GUERRA, P.A.; VIEIRA, L.J.; FERREIRA, C.F.; SOUZA, F.V.D. Indexação do PMWaV via RT-PCR em acessos do BAG abacaxi para fins de crioterapia. In: II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste, 2015, Fortaleza. Anais do II Simpósio da RGV Nordeste. Fortaleza, Embrapa Agroindústria Tropical, 2015 (R 75). Indexação do PMWaV via RT-PCR em acessos do BAG abacaxi para fins de crioterapia Patrícia Araújo Guerra1; Lívia de Jesus Vieira2; Claudia Fortes Ferreira3; Fernanda Vidigal Duarte Souza3 1 Estudante de Mestrado. Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Centro de Ciências Agrárias, 2 Ambientais e Biológicas (CCAAB). CEP: 44380-000, Cruz das Almas, BA. [email protected]; Bolsista de PósDoutorado FAPESB/CAPES/Embrapa Mandioca e Fruticultura. Rua Embrapa, s/n. CEP: 44380-000, Cruz das Almas, 3 BA. [email protected]; [email protected]; Embrapa Mandioca e Fruticultura. Rua Embrapa, s/n. CEP: 44380-000, Cruz das Almas, [email protected]; [email protected] Palavras chaves: ananas, limpeza viral, Pineapple Mealybug Associated Virus. Introdução A murcha-do-abacaxizeiro, ou vermelhão do abacaxizeiro, é causada pelo vírus Pineapple mealybug wilt-associated virus (PMWaV), em associação com cochonilhas das espécies Dysmicoccus ssp. Atualmente considera-se o PMWaV um complexo de vírus (PMWaV-1, PMWaV-2, PMWaV-3, PMWaV-4 e PMWaV-5 ), que tem o abacaxizeiro como seu único hospedeiro conhecido (VENTURA; COSTA, 2002). A doença causa perdas significativas em vários países produtores, e no Brasil, começa a se tornar um problema. O Banco Ativo de Germoplasma de abacaxi da Embrapa Mandioca e Fruticultura (BAG abacaxi) têm sido severamente ameaçados nos últimos anos devido à presença deste complexo viral. Várias ações de limpeza e prevenção estão em andamento, incluindo o cultivo de meristema e ensaios preliminares de crioterapia. A crioterapia de meristemas é um método baseado nas técnicas de criopreservação e que pode promover a morte de células infectadas, por injúrias causadas pelo congelamento. Pode proporcionar plantas livres vírus com elevada eficiência (YOUNES et al., 2014) e vem sendo utilizada para várias culturas. Entretanto, para o estabelecimento do protocolo de crioterapia, é necessário diagnosticar a presença do vírus antes e após o procedimento. Uma das técnicas para o diagnóstico viral atualmente utilizada é a RT-PCR (reação em cadeia da polimerase associada à transcrição reversa), utilizando oligonucleotídeos (primers) específicos para cada uma das espécies virais. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a incidência do PMWaV-1,2,3 em 5 acessos do BAG da Embrapa Mandioca e Fruticultura e proceder a ajustes no protocolo de limpeza viral para melhorar sua eficiência. Material e Métodos Como material vegetal foram utilizadas folhas de 5 acessos (BGA 265, BGA 332, BGA 335, BGA 365 e BGA 366) todos pertencentes à variedade botânica Ananas comosus var. comosus e provenientes do BAG Abacaxi. Esses acessos foram selecionados por apresentarem sintomas da infecção por PMWaV em campo. Como controle negativo (livre de vírus) foi utilizado o acesso BGA 001 mantido in vitro. (Tabela 1). As amostras foram inicialmente maceradas utilizando nitrogênio líquido. A extração do RNA total foi realizada utilizando o protocolo CTAB (DOYLE; DOYLE, 1990) rápido em que se utiliza o tampão de extração 2-mercaptoetanol a 2%, o PVP a 2% e o CTAB. As amplificações por PCR foram preparadas com reagentes padronizados para PCR em tempo real e adicionado aos conjuntos de primers e sonda específica para os genes de interesse. O produto das reações de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1% e corados com brometo de etídio para a visualização e a confirmação da amplificação. Resultados e Discussão Através da indexação foi possível notar a presença dos três tipos virais, inclusive com três dos cinco acessos avaliados com infecção mista (Tabela 1 e Figura 1). A presença do PMWaV3 foi detectada em todos os acessos, com exceção da planta controle. PERON at al. (2010) demonstrou a viabilidade do uso da técnica de RT-PCR na indexação de plantas matrizes e material propagativo de abacaxizeiros. Os resultados observados mostram que a técnica de RT-PCR utilizando primers específicos é útil para detectar a infecção das plantas sendo o tempo de diagnóstico menor e menos oneroso. Após a confirmação da presença do complexo viral nos acessos, as plantas serão encaminhadas para os procedimentos de crioterapia, que envolvem o cultivo de meristema em dimensões muito reduzidas (< que 0,5 mm) e seu congelamento de acordo com os procedimentos de criogenia usados na criopreservação do abacaxi (Souza et al, NO PRELO). II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste Fortaleza, 10-13 de novembro de 2015 Valorização e Uso das Plantas da Caatinga Tabela 1 - Acessos do Banco de Germoplasma de Abacaxi, classificação botânica e Indexação para PMWaV-1,2,3 por RT-PCR. Embrapa Mandioca e Fruticultura. Cruz das Almas. Acessos Controle 001 BAG265 BAG332 BAG335 BAG365 BAG366 PMWaV1 Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo PMWaV2 Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Negativo PMWaV3 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Figura 1 –Produtos da RT-PCR por eletroforese em gel de agarose 1% (M) Marcador de peso molecular 1kb, (C) Controle negativo. ((1 - BGA 265, 2 - BGA 332, 3 - BGA 335, 4 - BGA 365 e 5 - BGA 366) Conclusão A indexação realizada foi eficiente para a detecção dos três tipos virais nos acessos estudados com casos de infecção mista. Este diagnóstico é imprescindível para estabelecer um protocolo de crioterapia com a finalidade de regenerar plantas livres de vírus. Referências DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v. 12, n. 1, p. 13-15, 1990. PERON, F.N.; FERNANDES, P.M.B.; VENTURA, J.A. Detecção de PMWAV-1 e PMWaV-2 em abacaxizeiros no Estado do Espírito Santo. Tropical Plant Pathology. Lavras-MG, v.34 (suplemento), p.268, 2009. VENTURA, J.A. & H. COSTA. