17 1 INTRODUÇÃO A fruticultura no Espírito Santo é uma das

17
1 INTRODUÇÃO
A fruticultura no Espírito Santo é uma das atividades agrícolas mais recentes
quando comparada à pecuária e à cafeicultura. O setor ganhou destaque entre
as atividades do Estado do Espírito Santo, apresentando grande ênfase no
cenário econômico, tanto pela diversificação agrícola, como pela capacidade
de produção (SILVA; COSTA, 2007).
A maior disponibilidade e acessibilidade de novas tecnologias têm papel
importante no aumento da produção de frutas dentro do Estado, não se
restringindo apenas a grandes produtores rurais, mas abrangendo até mesmo
praticantes da agricultura familiar. Assim, a utilização de novas tecnologias de
produção tem possibilitado, entre outros aspectos, um aumento na exportação
de frutos.
Apesar dos avanços, a fruticultura capixaba ainda encontra diversos entraves
para sua maior ampliação. Os problemas de fitossanidade destacam-se como
ocasionadores de grandes perdas no setor. Um exemplo disso é a fusariose do
abacaxizeiro, doença fúngica extremamente severa e limitante da produção no
Estado.
Em meados dos anos 70, o Estado do Espírito Santo apresentava a terceira
maior produção de abacaxi do Brasil (ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL 1963-1976 apud VENTURA, 2006).
Entretanto, no fim da década, a alta
ocorrência da fusariose dizimou a produção capixaba do fruto. Houve
desestímulo por parte dos produtores, que buscaram, então, culturas
alternativas (VENTURA, 2006). Atualmente, o Espírito Santo é o oitavo maior
produtor de abacaxi do país (AGRIANUAL, 2007), perdendo espaço para
diversos estados brasileiros.
O controle da fusariose do abacaxizeiro é realizado pela utilização de
fungicidas, aumentando o custo de produção e riscos ambientais, além de que
o fungo apresenta grande variabilidade, desenvolvendo assim resistência a
fungicidas
(VENTURA;
ZAMBOLIM,
2002).
Como
alternativa
eficaz,
18
economicamente viável e ecologicamente sustentável, o uso de variedades
resistentes desponta como a melhor opção para o controle de doenças como a
fusariose.
Dessa forma, o Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e
Extensão Rural (INCAPER) selecionou a partir do melhoramento genético
clássico, a cultivar Vitória, que apresenta excelentes resultados quanto à
resistência à fusariose, além de apresentar em condições de campo qualidades
organolépticas iguais ou superiores às cultivares comercializadas atualmente
(VENTURA et al., 2006).
Uma agricultura sustentável, com a busca de mecanismos alternativos que
levem a um controle natural dos microorganismos pelas plantas, sem os efeitos
negativos dos agrotóxicos, tem sido o objetivo final de muitas pesquisas no
mundo inteiro. Estudos dos mecanismos de defesa em plantas contra doenças
vêm gerando grande quantidade de conhecimento, com aplicações que podem
gerar resultados promissores em campo. Assim, variedades resistentes se
firmam como uma boa alternativa para produtores e consumidores.
O conhecimento das respostas de defesas em abacaxizeiro é importante para
o suporte aos programas de melhoramento genético, o desenvolvimento de
alternativas de manejo da fusariose e a produção de frutos de melhor qualidade
para o mercado consumidor com menor custo para o produtor.
No presente trabalho foram estabelecidos os mecanismos relacionados com a
resistência da cultivar Vitória, através de análises histológicas, bioquímicas e
microbiológicas em comparação com duas outras cultivares suscetíveis à
fusariose (‘Pérola’ e ‘Smooth Cayenne’) visando assim, a caracterização das
diferenças das respostas de defesa entre as três cultivares.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O AGRONEGÓCIO NO BRASIL E NO ESPÍRITO SANTO
O Brasil é um dos líderes mundiais na produção e exportação de vários
produtos agropecuários, sendo o agronegócio responsável por 25,11% do
Produto Interno Bruto (PIB) nacional (CEPEA, 2007). O país apresenta
destaque na produção e exportação de café, açúcar, álcool e sucos de frutas,
além disso, tem grande expressão nas vendas externas de soja, carne bovina,
carne de frango, tabaco, couro, dentre outros.
As exportações do agronegócio no Brasil atingiram recorde no ano de 2007.
Em relação ao ano de 2006, as exportações atingiram uma taxa de
crescimento de 18,2%, totalizando um montante de US$ 58,4 bilhões, valor
este que corresponde a 36,4% das exportações totais brasileiras no período
(BRASIL, 2007). Assim, além de representar uma boa parcela do PIB brasileiro,
o agronegócio é um dos maiores geradores de emprego e renda, não só no
meio rural como no urbano. Este segmento é responsável ainda por boa parte
do saldo positivo da balança comercial brasileira, demonstrando-se como um
setor econômico de significativa importância para o país.
No contexto nacional do agronegócio, o estado do Espírito Santo é responsável
por 2,54 % das exportações. Em comparação com o ano de 2006, houve um
acréscimo no valor exportado de 22,4%, ficando acima da média brasileira.
Apesar de possuir cerca de 0,5% da área geográfica do país, o Estado ocupa o
10º lugar dentre os Estados exportadores de produtos do agronegócio.
Para 82% dos municípios capixabas o agronegócio é a principal atividade
econômica e o crescimento do setor no Estado está atingindo destaque
nacional em diversas culturas agrícolas que demandam mão-de-obra manual e
geram rendas em pequenas áreas (ESPÍRITO SANTO, 2005).
20
A fruticultura é a segunda atividade da agropecuária estadual, superada
somente pela cafeicultura. Essa atividade ocupa uma área de 85 mil hectares,
com uma produção anual estimada em 1,33 milhão de toneladas,
proporcionando uma renda superior a R$ 550 milhões por ano e gerando cerca
de 50 mil empregos diretos (SILVA; COSTA, 2007). Em nível nacional, o setor
vem contribuindo com o aumento do superávit na balança comercial devido às
exportações de frutas “in natura”, de polpas de frutas e de sucos prontos para
beber. A atividade é responsável, também, pela diversificação agrícola de
vários municípios, onde além de gerar renda e tributos, a fruticultura vem
contribuindo diretamente para a redução do êxodo rural, devido ao aumento da
oferta de emprego no campo.
2.2 ABACAXI
2.2.1 Produção
A cultura tem uma produção mundial de aproximadamente dezesseis milhões
de toneladas, ocupando lugar de destaque entre as principais culturas de frutas
tropicais do comércio internacional. O Brasil, com uma produção de cerca de
1,5 milhões de toneladas/ano, caracteriza-se como primeiro produtor mundial
de abacaxi (FAO, 2007). Os estados do Pará, Paraíba e Minas Gerais
destacam-se como os maiores produtores do país, seguidos de produções
mais modestas nos estados da Bahia, São Paulo e Rio de Janeiro
(AGRIANUAL, 2007).
No Espírito Santo a cultura começou a ganhar expressão na década de
sessenta, atingindo a maior área plantada e a sua maior produção em 1975,
quando foram colhidas 62.190 toneladas. Esse aumento evidente na produção
de abacaxi capixaba fez com que o Estado ocupasse a 3ª posição na produção
nacional, atrás apenas de Minas Gerais e Bahia, tendo participação de 12% da
21
produção nacional. Em 1973/1974, com o estabelecimento de indústrias
alimentícias no estado houve grande estímulo para a expansão da cultura no
Espírito
Santo.
Entretanto,
problemas
fitossanitários,
principalmente
a
fusariose, contribuíram para paralisação dessas indústrias. Assim, houve um
desestímulo generalizado com relação à cultura, trazendo sucessivas reduções
da área cultivada e consequentemente da produção a partir de 1976
(VENTURA, 2006). Atualmente, o Estado tem uma produção de 87.898
toneladas, ocupando o modesto 8º lugar na produção brasileira (AGRIANUAL,
2007).
Segundo dados de 2005 do Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência
Técnica e Extensão Rural (INCAPER), a produção de abacaxi no Espírito
Santo concentra-se nos municípios litorâneos da região sul do estado do
Espírito Santo, que compõem o Pólo de Abacaxi Sul, e na região norte, onde
se encontra o Pólo de Abacaxi Norte, ainda em expansão (Figura 1). As
principais cultivares plantadas são Pérola e Smooth Cayenne, numa área de
cerca de 4.000 hectares.
O consumo da fruta normalmente é in natura ou sob forma industrializada,
como polpa ou sucos prontos para beber. Mais ainda, o mercado de plantas
ornamentais está em franca expansão, destacando-se as variedades de
abacaxi de interesse paisagístico.
22
Figura 1 – Estado do Espírito Santo: em destaque municípios produtores de abacaxi.
Em cinza) Pólo de Abacaxi Norte; Em amarelo) Pólo de Abacaxi Sul. Fonte:
Adaptado de INCAPER citado por PEREIRA, 2006.
23
2.2.2 Caracterização Botânica e Fisiologia da Planta
O abacaxi cultivado (Ananas comosus (L., Merril) var. comosus Coppens
d'Eckenbrugge & Leal, 2003) é uma monocotiledônea perene da Família
Bromeliaceae.
As folhas lanceoladas apresentam-se dispostas em espiral,
formando uma densa roseta (Figura 2). A região basal das folhas (porção
aclorofilada) é expandida e circunda o caule, cobrindo-o lateralmente
(KRAUSS, 1948).
O abacaxizeiro é extensivamente cultivado em áreas tropicais e subtropicais de
ambos os hemisférios. Apresenta origem na América do Sul, onde apresenta
grande variabilidade genética dentro da espécie (PY; LACOEUILHE; TEISON,
1984; LOISON-CABOT, 1992; FERREIRA et al., 1992).
A classificação das folhas do abacaxizeiro já foi padronizada pela literatura de
abacaxi (PY; LACOEUILHE; TEISON, 1984). O número total de folhas pode ser
dividido em dois grupos, de acordo com o desenvolvimento e forma geral
(Figura 2). As folhas mais velhas (A, B, C e D) são completamente
desenvolvidas
e
apresentam
forma
lanceolada,
enquanto
a
base
é
consideravelmente expandida. As folhas jovens (E e F) apresentam-se
localizadas centralmente na roseta (Figura 2).
A folha “D” apresenta-se como a mais jovem entre as folhas adultas e a mais
ativa fisiologicamente entre todas as folhas, apresentando-se como folhas em
fim de crescimento. Em geral, as folhas “D” formam um ângulo de 45º entre o
nível do solo e um eixo imaginário que passa pelo centro da planta (PY;
TISSEAU, 1969).
A folha completamente desenvolvida do abacaxizeiro consiste em uma lâmina
com uma parte clorofilada, sua porção principal e uma base não clorofilada
expandida. As diferenças nas porções externas da folha também são notadas
internamente, em que as regiões desiguais superficialmente também são
caracterizadas pelas diferenças nas estruturas internas (KRAUSS, 1948).
24
Figura 2 - Distribuição das folhas do abacaxizeiro de acordo com a idade (A – mais
velha, F – mais jovem). Fonte: Py; Lacoeuilhe; Teison (1984).
As diferenças internas entre as duas regiões da folha – clorofilada e
aclorofilada – são descritas como quantitativas (em volume dos diferentes
tecidos), não estando sempre presentes e sem importância para a sistemática
da planta. Outros autores afirmam que as diferenças estruturais entre a porção
basal e apical da folha do abacaxizeiro apresentam importância fisiológica: a
porção basal apresentaria função de raiz, enquanto a porção apical teria
funções essenciais de folha (KRAUSS, 1948).
No que se refere à anatomia foliar de A. comosus var. comosus (Figura 3), em
condições de campo, são descritas estruturas anatômicas tais como: presença
de ceras, tricomas, epiderme uniestratificada revestida por cutícula, com
diâmetro maior perpendicular ao eixo da folha e presença de hipoderme
(KRAUSS, 1948). Na face abaxial da epiderme, os estômatos encontram-se
dispostos
longitudinalmente
em
sulcos
pequenos
e
paralelos
(PY;
LACOEUILHE; TEISON, 1984). O mesófilo apresenta tecido aqüífero logo
abaixo da face adaxial da epiderme, parênquima clorofilado ou não, onde estão
os feixes vasculares, cordões de fibras isolados e canais de aeração
(BARBOZA et al., 2006).
25
x 200
x 200
x 650
c.u.
chl.
u.w
.
s.b.
chl.
s.c.
D
C
B
e.
ws.t.
A
v.b.
a.c.
ch.
s.a.c.
m.
ss.r.
f.s.
E
p.c.
c.a.c.
G
xy.
F
ss.c.
fi.
chl.
ch.
l.a.c.
g.c.
hy.
phl.
s.b.
x 200
x 200
x 650
p.
Figura 3 - Anatomia foliar do
abacaxizeiro. Fonte: Krauss (1948).
A- Representação esquemática da
sessão transversal da folha: a.c. –
canal aerífero; f.s. – fibra padrão; e. –
epiderme; v.b. – feixe vascular; m. –
mesófilo; ws.t. – tecido aqüífero;
B- Epiderme superior: c.u.– cutícula;
s.b. – corpos silicosos; u.w. – paredes
ondulares;
C- Canal Aerífero: c.a.c. – canal
aerífero central; s.c. – célula
estrelada; chl. – cloroplasto;
D- Porção inferior do tecido de
armazenamento de água: ch. –
clorênquima; chl. – cloroplasto; p.c. –
células
paliçádicas
de
armazenamento de água;
E- Feixe vascular (mesófilo sem
cloroplastos): phl. – floema; xy. –
xilema;
F- Hipoderme e mesófilo (tricomas
não mostrados): ch. – clorênquima;
chl. – cloroplasto; fi. – fibras; hy. –
hipoderme;
G- Detalhe da epiderme inferior: ss.r.
– canal subestomático; s.a.c. – canal
aerífero secundário; l.a.c. – célula
acessória lateral; g.c. – célula-guarda;
ss.c. – câmara subestomática; s.b. –
corpos silicosos; p. – poro.
26
Em termos de reprodução, A. comosus var. comosus é considerado autoincompatível (COPPENS D'ECKENBRUGGE; DUVAL; VAN MIEGROET,
1993). A propagação vegetativa é a forma dominante de reprodução (PY;
LACOEUILHE; TEISON, 1984), sendo os plantios de abacaxi essencialmente
originários de mudas de vários tipos, tais como coroa, filhote, rebentão (Figura
4) e mudas de cultura de tecidos ou de seccionamento do caule (REINHARDT;
SOUZA, 2000). As sementes são dormentes e possuem endospermas
impermeáveis, sendo usadas somente para programas de melhoramento (PY;
LACOEUILHE; TEISON, 1984).
Coroa
Coroas múltiplas
Muda do tipo
Filhote
Muda do tipo
Filhote-rebentão
Muda do tipo
Rebentão
Figura 4 - Aspecto geral da planta do abacaxizeiro: principais estruturas morfológicas e
tipos de mudas convencionais do abacaxizeiro. Fonte: Adaptado de
Bartholomew; Paull e Rohrbach (2003).
27
O abacaxizeiro apresenta fisiologia CAM (Metabolismo do Ácido das
Crassuláceas), o que permite à espécie uma maior resistência a períodos
secos provocada pela adaptação na fixação de carbono fotossintetizado. As
plantas com metabolismo CAM possuem células com habilidade de fixar o
carbono no escuro, havendo uma separação temporal entre a via C4 e o ciclo
de Calvin. Assim, o CO2 é fixado à noite, quando os estômatos estão abertos.
Nesse período o amido do cloroplasto é quebrado em fosfoenolpiruvato (PEP)
até redução em malato, que é bombeado para o vacúolo e estocado como
ácido málico. Durante o dia, o ácido málico é recuperado, produzindo CO2 (que
entra no ciclo de Calvin e é fixado pela Rubisco) e piruvato (que é convertido
em amido e outros açúcares). Assim os estômatos permanecem fechados
durante o dia, o que previne a perda de água e do CO2 (TAIZ; ZEIGER, 2004).
2.2.3 Melhoramento do abacaxizeiro
Apesar de serem extensivamente plantadas, as cultivares Pérola e Smooth
Cayenne apresentam alta suscetibilidade à fusariose (CABRAL; MATOS;
CUNHA, 1991; PY; LACOEUILHE; TEISON, 1984; VENTURA; MAFFIA;
CHAVES, 1981), considerada a doença de maior importância econômica para
a cultura no país.
O uso de cultivares resistentes tem sido apontado como o método de controle
de doenças mais eficiente e econômico, principalmente para culturas como o
abacaxi, plantado normalmente por agricultores de baixa renda e de reduzido
conhecimento tecnológico (VENTURA, 1994).
O primeiro trabalho de melhoramento genético do abacaxizeiro foi desenvolvido
na Flórida (EUA) com os objetivos de obter cultivares mais adaptados às
condições locais e de melhorar a qualidade do fruto para exploração industrial.
Posteriormente, programas semelhantes foram conduzidos na África do Sul,
Austrália, Costa do Marfim, França, Havaí (EUA), Índia e Malásia. Nas últimas
décadas, alguns programas também têm sido desenvolvidos no Brasil, Cuba,
28
Japão, Porto Rico e Venezuela (CABRAL, 1999). No Brasil, em 1984 foi
iniciado o Programa de Melhoramento Genético do Abacaxizeiro, coordenado
pela Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, em Cruz das Almas- BA, com o
objetivo principal de identificar fontes de resistência e obter híbridos resistentes
à fusariose, além de mais produtivos e com qualidade de frutos para o mercado
(VENTURA et al., 2006).
Neste programa, utilizando como parental feminino a cv. Primavera (PRI) e
parental masculino a cv. Smooth Cayenne (SC), foram gerados centenas de
híbridos, que após avaliações preliminares em condições controladas
resultaram na seleção de genótipos promissores, avaliados posteriormente em
diferentes regiões produtoras. Destes, três híbridos provenientes da Embrapa
Mandioca
e
Fruticultura
Tropical
foram
introduzidos
nas
Fazendas
Experimentais do Incaper, onde nos últimos 10 anos se realizou uma Seleção
Recorrente Clonal no híbrido PRIxSC-08, originando o genótipo de acesso EC099, que deu origem à cultivar Vitória (Figura 5), lançada em novembro de
2006 (VENTURA et al., 2006).
