Diversidade e evolução bacteriana Arquivo
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Diversidade e Evolução Bacteriana Robson Francisco de Souza Laboratório de Estrutura e Evolução de Proteínas Departamento de Microbiologia ICB-USP BMM0271 – Microbiologia Básica para Odontologia Obje4vodaAula • Introduçãoaosmétodosdeclassificaçãoe iden4ficação • Conceitosdetaxonomiaesistemá4ca • Breveintroduçãoàdiversidadebacteriana ClassificaçãoXIden4ficação • Classificação – Organizaçãodosorganismosvivosemgrupos – Construídaapar4rdaanálisedassemelhançasediferenças entreosorganismos – Buscarefle4rahistóriaevolu4vadosorganismos • Iden0ficação – Processodedeterminaçãodaespécieougêneroaoqualum novoisoladoouamostrademicroorganismos TécnicaslaboratoriaisdeIden0ficação • MétodosFenó4picos • • • Caracterizaçãomorfológica Métodossorológicos FAME • AnáliseGenoOpica • • • • FISH Ribo4pagem HibridizaçãoDNA-DNA rep-PCR MétodosfenoOpicos Namaioriadoscasos,énecessárioscombinarvárias4posdedadosfenoOpicosantes quesejapossíveliden4ficarumorganimo. Exemplosdecaracterís0casusadasnaclassificaçãoe/ouiden0ficaçãodemicroorganismos Morfologiacelular Forma;ColoraçãodeGram;presença/ausênciadeflagelos; corposdeinclusão;espores;tamanho Aparênciadacolônia Pigmentos;hemólise;forma;tamanho Fermentaçãodecarboidratos Produçãodeàcidosougás Hidrólisedeaminoácidos Produçãodeamônia Fisiologia(condiçõesparacul4vo) Temperaturaó4ma;pH;concentraçãodeoxigênio Produtosdafermentação Bu4rato;lactato;acetato AnOgeno An4corposmonoclonaloupoliclonalcontraproteínasou açucaresdasuper]ciecelular Lipídeos Menaquinonas,ácidosgraxosdecadeialonga Perfilenzimá4co Presença/ausênciadeenzimas;mobilidadeeletroforé4ca Pep4doglicano Composiçãodeaminoácidosnaligaçõescruzadas Métodos fenotípicos: morfologia Métodos fenotípicos: arranjo • Assimcomoaforma,dadascondiçõesó4masepadronizadasdecul4vo,a organizaçãoespacialdascélulaséestávelecaracterís4cadecadaespécie • Adependêncianascondiçõesdecul4volimitaau4lidadedessacaracterís4ca MétodosfenoOpicos • Sorologia:otestedeaglu4nação Aaplicaçãodeuman4corpocontraumorganismodesconhecidopermitea verificaçãodapresençadeanOgenoscaracterís4cosdeumcertogrupode bactériaspelaobservaçãodeagregadosdecélulas. + - MétodosfenoOpicos • EnsaiodeELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay) • Placacomdiferentesan4corpos aderidos • Incubacomumorganismo desconhecido(anOgenos) Testesbioquímicos • Iden4ficamasbactériaspresentescombasenoperfildea4vidadeenzimá4ca • Exemplo:testedebactériasentéricas(famíliaEnterobacteriaceae) • Amudançadecoréumindica4voquehouvereaçãoquímicaeaformaçãode produtosácidosporexemplo(indicadoresdepH) Cadaensaiomedeau4lizaçãodesubstratos ouaformaçãodeprodutosmetabólicosque indicamapresençadeenzimasespecíficas. Exemplosdemarcadores: • Hidrólisedeaçúcaresacidificaomeio (pH) • Produçãodegases • TesteVoges-Proskauer(V-P):produção deacetoínapelaconversãodeácido pirúvicoemacetoína FAME does have some drawbacks. Inofparticular, FAME analyses composition of cross-links; presence or absence cross-link interbridge profiles of an organism, like many other phenotypic traits, can vary as a function of temperature, growth phase (exponential versus stationary), and to a lesser extent, growth medium. Thus, for consistent results, it is necessary to grow the unknown organism on a specific medium andofatFatty a specific temperature for comparison of its Classes Acids in Bacteria fatty acid profile with those of organisms from the database that Class/Example Structure of example have been grown in the same way. For many organisms this is O impossible, of course, and thus FAME analyses are limited to I. Saturated: C (CH2)12 CH3 those tetradecanoic organisms that acid can be grown under the specified condiHO tions. In addition, the extent of variation in FAME profiles among O H strains of a species, a necessary consideration in Hstudies to disII. Unsaturated: (CH2)6 C C (CH2)6 CH3 criminate between species, is not yet wellC documented. omega-7-cis 13-methyltetradecanoic acid ype; production