... 38 4.5.4 Avaliação da parasitemia ............................................................................... 38 4.5.5 Eutanásia dos animais ................................................................................... 39 4.6 Análise do perfil de citocinas .................................................................................. 39 5 RESULTADOS ........................................................................................................... 40 5.1 Avaliação da atividade antiparasitária dos compostos em células vero infectadas com as cepas G e CL e Esmeraldo .................................................................................. 41 5.2 Estudos in vivo ....................................................................................................... 46 5.2.1 Fase aguda .................................................................................................... 46 5.2.2 Análise da parasitemia dos animais infectados com a cepa G na fase aguda ... 46 5.2.3 Análise da parasitemia nos animais infectados com a cepa CL na fase aguda. 47 5.3 Estudos in vivo fase crônica .................................................................................... 48 5.4 Análise da parasitemia nos animais infectados com a cepa G na fase crônica .......... 48 5.5 Análise da parasitemia nos animais infectados com a cepa CL na fase crônica........ 48 5.6 Quantificação das citocinas IL-1, IL-12, IFN-beta e TNF-alfa no soro dos animais com doeça de chagas fase crônica. .......................................................................... 49 6 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 54 7 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 57 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 58 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Atividade citotóxica e índice de segurança dos compostos metálicos em células VERO e formas epimastigotas das cepas G e CL do T. cruzi ................................................ 31 Quadro 2. Esquema de tratamento na fase aguda .................................................................. 38 Quadro 3. Esquema de tratamento na fase crônica ................................................................ 38 Quadro 4. Esquema das associações dos compostos utilizados ............................................. 40 Quadro 5. Índice de infecção das células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi cepa G. ........................................................................................................................ 41 Quadro 6. Índice de infecção das células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi cepa CL. ...................................................................................................................... 42 Quadro 7. Índice de infecção das células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi cepa Esmeraldo. .......................................................................................................... 43 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Carlos Chagas, descobridor da doença. .................................................................. 17 Figura 2. Espécies de Triatomíneos com mais frequência no Brasil. Fonte: .......................... 18 Figura 3. Taxonomia do protozoário T. cruzi. ....................................................................... 19 Figura 4. Forma Tripomastigota. .......................................................................................... 20 Figura 5. Forma Amastigota. ................................................................................................ 21 Figura 6. Forma Epimastigota. ............................................................................................. 21 Figura 7. Ciclo de vida do T. cruzi.. ..................................................................................... 23 Figura 8. “Sinal de Romaña”. ............................................................................................... 24 Figura 9. Ativação e transdução de sinal em tripomastigotas metacíclicas ............................ 26 Figura 10. Estrutura química do Nifurtimox (3-metil-4-5 (nitrofurfurilidenoamina) ............. 27 Figura 11: Estrutura química do Benzonidazol (N-benzil-2-nitroimidazol acetamida) .......... 28 Figura 12: Estrutura química da cumarina (A) e 4-hidroxi-3-nitrocumarina .......................... 29 Figura 13. Teste colorimétrico do MTT. ............................................................................... 34 Figura 14. Lâminas contendo lamínulas com células VERO infectadas com cepa CL. .......... 36 Figura 15. Células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi............................. 36 Figura 16. Atividades das associações em cepas G e CL. ..................................................... 40 Figura 17. IF de células Vero com a forma amastigota da cepa G do T. cruzi. ...................... 42 Figura 18. IF de células Vero com a forma amastigota da cepa CL do T. cruzi.. ................... 43 Figura 19. IF de células Vero com a forma amastigota da cepa Esmeraldo do T. cruzi.. ........ 44 Figura 20. % de inibição do IF das três diferentes cepas do T. cruzi ..................................... 45 Figura 21. Parasitemia na fase aguda – infecção com a cepa G do T. cruzi, .......................... 47 Figura 22. Parasitemia na fase aguda – infecção com a cepa CL de T. cruzi ......................... 47 11 Figura 23. Parasitemia na fase crônica – infecção com a cepa G do T. cruzi ......................... 48 Figura 24. Parasitemia na fase crônica – infecção com a cepa CL do T. cruzi ....................... 49 Figura 25. Concentração de IL-1β (pg/ml) – infecção com a cepa G. .................................... 50 Figura 26. Concentração de IL-12 (pg/ml) – infecção com a cepa G. .................................... 51 Figura 27. Concentração de IFN-γ (pg/ml) - infecção com a cepa G ..................................... 52 Figura 28. Concentração de TNF-α (pg/ml) – infecção com a cepa G ................................... 53 12 LISTA DE ABREVIATURAS 4H3NC 4H3NC-Cu 4H3NC-Fe 4H3NC-Ni 4H3NC-Zn AMPc BZ DMSO DMEM DNA EDTA gp35/50 gp82 HEPES IP3 IF IC50 LIT MTT NADH PBS rpm RPMI SFB T. cruzi TEMED Tris-HCl 4-hidroxi-3-nitrocumarina 4-hidroxi-3-nitrocumarina-Cu2+ 4-hidroxi-3-nitrocumarina- Fe2+ 4-hidroxi-3-nitrocumarina- Ni2+ 4-hidroxi-3-nitrocumarina- Zn2+ Adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico Benzonidazol Dimetilsulfóxido Dulbecco’s Modified Eagle Medium Ácido desoxirribonucleico Ácido etilenodiaminotetraacético Glicoproteina 35 e 50 kDa de T. cruzi Glicoproteina 82 KDa de T.cruzi (4-(2-hydroxyethyl)-ácido 1-piperazineethanesulfonic) Receptor trisfosfato de inositol Índice de infecção Concentração inibitória de 50% Liver Infusion Triptase 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio /triptose Nicotinamida adenina dinucleotídeo Tampão Salina fosfato Rotações por minuto Roswell Park Memorial Institute - 1640 meio para cultivo de células Soro fetal bovino Trypanosoma cruzi Tetramethylethyldiamine (hidroxymethyl) aminomethane hydrochloride 13 RESUMO A doença de Chagas ou Tripanossomíase Americana é uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Foi descoberta no Brasil por Carlos Chagas, ao examinar uma menina doente, encontrou tripanossomos em seu sangue. Posteriormente nas fezes de insetos existentes na região e em sangue de animais mamíferos, constatou também a presença dos mesmos parasitas. Neste estudo foi relatada a susceptibilidade de diferentes cepas do protozoário Trypanosoma cruzi a compostos metálicos e suas associações na eliminação de forma amastigotas, responsável pela fase crônica da doença. Usando combinações de compostos metálicos que resultaram maiores índices de segurança (IS), analisamos sinergia no tratamento de camundongos infectados pelas cepas G e CL de T.cruzi, estudando a ação na fase aguda e crônica da doença de Chagas. Os estudos in vitro foram realizados com as duas cepas G e CL nas formas amastigotas de T. cruzi tratados com benzonidazol, cumarina, 4-hidroxi-3-nitrocoumarin (4H3NC) e 4H3NC associado com metais (cobre, ferro, zinco ou níquel). A utilização de compostos relacionados com o tratamento de amastigotas mostrou uma maior eficácia em relação ao benzonidazol, assim como diferenças entre as cepas. Análise in vivo do sinergismo de ação dos compostos associados com zinco e ferro apresentou resultados muito promissores. Um total de 64 animais foi dividido em grupos que foram infectados com cepas de T. cruzi G e CL e depois tratadas com protocolos diferentes para a doença de Chagas aguda e crônica. A parasitemia foi realizada a cada 72 horas a partir do sétimo dia, por contagem do número de parasitas / mL em uma gota de sangue obtida a partir da cauda do animal. A análise mostrou significância na atividade antiamastigota de compostos 4H3NC-Cu, cumarina e 4H3NC-Fe em comparação ao controle e benzonidazol em diferentes linhagens. Estudos in vivo de sinergismo de ação dos compostos para a fase aguda da doença de Chagas experimental mostrou maior eficácia do que o tratamento com benzonidazol. Na fase aguda da doença de Chagas experimental, in vivo, o tratamento com a associação do benzonidazol com a 4H3NC-Fe controlou a parasitemia inibindo significativamente a multiplicação dos parasitos nos animais infectados com a cepa G as associações do benzonidazol com 4H3NC-Fe e 4H3NC-Zn diminuiram em 40% o número de parasitos circulantes. Para a cepa CL os achados demonstram o potencial antiparasitário das associações contra as cepas G e CL do T.cruzi. Palavra chave: doença de Chagas, fase aguda e crônica, sinergismo 14 ABSTRACT American trypanosomiasis or Chagas disease is a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. It was discovered in Brazil by Carlos Chagas, to examine a sick girl, found trypanosomes in their blood. Later in the feces of insects of the region and the blood of mammals, also found the presence of these parasites. This study reported the susceptibility of different strains of the protozoan Trypanosoma cruzi the metal compounds and their associations in the elimination of amastigotes, responsible for the chronic phase of the disease. Using combinations of metallic compounds resulting increased security indices (IS), we analyze synergy in the treatment of mice infected with strains G and T. cruzi CL, studying the action in acute and chronic Chagas disease. In vitro studies were performed with both strains G and CL in amastigotes of T. cruzi treated with benznidazole, Coumarin, 4-hydroxy3-nitrocoumarin (4H3NC) and 4H3NC associated with metals (copper, iron, zinc, or nickel) . The use of compounds related to the treatment of amastigotes showed greater effectiveness in benznidazole, as well as differences between the strains. In vivo analysis of synergism of action of the compounds associated with zinc and iron showed very promising results. A total of 64 animals were divided into groups that were infected with T. cruzi G or CL and then treated with various protocols for acute and chronic Chagas' disease. The parasitemia was performed every 72 hours from the seventh day by counting the number of parasites / ml in a drop of blood obtained from the tail of the animal. The analysis showed significance in the anti-amastigote activity 4H3NC-Cu compounds, coumarin and 4H3NC-Fe compared to the control and benznidazole in different lineages. In vivo synergistic action of compounds to the acute phase of experimental Chagas disease show greater efficacy than treatment with benznidazole. In the acute phase of experimental Chagas' disease, in vivo, treatment with the combination of benznidazole with 4H3NC Fe-controlled parasitaemia significantly inhibiting the multiplication of parasites in animals infected with strain G; benznidazole the associations with 4H3NC-Fe-Zn and 4H3NC decreased by 40% the number of circulating parasites. For the CL strain findings demonstrate the potential antiparasitic associations against strains G and T. cruzi CL. Keyword: Chagas disease, acute and chronic phase, synergism 15 1 INTRODUÇÃO A doença de Chagas foi descoberta em 1909, pelo médico e cientista brasileiro Carlos Chagas. Primariamente, ocorre apenas nas Américas, em virtude da distribuição do vetor estar restrita a este continente. Entretanto, são registrados casos em países não endêmicos por outros mecanismos de transmissão ou pela migração intensa de latino-americanos para outros continentes (FIOCRUZ, 2013). No Brasil, atualmente predominam os casos crônicos de doença de Chagas decorrentes de infecções adquiridas no passado. No entanto, nos últimos anos, a ocorrência de doença de Chagas aguda tem sido observada nos estados da Amazônia Legal (Acre, Amazonas, Amapá, Rondônia, Roraima, Pará, parte do Tocantins, Maranhão e Mato Grosso), com ocorrência de casos isolados em outros estados. Estima-se que existam aproximadamente 12 milhões de portadores da doença crônica nas Américas, cerca de 2 a 3 milhões no Brasil. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 8 milhões de pessoas estão infectadas com a doença de Chagas no mundo e 25 milhões encontram-se em áreas de risco para a enfermidade (AGÊNCIA FIO CRUZ DE NOTÍCIAS, 2013). A doença de Chagas é uma das principais causas das doenças do coração na América Latina, sendo a principal causa de morbidade e mortalidade que ocorre de 5 a 30 anos após a infecção primária em cerca de 30% dos indivíduos infectados (NETO, 1999). É uma doença de evolução crônica, debilitante, que determina no homem quadros clínicos com características e consequências muito variadas. Essa doença constitui um grande problema social e sobrecarrega os órgãos de previdência social, com um montante de aposentadorias precoces nem sempre necessárias. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) e o banco Mundial, são gastos mais de seis bilhões de dólares por ano no tratamento dessa doença, pois, essa enfermidade faz com que o indivíduo se torne debilitado e incapaz, sendo uma das principais causas da aposentadoria antecipada (DIAS; LOYOLA; BRENER, 1985; LOPES; CHAPADEIRO, 1986). Historicamente, por motivos econômicos, a indústria farmacêutica não tem investido na pesquisa e desenvolvimento de novos compostos contra as doenças negligenciadas, como a doença de Chagas. O único medicamento de referencia no Brasil atualmente é o benzonidazol que possui eficácia limitada à fase aguda, bem como efeitos colaterais severos e a resistência desenvolvida por algumas cepas do Trypanosoma cruzi. Assim, existe uma necessidade urgente de novas estratégias de tratamento, como a utilização de compostos naturais e 16 sintéticos com potencial atividade biológica e que possam ser administrados conjuntamente aos tratamentos atuais, visando um sinergismo de ação antiparasitária e diminuição dos efeitos colaterais (TEIXEIRA; 1987). 17 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 A doença de chagas A doença de Chagas ou Tripanossomíase Americana é uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Foi descoberta no Brasil por Carlos Chagas, pesquisador do Instituto Oswaldo Cruz, em 1909, cujo nome da doença é dado em sua homenagem. Este brasileiro descobriu a doença e descreveu praticamente todos os seus aspectos. Quando Carlos Chagas realizava uma campanha contra a malária que atingia operários na construção de um trecho da Estrada de Ferro Central do Brasil, ao norte de Minas Gerais, ao fazer exames de uma menina doente, encontrou tripanosomos em seu sangue. Ao examinar posteriormente as fezes de insetos existentes na região e o sangue de animais mamíferos, constatou também a presença dos mesmos parasitas. Desta forma, Carlos Chagas pode descrever o agente causador, o transmissor e o modo de transmissão da doença, como também comprovar a existência de vertebrados que são reservatórios silvestres e domésticos do parasita, esclarecendo assim os aspectos básicos da epidemiologia da doença. A transmissão do parasito para humanos ou outros animais é normalmente feita por meio do inseto triatomíneo hematófago popularmente chamado de “barbeiro” (MAYA, 2006). Figura 1. Carlos Chagas, descobridor da doença em seu Laboratório no Instituto Oswaldo Cruz. Fonte: Revista Vive Latinoamérica (15 de abril de 2014) 18 2.2 Transmissão A transmissão do parasito para humanos ou outros animais é normalmente feita por meio do inseto triatomíneo. O inseto vetor transmissor possui hábito noturno e se alimenta, exclusivamente, do sangue de animais vertebrados. Vivem em frestas de casas de pau a pique, camas, colchões, depósitos, ninhos de aves, troncos de árvores, dentre outros locais, sendo que tem preferência por locais próximos à sua fonte de alimento. Nessas habitações criaram-se condições ideais favoráveis para a vida de várias espécies de triatomíneos. O barbeiro é também conhecido por outras denominações, tais como: “chupança” ou “bicho de parede”, “fincão”, “bicudo” ou “chupão”. Originalmente silvestres ou exóticos, eles aí se domiciliaram e passaram a transmitir a infecção aos moradores e aos seus animais domésticos (REY, 2001). Existem mais de 100 espécies de insetos triatomíneos no continente americano e muitos desses são responsáveis pela manutenção do ciclo selvático da doença. No Brasil, os vetores mais importantes para a doença de Chagas são: Rhodnius prolixus, Panstrogilus megistus e Triatoma infestans. Em 2013, o Laboratório Nacional e Internacional de Referência em Taxonomia de Triatomíneos do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz) identificou um novo triatomíneo, o Triatoma pintodia. Figura 2. Espécies de Triatomíneos com mais frequência no Brasil. Fonte: Acervo pessoal – Adaptação feita do site: http://web.stanford.edu/group/parasites/ParaSites2004/Trypanosomiasis/vector.htm 19 A transmissão pode também ocorrer por transfusão de sangue, transplante de órgãos, aleitamento materno, durante a gestação, ingestão de formas parasitárias em alimentos contaminados e de forma acidental, quando ocorre por meio de outros vetores ou pelo contato direto com as fezes infectadas de triatomíneos (DIAS, 1992). 2.3 Taxonomia O agente etiológico da doença de Chagas, o protozoário flagelado T. cruzi, pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, gênero Trypanosoma, e espécie Trypanosoma cruzi, conforme o esquema representado na Figura 3. Figura 3. Taxonomia do protozoário T. cruzi. Fonte: Acervo pessoal – Construção Cmap Tools 20 2.4 Formas evolutivas Pela observação por microscopia óptica do T. cruzi é possível à identificação de três formas evolutivas bem definidas: a) Forma Tripomastigota: forma alongada (podendo se apresentar como formas finas e largas), com cinetoplasto arredondado, localizado na região posterior ao núcleo; flagelo emergindo da bolsa flagelar (não visível ao microscópio óptico) que se localiza lateralmente, na região posterior do parasito. O flagelo emerge e se adere ao longo do corpo do parasito, tornando-se livre na região anterior. Esta forma é infectante e pode ser encontrada no inseto vetor (porção posterior do intestino, no reto); sangue e espaço intercelular dos hospedeiros vertebrados; Por microscopia eletrônica de transmissão podemos ver que a sua superfície é bastante rugosa (AGUIAR, 2008). Figura 4. Forma Tripomastigota. Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/353039 b) Forma Amastigota: forma arredondada, com cinetoplasto em forma de barra ou bastão na região anterior ao núcleo, flagelo curto (não visível ao microscópio óptico) que emerge da bolsa flagelar. Esta forma pode ser encontrada no interior das células de hospedeiros infectados (Figura 5). Por microscopia eletrônica de transmissão sua superfície é bastante rugosa. Todos os membros da família Tripanossomatidae apresentam um flagelo que emerge de uma área de invaginação da membrana que reveste o corpo celular e forma a bolsa flagelar. Na forma amastigota o flagelo é muito curto, muitas vezes permanecendo no interior da bolsa flagelar, razão pelo qual às vezes não é visto ao microscópio óptico, o que levou à criação do termo amastigota (sem flagelo) para erroneamente designar a forma intracelular multiplicativa do T. cruzi e de Leishmania sp. (SOUZA, 2008b, apud, AGUIAR, 2008). 21 Figura 5. Forma Amastigota. Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/353039/ c) Forma Epimastigota: forma alongada, com cinetoplasto em forma de barra ou bastão localizado anteriormente ao núcleo (Figura 6). O flagelo emerge da bolsa flagelar com abertura lateral, e percorre aderido a parte do corpo do parasito, tornando-se livre na região anterior. Pode ser encontrado no tubo digestivo do inseto vetor. Por microscopia eletrônica de transmissão sua superfície é bastante lisa, exceto na região mais especializada do citóstomo(SOUZA, 2008b, apud, AGUIAR, 2008). Figura 6. Forma Epimastigota. Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/353039 2.5 Ciclo evolutivo Considerando-se o ciclo natural da infecção, o parasito estaria primitivamente restrito aos pequenos mamíferos e marsupiais selvagens das matas e campos da América, desde a Patagônia até o Sul dos Estados Unidos. Com o início da colonização espanhola e portuguesa, desmatamentos, queimadas, introdução de novas espécies de animais e mudanças de hábitos, levaram á redução do habitat dos triatomíneos, levando-os a invadirem os espaços ocupados pelos colonos e suas criações de animais (REY, 2001). O ciclo evolutivo completo do T. cruzi ocorre em duas etapas, como descrito na figura 7: uma no interior do hospedeiro invertebrado, denominado vetor e outra no interior do hospedeiro vertebrado, mamíferos em geral (REY, 2001). Envolve formas proliferativas e 22 formas altamente diferenciadas com capacidade infectante. Os insetos hematófagos (subfamília Triatominae,) são responsáveis pela transmissão da doença de Chagas para os hospedeiros mamíferos. Nos triatomíneos ocorrem as formas epimastigotas (proliferativas) e tripomastigotas metacíclicas. A primeira diferenciação do parasito no inseto vetor ocorre no estômago, onde o tripomastigota transforma-se em epimastigota poucas horas após a ingestão. A segunda diferenciação do parasito no tubo digestivo do vetor se dá quando os epimastigotas se transformam em tripomastigotas metacíclicos, sendo esta a forma infectante para o hospedeiro vertebrado (DE SOUZA, 2000; CARLIER, TORRICO, 2003). Após o repasto sanguíneo, estes insetos depositam suas fezes contendo as formas tripomastigotas metacíclicas do protozoário próximo ao orifício de picada. As formas tripomastigotas chegam ao interior das células onde ocorre a diferenciação em amastigotas, que por proliferação, formam ninhos. A entrada dos protozoários nas formas metacíclicas por lesões na pele ou através de mucosas resulta em posterior invasão de células do hospedeiro, tais como macrófagos, fibroblastos e células musculares estriadas e lisas. Após a diferenciação em tripomastigotas, ocorre a ruptura da célula e a liberação os parasitos no meio extracelular (BRENNER e ANDRADE, 2008, p. 13). No sangue periférico dos hospedeiros mamíferos, as formas tripomastigotas são compostas de duas populações pleomórficas principais: a fina ou alongada e a arredondada. Após a invasão celular, as formas tripomastigotas, em todas as cepas, são englobadas no vacúolo parasitóforo, onde, são internalizados, permanecendo um período, para, em seguida, se diferenciarem à forma amastigota, sendo posteriormente liberadas (REY, 2001). A forma amastigota é a responsável pela proliferação intracelular do parasito e, após alguns ciclos de replicação, estas se diferenciam novamente nas formas tripomastigotas, que são liberadas, podendo atingir a corrente sanguínea após a ruptura celular. Devido á sua motilidade, as formas tripomastigotas são capazes de infectar outras células ou tecidos, fechando o ciclo quando um triatomíneo não infectado fizer seu repasto sanguíneo (REY, 2001). 23 Figura 7. Ciclo de vida do T. cruzi. (1) O parasito presente no intestino do vetor ainda na forma epimastigota, (2) se diferencia para a forma tripomastigota (forma infectante) quando chega às fezes do inseto, (3) que é levado à corrente sanguínea do hospedeiro. 2.6 Fases da doença de chagas 2.6.1 Fase aguda A fase aguda da doença de Chagas é mais comum em crianças, inicia-se quando o inseto vetor elimina as fezes contendo as formas tripomastigotas infectantes na pele. No local da penetração do T.cruzi ocorre um edema dos gânglios linfáticos (ROBERTS; JANOVY, 2009; FOX, 2011). O Trypanosoma cruzi pode evadir-se do sistema imune por vários mecanismos, incluindo a indução de efeitos supressores nas células T, invasão de células fagocíticas, como macrófagos e adaptação ao microambiente intracelular, evitado uma resposta de anticorpos. A entrada de T. cruzi em macrófagos é mediada por lisossomos recrutados para o local de entrada na membrana plasmática (SACKS; SHER, 2002). Em metade dos casos, a forma tripomastigota penetra no corpo através da conjuntiva do olho, caracterizando o denominado sinal de Romaña (Figura 8). A conjuntiva e a pálpebra sucumbem ao edema; há um acúmulo de líquido intersticial nestas áreas. Ocorre também o edema do nódulo linfático anterior dos ouvidos, como uma característica do sinal de Romaña. Durante esta fase aguda, o T. cruzi 24 circula no sangue e pode ser transportado para qualquer órgão do corpo (TORTORA; NIELSEN, 2012). Figura 8. “Sinal de Romaña”. Fonte: http://medicinabaseadaemresidencia.blogspot.com.br/2013/02/diagnostico-diferencial. Tripomastigotas podem ser detectados por testes sorológicos na fase aguda (GALVÃO-CASTRO, 1984). Estas formas penetram nas células do sistema circulatório, transformam-se em amastigotas e se reproduzem. Os parasitos penetram nas células do baço, fígado, da mucosa intestinal e sistema linfático e nas células musculares lisas e esqueléticas cardíacas. Os músculos cardíacos são normalmente invadidos, e até 80% das células ganglionares cardíacas ou massas de células nervosas, podem ser destruídas. As contrações do coração permitem a circulação do sangue oxigenado no corpo por causa de autoestimulação, impulsos autonômicos gerados e conduzidos por tecido nervoso. Se o tecido nervoso, que não sofre divisão celular, for danificado, ou seja, destruído pelo T. cruzi, o músculo cardíaco não mais se contrai, e, eventualmente, esta condição é fatal (ROBERTS; JANOVY, 2009). No interior da célula, os parasitos transformam-se em amastigotas reproduzindo-se por divisão binária até a destruição das células hospedeiras, com a liberação dos parasitos. Assim, os parasitos, invadirão outras células ou se transformarão em formas intermédias, como promastigotas e epimastigotas, nos espaços intersticiais. Algumas destas formas intermédias irão converter-se em tripomastigotas e entrar na corrente sanguínea podendo infectar outros órgãos (CAMPBELL; REECE, 2009). 2.6.2 Fase crônica A fase crônica da doença de Chagas é mais comum em adultos. Esta fase caracterizase por uma grande variedade de sintomas. Em regiões endêmicas, a doença de Chagas pode ser responsável por até 70% das mortes por problemas cardíacos. Outros órgãos comumente invadidos incluem o esôfago e cólon. De forma semelhante ao coração, o tônus muscular e os 25 neurônios ao longo dos órgãos são destruídos. Os órgãos perdem sua função, tornando-se frouxos e extremamente alargados, e no caso do cólon e do esôfago ocorre a dificuldade ou impossibilidade da passagem dos alimentos e do bolo fecal. Esta patologia pode ser fatal, especialmente quando a pessoa infectada não pode deglutir devido à impossibilidade de passagem de alimentos pelo aparelho digestivo. Estas condições progressivas são chamadas megaesôfago e megacólon (ROBERTS; JANOVY, 2009). O tropismo tecidual, ou a resposta do tecido afetado devido á presença de T. cruzi, no coração e órgãos intestinais não é completamente compreendido, apesar de quase um século de pesquisa da doença de Chagas. 2.6.3 Fase latente ou indeterminada A fase de latência da doença de Chagas, outro aspecto da infecção por T. cruzi, é apenas parcialmente compreendida. Esta fase é interessante devido ao fato de que o indivíduo infectado não demonstra quaisquer sintomas clínicos, por muitos anos. A infecção é detectada por exames sorológicos com resultados positivos (GALVÃO-CASTRO, 1984). 2.7 Mecanismos de invasão celular As membranas do tripanossoma e das células do hospedeiro interagem ao iniciar a infecção. Todos os tipos de células cultivadas de mamíferos são passíveis de invasão por T. cruzi, porém apenas as formas tripomastigotas podem penetrar em células que não desenvolvam grande atividade fagocitária. A eficiência com que isso se dá depende da natureza da célula e da linhagem do tripanossomo (REY, 2001). O estabelecimento da infecção por T. cruzi, depende de uma série de eventos envolvendo interações de diversas moléculas do parasito com componentes do hospedeiro. Durante a internalização de tripomastigotas, vias de transdução de sinal são ativadas tanto no parasito como na célula alvo, acarretando a mobilização de cálcio (Ca2+). Para adesão, o tripomastigota utiliza as glicoproteínas de superfície como a gp82 e gp35/50, que são moléculas indutoras de sinal de Ca2+. O contato de glicofosfolipídeos de membrana do T. cruzi com a célula hospedeira via receptores Toll–like induz a via de sinalização de inositol fosfato (IP3) e IP3–kinases, produzindo agregação de vesículas lisossomais na membrana plasmática, favorecendo a entrada do parasito na célula. Simultaneamente, sinais proinflamatórios são produzidos através de interferon gama (INF-interleucina 12 (IL-12) e fator de necrose tumoral (TNF-, que consequentemente eleva níveis de óxido nítrico (NO) 26 intracelular, essencial para atividade parasiticida do macrófago. Por outro lado o parasito produz uma resposta inflamatória direcionada para evasão do sistema imune do hospedeiro, como indução de apoptose em diversas células e imunossupressão do hospedeiro (MAYA, 2006). Em isolados de T. cruzi cepa CL que entram na célula hospedeira de maneira dependente de gp82, a proteína quinase assim como a fosfolipase C do parasito são ativadas e Ca2+ é liberado de reservatórios sensíveis a IP3. Enquanto em isolados de T. cruzi cepa G que se ligam às células alvo através de gp35/50, a via de sinalização envolvendo adenilil ciclase parece ser estimulada, com liberação de Ca2+ de acidocalciossomos. (Figura 9). Além disso, dependendo do isolado de T. cruzi, sinais inibitórios mediados por gp90 específica de tripomastigota podem ser desencadeados tanto na célula hospedeira como no parasito. O repertório de moléculas de tripomastigota de cultura de tecido implicadas na invasão celular inclui glicoproteínas de superfície da família gp85, com membros contendo sítios de ligação à laminina e citoqueratina 18, enzimas como a cruzipaína, trans-sialidase e uma oligopeptidase B que gera um agonista de Ca2+ a partir de uma molécula precursora (YOSHIDA, 2006). Figura 9. Ativação de diferentes vias de transdução de sinal em tripomastigotas metacíclicas de T. cruzi. isolados, durante a invasão da célula hospedeira. Na cepa CL altamente invasiva, o reconhecimento da molécula de superfície gp82 por seu receptor leva à ativação proteína quinase (PTK), fosforilação de p175, ativação da PLC, geração de IP3, culminando com a liberação mediada por IP3 de Ca2+, provavelmente do retículo endoplasmático. Os componentes da cepa G que sinalizaram a cascata provocada na superfície da célula por gp35/50, são praticamente desconhecidas; AMPc gerados pela guanilatociclase podem estar envolvidos, e acidocalcisomas parece ser a fonte de cálcio necessária para a internalização do parasito. Fonte: YOSHIDA, 2006. 27 2.8 Tratamento O desenvolvimento de medicamentos eficientes contra a doença de Chagas continua sendo um desafio para pesquisadores de todo o mundo. Existem dois medicamentos que foram utilizados para o tratamento da infecção por T. cruzi, o nifurtimox e o benzonidazol. Devido à toxidade do nifurtimox o seu uso está suspenso no Brasil. Estes medicamentos possuem efeitos colaterais importantes que afetam aproximadamente 40% dos pacientes, sendo algumas vezes necessária a sua suspensão (URBINA, 2003; FIOCRUZ, 2014). O mecanismo de ação do nifurtimox (Figura 10) envolve a produção de radicais livres, por meio da redução do grupamento nitro, o que leva á morte do parasito (URBINA, 1999). Como consequência, os tecidos do hospedeiro também podem ser lesados e ocorrer reações de hipersensibilidade, anorexia, vômitos, polineurite e depressão da produção de células da medula óssea. O principal mecanismo de ação do nifurtimox contra o T. cruzi é a produção do radical livre hidroxila (OH•) (URBINA, 2003). Figura 10. Estrutura química do Nifurtimox (3-metil-4-5 (nitrofurfurilidenoamina) traidro-4H-1, tiazina 1-1 dióxido). O benzonidazol (figura 11) apresenta eficácia acima de 80% na fase aguda e diminuiu para 8% a 30% na fase crônica. O sucesso da terapêutica reside em alguns pontos tais como: esquema terapêutico prolongado, reações adversas, variabilidade genética dos parasitos e cepas naturalmente resistentes aos fármacos; mostrando a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos que, por um lado, apresentem menor toxicidade, e por outro, maior eficácia na fase crônica (OLIVEIRA at al., 2008). Seu mecanismo de ação ainda não está totalmente elucidado, podendo ocorrer por modificação covalente das macromoléculas por intermediários nitroreduzidos, ou por outras interações de nitroredução com os componentes do parasito (URBINA; DOCAMPO, 2003; DOCAMPO; MORENO, 1984). O benzonidazol incrementa a fagocitose, aumenta a mortalidade do T. cruzi por meio da indução de produção da citocina interferon gama (INF-γ) e da inibição da NADH-fumarato redutase do parasito (DOCAMPO; MORENO, 1984). A droga distribui-se no meio extra e intracelular, agindo 28 tanto sobre as formas tripomastigotas como sobre as formas amastigotas (POLAK; RICHLE, 1978, apud, OLIVEIRA et al., 2008; SILVEIRA et al., 2000, apud, OLIVEIRA et al., 2008). Figura 11: Estrutura química do Benzonidazol (N-benzil-2-nitroimidazol acetamida) Como a maioria das infecções parasitárias, a patologia da doença de Chagas é extremamente complexa. Existem duas principais manifestações da doença de Chagas, a fase aguda e crônica. Alguns indivíduos experimentam uma fase latente da doença, em que sintomas clínicos não estão presentes (GALVÃO-CASTRO et al., 1984). 2.9 Cumarinas As cumarinas são compostos naturais que apresentam um amplo espectro de atividades biológicas (SANDHU et al, 2014). O primeiro representante desta classe química foi isolado por Vogel, em 1820, da espécie Coumarona odorata. Esses metabólitos estão presentes em diferentes partes das plantas tanto nas raízes como nas flores e frutos e podem estar distribuídos em diferentes famílias de Angiospermae como Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae, nas quais são encontradas com ampla ocorrência. Também estão presentes em Fabaceae, Oleaceae, Moraceae e Thymeleaceae, entre outras, onde suas ocorrências são menores (RIBEIRO; KAPLAN, 2002). Mais de 1300 cumarinas foram identificadas como metabólitos secundários de plantas, bactérias e fungos. A função das cumarinas não está bem clara, embora seja sugerido que possam atuar como reguladores do crescimento das plantas, bacteriostáticos, fungiostáticos ou mesmo que sejam produtos de excreção (IRANSHAHI, 2009; BOGDAL, 1998). A cumarina demonstrou atividade anti-inflamatória em macrófagos murinos RAW264.7 estimulados por LPS in vitro e em edema de pata em camundongos (HUANG; DENG; LIÃO, 2012). Inibe a produção das enzimas ciclooxigenase e lipoxigenase e a geração de ânion superóxido. Algumas cumarinas são antagonistas da vitamina K, exibindo atividade anticoagulante (FYLAKTAKIDOU, et al. 2004; HIRSH; DALEN; ANDERSON, 2001). 29 A maior parte das cumarinas foi isolada de plantas, porém algumas foram isoladas de microorganismos, constituindo uma fonte para a produção de antibióticos como a novobiocina, metabólito da bactéria Streptomyces niveus (HESTRIN; FEINGOLD; AVIGAD, 1995). Uma grande variedade de produtos naturais têm sido descritos como agentes anti-HIV e compostos contendo núcleo de cumarina estão entre eles, inibindo inclusive a atividade da transcriptase reversa do HIV (PATIL; FREYER; EGGLESTON, 1993). Cumarinas apresentam atividade antitumoral inibindo a migração, invasão e metástase em câncer de mama, pela inibição de metaloproteinases de matriz e apresentaram citotoxicidade contra linhagens de células leucêmicas e de melanoma in vitro (YANG, et al., 2010; CHAKTHONG et al., 2012). Possuem ainda atividade anti-hipertensiva, anti-tuberculose, anticonvulsivante, antiadipogênica e anti-hiperglicemiante (KWON et al., 2011; IRANSHAHI et. al., 2009; BASILE et al., 2009). Compostos derivados da cumarina, como a 4-hidroxi-3-nitrocumarina (4H3NC), têm sido utilizados no tratamento de doenças como o câncer. A 4H3NC foi utilizada no tratamento do melanoma maligno, evitando a sua recorrência. Rehman e colaboradores (2013) demonstraram a atividade antimicrobiana e citotóxica de compostos derivados da nitrocumarina (REHMAN et al., 2013). A B Figura 12: Estrutura química da cumarina (A) e 4-hidroxi-3-nitrocumarina-(Sigma-Aldrich) (B) 30 2.10 Complexos metálicos Desde os tempos antigos os metais têm sido utilizados com sucesso para o tratamento de diversas doenças. Uma das características dos metais é seu potencial redox, especialmente, íons de metais de transição capazes de alternar entre vários estados de oxidação (GAUTIER et al., 2009). Compostos contendo metais oferecem muitas vantagens sobre os compostos convencionais no desenvolvimento de novos compostos medicinais. Estas vantagens devemse à capacidade de coordenar-se a ligante em uma configuração tridimensional, permitindo, assim, gerar grupos funcionais que podem ser delineados para alvos moleculares definidos (FRICKER, 2007; MEGGERS, 2009). Complexos baseados em metais oferecem um rico microambiente para a obtenção de uma variedade molecular com diferentes geometrias e números de coordenação o que não pode ser realizado com compostos baseados com carbono (YAN, et al., 2005; COHEN, 2007; OTT; GUST, 2007). A capacidade de sofrer reações de troca de ligantes oferece uma infinidade de possibilidade de interação com moléculas biológicas, como demonstradas pela forma de interação com DNA. O delineamento de agentes terapêuticos baseados em metais, não fica restrito apenas aos metais selecionados pela natureza e podem-se obter vantagens das propriedades únicas de metais não essenciais, incluindo os metais de transição de primeira e segunda séries e metais que podem conferir utilidades adicionais não encontradas na natureza (HAAS; FRANZ, 2009). O composto de coordenação consiste de um átomo central ligado a íons ou moléculas, denominados de ligantes que têm a propriedade de doar elétrons a esse átomo. Os compostos de coordenação apresentam um metal de transição ao qual se coordena a diferentes ligantes. Os metais apresentam a propriedade de interação com o DNA e seus sítios contendo átomos de oxigênio e nitrogênio. A coordenação dos metais a ácidos nucleicos pode resultar em efeitos terapêuticos como a atividade anticarcinogênica (GARETH, 2003). Os metais ocorrem nos sistemas biológicos como íons livres ou ligados covalentemente a moléculas biológicas. Os metais têm propensão a perder elétrons formando íons com carga positiva (cátions) que são mais solúveis em fluidos orgânicos. Os íons metálicos apresentam deficiência de elétrons, ao passo que biomoléculas como proteínas e DNA são ricas em elétrons. Esta oposição de cargas gera uma atração que leva à interação entre íons metálicos e as moléculas biológicas (BENITE, 2007). 31 Em estudos preliminares, Lozano (2011) avaliou a cumarina e os compostos 4H3NC, 4H3NC-Fe, 4H3NC-Ni, 4H3NC-Zn, 4H3NC-Cu, benzonidazol e associações sobre as formas epimastigotas e amastigotas do T.cruzi, demonstrando a ação citotóxicas dos compostos sobre as células VERO e células VERO infectadas com a forma amastigota do T.cruzi. Os valores das IC50 dos compostos (em µM) e dos índices de seletividade (IS) estão expressos no quadro 1. A partir destes dados, buscou-se uma variação na combinação das concentrações dos compostos, com potencial atividade antiparasitária contra as cepas G e CL e Esmeraldo do T. cruzi. Quadro 1. Atividade citotóxica e índice de segurança dos compostos metálicos em células VERO e formas epimastigotas das cepas G e CL do T. cruzi Compostos Células VERO IC50 (µM) Cumarina 4H3NC 4H3NC- Fe 4H3NC- Ni 4H3NC- Zn 4H3NC- Cu Benzonidazol 786,84 662,66 >378,40 270,27 100 247,41 514,54 T. cruzi cepa G IC50 (µM) 68,4 362,1 20 24,4 100 186,2 38,4 Índice de segurança(IS) * 11,2 1,8 18,92 11,1 1 1,32 13,4 T.cruzi cepa CL IC50 (µM) 68,4 120 20 12,2 50 268,96 19,2 Índice de segurança(IS) * 11,2 5,5 18,92 11,6 2 0,91 26,8 Fonte: Lozano (2011) modificado *O índice de segurança (IS) é obtido pelo cálculo da relação entre a IC50 das células VERO e a IC50 das formas epimastigotas. 32 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Estudar a susceptibilidade de diferentes cepas do protozoário T. cruzi, aos complexos metálicos da 4-hidroxi-3-nitrocumarina (4H3NC) com Zn, Fe, Cu e Ni na associação com Benzonidazol na eliminação do parasito intracelular em experimentos in vitro e in vivo. 3.2 Objetivos específicos Determinar a IC50 dos complexos metálicos da 4-hidroxi-3-nitro cumarina contra as formas amastigotas das cepas G e Cl do T. cruzi; Comparar a atividade antiparasitária dos complexos metálicos da 4-hidroxi-3-nitro cumarina com a atividade da droga usual de tratamento da doença de Chagas, o benzonidazol; Avaliar o sinergismo de ação dos complexos metálicos da 4-hidroxi-3-nitrocumarina associados ao benzonidazol, na forma intracelular das cepas G, CL e Esmeraldo do T. cruzi. Estudar em camundongos Swiss, infectados com T. cruzi cepas G e CL, a ação sinérgica do tratamento com os complexos metálicos da 4-hidroxi-3-nitrocumarina que obtiveram índice de seletividade (IS) > 10. Avaliar o perfil de citocinas dos animais infectados com as cepas G e CL do T. cruzi tratados com os complexos metálicos da 4-hidroxi-3-nitrocumarina. 