Para tanto, utilizou-se da metodologia de cruzamentos controlados entre o
material conhecido e o que apresentava características a serem incorporadas à
planta, realizando experimentos de hibridação entre as diversas cultivares,
espécies e gêneros disponíveis. Os genótipos selecionados no ciclo de
propagação sexual foram submetidos a várias avaliações clonais a fim de
observar a estabilidade das características de tais genótipos (VENTURA et al.,
2006).
Os melhores genótipos foram multiplicados para avaliações posteriores,
envolvendo maior número de plantas e vários ambientes. Nas avaliações
realizadas em distintas regiões do Espírito Santo (municípios de Marataízes,
João Neiva, Cachoeiro do Itapemirim e Sooretama), a nova cultivar destacouse dos demais genótipos, apresentando resistência à fusariose (VENTURA et
al., 2006).
29
Figura 5 - Abacaxi ‘Vitória’ resistente à fusariose em campo. Fonte: Ventura et al.
(2006).
2.2.3.1 A cultivar Vitória
A cultivar Vitória apresenta características agronômicas semelhantes ou
superiores em relação às cultivares Pérola e Smooth Cayenne, usadas como
referência (Tabela 1). As plantas têm como vantagem a ausência de espinhos
nas folhas, o que facilita os tratos culturais, sendo as recomendações técnicas
de cultivo as mesmas atualmente em uso pelos produtores para a ‘Pérola’ e
‘Smooth Cayenne’. Possui praticamente o mesmo porte da ‘Pérola’ e plantas
vigorosas. Apresenta bom perfilhamento, bom desenvolvimento e crescimento,
produz frutos quando maduros de excelente qualidade para o mercado. Os
frutos têm polpa branca, elevado teor de açúcares (média de 15,8 °Brix) e
30
excelente sabor nas análises químicas e sensoriais, sugerindo que suas
características relativas à acidez são superiores às do abacaxi ‘Pérola’ e
‘Smooth Cayenne’, tendo ainda uma maior resistência ao transporte e em póscolheita, o que pode facilitar a sua adoção pelos produtores e ter a preferência
dos consumidores (VENTURA et al., 2006).
Tabela 1 - Principais características da cultivar Vitória, comparada com as cultivares
Pérola e Smooth Cayenne, segundo média dos dados coletados no Espírito
Santo, entre 2000 e 2006.
Características
Fusariose
Tipo de folha (epinescência)
Cor da folha
Cultivares
Vitória
Pérola
Resistente
Sem
espinhos
Suscetível
Smooth
Cayenne
Suscetível
Espinhosa
Parcial
92,8
10,48
4,2
1.557
1.427
131
12
Verde
Escuro
93,4
9,58
7,4
1.473
1.309
164
11
Verde
Escuro
86,6
10,26
3,7
1.773
1.543
230
13
Verde Claro
Comprimento da folha "D" (cm)
Largura da folha "D" (cm)
Mudas do tipo filhote/planta (n°)
Peso do fruto com coroa (g)
Peso do fruto sem coroa (g)
Peso da coroa (g)
Diâmetro mediano do fruto (cm)
Diâmetro do eixo central do
fruto (cm)
Forma do fruto
1,2
2,3
2,7
Cilíndrica
Cilíndrica
Cor da casca do fruto maduro
Amarela
Cor da polpa do fruto
Sólidos solúveis totais (°Brix)
Acidez titulável (AT em %)
Branca
15,8
0,8
Cônica
Verde
Escuro
Branca
13,2
0,5
Alaranjada
Amarelada
14
0,7
Fonte: Ventura et al. (2006).
Outras características favoráveis da cultivar Vitória são o formato cilíndrico dos
frutos, casca cor amarela na maturação (Figura 6), pesando em torno de 1,5
Kg. Os frutos obtidos podem ser destinados ao mercado de consumo in natura
e para a agroindústria, face às suas adequadas características sensoriais e
físico-químicas (VENTURA et al., 2006).
31
A
B
C
Figura 6 - Características anatômicas dos frutos de abacaxi das cultivares Vitória (A),
Smooth Cayenne (B) e Pérola (C). Fonte: Ventura (2006).
O abacaxi ‘Vitória’, por ser resistente à fusariose, dispensa a utilização de
fungicidas para o controle da doença, possibilitando a redução nos custos de
produção por hectare, referente à aquisição de fungicidas e de aplicação, além
de reduzir também os riscos de impacto ambiental e aumentar a produtividade
comparativamente em, no mínimo, 30% (VENTURA et al., 2006).
Portanto, conclui-se que a cultivar ‘Vitória’ vem suprir a grande lacuna deixada
pela ausência de uma cultivar resistente à fusariose, constituindo-se em uma
alternativa economicamente viável para os produtores e consumidores de
abacaxi.
2.3 DOENÇAS DO ABACAXI
O abacaxizeiro é uma planta que pode ser afetada por várias doenças
causadas por fungos, bactérias e vírus, além de anomalias de origem não
parasitária. Devido à grande expansão da cultura no Brasil, muitos problemas
fitopatológicos têm surgido, destacando-se as doenças fúngicas como a
fusariose, a podridão-negra-das-mudas, doenças viróticas como a murcha do
abacaxizeiro e pragas como a cochonilha e a broca do fruto. Muitas dessas
32
doenças são limitantes à produção da cultura, impedindo assim a obtenção de
altos rendimentos.
A maioria dos patógenos é levado para as lavouras pelas mudas infectadas,
sendo a qualidade e fitossanidade destas fundamental para a prevenção ou
redução das perdas, além de evitar a disseminação do patógeno para áreas
ainda não afetadas (VENTURA; ZAMBOLIM, 2002).
2.3.1 Fusariose do abacaxizeiro
A fusariose é normalmente considerada a doença de maior importância
econômica para a cultura do abacaxizeiro no Brasil, com perdas estimadas em
30% a 40 % dos frutos e até 20 % das mudas. É conhecida também como
resinose-fúngica, sendo relatada pela primeira vez em 1964 no Brasil por
Kimati e Tokeshi, no estado de São Paulo (VENTURA; ZAMBOLIM, 2002).
2.3.1.1 Etiologia
A etiologia da doença é associada ao fungo Fusarium subglutinans
(Wollenweber & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas f. sp. ananas Ventura,
Zambolim
&
Gilbertson
(Sinônimo:
Fusarium
guttiforme),
que
tem
especificidade para o abacaxizeiro, por isso denominado como uma forma
especial (VENTURA, 1994).
Anteriormente ao trabalho de Ventura (1994) a espécie Fusarium subglutinans
(Wollenweber & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas era relatada como
patógeno de diferentes hospedeiros como abacaxi, pinus, milho, cana-deaçúcar, dracena, dentre outros, causando então a fusariose do abacaxizeiro e
de outras culturas.
33
Em 1998 alguns isolados do fungo foram avaliados filogeneticamente e
descritos como uma nova espécie, F. guttiforme Nirenberg e O´Donnell, sendo
sinônimo de F. subglutinans f. sp. ananas. No entanto, os caracteres
morfológicos descritos parecem não ser suficientes para distinguir este táxon
de
outros
isolados
de
F.
subglutinans,
separando-os
apenas
pela
patogenicidade nos seus hospedeiros, o que não justifica a separação do fungo
em uma nova espécie biológica (VENTURA; ZAMBOLIM, 2002).
2.3.1.2 Distribuição Geográfica
Após o primeiro relato da doença em 1964 no estado de São Paulo Robbs;
Amaral e Dianese (1965) descreveram a doença também nos estados do Rio
de Janeiro e de Minas Gerais, acreditando que esta tenha sido introduzida no
país por ocasião da importação de mudas de abacaxi da Argentina e Uruguai
(VENTURA, 1994). Atualmente a doença está presente em todas as regiões
produtoras do país.
Em 1991 foi identificada a presença do patógeno em mudas e frutos do abacaxi
da cv. Red Spanish provenientes da Bolívia (MATOS et al., 1991 apud
VENTURA, 1994). Pesquisadores de Cuba relataram a ocorrência de podridão
de frutos de abacaxi associada a F. subglutinans, existindo também a suspeita
de que a doença já esteja presente na Venezuela (VENTURA; ZAMBOLIM,
2002). Portanto, não existiriam relatos da ocorrência da fusariose em outros
países tradicionalmente produtores de abacaxi além do Brasil, havendo
registros apenas em países como Argentina, Bolívia, Venezuela, Cuba e no
Uruguai (VENTURA, 1994). Apesar disso, a fusariose constitui-se em séria
ameaça à abacaxicultura mundial tendo em vista a suscetibilidade à esta
doença manifestada pelas cultivares de abacaxi que apresentam participação
expressiva na produção dessa cultura no mundo.
34
2.3.1.3 Sintomas
Os prejuízos devidos à fusariose são decorrentes da infecção e morte de
mudas, morte de plantas durante o desenvolvimento vegetativo e podridão dos
frutos, que perdem seu valor comercial. O sintoma mais evidente da doença é
a exsudação de goma em frutos (Figura 7), podendo se manifestar em todos os
estágios de desenvolvimento vegetativo da planta, com diferentes sintomas
(PISSARRA; CHAVES; VENTURA, 1979).
Figura 7 - Abacaxizeiro da cv. Smooth Cayenne em campo com frutos demonstrando
sintomas característicos da fusariose. Fonte: Ventura et al. (2006).
35
O patógeno é capaz de infectar praticamente toda a planta, colonizando desde
a região das inserções foliares até os frutos e, principalmente, as mudas. Na
fase adulta, as lesões restringem-se à parte basal, acompanhadas de podridão
gomosa, enquanto que, em mudas, a exsudação gomosa é sempre menos
pronunciada. Plantas com sintomas de fusariose durante a fase de
desenvolvimento podem apresentar alteração na roseta foliar, encurtamento do
talo, morte do ápice, enfezamento e clorose (PISSARRA; CHAVES; VENTURA,
1979). Entretanto, nos estádios iniciais os sintomas são quase imperceptíveis,
levando os agricultores sem conhecimento a utilizar nos plantios material
propagativo doente (VENTURA, 1994).
Durante o ciclo da cultura, o período crítico para infecção ocorre após indução
floral até o final da antese, tendo como principal sítio de infecção as flores
(VENTURA; MAFFIA; CHAVES, 1981). Os conídios, que podem ser
transportados pelo vento, por respingos de chuva ou por insetos, quando se
depositam na roseta foliar podem provocar a infecção da inflorescência ainda
na fase inicial de desenvolvimento (VENTURA; MAFFIA; CHAVES, 1981;
VENTURA, 1994). A infecção pode também ocorrer por meio de ferimentos
localizados na base das folhas, já que a penetração direta não é uma
característica deste fungo.
2.4 MECANISMOS DE DEFESA EM PLANTAS
Apesar de não possuírem sistema imunológico como os animais, as plantas
apresentam uma série de mecanismos que as tornam resistentes a doenças e
pragas. Saber como os vegetais se protegem é essencial para obter cultivares
resistentes, o que pode aumentar a produção e a qualidade dos alimentos.
Dessa forma, grupos de pesquisa de todo o mundo buscam definir o papel de
cada substância participante dos processos bioquímicos de defesa das plantas
(RODRIGUES; LINDSEY; FERNANDES, 2006).
36
A resistência de plantas a organismos causadores de doenças é baseada em
mecanismos constitutivos (pré-formados) e induzidos (pós-formados). Os
mecanismos pré-formados estão presentes em plantas sadias (OSBOURN,
1996a), ainda sem contato com o fitopatógeno. Tratam-se de compostos préexistentes ou que possuem precursores inativos, que em resposta ao estresse,
ou ao ataque de patógenos, são rapidamente ativados (VAN ETTEN et al.,
1994). Os mecanismos induzidos de defesa envolvem a ativação de
mecanismos de resistência latentes em resposta ao contato com agentes
bióticos ou abióticos, representando assim, uma resposta ativa das células do
hospedeiro após o reconhecimento do(s) invasor(es) ou elicitor(es) (SIEGRIST;
OROBER; BUCHENAUER, 2000).
Os mecanismos constitutivos e induzidos podem ser divididos em mecanismos
bioquímicos e estruturais, os quais podem ou não estar vinculados um ao
outro. Pode-se afirmar que, separadamente, os mecanismos estruturais e
bioquímicos explicam apenas alguns dos casos de resistência, enquanto
integradamente podem explicar a imunidade das plantas diante de milhares de
espécies de microorganismos livres com potencial para infectar e colonizar a
matéria vegetal (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE, 2003).
2.4.1 Defesa bioquímica
As plantas produzem uma série de compostos químicos importantes para sua
sobrevivência e reprodução: os metabólitos secundários. Com atividades
comprovadamente relacionadas à defesa contra patógenos e herbívoros
(BENNETT; WALLSGROVE, 1994), estes compostos apresentam importância
primária no vegetal, tendo ainda funções na polinização, dispersão de
sementes (POIATTI, 2007), proteção contra radiação ultravioleta, bem como na
competição planta-planta (TAIZ; ZEIGER, 2004).
O
termo
fitoanticipinas
foi
proposto
para
distinguir
os
compostos
antimicrobianos pré-formados das fitoalexinas (VAN ETTEN et al., 1994), as
37
quais são sintetizadas após o contato com o patógeno ou elicitor,
provavelmente após a síntese de novo de enzimas (OSBOURN, 1996a). Uma
das primeiras barreiras bioquímicas existentes na planta são as fitoanticipinas,
caracterizando-se como compostos antibióticos que em muito inibem a
colonização dos tecidos vegetais por invasores.
2.4.1.1 Defesa bioquímica constitutiva
As plantas produzem uma gama de metabólitos secundários na ausência de
patógenos, muitos deles com ação antibiótica e antifúngica. Alguns deles estão
presentes na planta sadia, enquanto outros possuem precursores inativos que
são rapidamente ativados em resposta ao ataque por microorganismos ou
herbívoros (STOESSL, 1985). Em geral, após a destruição da membrana
celular ou parede celular, enzimas são liberadas e participam da ativação de
compostos pré-formados (RAO, 1995).
Os
compostos
bioquímicos
pré-formados
apresentam
frequentemente,
distribuição tecido-específica, com a tendência de acumularem-se em camadas
celulares mais externas, podendo assim agir como inibidores, funcionando
como uma barreira bioquímica primária para patógenos e herbívoros. Alguns
destes compostos com capacidade de difusão pelos tecidos poderiam inibir o
crescimento do patógeno ainda na superfície das folhas, entretanto, a grande
maioria é armazenada em vacúolos e organelas de plantas sadias (OSBOURN,
1996a).
A natureza e a quantidade de inibidores pré-formados aos quais um patógeno é
potencialmente exposto variam de acordo com o dano causado no tecido
vegetal, genótipo, idade do hospedeiro e condições ambientais (DAVIS, 1991).
Compostos pré-formados podem apresentar atividade contra uma grande
diversidade de patógenos, exercendo provavelmente um papel crucial na
resistência de plantas não-hospedeiras (HEATH, 1980; NIKS, 1987).
38
Patógenos capazes de minimizar os efeitos destes compostos em sua fisiologia
poderiam, então, estabelecer a doença em seus hospedeiros (CALLOW, 1983).
Uma enorme variedade de compostos secundários derivados do ácido
chiquímico (Figura 8) e aminoácidos aromáticos apresentam importante papel
na defesa de plantas. Glicosídeos cianogênicos, glicosinolatos, alcalóides,
fenóis,
fitoalexinas,
ácido
salícilico,
metiljasmonatos
(BENNETT;
WALLSGROVE, 1994), lactonas insaturadas, compostos sulfúricos e saponinas
(FRY;
MYERS,
1981;
MANSFIELD,
1983;
KUĆ,
1992;
BENNETT;
WALLSGROVE, 1994; GRAYER; HARBORNE, 1994; OSBOURN, 1996b) são
alguns dos metabólitos vegetais com ação antimicrobiana que funcionam como
componentes chaves dos mecanismos de defesa.
Fosfoenol Piruvato + Eritrose 4-Fosfato
Deoxi-arabino heptulosonato-7-fosfato
3-Dehidroquinato
3-Dehidrochiquimato
Ácido chiquímico
Chiquimato 3-fosfato
5-Enolpiruvoil Chiquimato 3-Fosfato
p-Amino Benzoato
Corismato
Tyr
Phe
p-Hydroxi Benzoato
Trp
Figura 8 - Via do ácido chiquímico ou chiquimato e a geração de aminoácidos
aromáticos que são utilizados na síntese de compostos secundários de
defesa. Os aminoácidos aromáticos, principalmente a fenilalanina e tirosina,
produzidos no final da via são precursores para a síntese de diversos
compostos envolvidos com a defesa vegetal, inclusive os compostos
fenólicos, na via dos fenilpropanóides. Fonte: Adaptado de Herrmann
(1995).
39
Muitos compostos fenólicos, taninos e dienos têm sido apontados como os
responsáveis pela resistência de tecidos vegetais jovens a determinados
patógenos, sendo potentes inibidores de muitas enzimas hidrolíticas de
fitopatógenos. Outros tipos de compostos antimicrobianos apresentam, além da
atividade antimicrobiana através da lise da membrana do patógeno, potencial
para eliminar o patógeno do local de infecção (AGRIOS, 2005).
Os fenóis são um grupo estruturalmente diverso de metabólitos secundários
(WONG, 1973), que inclui compostos formados a partir da condensação de
unidades
de
acetato,
por
modificações
de
aminoácidos
aromáticos,
flavonóides, isoflavonóides e taninos. Derivados do ácido chiquímico (Figura 8),
existe uma ampla gama de compostos fenólicos constitutivos com ação na
resistência contra fungos, bactérias e nematóides, entretanto, com ação
circunstancial (KUĆ, 1990).