of unique compounds, forbecause example, fatty antibiotics require rigid standardization acid H CH3 HO O H FAME:Análisedosácidosgraxosnasmembranas HO OH IDENTIFY ORGANISM Compare pattern of peaks with patterns in database Bacterial culture Peaks from various fatty acid methyl esters Extract fatty acids HO O CH2 III. Cyclopropane: C (CH2)7 C C (CH2)5 CH3 cis-7,8-methylene Figure 16.19 Fatty acid methyl ester (FAME) analysis HO H inHbacterial hexadecanoic acid identification. (a) Classes of fatty acids in Bacteria. Only a single examO CH3 ple IV. is given of each class, but in fact, more than 200 different fatty acids Branched: C (CH2)11 C 13-methyltetradecanoic acid A methyl ester contains a methyl group are known from bacterial sources. HO H CH3 (CH3) in place of the proton on the carboxylic acid group (COOH) of the O H fatty acid. (b) Procedure. Each peak from the gas chromatograph is due V. Hydroxy: C peak CH2 height C (CH )10 CH3 to one particular fatty acid methyl ester, and the is 2propor3-hydroxytetradecanoic acid HO tional to the amount. OH (a) C CH2 C (CH2)10 CH3 Derivatize to form methyl esters Gas chromatography Amount hexadecanoic acid V. Hydroxy: 3-hydroxytetradecanoic acid (a) (b) IDENTIFY ORGANISM • FAME:FafyAcidMethylEster(me4l-ésteresdeàcidosgraxos) Compare pattern of peaks with patterns in database • Amplamenteusadoemlaboratóriosclínicos Bacterial culture Peaks from • Seunívelderesoluçãopermiteiden4ficarespéciesbacterianas various Extract fatty acids fatty acid methyl esters • Exigeapadronizaçãodosexperimentos,umavezquetemperaturaeoutros fatoresmodificamoresultado Gas chromatography Amount Derivatize to form methyl esters AnáliseGenoOpica • Comaintroduçãodastécnicasdebiologiamolecular,váriosmarcadores gené4cosforamintroduzidos • ComaintroduçãodemétodosdesequenciamentodeDNA,aanálise compara4vadesequênciaspassouaserusadanataxonomiaeclassificação demicrorganismos • ExemplosdemétodosgenoOpicos: MétodosgenoOpicos HibridizaçãoDNA-DNA HibridizaçãoDNA-DNA 1. Marcado 2. Digerido (frag. pequenos) 3. Aquecido 4. Misturado 5. Resfriado 6. DNA dupla fita não hibridizado é separado 7. Mede a radioatividade e compara com um controle (100%) Diferenciação entre espécies P32 ou H3 Para evitar o anelamento do DNA marcado AssinaturasnassequênciasderRNAsãousadaspara aIden4ficaçãoeClassificação • Algumassequênciassãoespecíficaseoutrassãoausentesemumdomínio Localização ARCHAEA BACTERIA EUKARYA CACYYG 315 0 >95 0 AAACUCAAA 910 3 100 0 AAACUUAAAG 910 100 0 100 YUYAAUUG 960 100 <1 100 CAACCYYCR 1110 0 >95 0 UCCCUG 1380 >95 0 100 UACACACCG 1400 0 >99 100 CACACACCG 1400 100 0 0 FISH–FluorescentinsituHybridiza4on • Sondaéligadaaumcorantefluorescente • Aplicardiretamenteemcélulasemculturaounoambientenatural • Usadaemdiagnós4coclínicodepacientes(iden4ficaçãodopatógeno) Fotografia de Contraste de fase Sonda eucariótica Coradas com sonda universal do SSU rRNA MétodosgenoOpicos:ribo4pagem • ObterDNAgenômico • Digerí-locomenzimasderestrição • HibridizarcomumasondamarcadaderRNA(16SdarRNA) • Opadrãodasbandas(ribo4po)formaaassinaturadecadaorganismo • Métodorápidoequepermitesepararespécies Iden4ficaçãopeloperfildasBandas rep-PCR(repe$$veextragenicpalindromicPCR) • Avalia a presença de variações na sequência de marcadores • Baseia-seemfragmentosaltamenteconservadose repe44vosaolongodogenoma • PCRcomumpardeprimersespecíficoseverificao padrãodebandas • Podediferenciarlinhagens 5 linhagens diferentes Digitais do Microorganismo Conceito de espécie para procariotos Quando a hibridização de DNA resulta em valores menores de 70%, esse método começa a dar resultados incompatíveis com a análise filogenética do gene 16S. Acima desse valor, o gene 16S tem sempre mais de 97% de identidade Como as duas técnicas são os métodos genotípcos de referência para classificação de novas espécies, convencionou-se utilizar esse limite como padrão na definição de espécies Contraditória Mesma espécie Espécies diferentes Classificaçãodeprocariotos ClassificaçãoeNomenclatura • Nomenclatura – Segue regras