33 4 METODOLOGIA 4.1 Material biológico Neste trabalho, foram utilizadas células VERO que são fibroblastos provenientes de uma linhagem derivada do rim do macaco verde africano (Cercopithecus aethiops) e três cepas do T. cruzi, a cepa G, representante do grupo I integrante do ciclo silvestre isolada de Didelphis marsupialis na região amazônica, Brasil (YOSHIDA, 1983); a cepa CL, representante do grupo VI integrante do ciclo doméstico isolada de Triatoma infestans no Rio Grande do Sul, Brasil (BRENER; CHIARI, 1963); e a cepa Esmeraldo, representante do grupo II isolado de humanos no Brasil (BRISSE et al., 2000, ZINGALES et al., 1998), gentilmente cedidas pelo Dr. José Franco da Silveira do Departamento de Microbiologia, Imunologia, Parasitologia da UNIFESP (Universidade Federal de São Paulo). 4.2 Compostos utilizados Nos experimentos in vitro foi utilizado o benzonidazol (LAFEPE), cumarina (2H-1Benzopirano-2-ona-Sigma-Aldrich), 4-hidroxi-3-nitrocumarina (4H3NC-Sigma-Aldrich) e quatro complexos metálicos (4H3NC-Zn, 4H3NC-Cu, 4H3NC-Fe, 4H3NC-Ni) sintetizados pelo grupo da Dra. Regina Mara Silva Pereira do Laboratório de Química de Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmácia da Universidade Anhanguera de São Paulo. Para o preparo da solução de benzonidazol um comprimido de 100 mg de Lafepe-Benzonidazol® foi macerado em cadinho e diluído em solvente dimetilsulfóxido (DMSO). A cumarina, 4 hidroxi-3-nitrocumarina (4H3NC) e seus complexos metálicos foram diluídos em DMSO. 4.3 Avaliação da citotoxidade em células vero A citotoxicidade dos compostos nas células VERO foi avaliada pelo método do MTT. Este teste colorimétrico baseia-se na capacidade das células viáveis converterem o sal de tetrazólio solúvel (MTT) num precipitado de formazan insolúvel. As células VERO foram cultivadas em garrafas de cultura de células de 75 cm2, em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) 1 mg/L de estreptomicina, 1000 UI/L de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 10% de soro fetal bovino (GIBCO), em estufa a 37°C com 5% de CO2 até atingirem a semiconfluência. Posteriormente, 1x105 células/mL foram plaqueadas em placas de 24 poços, foto representada na figura 13, incubadas em estufa a 37ºC, 5% de CO2, durante 24 horas. Após esse período, foi retirado o sobrenadante e adicionado novo meio e os compostos em diferentes 34 concentrações: benzonidazol (38,4µM), cumarina (68,4 e 136,8 µM), 4H3NC (241,38 e 362 µM), 4H3NC-Fe (126, 25,2 e 50,4 µM), 4H3NC-Ni (24,4, 48,8 µM), 4H3NC-Zn (60,4, 120,88 µM), 4H3NC-Cu (124,10 e 186,2 µM), ao grupo controle sem tratamento, foi adicionado apenas meio RPMI. As placas foram incubadas por 24 horas. Após esse período, foi retirado o sobrenadante e adicionados 100µL de solução de MTT (0,5 mg/mL) aos poços e as placas foram incubadas por 4 horas, em estufa de CO2 a 37ºC. O sobrenadante foi retirado e adicionados 100 μL de DMSO para a dissolução dos cristais. A leitura das absorbâncias foi realizada em espectrofotômetro em comprimento de onda de 570 nm em leitor de microplacas (LABTECH-4000). A B Figura 13. Teste colorimétrico do MTT. Cristais de formazan (A) e a dissolução em DMSO (B). Fonte: Acervo pessoal. 4.3.1 Infecção das células vero com T. cruzi As células VERO (1x105 células/mL) foram cultivadas em garrafas de cultura de 75 cm2, em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com 10 mM HEPES (N[2Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid]), 24 mM de bicarbonato de sódio, 1 35 mg/L de estreptomicina, 1000 UI/L de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 10% de soro fetal bovino (GIBCO), em estufa a 37°C com 5% de CO2 até atingirem a semiconfluência. As formas tripomastigotas metacíclicas com as cepas G e CL, infectivas, foram obtidas de culturas das formas epimastigotas, ambas cultivadas em meio LIT- Liver Infusion Tryptase (0,5% de infusão de fígado, 0,5% de triptose, 0,4% de NaCl, 0,04% de KCl, 0,8% de fosfato de sódio, 0,2% de glicose, 0,001% de hemina e 10% de soro fetal bovino), incubadas por 10 dias, em tubo cônico estéril de 50 ml permitindo a diferenciação do parasito. Essas formas foram utilizadas para infectar as culturas de células VERO. As culturas de células VERO foram infectadas pela adição de 1x105 parasitos/mL, contendo em torno de 40% de formas tripomastigotas metacíclicas, diretamente na garrafa contendo as células. Após a infecção, as garrafas de cultura foram incubadas em estufa, a 37°C, com 5% de CO2 por 24 horas, o meio foi trocado e novamente as garrafas foram encubadas até o aparecimento dos ninhos de amastigotas intracelulares. 4.4 Avaliação da atividade dos compostos contra as formas amastigotas das cepas G, CL e Esmeraldo do T. cruzi As células VERO foram infectadas pelas formas tripomastigotas, como descrito anteriormente. Após um período de aproximadamente 5 dias de incubação, as formas tripomastigotas sofreram diferenciação em amastigotas intracelulares e multiplicaram-se. Após o aparecimento das formas amastigotas intracelulares foram adicionados 3,5 mL de tripsina 0,05%/EDTA 0,02%, para descolamento das células e o sobrenadante contendo as células foi recolhido em tubo cônico estéril de 50 mL e centrifugado a 3500 rpm por 5 minutos. As células infectadas foram contadas em câmara de Neubauer e 1x105 células/mL foram plaqueadas em placas de 24 poços, contendo lamínulas de 13 mm estéreis, incubadas por 24 h, a 37°C, com 5% de CO2. Após esse período, foram adicionados os compostos em diferentes concentrações e as placas foram incubadas por 24h, a 37°C, com 5% de CO2. As culturas foram observadas em microscópio invertido, para avaliação de possíveis alterações provocadas pelos compostos sobre as células e os parasitos. O meio de cultura das placas foi retirado e as lamínulas lavadas duas vezes, com 2 mL de PBS (Phosphate-buffered saline ) 1X (137mM de NaCl, 2,7mM KCl, 4,3mM de Na2HPO4, 1,47mM KH2PO4 com pH 7,4). Posteriormente, foi adicionado metanol 100% nos poços, por 2 minutos, para preservar a integridade celular e procedeu-se à lavagem das lamínulas com 2 mL de PBS. As células 36 aderidas foram coradas adicionando-se aos poços 500 μL de Giemsa (04 gotas/ml em água destilada), por aproximadamente 20 minutos, e em seguida lavadas com água destilada. As lamínulas foram distribuídas sobre papel toalha para secagem por 24h e na sequência fixadas sobre lâminas de microscopia com o auxílio de cola entellan representado na figura 14. Figura 14. Lâminas contendo lamínulas com células VERO infectadas com cepa CL. Fonte: Acervo Pessoal As lamínulas, em triplicatas, foram analisadas em microscópio óptico no aumento de 40x. A atividade dos compostos foi avaliada pela contagem de 200 células VERO por lamínula totalizando 600 células por triplicata, considerando-se o número de células infectadas e o número de amastigotas intracelulares, para determinação do índice de infecção (IF). Figura 15. Células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi. Fonte: Acervo Pessoal 37 O IF foi calculado utilizando a seguinte fórmula: definidos como a porcentagem de células infectadas X o numero médio de amastigota intracelular. IF=% de células infectadas x n° de amastigotas/n° de células infectadas 4.5 Avaliação da atividade antiparasitária in vivo 4.5.1 Procedência dos animais Os testes in vivo foram realizados após os estudos in vitro. Nesse estudo, foram utilizados 64 camundongos Swiss, machos com 45 dias de idade e peso aproximado de 3040g, provenientes da ANILAB-Animais de laboratório (Paulínia-São Paulo). Todos os experimentos in vivo foram realizados em conformidade com as normas e procedimentos estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), tendo sido aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA) da UNIAN. Universidade Anhanguera de São Paulo, protocolo: 006/13 4.5.2 Infecção dos animais com T. cruzi Foram infectados 32 animais com 106 parasitos da cepa G (formas tripomastígotas metacíclicas) e 32 animais com 106 parasitos da cepa CL (formas tripomastígotas metacíclicas). Os animais infectados com as cepas G e CL foram divididos em quatro grupos: grupo controle sem tratamento e três grupos de tratamento, conforme descrito nos quadros 1e 2. Os parasitos foram inoculados em um volume de 100µl, intraperitonealmente, e os animais foram observados durante 70 dias, incluindo a fase aguda e crônica da doença. Os animais foram mantidos no laboratório de farmacologia experimental (LAFE) em caixas de polipropileno, alimentados com ração comercial especifica para a espécie e água “ad libitum”. 38 4.5.3 Grupos de tratamento Na fase aguda os animais infectados com as cepas G e CL foram tratados no 4°, 5º, 7º, 8º e 11° dia de infecção totalizando cinco dias (Quadro 2). Quadro 2. Esquema de tratamento na fase aguda Grupos de tratamento Dose administrada Controle sem tratamento ------(n=3) Benzonidazol (n=3) 10 mg/100µl Benzonidazol + 4H3NC-Zn 10 mg/100µl + 1,5mg/ 150 µl (n=5) Benzonidazol + 4H3NC-Fe 10 mg/100µl + 1,32mg/ 200 µl (n=5) Volume total ------------100µl 250µl 300µl Fonte: Acervo Pessoal Na Fase crônica, os animais infectados com as cepas G e CL foram tratados com seis doses no 25°,26º, 27º, 28º, 33º e 40° dias de infecção (Quadro 3). Quadro 3. Esquema de tratamento na fase crônica Grupos de tratamento Dose administrada Controle sem tratamento Volume total ------- ------------- Benzonidazol (n=3) 10 mg/100µl 100µl Benzonidazol + 4H3NC-Zn 10 mg/100µl + 1,5mg/ 150 µl 250µl 10 mg/100µl + 1,32mg/ 200 µl 300µl (n=3) (n=5) Benzonidazol + 4H3NC-Fe (n=5) Fonte: Acervo Pessoal Os compostos foram administrados pela técnica de gavagem com o auxílio de uma cânula intragástrica. 4.5.4 Avaliação da parasitemia Na fase aguda, a parasitemia foi avaliada no 4º, 11º, 18º dias de infecção e na fase crônica, no 33º, 40º, 49º, 60º, 70º dias. A parasitemia é avaliada pela contagem do número de parasitos no sangue coletado da cauda do animal. O número de parasitos por mililitro de 39 sangue foi determinado por contagem direta, em microscópio óptico, em lâmina de vidro, de acordo com a técnica descrita por Brener (1962). O pico de parasitemia ocorre entre o 7 e o 18 dia de infecção. Após esse período, observa-se o declínio da parasitemia e o início da fase crônica. 4.5.5 Eutanásia dos animais Os animais foram eutanasiados com uma dose letal de tiopental sódico (ThiopentaxCristália®) 2,5% (0,1 ml/10g peso corporal) no 18º dia na fase aguda e no 70º dia na fase crônica. Os órgãos foram coletados para análises histológicas futuras. 