Os compostos fenólicos frequentemente apresentam-se solúveis em água,
visto que, na célula vegetal ocorrem mais frequentemente dentro do vacúolo na
forma conjugada, principalmente com resíduos de açúcares ligados por um ou
mais grupos hidroxila fenólicos ou como ésteres conjugados (HARBORNE,
1998). Geralmente, os fenóis livres e os fenóis ácidos são considerados únicos,
já que são normalmente identificados juntos nas análises químicas em plantas
(DE ASCENSAO; DUBERY, 2003). A hidrólise ácida ou alcalina dos extratos
vegetais libera um grande número de ácidos fenólicos éter-solúvel que ou são
associados com lignina combinada como grupos éster ou apresentam-se na
fração solúvel, ligados a álcoois como simples glicosídeos (HARBORNE,
1991).
Evidências acumuladas ao longo dos anos sugerem que a esterificação de
fenóis a materiais da parede celular é um tema muito comum na expressão da
resistência (FRY, 1987) e a presença de compostos fenólicos nas paredes
celulares dos hospedeiros é associada à resistência a enzimas fúngicas, além
de apresentarem função de barreira física contra a penetração fúngica (DE
ASCENSAO; DUBERY, 2003). Ácidos fenilpropanóicos esterificados na parede
celular
vegetal
fenilpropanóicos
(MATERN;
KNEUSEL,
1988)
e
ligação
de
ésteres
na parede, têm sugerido a formação de polímeros
40
semelhantes à lignina pela ligação daqueles à matriz de polissacarídeos
(LEWIS; YAMAMOTO, 1990).
Assim, fenóis na parede celular primária
funcionariam como um molde para deposição adicional de lignina, sendo então
a esterificação e a lignificação considerados processos contínuos e integrados
(DE ASCENSAO; DUBERY, 2003).
Além dos compostos de baixo peso molecular, moléculas mais complexas
como proteínas também estão presentes constitutivamente em plantas com
funções de defesa. Várias classes de proteínas pré-formadas têm sido
relatadas como inibidoras de proteinases do patógeno, ou mesmo de enzimas
hidrolíticas envolvidas na degradação da parede celular, para inativar os
ribossomos exógenos ou para aumentar a permeabilidade da membrana
plasmática dos fungos (AGRIOS, 2005).
Muitos genes de plantas são ativados em momentos específicos do
desenvolvimento reprodutivo e vegetativo das plantas. Dois momentos do ciclo
de vida de plantas associados com a reprodução apresentam uma ampla gama
de proteínas tóxicas (BOWLES, 1990). Sementes e tubérculos apresentam
mecanismos para resistirem às condições adversas, dentre os quais se
destacam proteínas relacionadas à defesa que restringem o desenvolvimento
de patógenos e herbívoros.
Muitas plantas apresentam um grupo de proteínas de baixo peso molecular
chamadas fitocistatinas que inibem cisteíno-proteases transportadas pelo
sistema digestivo de nematóides e algumas vezes secretadas por fungos
fitopatogênicos. Presentes constitutivamente ou induzidas por transgenia, as
fitocistatinas promovem a redução das lesões causadas por nematóides. Além
das fitocistatinas, as lectinas, um grupo de proteínas que se ligam
especificamente a determinados açúcares, causam lise e inibição do
crescimento de muitos fungos. Células da superfície das plantas também
contêm quantidades variáveis de enzimas hidrolíticas, algumas das quais,
como glucanases e quitinases, podem causar quebra de componentes da
parede celular dos patógenos, contribuindo assim para a resistência à infecção
(AGRIOS, 2005).
41
2.4.1.2 Defesa bioquímica induzida
As plantas, ao longo de seu processo evolucionário, desenvolveram um
sistema de defesa latente, o qual pode ser ativado de acordo com as
necessidades do vegetal, enquanto a defesa constitutiva representa um gasto,
muitas vezes desnecessário, para a planta (POIATTI, 2007). Esta transloca
produtos energéticos de seu metabolismo para a produção de fatores de
defesa, mesmo na ausência de patógenos (DI PIERO; KUHN; PASCHOLATI,
2005).
O contato entre o patógeno e seu potencial hospedeiro desencadeia na planta
uma série de reações de biossíntese, capazes de produzir então compostos
tóxicos ao invasor. Entretanto, esses compostos devem ser produzidos
rapidamente, próximos ao ponto de infecção e, em concentrações suficientes
para inibir o crescimento do patógeno (SEQUEIRA, 1983).
Fitoalexinas são moléculas com atividade antimicrobiana, de baixo peso
molecular, produzidos após a infecção por fitopatógenos ou induzidos por
agentes abióticos (KUĆ, 1997). Apresentam estruturas químicas diversas,
incluindo derivados dos fenilpropanóides, flavonóides e isoflavonóides,
podendo existir ainda fitoalexinas inorgânicas como o enxofre elementar (S8)
(COOPER et al., 1996). Encontradas em cerca de 30 famílias botânicas, as
fitoalexinas foram isoladas de diferentes partes de plantas como hastes, raízes,
folhas, tubérculos e frutos (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE, 2003).
A importância das fitoalexinas na resistência de uma espécie ou cultivar
depende da taxa em que são sintetizadas, velocidade com as quais são
degradadas pela planta ou microorganismo e sua toxicidade para o
microorganismo (KUĆ, 1997). O balanço entre síntese e degradação será,
então, o nível de fitoalexina presente no tecido (MEDEIROS; FERREIRA;
DIANESE, 2003), sendo caracterizadamente importante na resistência vegetal
como uma barreira química (KUĆ, 1995).
42
A síntese de fitoalexinas pode ocorrer a partir de vias bioquímicas secundárias
como a do acetato-mevalonato, acetato-malonato e ácido chiquímico. A síntese
e acumulação de maneira rápida e eficiente são associadas com a resistência
de determinadas plantas a fungos e bactérias, entretanto, a informação
genética para a síntese de fitoalexinas á encontrada em cultivares resistentes e
suscetíveis (KUĆ, 1995).
Nas interações com fungos, a velocidade e a duração da biossíntese de novo
de fenóis são mais importantes para a resistência do que as concentrações
constitutivas destes compostos. Os modos de ação destes produtos parecem
se restringir a dois: (1) efeitos tóxicos diretos sobre o fungo (fitoalexinas e
radicais livres formados a partir de precursores da lignina) e (2) deposição
rápida
e ativa
de
barreiras
estruturais
como a
lignina
(BENNETT;
WALLSGROVE, 1994).
A importância dos compostos fenólicos na inibição do crescimento de várias
espécies do gênero Fusarium tem sido relatada em pesquisas científicas
(MCKEEHEN; BUSCH; FULCHER, 1999; MODAFAR et al.; 2000; DE
ASCENSAO; DUBERY, 2003; SANTIAGO et al., 2007) em que tecidos
inoculados são testados quanto à presença ou ausência de compostos
fenólicos e sua correlação com a resistência ou suscetibilidade de cultivares
agrícolas. Assim, após o tratamento com o elicitor há um rápido aumento na
síntese de fenóis totais de baixo peso molecular, aumentando também várias
subfrações de fenóis livres, fenóis ligados à parede celular e ligados à
glicosídeos (DE ASCENSAO; DUBERY, 2003).
O papel dos fenóis na resistência vegetal contra fungos ocorre de maneira mais
dinâmica
quando
comparado
ao
papel
contra
insetos
(BENNETT;
WALLSGROVE, 1994). Estruturas e barreiras distintas são formadas em
resposta à infecção pelo hospedeiro, que é exposto ao patógeno em uma longa
e íntima relação. A formação da lignina e de seus intermediários bioquímicos
tem relação íntima com o mecanismo de defesa contra fungos (VANCE; KIRK;
SHERWOOD, 1980; AIST, 1983). Assim, há uma forte correlação entre a
indução rápida da enzima fenilalanina amônia liase e outros tipos de enzimas
envolvidas
na síntese de fenilpropanóides (incluindo cinamato álcool
43
desidrogenase e peroxidases, responsáveis pela síntese de precursores de
fenilpropanóides e lignina) e a resistência contra fungos (SOUTHERTON;
DEVERALL,
1990).
Portanto,
alterações
bioquímicas
na
via
dos
fenilpropanóides (Figura 9), responsável pela síntese de precursores de
compostos fenólicos e lignina, seriam importantes para a resistência de
plantas, já que a maioria desses compostos é tóxica para as células dos
patógenos.
Fenilalanina
Ácido
Salicílico
Ácido
Benzóico
Cinamato
p-cumarato
5-OH ferulato
Sinapato
Lignina
4-cumaroil-Coa
Isoflavonas
Ferulato
Ácido caféico
3-malonil-Coa
Naringerina chalcona
Isoflavanonas
5’-OH Eriodictiol
Naringerina
Flavonas
Eriodictiol
Dihidromiricetina
Dihidrocaempferol
Dihidroquercetina
Leucodelfinidina
Leucopelargonidina
Leucocianidina
Delfinidina
Delfinidina-3
glicósido
Pelargonidina
Flavonóis
Flavana 3-ols
epicatequina
Cianidina
Pelargonidina-3 Cianidina-3 glicósido
glicósido
Taninos
Proantocianidinas
Antocianinas
Figura 9 - Via dos fenilpropanóides em plantas. A fenilalalina proveniente da via do
ácido chiquímico é o composto precursor para a síntese de diversos
compostos envolvidos com a defesa vegetal, inclusive os compostos
fenólicos e lignina. Fonte: Adaptado de Zabala et al. (2006).
As cultivares resistentes em geral expressam níveis muito mais altos de
compostos
fenólicos
e
enzimas
oxidativas
como
peroxidases
e
polifenoloxidases e, isto pode criar um ambiente tóxico em torno do tecido
afetado, formando radicais livres derivados de fenilpropanóides reativos, além
44
de moléculas substrato para posterior lignificação (BENNETT; WALLSGROVE,
1994).
Outra resposta da planta à agressão do patógeno é o acúmulo de proteínas
relacionadas à patogênese (PRPs) (KUĆ, 1997). Tais proteínas são
sintetizadas em resposta a agentes patogênicos como vírus, bactérias, fungos,
estresses abióticos, como por exemplo, ferimentos e também em resposta a
elicitores. Todas as proteínas cuja expressão é ativada após o dano ao tecido
vegetal têm sido consideradas PRPs, levando-se em conta tratar-se de um dos
eventos
bioquímicos
mais
frequentemente
observados
em
diversos
patossistemas (STINTZI; HEITZ; PRASAD, 1993). Assim, em algumas plantas,
o surgimento da resistência está ligado à expressão coordenada de uma classe
de genes que codificam proteínas de defesa. Estas podem inibir diretamente o
patógeno ou levar a alterações estruturais - um exemplo é o espessamento da
parede celular, que além de dificultar a entrada do agressor também limita as
trocas entre este e a planta (MARGIS-PINHEIRO et al., 1999).
As PRPs são classificadas em diferentes famílias segundo suas seqüências de
aminoácidos,
peso
molecular,
função
biológica
e
relação
sorológica.
Apresentam-se como proteínas solúveis, produzidas principalmente no local da
agressão, podendo também ser posteriormente acumuladas em diferentes
porções da planta (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE, 2003). Algumas das
PRPs tem função enzimática, como quitinases e glucanases, que apresentam
capacidade de degradar a parede celular de fungos (SELA-BUURLAGE et al.,
1993), funcionando assim como enzimas hidrolíticas. Outros grupos de PRPs
apresentam atividade de inibidoras de enzimas patogênicas, como proteases e
ribonucleases. Ataques de patógenos e ferimentos levam ainda à produção de
outros componentes da parede celular vegetal, como proteínas ricas nos
aminoácidos hidroxiprolina (HRGP) e glicina (GRP). As proteínas HRGP
acumulam-se em muitas plantas em resposta tanto a fungos quanto a bactérias
e vírus, alterando a estrutura das paredes celulares para criar uma barreira
física à invasão do patógeno (MARGIS-PINHEIRO et al., 1999).
A resposta de hipersensibilidade (Figura 10) em plantas é também considerada
como um mecanismo de defesa à invasão do patógeno ao tecido vegetal.
45
Caracteristicamente de ocorrência em interações incompatíveis, as respostas
de hipersensibilidade ocorrem de maneira rápida e localizada nos tecidos
(KUĆ, 1997), ocorrendo expressão de genes de resistência, produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS), síntese de compostos antimicrobianos e
PRPs, perda de íons potássio, ganho de íons hidrogênio, destruição de
compartimentos celulares e espessamento das paredes celulares por meio da
deposição de lignina e morte celular.
Patógeno
Produto do gene
de resistência
Célula vegetal
Figura
10
-
Esquema da resposta de hipersensibilidade. A resposta de
hipersensibilidade (HR) é disparada pelo reconhecimento de um elicitor
derivado do patógeno por um produto gênico de resistência da planta.
O poderoso sistema de defesa que é ativado constitui a resposta de
hipersensibilidade que inibe o avanço do patógeno na célula vegetal.
Fonte: Adaptado de Stuiver e Custers (2001).
Por meio da morte das células localizadas ao redor do sítio de penetração, o
acesso às células vizinhas é restrito, limitando o avanço do patógeno no tecido.
Adicionalmente, a morte celular programada ocorrente na resposta de
hipersensibilidade tem também a função de remover células infectadas, assim
como células danificadas e indesejadas do organismo atacado (KERR;
WYLLIE; CURRIE, 1972). A morte celular das células vegetais no local de
infecção do patógeno pode constituir-se em uma situação nociva para os
patógenos biotróficos, que necessitam da célula viva do hospedeiro para seu
desenvolvimento e obtenção de nutrientes. No caso do F. subglutinans f. sp.
46
ananas, um fungo necrotrófico, a morte celular vegetal pode constituir-se um
evento prejudicial, já que, com a lise celular uma série de compostos pré e pósformados, tóxicos ao fungo como por exemplo fitoalexinas, PRPs e compostos
oxidativos são liberados. A resistência de uma série de variedades vegetais a
determinados patógenos têm sido correlacionada à resposta hipersensitiva
(GUZZO, 2004).
A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) tem sido caracterizada
como mecanismo essencial para sinalização das respostas de defesa pósformadas, apresentando papel central em vias de sinalização durante a
percepção de estresses. Assim, as ROS foram demonstradas recentemente
como mecanismo base das mudanças bioquímicas e fisiológicas que ocorrem
em condições de estresse ambiental, as quais, por conseqüência medeiam a
resistência de plantas a doenças causadas por fatores bióticos (KOTCHONI;
GACHOMO, 2006).
As ROS são moléculas tóxicas produzidas durante o metabolismo celular
normal das plantas. Entretanto, quando sujeitas aos diversos tipos de estresses
abióticos e bióticos, a quantidade de ROS produzida é muito grande, e, esse
acúmulo
excessivo
dessas
moléculas
necessita
do
acionamento
de
mecanismos de defesa adicionais (SOUZA, 2007). Ao menos que essas
moléculas sejam metabolizadas rapidamente no tecido vegetal, elas danificam
componentes
celulares
vegetais,
conduzindo
à morte celular
ou
ao
aparecimento de lesões necróticas (FOYER; NOCTOR, 2005).
2.4.2 Defesa Estrutural
Os mecanismos estruturais de defesa de plantas funcionam como barreiras
físicas aos patógenos, impedindo a infecção e colonização dos tecidos
vegetais.
Tais
propriedades
estruturas
são
portadoras
de
estabilidade
físicas capazes de evitar a adesão
química
e
e penetração de
microorganismos (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE, 2003).
47
2.4.2.1 Defesa Estrutural Constitutiva
Algumas defesas estruturais da planta estão presentes mesmo antes do
contato da planta com o patógeno. A primeira barreira a ser transposta por
todos fitopatógenos é a epiderme da planta. Para que um microorganismo
obtenha os nutrientes presentes no interior das células vegetais, inicialmente é
necessário adentrar os tecidos vegetais, saindo do ambiente externo,
transpondo a epiderme vegetal e chegando até o interior dos tecidos. A
epiderme é composta por uma ou mais camada de células e, externamente,
uma rede lipídica, apresentando função estrutural primordial na defesa das
plantas. Essas estruturas associadas agem como barreira limitando a invasão
por patógenos, como fungos e bactérias.
A cutina é uma macromolécula formada por ácidos graxos de cadeia longa
ligados por ligações ésteres. Constituindo uma rede tridimensional rígida, a
cutina é o principal constituinte da cutícula, uma estrutura secretada,
pluriestratificada, que cobre as paredes celulares externas das células da
epiderme das partes aéreas de plantas (TAIZ; ZEIGER, 2004). A cutícula é
formada por uma cobertura de substâncias cerosas, uma camada intermediária
contendo cutina e cera e uma camada mais interna de cutina e ceras
combinadas com sustâncias glicídicas da parede celular, tais como pectinas,
celulose e outros carboidratos (Figura 11). Desta forma, sendo formada em
grande parte por substâncias hidrofóbicas, a cutícula inibe a formação de um
filme de água na superfície das células, prevenindo o estabelecimento de
microorganismos na superfície das plantas (BELL, 1981).
As ceras são compostos altamente hidrofóbicos compostos por acil lipídios de
cadeia longa. A resistência de certos genótipos de plantas está associada à
espessura da camada cerosa da planta, como por exemplo genótipos de milho
resistentes à infecção por Aspergillus flavus têm camada cerosa mais espessa
(RUSSIN et al., 1997). Os grãos de milho mais resistentes à infecção por
Aspergillus flavus apresentam, quando armazenados, menores níveis de
aflatoxinas, devido à camada mais espessa de ceras.
48
Epiderme
adaxial
Epiderme
abaxial
Tricoma
Estômato
Figura 11 - Esquema da estrutura da epiderme e cutícula das folhas de plantas: EW –
ceras epicuticulares; C – cutícula propriamente dita, na qual moléculas de
cutina são embebidas com ceras intracuticulares; CL – camada cuticular,
que apresenta cutina e polissacarídeos da parede da célula adjacente,
podendo conter ceras intracuticulares; PW - parede celular primária; Cy –
citoplasma; V – vacúolo; ML - lamela média e camada pectinácea; PM –
membrana plasmática. Fonte: Adaptado de Pollard et al. (2008).
Outra molécula importante de revetimento é a suberina, um polímero, assim
como a cutina, formado por ácidos graxos hidroxi e epoxi unidos por ligações
ésteres, apresentando ainda ácidos dicarboxílicos, além de uma significativa
proporção de compostos fenólicos. Apresenta-se como o principal constituinte
da periderme, se formando também em áreas de abscisão foliar e em
ferimentos cicatrizados (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Outra barreira física muito eficiente nas células vegetais é a parede celular. As
células vegetais apresentam parede celular externamente à membrana
plasmática. Essa barreira física separa os agentes patogênicos dos produtos
do metabolismo vegetal, que ficam restritos, em grande parte, nas células
vegetais (HÜCKELHOVEN, 2007). A parede celular vegetal desempenha uma
série de importantes funções no metabolismo vegetal. Funcionando como uma
matriz elaborada, que circunda cada célula vegetal, a parede celular apresenta
funções específicas como manutenção da forma da célula, resistência
49
mecânica, proteção
contra microorganismos,
sustentação,
controle da
expansão celular, armazenamento de material de reserva, participação no
reconhecimento entre células e sinalização, além de apresentar efeitos sobre o
transporte intercelular e sobre o potencial de água da célula (SOUZA, 2007).
A parede primária é uma fina camada produzida a partir da divisão celular,
sendo composta basicamente por celulose, hemicelulose e proteínas. Sua
arquitetura precisamente regulada e extraordinária complexidade estrutural
desempenham papéis importantes na tarefa de defesa das plantas contra
microorganismos invasores. A presença de uma malha composta por uma série
de carboidratos complexos e glicoproteínas faz da parede celular uma barreira
física muito eficaz, impedindo a penetração de microorganismos no interior das
células do hospedeiro (TAIZ; ZEIGER, 2004).
As paredes celulares dos tecidos invadidos por patógenos variam em
espessura e resistência e, devido a essas características, podem algumas
vezes inibir o avanço do patógeno. A presença, em particular de vasos ou
áreas extendidas de células esclerenquimáticas, podem parar ou inibir a
colonização por parte do patógeno nos tecidos vegetais (AGRIOS, 2005).
Assim, tecidos em que as células apresentem paredes celulares espessadas
podem inibir o avanço do patógeno na planta.
As proteínas presentes nas paredes celulares também apresentam uma grande
importância na defesa estrutural de plantas. Proteínas estruturais são
moléculas extremamente importantes para os processos de síntese de tiloses e
géis e moléculas de lignina sintetizadas e ligadas a proteínas da parede celular
são mais resistentes à hidrólise que aquelas ligadas a carboidratos. Muitas
dessas
proteínas
estruturais
apresentam
atividades
enzimáticas
e
provavelmente são importantes para reações químicas nas paredes celulares
(BELL, 1981). Dessa forma, as proteínas ligadas à parede celular
desempenham uma ampla gama de funções importantes para a defesa da
célula contra agressores patogênicos.
Muitos outros fatores estruturais têm sido correlacionados com o nível de
resistência de certas espécies vegetais. O número e tipo de estômatos, número
50
e tamanho de lenticelas, quantidade de silício na epiderme foliar, número e tipo
de tricomas, conteúdo e distribuição de fibras esclerenquimáticas (MEDEIROS;
FERREIRA; DIANESE, 2003) e estrutura das células epidérmicas são alguns
dos fatores considerados importantes para definição do nível de resistência ao
patógeno (AGRIOS, 2005).
2.4.2.2 Defesa Estrutural Induzida
A existência de barreiras estruturais pré-existentes nas plantas inibe a
penetração de uma gama de microorganismos nos tecidos vegetais, tornandoos resistentes à maioria dos microorganismos potencialmente causadores de
doenças. Entretanto, apesar da eficiência desses mecanismos, muitos
organismos causadores de doenças podem infectar o vegetal por meio de
ferimentos e aberturas naturais na epiderme. Assim, após a entrada do
microorganismo, a planta responde ao ataque patogênico se defendendo por
meio de estruturas de defesa pós-formadas, ou seja, induzidas pela presença
do patógeno.
A defesa estrutural induzida em plantas pode se dar de diversas formas. Após
a infecção por um determinado microorganismo uma série de reações e vias
bioquímicas são ativadas para a síntese de compostos que inibirão
estruturalmente o avanço do patógeno.
Algumas estruturas de defesa formadas envolvem o citoplasma das células sob
ataque, outras envolvem as paredes das células infectadas (AGRIOS, 2005),
em que, modificações da parede celular se traduzem em diversos níveis de
espessamento nos pontos de infecção (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE,
2003). Tais estruturas envolvem modificações morfológicas na parede ou
mesmo modificações derivadas das paredes das células invadidas pelo
patógeno.
Muitos microorganismos são capazes de degradar substâncias presentes nas
paredes celulares, penetrando assim no citoplasma celular e posteriormente no
51
tecido vegetal. Enzimas degradadoras de polímeros presentes na parede,
como pectinases, celulases, xilanases e poligalacturonases, são produzidas
por muitos fitopatógenos. Assim, muitas plantas podem responder à invasão de
patógenos pelo espessamento de suas paredes celulares, tornando-as
resistentes à degradação e reduzindo o desenvolvimento do patógeno (KUĆ,
1997). Esse espessamento de parede celular restringirá fisicamente o
patógeno, além de bloquear a difusão de nutrientes das células para o
patógeno e de fitotoxinas do patógeno para a célula vegetal.
Modificações na composição da parede celular como resposta à infecção
incluem deposição de calose, formação de papilas, lignificação e cross-linking
(ligações cruzadas) entre proteínas estruturais (KUĆ, 1997) e compostos
fenólicos (DE ASCENSAO; DUBERY, 2003).
Existem fortes correlações entre resistência e deposição rápida de substâncias
capazes de obstruir a entrada de microorganismos por meio do reparo de
ferimentos.
Muitas
dessas
substâncias, como papilas,
derivadas
dos
fenilpropanóides, previnem o ingresso fúngico no tecido vegetal. Outros
exemplos de barreiras estruturais fenólicas incluem ligações cruzadas de
dímeros de ácidos ferúlicos aos polissacarídeos da parede celular catalisadas
por peroxidases, que podem fazer com que as paredes tornem-se resistentes à
enzimas fúngicas degradadoras (BENNETT; WALLSGROVE, 1994).
Com a função de reparar o dano sofrido pela célula, as papilas algumas vezes
são produzidas antes da penetração, prevenindo a colonização das células. A
face interna da parede celular das células expostas a agressões mecânicas do
patógeno é um sítio de defesa à invasão patogênica no qual o citoplasma se
agrega e promove a deposição de material. As papilas ou aposições se formam
na face interna da parede celular abaixo do ponto de penetração direta de
fungos e algumas bactérias (Figura 12), interrompendo assim o processo
infeccioso. Nestas porções das células há o acúmulo de sustâncias viscoelásticas como a lignina, polifenóis, calose (β - 1,3 glucana), suberina, silício e
celulose que funcionam como barreiras contra a força mecânica exercida pelo
patógeno (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE, 2003).
52
Assim, a ruptura da parede celular não leva necessariamente à morte celular,
pois a limitação do crescimento do patógeno pode ocorrer de diversas formas.
As papilas são produzidas pelas células vegetais com minutos após ferimento e
com 2 a 3 horas após inoculação com microorganismos (AGRIOS, 2005),
podendo ser visualizadas por meio de microscopia ótica ou eletrônica.
H
CW
A
CW
S
AH
HC
Figura 12 - Formação de papila em torno de hifa fúngica penetrando a parede celular
vegetal. H: hifa fúngica; CW: parede celular vegetal; A: apressório; S:
papila; AH: penetração da hifa mesmo em presença da papila; HC: hifa no
citoplasma da célula vegetal. Fonte: Agrios (2005).
A principal componente das papilas é a calose, polissacarídeo formado pelas
plantas em resposta aos mais variados estresses, sendo constituída
principalmente por moléculas de glicose unidas por ligações β - 1,3. Em alguns
casos, os tubos de penetração fúngicos se expandem no sentido do lúmem
celular sendo então envolvidos por materiais celulósicos (calose) que mais
tarde apresentará substâncias fenólicas ligadas, formando assim um tubo
lignificado ao redor das hifas (Figura 12).
Lignina é um dos mais abundantes biopolímeros na Terra, sendo formado
principalmente pela condensação de radicais livres de álcoois hidroxinamil. A
lignificação pode limitar o crescimento fúngico dentro dos tecidos vegetais de
diversas formas. Assim, a lignina pode fazer com que as paredes tornem-se
53
mais resistentes à penetração mecânica. A lignificação da parede pode ocorrer
no ponto de ataque, fazendo com que aquela porção torne-se mais resistente à
diluição por enzimas fúngicas. A lignificação das paredes pode também impedir
a difusão de enzimas e toxinas do fungo para o hospedeiro e de água e
nutrientes do hospedeiro para o fungo. Mais ainda, precursores fenólicos de
baixo peso molecular da lignina e radicais livres produzidos durante a
polimerização desta podem atuar inativando membranas, enzimas, toxinas e
elicitores fúngicos. Por fim, as hifas fúngicas podem tornar-se lignificadas e
perderem a plasticidade necessária para o crescimento (RIDE, 1978).
O aumento da síntese de lignina pela via do ácido chiquímico e via biossintética
da lignina (Figura 8 e 13) é uma resposta celular frequentemente associada ao
insucesso da penetração por patógenos (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE,
2003). Provavelmente, peroxidases da parede celular, ao reduzir o peróxido de
hidrogênio, geram radicais livres do álcool coniferil, que espontâneamente, por
meio de ligações cruzadas, formam a lignina (WALTON, 1997).
Trabalhos recentes têm demonstrado a importância da lignificação no
espessamento da parede celular em culturas de interesse econômico
inoculadas com elicitores provenientes do patógeno. Em testes realizados com
banana, cacau, milho, tomate, batata, eucalipto e outros, as espécies
resistentes em campo apresentaram mecanismos de espessamento mais
eficientes através da deposição de fenóis e lignina na parede celular
(MODAFAR et al., 2000; DE ASCENSAO; DUBERY, 2000; NOJOSA et al.,
2003; DE ASCENSAO; DUBERY, 2003; SANTIAGO et al., 2007; MANDAL;
MITRA, 2007; POIATTI, 2007; SMITH et al., 2007).
54
L-Fenilalanina
PAL
Cinamato
C4H
Tirosina
TAL
4-Cumarato
4CL
C3H
Cafeato
COMT
Ferulato
COMT
Sinapato
CAD
Álcool 4-cumaril
CCoA-3H
4CL
Lignina
Cafeoil-CoA
CCoA-OMT
4CL
F5H
5 – Hidroxi
ferulato
4-Cumaroil- CCR
4CoA
Cumaraldeído
4CL
FeruloilCoA
5-Hidroxiferuloil-CoA
Suberina
CCR
CCR
Coniferaldeído
CAD
Álcool coniferil
5-Hidroxiconiferaldeído
Fenóis solúveis
Etc.
CCoA-OMT
4CL
SinapoilCoA
CCR
Sinapaldeído
Fenóis ligados à
parede celular
CAD
Álcool sinapil
Figura 13 - Via biossintética da lignina: PAL – Fenilalanina amônia liase; TAL - Tirosina amônia liase; C4H – Cinamato 4-hidoxilase; C3H - pCumarato 3-hidroxilase; COMT – Ácido cafeico O-metiltransferase; F5H - Ácido ferulico 5-hidroxilase; 4CL - 4-Cumarato-CoA ligase;
CCoA-3H – Cumaroil-coenzima A 3-hidroxilase; CCoA-OMT – Cafeoil-coenzima A O-metiltransferase; CCR - cinamil-CoA redutase;
CAD - cinamil álcool dehidrogenase. Fonte: Adaptado de Boudet e Grima-Pettenati (1996); Campbell e Sederoff (1996).
55
A defesa histológica em vegetais pode, portanto, ocorrer de uma série de
formas. A infecção do tecido vegetal por fitopatógenos, principalmente fungos
e bactérias induzem também a formação de camadas de células suberificadas,
constituindo camadas de cortiça em torno do ponto de infecção (Figura 14). O
tecido corticoso surge provavelmente para inibição da invasão adicional do
patógeno, constituído por um tecido morto que bloqueia a troca de substância
entre o patógeno e planta. Assim, a área infectada é limitada por regiões
necróticas nos tecidos, que limitam o avanço do patógeno nos tecidos
saudáveis (AGRIOS, 2005).
Micélio
Grão de
amido
Cortiça
Epiderme
Figura 14 - Esquema da formação da camada de cortiça entre tecidos saudáveis e
infectados em tubérculos de batata, não permitindo que o fungo
ultrapasse a barreira estrutural. Fonte: Adaptado de Agrios (2005).
56
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Determinar os fatores relacionados com a resistência à fusariose no
abacaxizeiro da cultivar Vitória.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Através da comparação entre a cv. Vitória e as cultivares suscetíveis à
fusariose, Pérola e Smooth Cayenne:
•
Determinar os mecanismos de resistência das cultivares de abacaxi
através das respostas estruturais à infecção com o fungo F. subglutinans f. sp.
ananas;
•
Analisar as diferenças quanto à presença de compostos orgânicos;
•
Caracterizar os teores de proteínas e compostos fenólicos;
•
Avaliar o potencial antifúngico do extrato bruto protéico de folhas de
mudas;
•
Avaliar os mecanismos de resistência através das respostas estruturais
à lesão mecânica.
57
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
As mudas de abacaxi das cultivares Vitória, Smooth Cayenne e Pérola foram
cedidas pelo INCAPER e plantadas em vasos plásticos de 25 cm de diâmetro e
30 cm de altura, contendo uma mistura de 2:1 p/p de terra adubada com
esterco e areia de rio lavada, com irrigação semanal, mantidas no telado do
Laboratório de Estudos Celulares e Moleculares do Estresse (LESMol), Núcleo
de Biotecnologia, Centro de Ciências da Saúde, UFES, com sombreamento de
aproximadamente 50%.
Para todos os testes realizados durante este estudo foram utilizadas a porção
basal, caracteristicamente aclorofilada, das folhas “D” do abacaxizeiro,
originárias de plantas com aproximadamente 6 meses de idade. As análises
foram realizadas em triplicatas.
4.2 ANÁLISE ANATÔMICA E HISTOQUÍMICA DAS RESPOSTAS DE DEFESA
NAS DIFERENTES CULTIVARES EM PRESENÇA DO INÓCULO
A comparação anatômica das diferenças nas respostas de defesa entre as
cultivares do abacaxizeiro foi realizada em seções de folhas com cerca de 10
cm, contando-se a partir da parte basal aclorofilada. Em seguida foram limpas,
desinfestadas com hipoclorito de sódio 1,5% e colocadas dentro de placas de
Petri estéreis. Foram realizados ferimentos com 12 agulhas entomológicas
unidas à cerca de 5 cm a partir da base foliar. Para os tratamentos foram
inoculados 100 µL de uma suspensão de conídios (1,5x 105 conídios/mL). Cada
placa, contendo duplicatas do experimento foi colocada dentro de caixas de
acrílico Gerbox (11 x 11 x 3,5 cm) com fundo coberto por papel filtro
umidificado com 5 mL de água destilada estéril.
58
Imagens para análise morfológica dos ferimentos para cada tratamento foram
capturadas por meio de câmera manual, sendo as imagens de detalhe obtidas
por zoom digital.
Cortes nas regiões de ferimentos foram realizados à mão livre no período de 0
e 48 h após o ferimento. Os cortes foram submetidos aos testes de coloração
temporária (KRAUS; ARDUIN, 1997). Foram preparadas lâminas semipermanentes utilizando-se material fresco, preso a um suporte e cortado a mão
livre com o auxílio de lâmina de barbear. As seções transversais foram
colocadas em água destilada, coradas com safranina aquosa a 0,5%,
montadas na mistura glicerol-água 50%, entre lâmina e lamínula e vedadas
com esmalte incolor.
Para a realização dos testes histoquímicos foram empregados os seguintes
reagentes: lugol, para evidenciar grãos de amido (BERLYN; MIKSCHE, 1976);
cloreto férrico, para visualização dos compostos fenólicos do tecido
(JOHANSEN, 1940); Sudam III, para evidenciar lipídios como cutina e suberina
(SASS,
1951);
solução
de
floroglucinol
acidificado,
para
detectar
a
impregnação de lignina nas paredes celulares (HERR, 1992).
O reagente de lugol é indicado para amido, dando uma coloração azul-negra
ou marrom muito escuro. O cloreto férrico produz uma coloração negro-azulada
ou verde escuro com compostos fenólicos. O floroglucinol acidificado produz
uma coloração vermelha para a lignina, podendo também corar outros
componentes (como a suberina, por exemplo). Já o reagente Sudam III cora
lipídios, cutina e suberina de amarelo-alaranjado ou vermelho (KRAUS;
ARDUIN, 1997).
O material vegetal utilizado para os cortes anatômicos foi fotografado,
demonstrando o comportamento in vitro das cultivares em presença do agente
causador da doença após 48 h do ferimento e inóculo com F. subglutinans f.
sp. ananas.
59
As imagens foram capturadas em um microscópio ótico Leica DMLS, acoplado
a um sistema de aquisição de imagem digital, câmera Moticam 2000, utilizando
o programa Leica EWS.
4.3 ANÁLISE BIOQUÍMICA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS
O macerado utilizado para dosagens bioquímicas foi obtido a partir da
trituração de 0,3 gramas da parte aclorofilada das folhas “D” frescas de cada
um dos genótipos em nitrogênio líquido, e posterior extração de compostos
bioquímicos para dosagem por espectrofotometria de acordo com o protocolo
descrito a seguir.
4.3.1 Extração e determinação do teor de fenóis ligados e livres
A análise da concentração de fenóis totais foi feita utilizando metanol como
agente extrator e o reagente de Folin e Ciocalteu para determinação de sua
concentração (GUZZO et al., 1999).