específicas – Código Internacional de Nomenclatura de bactérias (contem as regras) – “Manual de Bergey” - contem informações de todos os organismos classificados – “Os procariotos” – fornece informações detalhadas sobre cultivo, isolamento, tem mais de 4100 páginas Regradenomenclatura • Todososnomesdeespéciesbiológicasseguemomesmopadrão:gênero seguidodaespécie(comformatoitálico). • AprimeiraletradogênerodeveserMaiúsculaeasdemaisemminúsculo. Níveishierarquicosnaclassificaçãodemicroorganismos Domínio Bacteria Filo Firmicutes Classe Bacilli Ordem Lactobacillales Famílis Streptococcaceae Gênero Streptococcus Espécie Streptococcusmutans Sero4po* Streptococcusmutansserotypec Linhagem* StreptococcusmutansNCTC10449** *Theseranksarenotformallyrecognisedintaxonomy,butareofgreatprac4calimportance. **NCTC=Na4onalCollec4onofTypeCultures. BancosdeDadosdeOrganismos BancosdeDadosTaxônomicos Nome EndereçoWWW Comentário NCBITaxonomy hfps://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy OpenTreeofLife hfps://tree.opentreeoflife.org/ Projetocolabora4voqueincluia versãomaismodernadataxonomia universal Filogenia,Taxonomia&Sistemá0ca • Filogenia=ÁrvoreFilogené0ca – Representaarelaçãoevolu4vaentreosorganismos • Taxonomia – Caracteriza,nomeiaeposicionaosorganismosemgrupos – Atualmenteépolifásico:fenó4po+genó4po+filogené4co • Sistemá0caMicrobiana – Estudodasrelaçõesentremicroorganismos – Filogené4caéoramodasistemá4caqueestudacomoinferir árvoresfilogené4cas ÁrvoreFilogené4ca Ramos – linhagens individuais Nóancestral Ocomprimentodoramoéproporcional aonúmerodesubs4tuiçõesacumuladas DistânciaEvolu4va AnáliseEvolu4va–ÁrvoreFilogené4ca • SubunidademenordoRNAribossômal(SSUrRNA) – 16S(árqueasebactérias)e18S(eucariotos) – DistribuídosUniversalmente – Funçãoconstanteentreosorganismosvivos – Evoluemlentamente=>altamenteconservados – Tamanhoadequadoparaanáliseevolu4va AnáliseEvolu4va–árvoreFilogené4ca • Alémdo16S,mesmodepoisdebilhõesdeanosdeevolução, outrosgenescomunsaostrêsdomíniosaindapodemser iden4ficadoseusadosemfilogenias • Exemplos – FatorTUdeelongaçãodasínteseproteíca – Hsp60–choquetérmico – tRNAsintetases(vários) • Quandoanalisandolinhagensmaispróximas,outrosgenes podemcontermaisinformaçãosobreahistóriadosorganismos Linhagensoucepas:mesmaespécie FilogeniaMicrobiana CombasenafilogeniadoRNA16S,Woeseestabeleceuqueexistemtrês4posde organismoscelulares:Bacteria,ArchaeaeEukarya Domínios Protistas Eucariotos unicelulares Anovavisãoda árvoredavida: doisdomínios • Eucariotosdescendemde umsubgrupodearqueas • Gruposcompletamente novosdebactériassão iden4ficadosemamostras ambientais • Paraamaioriadosnovosgrupos,não sãoconhecidosmétodosparamanter culturaspurasemlaboratório Hug,L.A.etal.(2016)Anewviewofthetreeoflife.Nat.Microbiol.,1,16048 Anovavisãodaárvoredavida Hug,L.A.etal.(2016)Anewviewofthetreeoflife.Nat.Microbiol.,1,16048 FilogeniadasBacterias Àdireita:árvoredemáxima verissimilhançaconstruídaa par4rdoalinhamento concatenadode31proteínas codificadasporgenes housekeeping Firmicutes Proteobacteria hfp://itol.embl.de hfp://tolweb.org/tree/ Wu,M.andEisen,J.A.(2008)A simple,fast,andaccuratemethod ofphylogenomicinference. GenomeBiology,9,R151. PrincipaisgruposdeBacterias&Metabolismo Fototróficos Quimiorganotróficos Reproduçãopor brotamento Termo]licas Fototróficosoxigênicos Maioria Quimiorganotróficos Filomaisan4go • Hipertermófilo • Quimiolitrotrofico • OxidamH2 • • • • Maioremaisdiversometabolicamente AmplavariedadedeFormas Importânciamédica,agrícolaeindustrial TodasGram-nega4vas Protobactérias • Éomaiorgrupodebactérias descritas • Fantás4cadiversidade metabólica • Ancestraldasproteobateriasera provavelmentefotoautotrófico • Algunsgruposperderama capacidadedefazerfotossíntese Referências • Tortoraetal.Microbiologia11ªedição(2013). • Capítulo10:ClassificaçãodeMicroorganismos • Capítulo11:Osprocariotos:domíniosBacteriaeArquea • MicrobiologiadeBrock13aedição(2012) – Unidade6:EvoluçãomicrobianaeSistemá4ca • MarsheMar4nMicrobiologiaOral5ªedição(2009) • Capítulo3:Amicrofloraoralresidente 38