4.6 Análise do perfil de citocinas O efeito dos compostos no perfil de citocinas foi analisado no soro dos animais infectados com as cepas G e CL do T. cruzi. Os animais infectados foram tratados com os compostos, no esquema descrito anteriormente, e ao final do período experimental o sangue foi coletado para a análise das citocinas: IL-1β, IL-12, IFN-γ e TNF-α, no soro dos animais, por imunoensaio, com a utilização do Mouse Cytokine 10-Plex Panel- NOVEX lifetechnologies, em colaboração com a Dra. Leda Talib (LIM 27-HC-USP). 40 5 RESULTADOS Os compostos metálicos foram preliminarmente associados ao benzonidazol para avaliar sinergismo de ação destes compostos. Na Figura 16 representada em (A), porcentagem de viabilidade celular das células VERO tratadas com os compostos A a F. Em (B), índice de infecção (IF), com as formas amastigotas de T. cruzi cepa G e CL. Figura 16. Os dados mostram a diferentes atividades das associações A, B e C, na cepa G e das associação E e F na cepa CL comparado ao benzonidazol. A associação C mostra um resultado melhor que o benzonidazol nas duas cepas. Fonte: Lozano (2011) modificado. A partir desses estudos a atividade de associações com diferentes concentrações dos compostos metálicos está descrito no quadro 4 o esquema das associações com as respectivas concentrações em micromolar (µM). Quadro 4. Esquema das associações dos compostos utilizados Compostos metálicos associados A1, A2 38,4 µM-Benzonidazol + 68,4 / 136,8 µM- Cumarina B1, B2 38,4 µM-Benzonidazol + 241 / 362,1 µM- 4H3NC C1, C2,C3 38,4 µM-Benzonidazol + 12,6 / 25,2 / 50,4 µM- 4H3NC-Fe D1, D2 38,4 µM-Benzonidazol + 24,4 / 48,8 µM 4H3NC-Ni E1, E2 38,4 µM-Benzonidazol + 60,4 / 120,8 µM- 4H3NC-Zn F1, F2 38,4 µM-Benzonidazol + 124,13 / 186,2µM- 4H3NC-Cu Fonte: acervo pessoal 41 5.1 Avaliação da atividade antiparasitária dos compostos em células vero infectadas com as cepas G e CL e Esmeraldo O índice de infecção foi um dos parâmetros utilizados para avaliar o efeito dos compostos nas células infectadas com as formas amastigotas do T. cruzi. Os quadros 5, 6 e 7 expressam os dados utilizados para o cálculo do IF. Quadro 5. Índice de infecção das células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi cepa G. Concentração % Células Nº Nº Células Compostos (µM) Infectadas Amastigota Infectadas IF* ---S/ tratamento 64,8 2301 389 383,5 38,4 Benzonidazol 19,8 897 145 149,5 68,4 A1 42,5 1123 255 187,2 136,8 A2 46,2 1330 277 221,7 241 B1 43,5 1227 261 204,5 362,1 B2 63,3 1683 380 280,5 12,6 C1 33,7 1278 202 213,0 25,2 C2 33,0 1117 198 186,2 50,4 C3 36,3 1300 218 216,7 24,4 D1 39,2 1151 235 191,8 48,8 D2 39,5 1576 237 262,7 60,4 E1 26,5 1002 159 167,0 121 E2 20,2 737 121 122,8 124,13 F1 29,8 881 179 146,8 186,2 F2 20,0 677 120 112,8 Fonte: Acervo Pessoal *O índice de infecção (IF) é calculado pela fórmula: % células infectadas x n°amastigotas intracelulares/n°células infectadas. De acordo com dados apresentados no gráfico da Figura 17, observa-se que as células infectadas com a cepa G e tratadas com todas as associações apresentaram diminuição do IF, em comparação às células infectadas do grupo controle sem tratamento. As associações E2, F1 e F2, por sua vez, diminuíram o IF, em mais de 60% ao do grupo tratado com o composto benzonidazol 61%. 42 Figura 17. Índice de infecção de células Vero com a forma amastigota da cepa G do T. cruzi. Tratamentos: benzonidazol 38,4 µM e suas associações com compostos metálicos. A1: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 68,4 µM ;A2: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 136,8 µM; B B1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 241 µM; B2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 362,1 µM; C1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 12,6 µM; C2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 25,2 µM; C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 50,4; D1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 24,4 µM; D2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 48,8 µM; E1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCZn 60,4 µM; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 120,8 µM; F1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 124,13 µM; F2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 186,2 µM. Fonte: Acervo Pessoal Nas células VERO infectadas com a cepa CL do T.cruzi, observa-se uma diminuição dos IFs entre 15,7% e 67% nos diferentes grupos de tratamento, em comparação ao controle sem tratamento, que está representado no quadro 6 abaixo. Quadro 6. Índice de infecção das células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi cepa CL. Compostos S/ tratamento Benzonidazol A1 A2 B1 B2 C1 C2 C3 D1 D2 E1 E2 F1 F2 Concentração (µM) ---38,4 68,4 136,8 241 362,1 12,6 25,2 50,4 24,4 48,8 60,4 121 124,13 186,2 % Células Infectadas 41,8 16,6 22,8 27,7 25,7 32,6 20,6 24,1 2,0 21,0 17,3 21,1 12,0 1083 1154 Nº Amastigota 1889 702 1021 1384 1591 1526 1088 819 620 707 663 622 619 195 184 Nº Células Infectadas 279 72 150 180 172 208 140 155 13 138 116 134 75 164,3 154,3 IF* 283,2 161,4 154,9 212,9 238,2 238,8 160,5 127,2 94,4 107,6 99,0 98,0 99,0 164,3 154,3 Fonte: Acervo Pessoal *O índice de infecção (IF) é calculado pela fórmula: % células infectadas x n°amastigotas intracelulares/n°células infectadas. 43 A figura 18 mostra a comparação do IF obtidas nas células VERO infectadas com a cepa CL do T.cruzi. E diferentemente tratados as associações C2, C3, D1, D2, E1 e E2 apresentaram índices de infecção de 12 a 24% menores que o benzonidazol. Figura 18. Índice de infecção de células Vero com a forma amastigota da cepa CL do T. cruzi. Tratamentos: benzonidazol 38,4 µM e suas associações com compostos metálicos. A1: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 68,4 µM ;A2: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 136,8 µM; B1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 241 µM; B2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 362,1 µM; C1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 12,6 µM; C2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 25,2 µM; C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 50,4; D1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 24,4 µM; D2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 48,8 µM; E1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCZn 60,4 µM; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 120,8 µM; F1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 124,13 µM; F2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 186,2 µM. Fonte: Acervo Pessoal. Nas células VERO infectadas com a cepa Esmeraldo do T. cruzi, observa-se uma diminuição do índice de infecção entre 12% e 46% nos grupos tratados com os diferentes compostos, em comparação ao grupo controle sem tratamento. Quadro 7. Índice de infecção das células VERO infectadas com a forma amastigota do T. cruzi cepa Esmeraldo. Compostos S/ tratamento Benzonidazol A1 A2 B1 B2 C1 C2 C3 D1 D2 E1 E2 F1 F2 Concentração (µM) ---38,4 68,4 136,8 241 362,1 12,6 25,2 50,4 24,4 48,8 60,4 121 124,13 186,2 % Células Infectadas 34,3 21,0 37,5 44,7 37,0 75,5 53,1 75,0 50,6 85,5 45,7 62,6 59,9 63,8 50,5 Nº Amastigota 576 798 896 616 765 589 440 518 620 504 334 561 869 866 1200 Nº Células Infectadas 71 88 186 122 184 210 78 156 130 177 101 166 145 157 247 IF* 278,3 190,0 180,6 225,6 153,9 211,9 299,3 249,0 241,2 243,5 151,1 211,7 359,1 352,0 245,4 Fonte: Acervo Pessoal *O índice de infecção (IF) é calculado pela fórmula: % células infectadas x n°amastigotas intracelulares/n°células infectadas. 44 A figura 19 mostra a comparação dos IFS obtidos nas células VERO infectadas com a cepa Esmeraldo do T. cruzi. Em comparação ao benzonidazol, os tratamentos com os compostos A1, B1 e D2 apresentaram diminuição dos índices de infecção em 3%, 13% e 14% respectivamente. O composto D2 (benzonidazol 38,4 M e 4H3NC-Ni 48,8 µM) mostrou melhor resultado, sendo, portanto, um composto potencial para teste futuros, devendo ser verificada diferentes concentrações do produto, no intuito de sabermos o que ocorre ao aumentarmos ou diminuirmos a quantidade de níquel presente no composto e, além disso, verificar a quantidade de cumarina necessária em prol de melhores resultados. Esta variação vai nos permitir comprovar a eficácia desse composto na hostilização da cepa Esmeraldo para diferentes doses. Figura 19. Índice de infecção de células Vero com a forma amastigota da cepa Esmeraldo do T. cruzi. Tratamentos: benzonidazol 38,4 µM e suas associações com compostos metálicos. A1: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 68,4 µM ;A2: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 136,8 µM; B1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 241 µM; B2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 362,1 µM; C1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 12,6 µM; C2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 25,2 µM; C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 50,4; D1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 24,4 µM; D2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 48,8 µM; E1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 60,4 µM; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 120,8 µM; F1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 124,13 µM; F2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 186,2 µM. O índice de infecção (IF) é calculado pela fórmula: % células infectadas x n°amastigotas intracelulares/n°células infectadas. Fonte: Acervo Pessoal. A inibição do IF foi calculada para cada cepa utilizada: [IF associação X 100/ IF controle menos 100%] a figura 20 resume a porcentagem de inibição do índice de infecção, obtidos para as cepas G, CL e Esmeraldo de T.cruzi considerando 100% IF dos respectivos controles sem tratamento em cada cepa. 45 Figura 20. Porcentagem de inibição do IF das três diferentes cepas do T. cruzi nos tratamentos realizados benzonidazol, associação de compostos em diferentes concentrações: A1: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 68,4 µM ;A2: benzonidazol 38,4 µM e cumarina 136,8 µM; B1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 241 µM; B2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC 362,1 µM; C1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 12,6 µM; C2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 25,2 µM; C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 50,4; D1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 