Para extração dos compostos fenólicos, 0,3 g de folhas foram trituradas em
nitrogênio líquido e o pó foi ressuspenso em 4 mL de metanol à 50% e deixado
em banho-maria por 1,5 h à 80 °C. O extrato foi resfriado e centrifugado à
12000 rpm (Centrífuga Eppendorf modelo 5804R) por 15 minutos. O
sobrenadante foi coletado para dosagem de fenóis livres. Ao pellet foram
adicionados 2 mL de NaOH (hidróxido de sódio) 0,5 M e incubado por
aproximadamente 24 h para saponificação de fenóis ligados à parede celular. A
reação foi neutralizada com 0,5 mL de ácido clorídrico (HCl) 2 M e o extrato foi
centrifugado à 12000 rpm por 15 minutos.
À 150 µL dos sobrenadantes (fenóis livres e ligados à parede) foi adicionado 3
mL de carbonato de sódio (Na2CO3) (2% m/v) e 150 µL do reagente de Folin-
60
Ciocateu diluído em água (1:1 v/v). Procedeu-se a leitura em espectrofotômetro
(BioMate 3 – ThermoSpectronic) à 750 nm. A concentração de fenóis foi
expressa em equivalentes de ácido clorogênico (µg) por mg de tecido fresco. A
concentração de fenóis presente em cada amostra foi determinada utilizandose uma curva padrão utilizando soluções de ácido clorogênico nas
concentrações de 0; 10; 20; 30; 40; 50; 100 e 150 µg/mL.
4.3.2 Determinação do conteúdo protéico total
A determinação do conteúdo protéico foi realizada segundo o método proposto
por Lowry (1951).
O macerado foliar foi ressuspenso em 4 mL do tampão fosfato 0,01 M (pH 6,0)
a 4 ºC, obtendo-se assim o extrato bruto. O extrato foi centrifugado a 12.000
rpm por 25 minutos à 4 ºC e o sobrenadante coletado.
Para dosagem adicionou-se 1 mL do extrato bruto à 5 mL do reagente de cobre
(composto por 48 mL da solução de carbonato de sódio 3% em NaOH 0,1 M, 1
mL de tartarato de sódio e potássio 4% e 1 mL de sulfato de cobre 2%). Após
10 minutos, acrescentou-se 500 µL do Reagente de Folin-Ciocalteu diluído em
água destilada (1:2 v/v). Após 10 minutos as amostras tiveram a absorbância
estimada em espectrofotômetro à 660 nm. A concentração de proteínas
presente em cada amostra foi determinada utilizando-se uma curva padrão (25,
50, 100 e 150 µg) de albumina de soro bovino.
4.4 PREPARO DO EXTRATO BRUTO PROTÉICO
Os tecidos foliares de cada um dos genótipos foram triturados em nitrogênio
líquido e colocados rapidamente em tampão Tris 30 mM pH 7,5 a 4 °C com
polivinilpolipirrolidona (PVPP) 2%, azida sódica 1 mM e os inibidores de
61
proteases, aprotinina, pepstatina e leupeptina à concentração final de 25 µM e
PMSF 100 µg/mL, numa proporção de 1:5 (g de folha/mL do tampão). Os
extratos foram submetidos à agitação por 4 horas a 4 °C, visando à diluição
das proteínas no meio líquido. Restos celulares e macro elementos foram
excluídos através de centrifugação por 40 min a 4 °C à 10.000 rpm. Colocou-se
os extratos protéicos individualmente em sacos de membrana de diálise com
poro de 3,5 kDa. Estes foram então submetidos à diálise em tampão Tris 30
mM por 18 h. Para a concentração do extrato, as membranas de diálise foram
colocadas em uma bandeja contendo polietilenoglicol 4000 USP. Desta forma,
as proteínas de pesos moleculares superiores ao tamanho do poro ficaram
retidas no interior da membrana. O extrato protéico concentrado foi
armazenado em freezer a -20 °C até posterior utilização.
4.5 AVALIAÇÃO ANTIFÚNGICA
Uma suspensão matriz de conídios (1.5x 106 conídios/mL) do fungo F.
subglutinans f. sp. ananas foi filtrada em gaze dupla e adicionada em meio de
cultura Batata-Dextrose (BD), obtendo-se uma concentração final de 2,5 x 104
conídios/mL. Alíquotas de 150 µL desta cultura foram colocadas nos poços de
microplacas de 96 poços. A cada poço foram adicionadas concentrações
protéicas finais de 0,5 mg/mL e água estéril para um volume final de 300 µL.
Como controle negativo foi utilizado água destilada estéril. Como controle
positivo foi utilizado 0,05% p/v do fungicida sintético benomyl (Benlate® 500
PM, DuPont do Brasil). As placas foram incubadas a 28 °C por 3 ou 4 dias,
tempo necessário para que o fungo atinja, ao menos, metade da fase
exponencial de crescimento. O crescimento fúngico foi acompanhado em
espectrofotômetro a uma densidade ótica (DO) de 620 nm em aparelho de
ELISA (ELX 800 LBP, EUA).
Para confeccionar a curva de crescimento fúngico nas condições do
experimento foi utilizado um modelo matemático de probabilidade segundo
Gibson e Hocking (1997), estimando-se assim a taxa de crescimento do fungo.
62
A probabilidade de crescimento foi obtida a partir do modelo de regressão S
logistic, com o auxílio do programa Origin 6.0.
4.6 ANÁLISE ANATÔMICA DAS RESPOSTAS DE DEFESA AO FERIMENTO
NAS DIFERENTES CULTIVARES
A comparação anatômica das diferenças nas respostas de defesa entre as
cultivares do abacaxizeiro foi realizada segundo o item 4.2, utilizando-se o
reagente safranina aquosa. Entretanto, os tratamentos receberam 100 µL de
água destilada autoclavada, ao invés da suspensão de conídios.
63
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 INTERAÇÃO DOS TECIDOS VEGETAIS COM F. subglutinans f. sp.
ananas
Os mecanismos celulares e moleculares que conferem resistência à fusariose
na cv. Vitória ainda não são conhecidos. Análises morfológicas e histológicas
comparativas das três cultivares em presença de F. subglutinans f. sp. ananas
auxiliam a compreensão dos mecanismos que conferem a resistência à
fusariose na cv. Vitória.
Neste estudo foram utilizadas porções aclorofiladas de folhas ‘D’ por se
apresentarem completamente desenvolvidas, mas sem sintomas de clorose.
Estas são as folhas ideais para a análise do desenvolvimento da doença, já
que folhas muito jovens apresentam uma alta severidade da doença, enquanto
folhas muito velhas demonstram-se, em alguns casos, resistentes à inoculação
com o patógeno. Mais ainda, os tecidos clorofilados não desenvolvem a lesão
característica
da
doença,
podendo
estar
associada
à
formação
de
determinados compostos bioquímicos (como compostos fenólicos, em especial
taninos), à pressão osmótica das células ou mesmo a teores de nutrientes, o
que não ocorreria nos tecidos aclorofilados utilizados no presente estudo
(VENTURA, 1994).
As porções aclorofiladas das folhas foram submetidas a ferimentos formando
aberturas para entrada do patógeno nos tecidos vegetais. Tal procedimento foi
necessário já que a penetração direta (pela superfície intacta do hospedeiro)
não é uma característica deste fungo, que pode sobreviver epifiticamente na
superfície das folhas do abacaxi sem causar a doença (DIANESE, 1981). Em
estudos com a cv. Pérola, Ventura (1994) confirmou, através de testes de
inoculação das folhas, que a penetração do patógeno só ocorre através de
ferimentos.
64
A região destacada indica a porção onde o ferimento foi realizado na porção
basal das folhas, demonstrando os pontos de penetração das agulhas no
tecido (Figura 15 – A, B e C setas). Imagens obtidas imediatamente após o
ferimento e inoculação com os conídios do fungo demonstraram a regularidade
dos tecidos em uma análise morfológica ao olho nu (Figura 15 – A, B e C).
A análise das folhas das cultivares de abacaxi inoculadas com F. subglutinans
f. sp. ananas evidenciou o estabelecimento de lesões nas cultivares
suscetíveis. Verdadeiramente, as folhas das cultivares suscetíveis exibiram
visíveis sintomas da doença após 48 horas de inoculação, com degradação de
células em torno do ferimento (Figura 15 - E, H, F e I). A doença pode ser
caracterizada pela necrose dos tecidos, que se apresentam com a coloração
amarronzada na região do ferimento, além da degradação das células nessa
região, indicando a suscetibilidade das cultivares Smooth Cayenne e Pérola
(Figura 15 - E, H, F e I). Nestas houve decomposição dos tecidos adjacentes
ao ponto de inoculação, originando assim, sintomas da doença semelhantes
aos observados em condições naturais.
A cv. Vitória, resistente em campo à fusariose, também mostrou-se resistente
in vitro à doença (Figura 15 - A, D e G), confirmando os resultados obtidos por
Ventura et al. (2006). Após 48 horas de inoculação a região dos ferimentos não
apresentou degradação de células, mantendo o aspecto íntegro do tecido, além
de apresentar coloração clara, bastante diferenciada da coloração evidenciada
nas outras cultivares. Assim, ao longo do ferimento, além de manter-se integro,
o tecido demonstra-se em cicatrização, com porções esbranquiçadas
circundantes.
Em trabalho semelhante, Ventura (1994) comparou as cultivares Pérola
(suscetível) e Perolera (resistente). O método da folha destacada mostrou-se
eficiente para a avaliação de patogenicidade e verificou-se que as inoculações
na base das folhas resultaram lesões mesmo nas cultivares tidas como
resistentes. Apesar da utilização do mesmo método, com a mesma região da
folha, a cv. resistente no presente trabalho não desenvolveu a doença in vitro,
evidenciando-se ainda mais os eficazes mecanismos de resistência em
‘Vitória’.
65
Santos; Matos e Cabral (2001) também utilizaram o método da folha destacada
com as folhas ‘D’ em 6 diferentes genótipos: ‘Guiana’, ‘Pérola’, ‘Perolera’,
‘Primavera’, ‘Roxo de Tefé’ e ‘Smooth Cayenne’. As análises in vitro foram
realizadas após 15 dias de incubação, enquanto em campo as mudas do tipo
filhote foram analisadas após 100 dias de inoculação. Os genótipos suscetíveis
‘Guiana’, ‘Pérola’, ‘Roxo de Tefé’ e ‘Smooth Cayenne’ expressaram reação de
suscetibilidade ao patógeno. Essa reação de suscetibilidade ao patógeno
também foi observada para as cultivares suscetíveis ‘Pérola’ e ‘Smooth
Cayenne’.
Nas análises realizadas por Santos; Matos e Cabral (2001) os genótipos
suscetíveis diferiram da cv. Primavera e Perolera, nos quais não se constatou
infecção nas folhas inoculadas com nenhum dos 10 isolados de F. subglutinans
f. sp. ananas utilizados no estudo. A cv. Primavera, não apresentou lesões
após incubação com nenhum dos 10 isolados estudados.
Tida como resistente por Cabral; Matos e Souto (1985) e confirmada como tal
no estudo de Santos; Matos e Cabral (2001) a cv. Primavera é o parental
resistente usado na hibridação da cv. Vitória.
66
A
D
G
B
E
H
C
F
I
Figura 15 - Região do ferimento da porção aclorofilada da folha do abacaxizeiro.
A, D e G: Vitória; B, E e H: Smooth Cayenne; C, F e I: Pérola.
A, B e C: imediatamente após injúria e inoculação com conídios de F.
subglutinans f. sp. ananas; D, E e F: 48 horas após injúria e inoculação; G,
H e I: Detalhe da porção do ferimento apresentados em D, E e F
respectivamente, após 48 horas da inoculação. As setas indicam a região
do ferimento nos tecidos. (Barra = 0,5 cm).
67
Os tecidos analisados por microscopia óptica imediatamente após o ferimento
e inoculação apresentaram-se íntegros nas análises. Apesar dos ferimentos
realizados com as agulhas entomológicas, o parênquima aclorofilado
apresentou-se íntegro, sem alteração nos feixes vasculares e tecidos de
aerênquima. Assim, histologicamente não foram detectadas diferenças entre os
tecidos parenquimáticos das folhas das três cultivares (Figura 16 - A, B e C),
apesar da grande quantidade de amido na cv. Pérola, visível mesmo sem
coloração específica, imediatamente após a realização do ferimento (Figura 16
– C estrela). Tal visualização foi possível uma vez que, os grãos de amido nos
tecidos vegetais apresentam-se como grânulos de diferentes tamanhos e com
coloração esbranquiçada. Com a passagem da luz pela lâmina dos tecidos, por
apresentarem maior absorção da luz, os grãos de amido eram então
evidenciados mesmo sem a utilização de um reagente para coloração, como o
lugol.
As cultivares apresentaram, após reação dos tecidos com a safranina,
coloração avermelhada uniforme no momento após a realização do ferimento,
indicando assim, para este momento, a ausência de mecanismos de defesa
induzidos. Ao redor das lesões é bastante visível a uniformidade da coloração
com as outras regiões do parênquima (Figura 16 - A, B e C). Diferentemente,
nas análises após 48 h do ferimento e inoculação o espessamento de parede é
bastante evidente pela coloração mais escura (negra nas fotos) ao longo das
lesões em todas as cultivares (Figura 16 - D, E e F).
68
*
A
D
B
E
C
F
Figura 16 - Seção transversal da região basal aclorofilada da folha de
abacaxi. A e D: Vitória; B e E: Smooth Cayenne; C e F: Pérola.
A, B e C: imediatamente após injúria e inoculação com conídios
de F. subglutinans f. sp. ananas.; D, E e F 48 horas após injúria
e inoculação. As setas indicam a região parenquimática abaixo
da lesão. O asterisco indica a presença de tecido suberificado e
a estrela indica a grande concentração de grãos de amido no
tecido (Coloração: safranina aquosa). (Barra= 500µm).
69
As análises histológicas das cultivares inoculadas com a suspensão de
conídios de F. subglutinans f. sp. ananas mostraram um espessamento de
parede celular ao redor do ferimento (Figura 16 - D, E e F) após 48 h de
incubação.
As plantas podem responder à infecção através do espessamento de suas
paredes celulares, fazendo com que estas se tornem resistentes à degradação,
reduzindo a penetração e restringindo o desenvolvimento do patógeno. Por
meio do espessamento das paredes celulares, a planta pode também evitar a
difusão de nutrientes das células vegetais para o microorganismo e retardar a
difusão de fitotoxinas do patógeno para suas células (KUĆ, 1997).
No tecido colonizado da cv. Pérola, a presença de hifas no tecido é marcada
pela desintegração do tecido parenquimático aqüífero (Figura 16 - F) de modo
precoce, quando comparado com as outras cultivares. Presente na face adaxial
das folhas do abacaxizeiro e constituído por células maiores, o tecido
parenquimático aqüífero apresenta importância no suprimento de água para a
planta (PY; LACOEUILHE; TEISON, 1984). Tal tecido, rico em água, poderia
criar condições propícias para o estabelecimento do patógeno nessa região.
As paredes celulares vegetais são estruturadas por diversos compostos, dentre
os quais os compostos fenólicos e a lignina, e o espessamento das paredes
envolve o aumento da quantidade de lignina ligada aos componentes da
parede. A lignificação dos tecidos vegetais ocorre durante o desenvolvimento
vegetal e também como resposta a infecções fúngicas como parte do
mecanismo de defesa geral em plantas (WALTER, 1992).
Células com paredes lignificadas são mecanicamente mais rígidas e mais
resistentes à degradação por enzimas produzidas pelo patógeno, restringindo
fisicamente a invasão (VANCE; KIRK; SHERWOOD, 1980; RIDE, 1980). O
aumento da síntese de lignina pelo metabolismo dos fenilpropanóides (Figura 9
e 13) é uma resposta frequentemente associada ao insucesso da penetração
nos tecidos vegetais por patógenos (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE,
2003). Foi facilmente perceptível no intervalo de 48 h uma camada de células
com paredes lignificadas mais espessa na cv. Vitória, envolvendo um número
70
maior de células, quando comparada às duas outras cultivares suscetíveis (Fig.
16 – D, E e F). Uma das possibilidades é que a formação da lignina ocorreria a
partir da peroxidação do peróxido de hidrogênio na parede celular, gerando
radicais livres do álcool coniferil, que por ligações cruzadas forma a molécula
da lignina (WALTON, 1997).
As alterações da parede celular observadas nas tecidos da cv. Pérola, não
restringiram a colonização intracelular neste hospedeiro, podendo ser
observada a degradação dos tecidos internos à lesão, com as paredes já
espessadas no período de 48 h após a inoculação (Figura 16 - F) . O mesmo
foi observado por Mims e Vaillancourt (2002) na interação Colletotrichum
graminicola (Cesati) Wilson e uma cultivar suscetível de milho (Zea mays L.),
onde papilas foram produzidas nas células da epiderme e do mesófilo em
resposta à tentativa de penetração pelo patógeno, mas estas não tiveram
sucesso em prevenir a entrada das hifas nas células. De acordo com Aist
(1983), as papilas nem sempre são efetivas em restringir a penetração do
patógeno no hospedeiro. A freqüência e a velocidade da formação das papilas
são fatores que podem influenciar na retenção do patógeno. Nicholson e
Hammerschmidt (1992) citam que se a papila é formada rapidamente e se esta
se torna fortemente lignificada, pode prevenir a entrada do fungo no
hospedeiro. Matsuoka (1988) verificou que a resistência de pimentão
(Capsicum annuum L.) à Phytophthora capsici Leonian manifesta-se através da
rápida formação de papilas, em resposta à penetração da hifa infetiva.
A intrínseca relação entre resistência contra o ataque de patógenos e
lignificação já foi claramente observada e demonstrada em diferentes órgãos
e/ou
tecidos
de
diversas
plantas
incluindo
folhas
de
pepino
(HAMMERSCHMIDT; KUĆ, 1982; HAMMERSCHMIDT et al., 1985), tubérculos
de batata (HAMMERSCHMIDT, 1984), folhas de trigo (RIDE; PEARCE, 1979),
e casca das árvores de amendoeiras (DOSTER; BOSTOCK, 1988).
Estas observações comprovam que o espessamento das paredes celulares
observado na folha do abacaxizeiro está claramente relacionado com o
mecanismo de defesa, provavelmente pela lignificação, uma barreira física que
dificulta a penetração das hifas nos tecidos da folha.
71
A resistência da lignina à degradação microbiana suporta sua acumulação na
resposta à infecção como um importante mecanismo de resistência (KUĆ,
1997).
