(grapevine virus b) em plantas modelo

PROBIC/FAPERGS
Projeto: Enrrolamento
DESENVOLVIMENTO DE shRNA CAPAZ DE SILENCIAR RNA
VIRAL DE GVB (GRAPEVINE VIRUS B) EM PLANTAS MODELO DA
ESPÉCIE Nicotiana sp.
Mauricio Schiavo, Sergio Echeverrigaray
Laboratório de Biotecnologia Vegetal e Microbiologia Aplicada – Instituto de Biotecnologia
Universidade de Caxias do Sul
–[email protected]
INTRODUÇÃO
A uva é uma das frutas mais consumidas no mundo, seja na forma in natura, seja como suco ou vinho. A videira pode ser afetada por diversos
vírus, o fendilhamento cortical ou ‘Grapevine corky bark’ é uma virose de ocorrência comum em grande parte dos países vitícolas e no Brasil. O
fendilhamento cortical possui como agente causal o Grapevine virus B (GVB), vírus de RNA fita senso positivo que possui hospedeiros herbáceos do
gênero Nicotiana. Sendo o fendilhamento cortical uma doença de importância econômica, seu agente causal, GVB, foi escolhido para realizar
experimentos com modelos para o desenvolvimento de uma ferramenta biotecnológica visando seu controle. Tal controle se dará pós
transcricionalmente utilizando-se a expressão de shRNA com complementaridade a um sítio específico do RNA viral.
Imagem 1: Representação do RNA de
GVB, de aproximadamente 7600 nt,
contendo região cap e poly-A e as ORFs
1 a 5 com regiões conservadas na ORF1
de metiltransferase (mtr), Proteinase (ppro), Helicase (hel), e Polimerase (pol),
modificado de (Saldarelli et al, 1996).
OBJETIVO
Desenvolver um sistema recombinante baseado em shRNA para o controle do vírus GVB em Nicotiana sp., como um
modelo para videiras.
MATERIAL E METODOS
Foi realizada busca por sítios alvo
em GVB utilizando as ferramentas
online BLAST e RNAfold.
A sequência selecionada foi sintetizada
e clonada em plasmídio pCAMBIA 1303,
esta sequência possui complementaridade
com
a
ORF1
do
vírus
na
porção
correspondente a RNA Polimerase.
O plasmídio será inserido em A. tumefaciens
por eletroporação e plantas do gênero
Nicotiana serão transformadas com plasmídio e
posteriormente infectadas com GVB, a análise
da presença do vírus será realizada por qrtPCR.
Plantas transformadas
Plantas não
transformadas
Infecção
por GVB
Inserto para expressão de shRNA clonado em pCAMBIA 1303
Estrtura secundaria do RNA de GVB.
Quantificação de RNA viral por qrtPCR
Estrtura secundaria do shRNA desenvolvido.
pCAMBIA 1303 com inserto. Plasmidio pshRNA1
Avaliação da eficácia do shRNA desenvolvido in vivo
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A sequência (TGGGCAAACCATAGCGTGCTT) selecionada e o
fragmento sintetizado contendo sequência para shRNA que
reconhece região genômica de GVB correspondente a RNApolimerase, estão descritos em materiais e métodos.
O plasmídio pCAMBIA1303 foi inserido em E. coli e extraído e
purificado por lise alcalina. Este foi clivado liberando um
fragmento de 2559 pares de base. O plasmídio clivado
“backbone” foi extraído de gel e purificado para reação de
ligação com o inserto por T4-ligase. O projeto encontra-se
em desenvolvimento e as próximas etapas estão sendo
preparadas e os experimentos esquematizados.
pCAMBIA 1303
“backbone” 9803 pb
Imagem 2: Padrão de
clivagem
do
plasmidio
pCAMBIA 1303 com as
enzimas SpeI e BstEII.
pCAMBIA 1303
genes reporter
retirados por SpEI
e BstEII 2559 pb
Referências:
Saldarelli, P. et al (1996). Journal of
General Virology. 77: 2645-2652.
Yuan, D. et. al (2011). Plant Cell Reports
30: 249 – 265
APOIO