24,4 µM; D2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Ni 48,8 µM; E1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 60,4 µM; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 120,8 µM; F1: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 124,13 µM; F2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Cu 186,2 µM. Abaixo do gráfico estão numericamente representados as porcentagens de inibição. A comparação da porcentagem de inibição dos IF em relação ao controle sem tratamento demonstrou que na cepa G as associações E2, F1 e F2, causaram uma diminuição de IF maior que 60%, resultado semelhante ao benzonidazol. Na cepa CL, as associações C3, D1, D2, E1 e E2 também apresentaram mais de 60% de diminuição do índice de infecção, enquanto o benzonidazol só diminuiu o índice de infecção em 43 %, mostrando menor atividade que as associações testadas. Nos estudos com a cepa Esmeraldo, o benzonidazol diminuiu o índice de infecção em 32% e as associações A1, B1 e D2, 35%, 45% e 46%, respectivamente, o que evidencia uma maior resistência desta cepa aos tratamentos, comparada à G e Cl. Considerando que foram utilizados 13 diferentes associações de compostos para tratamento das formas amastigotas de três cepas de T. cruzi e que, dentre elas oito mostraram diminuição do IF acima de 60 %, em pelo menos uma das cepas (Figura 20), foram escolhidas duas diferentes associações para continuidade dos testes in vivo. A associação E2 por ter apresentado resultados mais promissores nas cepas G e CL e a associação C3, pela maior atividade na cepa CL. 46 5.2 Estudos in vivo A partir dos dados obtidos em amastigotas as associações dos compostos A1, B1, C3, D1, D2, E1, E2 e F2 mostraram-se promissoras para continuidade dos estudos in vivo do sinergismo de ação no tratamento da doença de Chagas experimental em modelos animais. Para racionalização do número de animais a serem utilizados nos experimentos, foram selecionamos as associações C3 e E2, em comparação ao benzonidazol, para os tratamentos de camundongos Swiss infectados com duas cepas T.cruzi das cepas G e CL estudando a fase aguda e crônica da Doença de Chagas. A atividade dos compostos foi avaliada pelo monitoramento da parasitemia nos animais infectados durante a fase aguda e na fase crônica pela avaliação do perfil das citocinas no soro desses animais. 5.2.1 Fase aguda Na fase aguda, a parasitemia dos animais infectados pelas cepas G e CL foi monitorada do 4° ao 18° dia. O tratamento foi realizado do 4° ao 11° dia e após este período, no 18° dia, os animais foram eutanasiados e o sangue foi coletado para análise do perfil de citocinas no soro. 5.2.2 Análise da parasitemia dos animais infectados com a cepa G na fase aguda Erro! Fonte de referência não encontrada.A figura 21 mostra o monitoramento da parasitemia nos animais dos diferentes grupos de tratamento, a partir do 4º dia de infecção com a cepa G do T. cruzi. O pico de parasitemia ocorreu no 11º dia nos animais do grupo sem tratamento e benzonidazol . Observa-se que, o tratamento com a associação C3 controlou a parasitemia na fase aguda inibindo significativamente a multiplicação dos parasitos, em comparação ao grupo controle sem tratamento e ao benzonidazol. No grupo tratado com a associação E2 observa-se um aumento sucessivo da parasitemia do 7° ao 18° dia quando foi finalizado o experimento na fase aguda. 47 Parasitemia/ml X 1000 25000 20000 S/ Tratamento 15000 BZ C3 10000 E2 5000 0 4º 7º 11º 14º 18º DIAS Tratamento Figura 21. Parasitemia dos grupos de camundongos na fase aguda da doença de Chagas, infectados com a cepa G do T. cruzi, tratados com os compostos benzonidazol, C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCFe 50,4 µM e ; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCZn 60,4 µM. 5.2.3 Análise da parasitemia nos animais infectados com a cepa CL na fase aguda A parasitemia nos grupos de animais infectados com a cepa CL de T.cruzi foi acompanhada do 4º até 18º dia. A Erro! Fonte de referência não encontrada.22 mostra que o pico de parasitemia ocorreu no 14° dia para animais dos grupos sem tratamento, benzonidazol e C3, já no grupo E2, observa-se que o pico de parasitemia ocorre no 11º dia. Ressalta-se que, o tratamento com a associação de compostos C3 e E2 diminuiu em 40% o número de parasitos circulantes, em relação ao grupo controle sem tratamento e ao grupo tratado com Parasitemia/ml X 1000 benzonidazol. 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 s/ trat. BZ C3 E2 4º 7º Tratamento 11º 14º 18º DIAS Figura 22. Parasitemia na fase aguda da doença de Chagas nos diferentes grupos de camundongos infectados com a cepa CL de T. cruzi, tratados com os compostos benzonidazol, C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCFe 50,4 µM; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCZn 60,4 µM. 48 5.3 Estudos in vivo fase crônica A parasitemia dos grupos de animais para o estudo na fase crônica da doença de Chagas experimental foi acompanhada do 4º dia até a cronifícação, que é caracterizado pela diminuição do número de parasitos no sangue circulante. Os animais foram tratados, conforme descrito anteriormente, com 6 doses de C3 e E2 do 25º ao 40º de infecção. A fase crônica foi interrompida no 70º dia e foi coletado o sangue dos animais para dosagem de citocinas no soro. Análise da parasitemia nos animais infectados com a cepa G na fase crônica 3 mostra que os grupos de animais infectados com a cepa G e tratados com benzonidazol e com os complexos metálicos mantiveram níveis muito baixos de parasitemia em comparação ao grupo sem tratamento, no qual se observa um aumento dos parasitos no Parasitemia/ml X 1000 sangue circulante. 40000 35000 30000 25000 S/ Tratamento BZ 20000 15000 10000 5000 0 C3 E2 4º 7º 11º 14º 18º 25º 33º 40º 49º 60º 70º DIAS Tratamento Figura 23. Parasitemia na fase crônica em camundongos infectados com a cepa G do T. cruzi, tratados com os compostos benzonidazol, C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCFe 50,4 µM; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCZn 60,4 µM. 5.4 Análise da parasitemia nos animais infectados com a cepa CL na fase crônica A parasitemia na fase crônica dos animais infectados com a cepa CL apresenta um pico no 7º e no 11º dias e uma diminuição no 25º, 33º e 40º dias, mantendo-se estável do 40º ao 70º dia de infecção. O grupo de animais tratados com o benzonidazol apresentou uma diminuição da parasitemia no 25º dia e um aumento no 33º dia e manteve-se estável até o 40º dia. Por outro lado, o grupo sem tratamento apresentou uma diminuição da parasitemia no 33º dia, mantendo-se estável até o 70º dia. Em comparação aos demais grupos de tratamento, o 49 grupo E2 apresentou pico de parasitemia no 11º dia com uma diminuição no 40º dia, Parasitemia/ml X 1000 mantendo-se estável ate o 70º dia de infecção. 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 S/Tratament o BZ C3 E2 4º 7º 11º 14º 18º 25º 33º 40º Tratamento 49º 60º 70º DIAS Figura 24. Parasitemia na fase crônica em camundongos infectados com a cepa CL do T. cruzi, tratados com os compostos benzonidazol, C3: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCFe 50,4 µM e ; E2: benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCZn 60,4 µM. 5.5 Quantificação das citocinas IL-1, IL-12, IFN-beta e TNF-alfa no soro dos animais com doeça de chagas fase crônica. A fase aguda da doença de Chagas caracteriza-se por uma alta parasitemia com ativação exacerbada do sistema imune, incluindo elevados níveis plasmáticos de citocinas tipo Th1, principalmente TNF-α e IFN-γ, associadas com a resistência à infecção pelo parasito, bem como uma ativação importante de células T e B e processos inflamatórios severos relacionados com o parasitismo (MACHADO, et al, 2014). Neste trabalho, foi avaliado o perfil de citocinas de camundongos infectados pelas cepas G em CL do T. cruzi tratados com os compostos associados, em comparação com o benzonidazol e com o grupo controle não tratado. Para isso, foram quantificadas as citocinas IL-1β, IL-12, IFN-γ e TNF-α no soro dos animais na fase crônica da Doença de Chagas. No gráfico representado na figura 25 (A), mostra que o perfil de citocinas IL-1β no soro dos animais infectados com a cepa G do T. cruzi na fase crônica e tratados com a associação C3 teve uma diminuição em relação ao grupo sem tratamento. A figura (B) mostra o perfil das citocinas IL-1β no soro dos animais infectados com a cepa CL do T.cruzi na fase crônica. O grupo benzonidazol e E2 teve uma diminuição de expressão de IL-1β em relação ao grupo sem tratamento. Porem a associação C3, na cepa CL teve aumento de expressão em relação ao grupo sem tratamento. 50 A IL-1 (pg/mL) 150 100 50 0 Sem tratam. Benzonidazol C3 E2 Tratamentos B 80 IL-1 (pg/mL) 60 40 20 0 Sem tratam. Benzonidazol C3 E2 Tratamentos Figura 25. Representa a concentração de IL-1β (pg/ml) no soro dos animais infectados com a cepa G em (A) e na cepa CL em (B) do T.cruzi na fase crônica e tratados com os compostos: benzonidazol 38,4µM; C3( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCFe 50,4 µM); E2( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 60,4 µM), em comparação com o grupo controle sem tratamento, ANOVA (p= 0.2778) seguido de teste Tukey-kramer de múltiplas comparações (p>0.05). As figuras do perfil das citocinas IL-12 infectados com as cepas G em (A), nos mostra que a associação C3 diminuiu a expressão em comparação ao grupo sem tratamento. Os compostos benzonidazol e E2 mantiveram níveis iguais ao grupo sem tratamento. A figura CL em (B) mostra que o perfil de citocinas IL-12 no soro dos animais infectados com T.cruzi na fase crônica tratados com o benzonidazol mantive níveis iguais ao grupo sem tratamento e as associações C3 e E2 tive um aumento em comparação ao grupo sem tratamento. 51 A IL-12 (pg/mL) 300 200 100 0 Sem tratam .Benzonidazol C3 E2 Tratamentos B 250 IL-12 (pg/mL) 200 150 100 50 0 Sem tratam. Benzonidazol C3 E2 Tratamentos Figura 26. Representa a concentração de IL-12 (pg/ml) no soro dos animais infectados com a cepa G em (A) e na cepa CL em (B) do T.cruzi na fase crônica e tratados com os compostos: benzonidazol 38,4µM; C3( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NCFe 50,4 µM); E2( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 60,4 µM), em comparação com o grupo controle sem tratamento, ANOVA (p= 0.2778) seguido de teste Tukey-kramer de múltiplas comparações (p>0.05). As figuras do perfil das citocinas IFN-ɣ para as cepas G e CL, mostra que o benzonidazol tanto para a cepa G, quanto para a cepa CL não teve muita diferença comparado ao grupo sem tratamento, mas em relação ao composto C3 na cepa G diminui e na cepa CL aumenta, diferente do composto E2 que na cepa G aumenta e na cepa CL diminui comparado ao grupo sem tratamento. 