A cv. Vitória apresentou também a formação de um tecido com a coloração
amarronzada (Fig. 16 – D asterisco), evidenciada mesmo sem a utilização de
corantes. Essa coloração sugere a presença de suberina, caracterizando um
tecido de cicatrização, situação não observada para as cultivares Pérola e
Smooth Cayenne, suscetíveis ao patógeno.
De modo geral, a suberina é depositada em torno de ferimentos e a camada de
células suberizadas é denominada periderme de cicatrização (SILVA; ALQUINI;
CAVALLET, 2005). No caso de microrganismos, a suberização pode impedir a
passagem do patógeno e de qualquer substância tóxica secretada por ele.
Posteriormente, pode impedir a passagem de nutrientes para a área atingida
privando o patógeno de nutrição, enfraquecendo-o e até mesmo causando a
sua morte. O tecido suberizado e o patógeno mortos costumam formar uma
lesão necrótica ou são empurrados pelos tecidos saudáveis em direção ao
exterior da planta. No primeiro caso ocorre uma limitação do patógeno a
pequenas manchas e no segundo caso ocorre a remoção do invasor. Em frutos
é um empecilho à comercialização (PASCHOLATI; LEITE, 1995; AGRIOS,
2005).
A formação de células suberosas constituindo camadas de cortiça em torno
dos ferimentos é um mecanismo comum de defesa histológica de plantas. A
suberina é um polímero insolúvel altamente resistente à degradação enzimática
e é depositada nas paredes celulares de várias plantas, quando os tecidos são
invadidos por patógenos (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE, 2003). O tecido
corticoso é morto e inibe a invasão crescente pelo patógeno, bloqueando o
transporte de substâncias tóxicas por ele produzidas. Assim, a área em que o
patógeno encontra-se presente torna-se limitada, na forma de manchas e/ou
lesões locais, isolando o patógeno, sem maiores possibilidades de ação em
outros tecidos (GOODMAN; KIRÁLY; ZAITLIN, 1967; AGRIOS, 2005).
72
A presença da suberina em tecidos vegetais pode ser constitutiva ou induzida,
sendo depositada principalmente após danos mecânicas ao tecido. A produção
da suberina é dependente de enzimas oxidativas como desidrogenases,
fenilalanina amônia liase (FAL) e peroxidases e a infecção por fungos já é
caracterizada por ativar todas essas enzimas (VIDHYASEKARAM, 1997).
A presença de tecido suberificado não foi observada nos tecidos das cultivares
Pérola e Smooth Cayenne (Figura 16 – E e F), não sendo observada a
formação de camada amarronzada como a que ocorre na cv. Vitória (Figura 16
– D). Em interações compatíveis, a literatura relata que o patógeno pode
atrasar o acúmulo de suberina, como observado em tomates suscetíveis à
infecção com Verticillium albo-atrum (MEDEIROS; FERREIRA; DIANESE,
2003). Apesar de Verticillium albo-atrum apresentar mecanismo de infecção
distinto do observado em F. subglutinans f. sp. ananas, a síntese e acúmulo de
suberina nas cultivares Smooth Cayenne e Pérola poderia ser adiada por
mecanismos ainda não conhecidos no fungo.
Nos tecidos da cultivar Pérola, 48 h após a inoculação, apesar da formação de
uma barreira estrutural na região do ferimento, os tecidos internos
encontraram-se com visível degradação (Figura 16 – E seta). Isso ocorreu,
provavelmente devido ao tardio mecanismo de espessamento de parede,
permitindo que as hifas fúngicas penetrassem o tecido. Outra explicação para
esse mecanismo de cicatrização ineficiente pode ser atribuída à liberação de
forma inadequada de um elicitor, como alguns monômeros componentes da
própria parede, que poderiam ter a função de induzir a síntese de lignina.
A diferença chave entre uma planta resistente e uma suscetível é definida por
Yang; Shah e Klessig (1997) como o tempo gasto pela planta para o
reconhecimento do patógeno invasor e a rápida e efetiva ativação dos
mecanismos de defesa pela planta hospedeira. Uma planta resistente como a
cv. Vitória é capaz de desenvolver rapidamente uma ampla variedade de
respostas de defesas que podem prevenir a invasão e colonização do
patógeno. Em contraste, plantas suscetíveis como ‘Smooth Cayenne’ e
principalmente ‘Pérola’ apresentam respostas de defesa atrasadas em relação
à ‘Vitória’, além de menor intensidade. Assim, essas defesas não seriam
73
suficientes para restringir o avanço do patógeno nos tecidos vegetais. Como
resultado, frequentemente uma planta suscetível é severamente afetada pela
infecção do patógeno, podendo culminar na morte das células. A ativação das
respostas de defesa nas plantas inicia no momento do reconhecimento, por
parte da planta, das moléculas elicitoras do patógeno. A interação das
moléculas elicitoras do patógeno com os receptores do hospedeiro ativa a
cascata de sinais que podem estar envolvidas na fosforilação de proteínas,
fluxo de íons, produção de ROS e outros eventos de sinalização (YANG;
SHAH; KLESSIG, 1997).
A diferença entre resistência e suscetibilidade pode ser o resultado de uma
variação de tempo, autonomia celular ou intensidade das respostas de defesa
das plantas (MORAES, 1998). O reconhecimento rápido de patógenos
invasores pelas células vegetais e a indução rápida das respostas de defesa
são essenciais para a resistência das plantas. Desta forma, a resistência ocorre
quando
respostas
múltiplas
de
defesa
são
ativadas
rapidamente
e
coordenadamente (YAMAMIZO et al., 2006), o que poderia explicar a
resistência do abacaxi ‘Vitória’ no campo.
5.2
A
LESÃO
MECÂNICA
COMO
ESTÍMULO
PARA
RESPOSTAS
HISTOLÓGICAS DE DEFESA
As fotos capturadas das porções das folhas imediatamente após ferimento e o
recebimento da água estéril demonstram a regularidade dos tecidos em uma
análise morfológica ao olho nu (Figura 17 – A, B e C), da mesma forma que
nos tecidos inoculados com o fungo (Figura 15 – A, B e C).
De forma semelhante às análises com as folhas inoculadas com F.
subglutinans f. sp. ananas, as regiões destacadas indicam a porção onde o
ferimento foi realizado, demonstrando os pontos de penetração das agulhas no
tecido (Figura 17 – A, B, C, D, E e F setas).
74
A análise das folhas das três cultivares de abacaxi lesionadas, sem o inóculo
de F. subglutinans f. sp. ananas demonstrou cicatrização dos ferimentos na cv.
Vitória após 48 horas de inoculação. As folhas das cultivares suscetíveis
exibiram coloração amarronzada ao redor dos ferimentos, em menor
intensidade quando comparadas às folhas inoculadas com o fungo. A
degradação das células na região dos ferimentos após 48 h de incubação
demonstrou uma maior suscetibilidade das cultivares Smooth Cayenne e
Pérola (Figura 17 - E, H, F e I).
Na região dos ferimentos, a cv. Vitória não apresentou degradação de células,
mantendo o aspecto íntegro do tecido, além de apresentar coloração clara,
bastante diferenciada da coloração evidenciada nas outras cultivares. Ao redor
do ferimento, além de manter-se íntegro, não houve qualquer alteração de cor.
75
A
D
G
B
E
H
C
F
I
Figura 17 - Região do ferimento da porção aclorofilada da folha do abacaxizeiro.
A, D e G: Vitória; B, E e H: Smooth Cayenne; C, F e I: Pérola.
A, B e C: imediatamente após injúria; D, E e F: 48 horas após injúria; G, H e
I: Detalhe da porção do ferimento em D, E e F respectivamente, após 48
horas de ferimento. As setas indicam a região do ferimento nos tecidos.
(Barras = 0,5 cm).
76
Nas amostras que receberam água após o ferimento, os tecidos analisados por
microscopia óptica também apresentaram-se íntegros nas análises. Apesar dos
ferimentos
realizados
com
as
agulhas
entomológicas,
o
parênquima
aclorofilado apresentou-se íntegro, sem alteração nos feixes vasculares e
tecidos de aerênquima. Assim, histologicamente não foram detectadas
diferenças entre os tecidos parenquimáticos das folhas das três cultivares
(Figura 18 – A, B e C).
As cultivares apresentaram coloração uniforme no momento após a realização
do ferimento, indicando assim a ausência de mecanismos de defesa induzidos
já neste momento. Ao redor das lesões é bastante visível a uniformidade da
coloração com as outras regiões do parênquima (Figura 18 – A, B e C).
Diferente do que observado após 48 h de ferimento e inoculação, onde o
espessamento de parede é bastante evidente pela coloração mais escura
(negra nas fotos) ao redor das lesões em todas as cultivares (Figura 18 – D, E
e F).
A análise histológica dos tecidos das três cultivares de abacaxi imediatamente
após o ferimento e após 48 h de ferimento demonstrou o espessamento de
parede principalmente na cv. Vitória e Smooth Cayenne (Figura 18 – A, B, D e
E), processo não observado de modo evidente em ‘Pérola’ (Figura 18 - C e F).
Essa resposta à agressão mecânica na cv. Smooth Cayenne poderia estar
associada à menor severidade da doença em campo, quando comparada com
a cv. Pérola.
É importante destacar também que ‘Smooth Cayenne’ é um dos parentais da
cv. Vitória, sugerindo que parte da resistência desta cultivar também poderia ter
sido herdada da primeira. Apesar de suscetível, a cv. Smooth Cayenne
apresenta algumas respostas de defesa, como o espessamento de parede em
resposta ao ferimento, respostas estas evidenciadas também na cv. resistente,
entretanto, de forma mais intensa.
77
A
D
B
E
C
F
Figura 18 - Seção transversal da folha de abacaxizeiro, região da lesão.
A e D: Vitória; B e E: Smooth Cayenne; C e F: Pérola.
A, B e C: imediatamente após injúria; D, E e F 48 horas após injúria. As
setas indicam a região parenquimática abaixo da lesão (Coloração:
Safranina aquosa). (Barra = 500µm).
78
Na cv. Vitória, após 48 h da inoculação (Figura 18 - D), houve coloração
intensa (cinza escuro) na região do ferimento, havendo continuidade das
porções mais escuras ao longo de toda a injúria, demonstrando “fechamento”
do tecido lesionado. Essa “cicatrização” do tecido lesado deu-se principalmente
por meio do espessamento das paredes celulares, coradas com o reagente
safranina. Na ‘Smooth Cayenne’ (Figura 18 - E) a coloração em torno do
ferimento não foi tão intensa quanto na cv. Vitória, além de não ter
demonstrado continuidade ao longo de todo o ferimento. Entretanto, houve
envolvimento de um número maior de camadas de células do que na cv.
resistente. Já na ‘Pérola’ o espessamento de paredes não foi evidenciado ao
longo da lesão, deixando os tecidos íntegros sujeitos à entrada de patógenos
oportunistas, já que com o ferimento toda a barreira inicial da epiderme foi
eliminada.
A lignificação dos tecidos e células vegetais ocorre em resposta a várias
pressões ambientais como estresses mecânicos e ataques de patógenos
(DIXON, 2001). Estresses mecânicos, como os ferimentos realizados nas
folhas do abacaxizeiro, são caracterizados como indutores dos mecanismos de
defesa de plantas. No abacaxizeiro, as injúrias mecânicas foram capazes de
induzir o espessamento de paredes através da lignificação.
Respostas semelhantes às do presente estudo, principalmente na cv. Vitória,
foram obtidas com frutos de pêssego injuriados com estiletes e aplicados com
água deionizada. Nestes tecidos, houve aumento nos teores de açúcares
neutros nas paredes celulares dos tecidos injuriados em relação a frutos
controle sem ferimento (SOUZA et al., 1999). Essa resposta demonstra
tendência de reforço das paredes celulares (biossíntese de compostos
fenólicos e de componentes estruturais da própria parede) como resposta de
defesa dos tecidos (RITTINGER; BIGGS; PEIRSON, 1987) nos tecidos
injuriados mecanicamente. A cura do ferimento em tecidos de pêssego da cv.
Biuti
estimulou
a
síntese
de
enzimas
(fenilalanina
amônia-liase,
polifenoloxidase e peroxidase) e de lignina como resposta de defesa à injúria
mecânica (SOUZA et al., 1999).
79
Os tecidos parenquimáticos de todas as cultivares demonstraram-se íntegros
após 48 h de injúria, evidenciando dessa forma que os tecidos não foram
colonizados por fitopatógenos.
O espessamento das paredes celulares se dá, principalmente, pela deposição
da lignina ou compostos semelhantes, que posteriormente formarão lignina
para defesa. Existem evidências consideráveis de que a lignina apresenta um
importante papel na defesa de plantas, e realmente representa uma
característica da resposta de defesa em plantas a injúrias (VANCE; KIRK;
SHERWOOD, 1980; NICHOLSON; HAMMERSCHMIDT, 1992).
A lignina depositada em casos de injúria mecânica é conhecida como
“semelhante à lignina” (STRANGE et al., 2001) ou lignina de defesa,
distinguindo-a da lignina depositada durante o desenvolvimento do vegetal
(HAWKINS; BOUDET, 2003). Dessa forma, o espessamento de parede
decorrente de injúrias mecânicas representa a formação de uma barreira
impermeável, protegendo assim os tecidos sadios de uma futura infecção
oportunista
(VANCE;
KIRK;
SHERWOOD,
1980;
WALTER,
1992;
TROCKENBRODT, 1994a). A lignina de defesa pode também ser formada
como resposta da planta a outros tipos de estresses abióticos como exposição
ao ozônio (SANDERMANN et al., 1998) e estresse hídrico (COSTA et al., 1998)
além de estresses bióticos, como a invasão por patógenos.
A suberina também é um importante componente da defesa de plantas a danos
mecânicos. A suberificação é uma resposta comum ao ferimento em diversos
órgãos de plantas (KOLATTUKUDY, 1981) formando, da mesma forma que a
lignina, uma barreira física, a qual um patógeno oportunista é incapaz de
transpor.
A formação de lignina e/ou suberina em resposta a ferimentos têm sido
relatada em órgãos de diversas culturas dentre os quais tubérculos de batata
(BERNARDS; LEWIS, 1992; BORG-OLIVER; MONTIES, 1993; LAPIERRE;
POLLET; NEGREL, 1996), folhas de trigo (SOUTHERTON; DEVERALL, 1990),
caules de linho (MCDOUGALL, 1993), além de espécies de plantas lenhosas
(BIGGS, 1987; DOSTER; BOSTOCK, 1988; SCHMITT; LIESE, 1993;
80
TROCKENBRODT, 1994b). Dessa forma, os dados apresentados por esses
autores explicam e corroboram com os resultados obtidos nesse trabalho.
As respostas de espessamento de parede após 48 h de incubação na cv.
Vitória e em menor proporção na cv. Smooth Cayenne sem a presença do
inóculo (Figura 18 – D e E) demonstraram-se menos acentuadas do que nos
casos em que os tecidos foram lesionados e inoculados com o fungo F.
subglutinans f. sp. ananas (Figura 16 – D e E). Isso poderia ser explicado por
um mecanismo de defesa não-específico ao fungo na cv. Vitória. Assim, a cv.
Vitória apresenta resistência não só ao patógeno causador da fusariose como
também a lesões mecânicas, as quais também induzem defesas estruturais
pós-formadas na cv. resistente.
5.3 HISTOQUÍMICA DIFERENCIAL DAS FOLHAS DAS TRÊS CULTIVARES
A histoquímica é uma ferramenta que pode ser utilizada para correlacionar
resistência ou suscetibilidade em plantas (BAILEY, 1983). Assim, a realização
de testes histoquímicos com as três cultivares foi aplicada como uma
alternativa para análise dos compostos dos tecidos de cada cv., contribuindo
para a compreensão da resistência da cv. Vitória. As diferenças são
evidenciadas através de testes, que demonstram a presença ou ausência de
metabólitos importantes para a resistência.
Cultivares suscetíveis podem apresentar uma maior quantidade de compostos
atrativos ao patógeno. Assim, substratos que podem ser, de alguma forma,
utilizados pelo fungo em seu metabolismo basal seriam atrativos quando em
maiores quantidades nos tecidos. Sob esse ponto de vista, realizaram-se testes
histoquímicos para detecção de amido, carboidrato de reserva em plantas, que
constituiria uma fonte nutricional para o crescimento e avanço do fungo nos
tecidos mais suscetíveis.
Os resultados das análises histoquímicas das folhas das três cultivares
mostraram que o reativo de lugol indicou a presença de grãos de amido com a
81
mesma localização em todas as três cultivares, nos diferentes tratamentos,
distribuídos ao longo do mesófilo, concentrado principalmente entre os feixes
vasculares e aerênquima.
As diferenças observadas em relação à presença ou ausência de amido foram
apenas em relação à intensidade de coloração (o que poderia indicar maior ou
menor quantidade em termos semi-quantitativos). As cultivares Vitória e Pérola
apresentaram constitutivamente coloração mais intensa quando comparada
com ‘Smooth Cayenne’ e para 48 h Controle (Tabela 2, Figura 19 e 20).
Tabela 2 - Representação da presença de compostos orgânicos nas folhas de três
cultivares de abacaxi constitutivamente e após 0 e 48 horas de inoculação,
analisadas por histoquímica após coloração com reagentes específicos.
Composto
48 horas
Controle
Constitutivo
48 horas
Inoculado
V
SC
P
V
SC
P
V
SC
P
Amido
++
+
+++
++
++ +++
+++ +++ +++
Compostos fenólicos totais
+++
++
+
+++
+
+
+++
+
+
Compostos fenólicos ligados
++
++
++
++
++
++
+++
++
++
Lipídios
+++
++
+
++
++
+
++
++
+
V - 'Vitória’; SC - 'Smooth Cayenne’; P - 'Pérola’
+++ - coloração mais intensa
++ - coloração intermediária
+ - menor intensidade de coloração
Em estudo com dois genótipos de amendoim (Arachis hypogaea L.), um
resistente e outro suscetível, a análise histoquímica foliar de não demonstrou
diferenças entre os genótipos quanto à coloração para amido. O teste foi
positivo nas células epidérmicas, hipoderme, clorênquima, bainha, parênquima
do xilema e floema, na seção transversal do pecíolo (VEIGA et al., 1992). Em
todas as cultivares de abacaxizeiro analisadas no presente estudo a
distribuição do amido foi mais restrita, localizando-se principalmente na região
central do parênquima.