52 A IFN- (pg/mL) 200 150 100 50 0 Se m tratam .Be nzonidazol C3 E2 Tratame ntos B IFN- (pg/mL) 80 60 40 20 0 Sem tratam. Benzonidazol C3 E2 Tratamentos Figura 27. Representa a concentração de IFN-γ (pg/ml) no soro dos animais infectados com a cepa G em (A) e na cepa CL em (B) do T.cruzi na fase crônica e tratados com os compostos: benzonidazol 38,4µM; C3( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 50,4 µM); E2( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 60,4 µM), em comparação com o grupo controle sem tratamento, ANOVA (p= 0.2778) seguido de teste Tukey-kramer de múltiplas comparações (p>0.05). As figuras do perfil das citocinas TNF-α para as cepas G e CL, mostram que o benzonidazol para a cepa G diminui pouco e para a cepa CL aumenta pouco, já o composto C3diminui na cepa G e aumenta na cepa CL. Na cepa G tratada com o composto E2 ele diminui e na cepa CL mantém igual ao grupo sem tratamento. 53 A TNF- (pg/mL) 150 100 50 0 Sem tratam. Benzonidazol C3 E2 Tratamentos 400 TNF- (pg/mL) B 300 200 100 0 Sem tratam. Benzonidazol C3 E2 Tratamentos Figura 28. Representa a concentração de TNF-α (pg/ml) no soro dos animais infectados com a cepa G em (A) e na cepa CL em (B) do T.cruzi na fase crônica e tratados com os compostos: benzonidazol 38,4µM; C3( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Fe 50,4 µM); E2( benzonidazol 38,4 µM e 4H3NC-Zn 60,4 µM), em comparação com o grupo controle sem tratamento, ANOVA (p= 0.2778) seguido de teste Tukey-kramer de múltiplas comparações (p>0.05). 54 6 DISCUSSÃO A doença de Chagas permanece um grave problema de saúde pública na América Latina, mesmo após mais de um século de pesquisas. O nifurtimox e o benzonidazol são as únicas drogas disponíveis para o tratamento desta doença, sendo que o primeiro não é mais utilizado no Brasil (SESTI-COSTA et al, 2014). O tratamento com benzonidazol durante a fase aguda da doença é capaz de curar aproximadamente 60% dos pacientes. No entanto, as taxas de cura não excedem 20%, na fase crônica, mesmo em pacientes tratados durante mais de 10 anos. Além disso, o tratamento é longo e provocando vários efeitos colaterais como cefaléia, anorexia, distúrbios gástricos, hepatotoxicidade e mielossupressão, dentre outros. Dessa forma, surge a necessidade de desenvolver novos compostos para o tratamento da doença de Chagas com maior eficácia e menor toxicidade. A associação de compostos é uma importante forma de aumentar a eficácia de drogas já existentes, mas que apresentam diferentes mecanismos de ação, no tratamento de determinadas doenças, especialmente no controle de doenças infecciosas. Em comparação à monoterapia, a terapia que utiliza a combinação de diferentes compostos, pode apresentar aumento nos índices de cura, reduzir o tempo de tratamento, diminuir os efeitos colaterais e impedir a resistência dos parasitos ao tratamento (RODRIGUES, 2014). Neste trabalho, foi avaliada a atividade antiparasitária de compostos cumarínicos complexados com os metais de transição ferro, zinco, cobre e níquel em associação ao benzonidazol, com o objetivo de estudar o potencial efeito sinérgico desses compostos buscando assim, menor toxicidade pela utilização de menores concentrações do benzonidazol, agregando também, os potenciais efeitos biológicos atribuídos aos compostos naturais complexados a metais de transição. Os compostos avaliados neste estudo apresentaram sinergismo de ação contra as formas amastigotas intracelulares do T. cruzi, quando associados ao benzonidazol, que é o composto de escolha utilizado, atualmente, para o tratamento da doença de Chagas. O mecanismo de ação do benzonidazol ocorre pela formação de radicais livres e/ou metabólitos eletrofilicos em uma reação que culmina na formação do radical hidroxila, ao qual se atribui o efeito tripanocida, por mecanismos que envolvem a ligação a lipídeos, proteínas e ao DNA do T. cruzi. O benzonidazol também aumenta a fagocitose e lisa o T. cruzi, através de um mecanismo dependente de IFN-γ e inibe o crescimento do T. cruzi através da inibição da enzima NADH-fumarato redutase, relacionada ao processo de geração de energia (DIAS et al, 2009). 55 Compostos naturais têm demonstrado potencial como novos agentes para o tratamento da doença de Chagas. Reyes-Chilpa e colaboradores avaliaram a atividade de cumarinas derivadas da espécie mammea sp contra as formas epimastigotas e tripomastigotas do T. cruzi. Essas cumarinas apresentaram atividade antiparasitária e neste estudo, sugere-se que as cumarinas podem afetar a mitocôndria e a mitose (REYES-CHILPA, et al, 2008). O óleo essencial de Cinnamon verum apresentou atividade antiparasitária contras as formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas do T. cruzi, o eugenol e a cinnamaldeído são os principais constituintes desse óleo essencial. Sua atividade pode ser associada à sua lipofilicidade, formando ligações covalentes com resíduos de aminoácidos inativando proteínas afetando as funções celulares. A ação contra o T. cruzi pode ser atribuída à adição de um tiol aldeído ao componentes que contem enxofre nas enzimas tripanotiona e tripanotiona redutase, promovendo um desequilíbrio redox no citosol no interior do tripanosoma (AZEREDO et al, 2014). Uma das principais propriedades dos compostos naturais é a atividade antioxidante e a complexação destes compostos com metais de transição aumenta seu potencial antioxidante (KOSTYUK et al, 2004). Apesar do benzonidazol atuar como agente indutor de estresse oxidativo na eliminação do T. cruzi, nota-se, neste trabalho, que a sua associação com os compostos cumarínicos complexados a metais de transição potencializou sua atividade antiparasitária in vitro e in vivo, sugerindo que as propriedades antagônicas do benzonidazol, indutor da formação de radicais livre e dos complexos metálicos, com propriedades antioxidantes, colaboraram sinergisticamente, para um aumento da atividade antiparasitária. O benzonidazol tem ação tripanossomicida contra todas as formas de parasita e tem atividade significativa em fase aguda, com até 80% de cura dos pacientes tratados. Embora, sua eficácia varie de acordo com a área geográfica, provavelmente devido a diferenças na susceptibilidade de drogas entre diferentes cepas T. cruzi e a existência de cepas naturalmente resistentes aos compostos utilizados no tratamento (SÁNCHEZ-SANCHO, 2010). Entretanto, muitos compostos possuem limitações importantes como a sua própria baixa atividade antiparasitária na forma crônica da doença. Na fase crônica, a decisão de tratamento do paciente com esses drogas tripanocidas deve ser individualizado, avaliando-se os possíveis riscos e benefícios para o paciente (NETO- MARIN GUEDES 2003, CALDAS;, et al 2008). O nivel de citocinas demonstrou na doença de Chagas, após a infecção, o aumento inicial da parasitemia é contido por citocinas pró-inflamatórias e mediadores liberados por macrófagos e células natural killer. Estas respostas imunes inata são seguidas por ativação policlonal de linfócitos e aparecimento de imunidade adquirida contra o parasita mediada por 56 células T CD4 +. Os estudos com camundongos imunodeficientes indicam que tanto as células CD4 + e CD8 + T são igualmente essenciais para o controle de parasitemia e sobrevivência do hospedeiro (TARLETON RL, 2000). A persistência do parasita depende de uma combinação de fatores, incluindo a liberação de moléculas que interferem com as respostas imunes. T. cruzi suprime a ativação de linfócitos, um efeito que depende da densidade de parasitas. Portanto, a supressão induzida por moléculas do parasita é mais relevante na fase aguda, quando a concentração dessas moléculas pode ser bastante elevada. Além disso, a depleção de células T pode ser observada no pico da parasitemia (MALECKAR JR, et al, 1983, CHAUSSABEL D, et al 2003) Juntos, esses fatores contribuem para a imunossupressão, e promover a difusão da infecção. Este retardo na resposta de células T CD8 + poderia ser responsável pela disseminação sem controle do parasita no hospedeiro. 57 7 CONCLUSÕES Estudos de atividades dos compostos cumarinicos complexados com metais contra o T. cruzi permitiu-nos chegar as seguintes conclusões: As células infectadas com a cepa G do T. cruzi e tratadas com as associações E1, E2 e F2 apresentaram diminuição do índice de infecção comparável ao do composto benzonidazol; As células infectadas com a cepa CL do T. cruzi e tratadas com as associações A1,C2, C3, D1, D2, E1, E2 e F2 apresentaram índices de infecção menores que o benzonidazol; As células infectadas com a cepa Esmeraldo do T. cruzi e tratadas com as associações A1, B1 e D2 apresentaram índices de infecção menores que o benzonidazol; O tratamento com a associação C3 controlou a parasitemia na fase aguda da doença de Chagas experimental, in vivo, inibindo significativamente a multiplicação dos parasitos nos animais infectados com a cepa G, em comparação ao benzonidazol; O tratamento com a associação de compostos C3 e E2 diminuiu em 40% o número de parasitos circulantes nos animais infectados com a cepa CL na fase aguda da Doença de Chagas, em comparação benzonidazol; Embora sem significância estatística ocorre um aumento no nível de citocinas pro inflamatórias nos animais infectados com a cepa CL de T.cruzi na fase crônica nos grupos controles B2 e E2. O tratamento dos animais na fase crônica da Doença de Chagas com benzonidazol e associação C3 mostrou uma diminuição em 33% e 58% nos níveis de IL-1β nos soros, corroborando nossa hipótese de sinergismo de ação do composto 4H3NC-Fe com o benzonidazol. Por outro lado também verificamos uma diminuição na expressão de IL-12 nos animais do grupo C3 infectados com a cepa G e aumento nos infectados com a cepa CL. 58 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGÊNCIA FIO CRUZ DE NOTÍCIAS. Doença de Chagas: a doença / agentes causadores. 2013. Disponível em: http://www.agencia.fiocruz.br/doen%C3%A7a-de-chagas. Acesso em: 21 jul 2014. AGUIAR, C. S. Aplicações dos sorotestes elisa e western blotting na avaliação de reatividade cruzada no diagnóstico diferencial de infecções causadas por Trypanosoma cruzi e leishmania chagasi em soros caninos de área endêmica na bahia. Dissertação de Mestrado. Salvador – Bahia, 2008. 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