Já nas folhas de Brosimum gaudichaudii, uma espécie comum nos cerrados,
com grande valor na medicina popular e na indústria de medicamentos, foi
82
observada a mesma distribuição de amido presente na folha de abacaxizeiro.
Os grãos de amido na lâmina foliar de B. gaudichaudii são presentes no
parênquima da nervura principal e no parênquima paliçádico da região
internervural (JACOMASSI; MOSCHETA; MACHADO, 2007).
+++
++
D
A
+
B
++
E
+++
C
+
F
Figura 19 - Padrão de distribuição e intensidade de coloração para amido e lipídios na
seção transversal da folha de abacaxizeiro segundo símbolos da tabela 2.
A e D: Vitória; B e E: Smooth Cayenne; C e F: Pérola. A, B e C: coloração
com o reagente de Lugol para identificação de amido; D, E e F: coloração
com o reagente Sudam III para identificação de lipídios. (Barra A, B, D-F
= 500 µm; C = 100 µm).
83
+++
+++
D
A
++
++
B
E
+
C
++
F
Figura 20 – Padrão de distribuição e intensidade de coloração para compostos
fenólicos totais e ligados a parede celular na seção transversal da folha de
abacaxizeiro segundo símbolos da tabela 2. A e D: Vitória; B e E: Smooth
Cayenne; C e F: Pérola. A, B e C: coloração com o reagente Cloreto Férrico
para identificação de compostos fenólicos totais; D, E e F: coloração com o
reagente Floroglucinol Acidificado para identificação de compostos
fenólicos ligados à parede celular. (Barra A, B, D-F = 500 µm; F = 100 µm).
84
Muitos compostos presentes na planta podem estar associados à resistência
do tecido vegetal. Compostos fenólicos ligados à parede celular, fenóis livres e
lipídios constituintes da cutina são compostos que contribuem, em muito, com a
resistência de uma planta, formando barreiras químicas e constitutivas aos
patógenos. Em geral, cultivares ou espécies que apresentem determinados
compostos do metabolismo secundário ou mesmo primário (como lipídios na
epiderme) são mais resistentes. Assim, realizaram-se testes histoquímicos
objetivando evidenciar a presença e localização de compostos tóxicos ao
patógeno (como os compostos fenólicos) ou mesmo compostos importantes
para defesa estrutural da planta (como lipídios presentes na cutina).
Todas as cultivares apresentaram a mesma localização em relação aos
compostos fenólicos totais, caracterizada pela coloração esverdeada à negra
dada pelo reagente Cloreto Férrico. A maior intensidade de fenóis totais foi
observada principalmente ao longo da região central do mesófilo, concentrado
principalmente entre os feixes vasculares e aerênquima, além de concentração
evidente nas fibras, devido à presença de compostos fenólicos e monolignóis
ligados à parede. As diferenças observadas para este teste foram em termos
de intensidade de coloração, ao longo do tempo e entre as cultivares.
Nas análises após 48 h de incubação, a cv. Vitória apresentou diferenças entre
Controle e Inoculado. Nos tecidos da cv. ‘Vitória’ 48 h Controle houve uma
redução na intensidade de coloração esverdeada à negra na região central do
mesófilo. Os compostos fenólicos tornam-se concentrados nas fibras,
provavelmente pela presença de compostos fenólicos ligados à parede das
células localizadas ao redor da lesão. Já nos tecidos de ‘Vitória’ 48 h Inoculado
não foi observada a redução na intensidade de coloração observada no
Controle, sendo evidente uma concentração superior na porção central do
mesófilo, além da concentração nas fibras, feixes vasculares e principalmente
ao longo da lesão.
Constitutivamente a cv. Smooth Cayenne apresentou coloração ao longo da
região central do mesófilo, entretanto, numa menor área, quando comparado
com a ‘Vitória’. Nos tecidos do 48 h Controle de ‘Smooth Cayenne‘ há uma
redução na concentração dos compostos fenólicos na região central do
85
mesófilo, restringindo-se a poucas porções com coloração intensa. Os
compostos fenólicos tornam-se concentrados nas fibras, devido à presença de
compostos fenólicos ligados, entretanto ao longo da lesão não foi envidente a
presença de compostos fenólicos, sendo ausente a coloração esverdeada.
A cv. Pérola apresentou distribuição de compostos fenólicos constitutivos numa
menor área e em menor intensidade quando comparado com ‘Vitória’ e
‘Smooth Cayenne’. Para os tecidos analisados após 48 h do ferimento, tanto
Controle como o Inoculado, há restrição a poucas porções com coloração
intensa, apresentando menor coloração para compostos fenólicos.
Em estudo recente, foi observada a presença de compostos fenólicos, por meio
da histoquímica, em 5 de 7 espécies de eucalipto. Em todas as cinco espécies
a presença mais evidente desses compostos foi observada no mesófilo,
especialmente na região do parênquima paliçádico e, em alguns casos na
epiderme (SANTOS et al., 2008). A presença de compostos fenólicos nos
tecidos dessas espécies foi abordada como uma vantagem, já que estes
compostos estão relacionados com a defesa vegetal.
A presença de compostos fenólicos nos tecidos parenquimáticos também foi
observada no presente estudo, funcionando como uma vantagem para a
espécie que os possuiria em maiores quantidades. No caso, a cv. Vitória
poderia exibir vantagens em relação às demais cultivares não só com relação à
ausência de ataques de patógenos e herbívoros, mas também com relação à
proteção contra raios ultra-violeta e situações de deficiência hídrica.
Análises histoquímicas dos compostos fenólicos presentes em plantas de
Aspidosperma
australe
e
Aspidosperma
cylindrocarpon
demonstraram
coloração diferenciada para as duas espécies. A. australe é altamente
suscetível à infestação por insetos galhadores. Os polifenóis foram detectados,
em A. australe, como conteúdo castanho claro em quantidade relativamente
pequena nas células epidérmicas da face abaxial. Em A. cylindrocarpon, os
polifenóis foram detectados como conteúdo enegrecido nos vacúolos das
células parenquimáticas adjacentes às epidermes em ambas as faces e na
camada mais externa do parênquima paliçádico (ISAIAS et al., 2000).
86
Nas análises histoquímicas A. cylindrocarpon apresentou maior produção de
substâncias fenólicas. A maior concentração e a localização de substâncias
fenólicas no mesófilo de A. cylindrocarpon foram descritas como uma barreira
ao ataque por insetos herbívoros (ISAIAS et al., 2000). Da mesma forma, a cv.
Vitória
apresentou
a
maior
coloração
dentre
as
cultivares,
tanto
constitutivamente como após os tratamentos.
A coloração com o reagente Floroglucinol Acidificado demonstrou a mesma
localização nos tecidos das três cultivares para a lignina e compostos fenólicos
ligados à parede, presentes nas fibras e nos feixes vasculares de xilema.
Semelhantemente, em uma espécie de maracujazeiro Passiflora setacea,
análises das folhas com Floroglucinol indicaram a presença de lignina nos
elementos do tecido vascular (PEREIRA et al., 2008), onde normalmente esse
composto está presente (GLÓRIA, 2006). Em geral, os tecidos vasculares
apresentam-se lignificados, o que confere proteção a estes tecidos e
sustentação ao corpo da planta.
Na cv. Vitória, nos tecidos de 48 h Controle, os compostos fenólicos ligados
encontravam-se nas fibras e ao longo do ferimento. No tecido da ‘Vitória’ 48 h
Inoculado, a distribuição dos compostos fenólicos manteve-se nos feixes
vasculares de xilema, logo abaixo da epiderme (hipoderme), fibras e em torno
da lesão de forma intensa.
‘Smooth Cayenne‘ e ‘Pérola’ apresentaram distribuição de compostos fenólicos
ligados semelhante ao já descrito para todos os tratamentos. As duas cultivares
suscetíveis não diferiram também com relação à intensidade de coloração para
compostos fenólicos ligados, apresentando-se com coloração intermediária
(Tabela 2, Figura 20).
Na detecção de lipídios, todas as cultivares apresentaram a mesma localização
para a presença destes compostos. A coloração apresentou-se nos feixes de
xilema e fibras, onde podem ser observados depósitos de lipídios provenientes
da suberina, que compõe estes órgãos. A coloração também foi intensa na
epiderme, proveniente dos lipídios que compõem a cutícula.
87
A cv. Vitória apresentou diferenças em termos de localização apenas nos
tecidos de 48 h Controle e Inoculado, nos quais houve ainda coloração ao
redor da lesão (restrito à lesão). A coloração mais intensa ao redor da lesão na
cv. Vitória pode estar relacionada com uma maior eficiência da cv. em evitar a
perda de água, a partir do maior depósito de lipídios, apresentando-se como
uma vantagem nesta cv. Os lipídios são moléculas altamente hidrofóbicas que
evitam a perda de água dos tecidos vegetais para o ambiente externo.
Para os tecidos de 48 h Controle e 48 h Inoculado das cultivares Smooth
Cayenne e Pérola, os lipídios estão presentes nos feixes de xilema, fibras,
epiderme e ao redor da lesão. A cv. Pérola apresentou coloração de forma
menos intensa ao redor da lesão quando comparado à ‘Vitória’ e ‘Smooth
Cayenne’.
Em Passiflora setacea, análises com Sudam indicaram a presença de lipídios
apenas na cutícula das folhas (PEREIRA et al., 2008). Nas cultivares de
abacaxizeiro estudadas a distribuição de lipídios foi mais ampla, estando
presente também nas vasos do xilema e fibras. Provavelmente, a maior
distribuição destes compostos em abacaxizeiro dá-se pelas características
fisiológicas da planta, adaptada a ambientes secos, com grande intensidade
luminosa e elevada perda de água. Os lipídios teriam então maior importância
nesta espécie, diminuindo sua perda de água.
5.4 INFLUÊNCIA BIOQUÍMICA NA RESISTÊNCIA DA CV. VITÓRIA
5.4.1 Teores de fenóis ligados à parede celular e livres como fatores de
resistência da cv. Vitória
Com o objetivo de determinar as diferenças quanto ao teor de fenóis em cada
uma das cultivares realizou-se as dosagens bioquímicas. Pôde-se, dessa
forma, estabelecer a existência de relações entre resistência e suscetibilidade
88
entre as variedades com os teores de compostos fenólicos maiores ou
menores.
As plantas produzem uma ampla gama de metabólitos secundários, muitos
constitutivos, estando presentes em suas formas ativas em plantas sadias.
Trata-se da defesa bioquímica pré-formada que, em geral, acumula-se em
tecidos mais externos e funcionam como barreiras bioquímicas primárias contra
os patógenos (OSBOURN, 1996a).
Os dados da figura 21 demonstram que a cv. Vitória apresentou quantidades
elevadas de compostos fenólicos ligados à parede celular quando comparados
aos teores das outras duas cultivares suscetíveis. Quanto comparada à
‘Smooth Cayenne’, a cv. Vitória apresentou quantidades 30% maiores de
compostos fenólicos ligados à parede celular. Já quando comparada à cv.
Pérola, a diferença é muito maior: ‘Vitória’ apresenta teores 519% maiores,
demonstrando uma diferença acentuada. Assim, a maior quantidade de
compostos fenólicos ligados à parede celular em ‘Vitória’ sugere uma
característica importante para sua resistência. Valores elevados de compostos
fenólicos,
além
de
funcionar
como
compostos
altamente
tóxicos
a
microorganismos, atuam também como precursores para polímeros complexos
com função de barreira estrutural.
Uma das mais importantes classes de produtos do metabolismo secundário
com atividade de defesa contra patógenos em plantas é a dos compostos
fenólicos (LEGRAND, 1983). Os compostos fenólicos são produzidos a partir
da fenilalanina e hidroxifenilalalina a partir da via do chiquimato (Figura 8 e 13).
Esta via é responsável pela síntese de aminoácidos aromáticos como a
fenilalanina e tirosina, extremamente importantes como precursores dos
compostos fenólicos, dentre os quais podemos citar a lignina.
A lignina é um polímero de monômeros aromáticos de fenóis que podem variar
em tipo e em quantidade, dependendo da espécie vegetal e tipo de lignina. Sua
formação dá-se como resposta a danos mecânicos ou ferimentos, e muitas
plantas respondem ao ataque de patógenos pela deposição de lignina e outros
89
fenóis ligados à parede celular no local do ataque patogênico (BOUDET;
GRIMA-PETTENATI, 1996).
2.00
Concentração de fenóis
(µg de fenol/mg de folha)
1.75
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
'Vitória'
'Smooth Cayenne'
'Pérola'
Cultivar
Figura 21 - Teor de fenóis ligados em µg por mg de folha fresca presentes na porção
aclorofilada das folhas de três cultivares de abacaxizeiro.
Valores superiores de compostos fenólicos ligados à parede celular sugerem
uma relação com a maior eficiência no espessamento das paredes celulares
quando em presença do patógeno após ferimento. Compostos fenólicos têm
sido implicados no mecanismo de defesa de plantas, principalmente
relacionado ao processo de lignificação (BAPTISTA et al., 1999; NOJOSA et
al., 2003). Assim, compostos fenólicos nas plantas podem apresentar efeitos
tóxicos, como radicais livres ou mesmo formação e deposição de lignina,
constituindo então uma barreira física.
A presença de fenóis na parede celular do hospedeiro é constantemente
associada à resistência às enzimas fúngicas e à formação de uma barreira
90
física contra penetração fúngica. Monômeros de fenóis presentes na parede
celular de plantas são importantes para a rápida resposta do tecido a
ferimentos e lesões, proporcionando a síntese e deposição de lignina durante a
resposta de defesa ao agente agressor (DE ASCENSAO; DUBERY, 2003).
Além disso, a esterificação de ácidos fenólicos nos materiais das paredes
celulares vegetais tem sido sugerida funcionar como molde para a deposição
de lignina adicional, constituindo-se expressão de resistência (SANTIAGO et
al., 2007). Assim, teores elevados de compostos fenólicos ligados à parede
celular estariam altamente correlacionados com a deposição de lignina,
caracterizando-se como processos integrados e contínuos.
A resistência da cv. Vitória em campo poderia então ser explicada em parte
pela grande quantidade de compostos fenólicos ligados à parede celular,
monômeros estes, que, no momento de infecção e colonização por parte do
patógeno formariam polímeros de lignina. A cv. Smooth Cayenne, parental da
cv. resistente, apresentou valores intermediários entre ‘Vitória’ e ‘Pérola’.
Com relação aos compostos fenólicos livres, a cv. Vitória apresentou
quantidades 60% menores que a cv. Smooth Cayenne, enquanto quando
comparado a ‘Pérola’ a cv. Vitória apresentou teores de compostos fenólicos
livres 719% maiores. Assim, a cv. Vitória apresentou valores intermediários,
enquanto ‘Pérola’ apresentou os menores teores de compostos fenólicos livres
(Figura 22).
91
1.50
Concentração de fenóis
(µg de fenol/mg de folha)
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
'Vitória'
'Smooth Cayenne'
'Pérola'
Cultivar
Figura 22 - Teor de fenóis livres em µg por mg de folha fresca presentes na porção
aclorofilada das folhas das três cultivares de abacaxizeiro.
Algumas plantas apresentam teores elevados de compostos fenólicos
constitutivamente, associados à defesa pré-formada. Esses compostos
fenólicos livres pré-formados, em geral, estão relacionados à resistência das
plantas não hospedeiras. Assim, o acúmulo de material fenólico, normalmente
em porções externas dos órgãos vegetais, em geral não está envolvido com a
maior resistência de espécies ou cultivares a agentes causadores de doenças
daquela espécie (BAPTISTA et al., 1999).
Com relação aos compostos fenólicos livres na célula, a cv. Smooth Cayenne
apresentou valores superiores aos de ‘Vitória’ e ‘Pérola’. Compostos fenólicos
livres podem apresentar função no isolamento do patógeno, constituindo-se
compostos antimicrobianos. Entretanto, a cv. Smooth Cayenne é caracterizada
como suscetível à fusariose em campo, demonstrando-se assim a ineficiência
desses compostos, apesar de em maior quantidade, como antifúngicos nesta
cultivar. Este fato poderia ser explicado pela ineficácia dos compostos fenólicos
livres, produzidos constitutivamente, na inibição do desenvolvimento de F.
92
subglutinans f. sp. ananas na ‘Smooth Cayenne’, já que este é um fungo que
apresenta como hospedeiro apenas o abacaxizeiro.
5.4.2 Influência dos teores de proteínas na resistência de ‘Vitória’
Com o objetivo de determinar as diferenças quanto ao teor de proteínas em
cada um das cultivares, realizou-se a dosagem bioquímica, estabelecendo-se
assim um paralelo entre a quantidade de proteínas e a resistência nas três
variedades de abacaxi.
A cultivar Vitória apresentou teor elevado de proteínas constitutivas quando
comparada às demais cultivares (Figura 23). Em relação à cultivar Smooth
Cayenne, a quantidade constitutiva de proteínas na cv. Vitória é 52% maior. Já
quando comparada à ‘Pérola’, o teor de proteínas da cv. Vitória é 135% maior.
Proteínas são macromoléculas constantemente envolvidas em mecanismos de
defesa em plantas. Assim, esta grande concentração de proteínas nos tecidos
de ‘Vitória’ explicaria, ao menos em parte, a resistência à fusariose de ‘Vitória’
em campo, já que estas proteínas poderiam constituir mecanismos eficientes
de defesa.
93
Concentração de proteínas
(µg de proteínas/mg de folha)
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
'Vitória'
'Smooth Cayenne'
'Pérola'
Cultivar
Figura 23 - Teor de proteínas totais em µg por mg de folha fresca presentes na porção
aclorofilada das folhas das três cultivares de abacaxizeiro.
Proteínas produzidas constitutivamente em vegetais podem ter funções
variadas na defesa vegetal, apresentando-se como enzimas degradadoras de
moléculas provenientes de patógenos, como a quitina fúngica, por exemplo,
além de inibidores de proteinases, tioninas, proteínas ricas em prolina, enzimas
envolvidas no metabolismo de fenilpropanóide e proteínas inativadoras de
ribossomos -RIPs (REINBOTHE et al., 1994), ou proteínas de reserva
vegetativa (VSPs), proteínas com a função de proteger e defender as plantas
sob condições de estresse (ROSSATO et al., 2002). Essa ampla gama de
proteínas produzidas nas plantas mesmo sem a invasão dos tecidos por
patógenos tem sua síntese aumentada em muito nos momentos de infecção,
colaborando para o combate do agente agressor.
Tecidos ricos em proteínas têm maiores probabilidades de apresentarem
elevados teores constitutivos de proteínas eficazes no combate imediato de
agentes patogênicos que invadam os tecidos do vegetal. Assim, ‘Vitória’ com
sua grande quantidade de proteínas poderia apresentar mecanismos mais
94
rápidos e eficientes de defesa imediatamente após a invação patogênica. Essa
disponibilização imediata de quantidades superiores de proteínas relacionadas
à defesa poderia constituir uma primeira “frente” de defesa na cv. Vitória,
combatendo, diminuindo ou anulando os efeitos danosos do patógeno nos
tecidos vegetais do abacaxizeiro.
Proteínas e peptídeos antifúngicos apresentam função protetora contra a
invasão fúngica. Produzidas por uma ampla gama de organismos com plantas
com flores, gimnospermas, fungos, bactérias e insetos (NG, 2004), as
proteínas antifúngicas apresentam uma grande diversidade de estruturas.
Algumas proteínas antifúngicas são classificadas, baseadas em sua estrutura
e/ou função em quitinases, glucanases, proteínas semelhantes à taumatinas,
tioninas e proteínas semelhantes à ciclofilina (WANG; NG, 2005). Outras
proteínas bem conhecidas como as lectinas, proteínas inativadoras de
ribossomo, ribonucleases, desoxiribonucleases, peroxidases e inibidoras de
proteases também apresentam atividade antifúngica (NG, 2004).
Além de atuarem imediatamente sobre o patógeno, muitas dessas proteínas
podem ser fatores importantes para síntese mais rápida de compostos e outras
proteínas para mecanismos mais tardios de defesa. Assim, a partir de fatores
protéicos pré-existentes, a síntese de novos compostos na cv. Vitória se daria
mais rapidamente, devido à maior quantidade de proteínas envolvidas na
síntese desses aparatos.
Proteínas de resistência em plantas estão direta ou indiretamente relacionadas
à presença de fatores de virulência do patógeno e representam uma forma
eficiente de imunidade vegetal, incluindo frequentemente a morte celular
programada no vegetal (GASSMANN, 2008). A ativação de algumas dessas
proteínas com papel importante na resistência do vegetal pode apresentar
papel lesivo às células vegetais, sendo este processo regulado em vários
níveis. Nestes casos, muitas PRP’s podem apresentar uma codificação
diferenciada devido a splicing alternativo dos genes, gerando transcritos
alternativos (GASSMANN, 2008) com papel positivo na ativação da defesa da
planta. Assim, esses transcritos alternativos seriam ativados nos momentos de
estresses na planta, não causando danos desnecessários à célula vegetal.
95
A presença de maior quantidade de proteínas na cv. resistente poderia indicar
uma maior quantidade de proteínas de reconhecimento. As moléculas elicitoras
do patógeno interagem com proteínas receptoras da planta, que sinalizam uma
cascata de reações que compõem as reações para a defesa das plantas. As
interações proteína-proteína são determinantes para a resistência ou
suscetibilidade da planta (BOGDANOVE, 2002). Interações genéticas entre
genes de resistência de plantas e genes de avirulência do patógeno torna a
planta capaz de reconhecer o patógeno e ativar os mecanismos de defesa.
Estas interações gene-a-gene, em geral, estão envolvidas diretamente com
interações dos produtos dos genes. A presença de uma pequena quantidade
de proteínas de reconhecimento nas células poderia ser a causa da
suscetibilidade das cultivares Pérola e Smooth Cayenne. A especificidade
incompleta de algumas dessas interações em laboratório sugerem que
proteínas adicionais poderiam ser requeridas para conferir especificidade na
planta (BOGDANOVE, 2002). Assim, a ausência da proteína específica para o
reconhecimento de elicitores de F. subglutinans f. sp. ananas impossibilitaria
determinada cv. “perceber” a presença do patógeno, não disparando as vias de
defesa do vegetal. Sem o reconhecimento por parte da planta o patógeno
poderia colonizar os tecidos vegetais, apresentando-se suscetível àquele
microorganismo.
5.5 INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO FÚNGICO EM PRESENÇA DO EXTRATO
PROTÉICO DAS FOLHAS
Diante da grande quantidade de proteínas presentes na cv. Vitória foram
realizados testes antifúngicos com o extrato protéico da porção aclorofilada das
folhas. Os ensaios foram realizados para determinar se estas proteínas
apresentariam atividade antifúngica ou outras funções como sinalização,
composição estrutural e ação enzimática, atuando em vias de resistência de
plantas. Assim, estas proteínas poderiam ser em parte responsáveis pela
resistência do abacaxizeiro ‘Vitória’, não com ação direta contra o fungo, mas
com papel na síntese de compostos responsáveis pela defesa, como por
96
exemplo, lignina, papilas, compostos tóxicos como fenóis, dentre outros. Vale
ressaltar que as plantas podem produzir potentes compostos antifúngicos com
atuação direta sobre o fungo. Produzidas constitutivamente ou de maneira
induzida, proteínas antifúngicas apresentam-se com função de implementar as
barreiras estruturais contra as infecções microbianas (LUCCA; CLEVELAND;
WEDGE, 2005).
Objetivando avaliar a possibilidade de proteínas de defesa serem as
responsáveis pela resistência da cv. Vitória em campo, foram realizados testes
antifúngicos com o extrato protéico das folhas aclorofiladas das três cultivares.
Assim, o fungo F. subglutinans f. sp. ananas foi crescido na presença do
extrato protéico, numa concentração de 0,5 mg de proteínas por mL de meio,
das três cultivares buscando-se compreender a possível relação de proteínas
antifúngicas presentes nas folhas de ‘Vitória’ com a ausência do crescimento
do fungo nestas plantas em campo.
Diferentes concentrações de proteínas também foram testadas (dados não
mostrados). As concentrações de 0,0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 e 0,4 mg/mL de
proteína apresentaram resultados menos expressivos com relação à inibição
do crescimento fúngico. Assim, com o aumento da concentração de proteínas
houve aumento da inibição do crescimento de F. subglutinans f. sp. ananas. Os
melhores resultados com relação ao efeito dos extratos das diferentes
cultivares no crescimento fúngico foram observados na concentração de
proteínas de 0,5 mg/mL (Figura 24).
Após análise do crescimento do fungo durante quatro dias observou-se que,
em presença do extrato da cv. Vitória, F. subglutinans f. sp. ananas obteve sua
menor absorbância (Figura 24), demonstrando o menor crescimento do fungo
em presença do extrato da cv. Vitória, quando comparado com as duas outras
cultivares. Este menor crescimento do fungo quando em presença do extrato
protéico da cv. Vitória pode ser atribuído à presença de proteínas antifúngicas
no extrato, como por exemplo, defensinas. Esses resultados são suportados
por uma série de estudos que abordam proteínas com atividade antifúngica
(FRITIG; HEITZ; LEGRAND, 1998; GIUDICI; REGENTE; CANAL, 2000; NG,
97
2004; WANG; NG, 2005; FERREIRA et al., 2007; MUÑOZ; GARCÍA; MARCOS,
2007).
1,00
Absorbância (u.a.)
0,75
0,50
0,25
0,00
0
1
2
3
4
Tempo (dias)
Figura 24 - Efeito do extrato protéico das folhas das três cultivares (
Vitória,
Pérola) no desenvolvimento do fungo F.
Smooth Cayenne e
subglutinans f. sp. ananas determinado pela absorbância. Como controle
positivo foi utilizado o fungicida benomyl ( ) e para o controle negativo
foi utilizado água estéril ( ).
As proteínas antimicrobianas expressas nas folhas são, de longe, as mais
estudadas (SLUSARENKO; FRASER; VAN LOON, 2001), sendo as folhas do
abacaxizeiro uma provável fonte desses compostos. Plantas tropicais são
expostas a uma série de estresses como, alta incidência de raios ultravioleta,
altas temperaturas e estresse osmótico. O abacaxizeiro, exposto a esses
estresses, apresenta-se com uma fruteira com potencial para produção de
grandes quantidades de proteínas de defesa, que atuariam não só em
estresses abióticos como também em estresses bióticos, como a invasão
fúngica (TAIRA; TOMA; ISHIHARA, 2005).
Dentre as proteínas antimicrobianas existem aquelas que atuam contra a
invasão fúngica dos tecidos vegetais. Proteínas antifúngicas estão envolvidas
98
na
defesa
constitutiva
e
induzida
contra
o
ataque
de
fungos
(SELITRENNIKOFF, 2001).
O fungo F. subglutinans f. sp. ananas, quando em presença dos três diferentes
extratos apresentou diminuição no crescimento micelial. Isto pode ser
observado através de valores inferiores de absorbância para as três cultivares
quando comparadas com o controle no quarto dia (Figura 22). Quanto maior a
absorbância obtida, maior a concentração de hifas do fungo ao longo do tempo.
O modelo matemático utilizado para a confecção da curva de crescimento de F.
subglutinans f. sp. ananas é bastante característico para crescimento de
microorganismos. Assim, para estimar o crescimento do fungo em meio líquido
a curva S pode ser dividida em algumas etapas: lag, exponencial, declínio,
estacionária e morte celular (BRITISH MYCOLOGICAL SOCIETY, 2009).
Durante a fase lag inicial a taxa de crescimento do fungo é bastante reduzida.
Esta fase foi observada no primeiro dia de análise para o crescimento do fungo
em presença de todos os extratos (Figura 24). Para as cultivares Smooth
Cayenne e Vitória, a partir do primeiro dia o crescimento fúngico demonstrouse acelerado, caracterizando a fase exponencial de crescimento. Esta fase
representa o período durante a incubação em que o fungo cresce mais rápido.
A cv. Pérola apresentou altos valores de absorbância (Figura 24) já nos
períodos iniciais (entre o dia 0 e 2), demonstrando já neste período a fase
exponencial de crescimento. Os valores de absorbância para ‘Pérola’ foram
muito superiores que os obtidos para as outras duas cultivares, inclusive para o
controle (exceto no dia 5). A fase exponencial é estimulada ou limitada por
diversos fatores, dentre eles a disponibilidade de nutrientes. As folhas da cv.
Pérola apresentam quantidades muito superiores de grãos de amido que nas
outras cultivares. Isto pôde ser observado nos testes histoquímicos a partir da
coloração com o reagente de lugol (Tabela 2), em que os tecidos de ‘Pérola’
apresentaram coloração intensa na região do mesófilo próximo aos feixes
vasculares. O maior crescimento do fungo na presença do extrato da cv. Pérola
poderia ser explicado pela permanência de concentrações, mesmo que menos
elevadas, de amido no extrato protéico desta cv. Devido às elevadas
99
concentrações de amido presentes na folha de ‘Pérola’, o método utilizado para
o preparo do extrato protéico não foi o suficiente para a completa eliminação
das moléculas de amido. A grande quantidade de amido nos tecidos de ‘Pérola’
poderia servir como substrato energético para o desenvolvimento do fungo F.
subglutinans f. sp. ananas, fazendo com que o crescimento deste fosse muito
superior em presença do extrato da cultivar.
Na cv. Vitória a fase de declínio do crescimento do fungo foi a mais precoce,
iniciando-se ainda no segundo dia de crescimento. Esse resultado demonstra a
efetividade de proteínas antifúngicas presentes no extrato desta cv. em inibir o
crescimento do fungo de maneira mais rápida e efetiva que nas outras duas
cultivares suscetíveis.
Após a fase de declínio, os nutrientes tornam-se escassos e os produtos
tóxicos mais abundantes, caracterizando a fase estacionária. Nesta etapa não
há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se
divide é equivalente ao número de células que morrem. No meio contendo o
extrato da cv. Pérola, a fase de declínio apresentou pequena duração, dando
lugar a uma fase estacionária bastante precoce quando comparada às outras
cultivares e ao controle. Este fato sugere o rápido consumo pelas células ali
presentes dos nutrientes contidos no meio. Estas células estariam em elevada
concentração devido à grande disponibilidade inicial de nutrientes. Após o
período inicial, de grande crescimento do fungo e grande consumo de
nutrientes, haveria então a escassez destes, limitando o crescimento futuro.
Em presença do extrato da cv. Vitória, o crescimento fúngico alcançou a fase
estacionária anteriormente do que quando em presença dos outros extratos. O
crescimento do fungo em extrato de ‘Smooth Cayenne’ e no controle não
alcançou a fase estacionária durante o período analisado.
O crescimento de F. subglutinans f. sp. ananas na presença do extrato protéico
da cv. Smooth Cayenne apresentou valores intermediários de crescimento
quando comparado ao crescimento em presença das cultivares Vitória e
Pérola.
100
Em trabalho com folhas inteiras do abacaxi, Taira; Toma e Ishihara (2005)
isolaram três quitinases denominadas (PL Chi) -A, -B e -C, as duas últimas com
alta atividade antifúngica, inibindo fortemente o crescimento fúngico. A PL ChiC é abundante em folhas de abacaxizeiro e pode ter papel fundamental contra
fungos fitopatogênicos, mesmo em condições de alta concentração de NaCl,
sendo assim adaptada para as condições de estresses a que o abacaxizeiro
está exposto. PL Chi-A, uma quitinase ácida, apresenta massa molecular de 25
kDa, pH ótimo em torno de 3. PL Chi-B, quitinase básica, apresenta massa
molecular de 33 kDa, com pH ótimo de 4, enquanto PL Chi-C apresenta massa
molecular de 39 kDa, características ácidas e pH ótimo em torno de 9.
Como as membranas de diálise utilizadas no presente estudo apresentavam
poros de 3,5 kDa, as três quitinases possivelmente estavam presentes nos
extratos de todas as cultivares. A inibição do crescimento fúngico que ocorreu
em todas as cultivares se deu, provavelmente em parte, pela presença dessas
quitinases, em especial a PL Chi-C, que apresenta alta atividade antifúngica. A
esse respeito, cumpre mencionar que as quitinases apresentam papel
essencial na defesa vegetal contra fungos e também contra bactérias
(CAVALCANTI et al., 2006). No que tange os fungos patogênicos, como F.
subglutinans f. sp. ananas, as quitinases presentes em abacaxi degradam a
quitina, o principal componente da parede celular dos fungos.
A maior inibição do crescimento fúngico em presença do extrato da cv. Vitória
poderia ser explicada por uma possível maior tradução de PL Chi-C nesta
cultivar, havendo então maiores concentrações desta quitinase nos tecidos da
‘Vitória’. A maior inibição pelo extrato da cv. resistente pode também ser
explicada por uma maior concentração de outras proteínas de defesa e, em
especial, proteínas antifúngicas, ainda não descritas.
101
6 CONCLUSÃO
•
Com base nos resultados obtidos, a interação dos tecidos vegetais com
o fungo F. subglutinans f. sp. ananas demonstrou que as folhas da cv. Vitória
apresentaram uma resposta mais rápida e eficaz ao ferimento acompanhado
da inoculação com o patógeno quando comparada às cultivares Pérola e
Smooth Cayenne. Essa resposta está relacionada à lignificação das paredes
celulares, como mecanismo de resistência.
•
Adicionalmente, a cv. Vitória apresentou também mecanismos de
espessamento de parede das células mais eficientes após injúria mecânica,
comparado com as cultivares suscetíveis submetidas aos mesmos tratamentos,
salientando o amplo espectro dos mecanismos de defesa desta cultivar.
•
A análise histoquímica diferencial das três cultivares revelou um padrão
de distribuição tecidual dos compostos analisados semelhante entre as três
cultivares
avaliadas
em
diferentes
tratamentos
(constitutivamente,
imediatamente após a inoculação com fungo e 48 h após a inoculação).
Entretanto, as cultivares apresentaram diferenças na intensidade de coloração
indicativa da presença de compostos fenólicos totais e ligados, sendo que a cv.
Vitória apresentou-se mais fortemente corada.
•
A cv. Vitória apresentou teores mais elevados de compostos fenólicos
ligados à parede, quando comparados com a cv. Smooth Cayenne e cv. Pérola
(que apresentou as menores concentrações). Altos teores de fenóis ligados à
parede encontrados constitutivamente na cv. Vitória estão relacionados a
mecanismos mais eficazes de espessamento de paredes, através da
lignificação.
•
A
cv.
Smooth
Cayenne,
suscetível
a
fusariose,
apresentou
concentrações de fenóis livres mais elevadas, entretanto, tais compostos não
estão envolvidos com a defesa contra o fungo F. subglutinans f. sp. ananas,
patógeno do abacaxizeiro.
102
•
A cv. Vitória apresentou teores mais elevados de proteínas totais quando
comparada às demais cultivares. Tais proteínas poderiam apresentar-se como
proteínas antifúngicas com ação direta sobre o fungo ou mesmo como enzimas
importantes na ativação de defesas mais tardias nos tecidos da ‘Vitória’,
apresentando-se como uma importante vantagem nos mecanismos de defesa
da cv. resistente.
•
O extrato bruto protéico da cv. Vitória demonstrou-se mais eficiente na
inibição do crescimento de F. subglutinans f. sp. ananas, evidenciando a
presença de proteínas antifúngicas mais eficazes contra o fungo no extrato
desta cultivar.
•
Como perspectivas sugerem-se o estudo da ultra-estrutura da parede
nas três cultivares, caracterizando-se as diferenças na organização das
microfibrilas de celulose, além do estudo das proteínas expressas nos tecidos
das três cultivares submetidos a estresses bióticos.
103
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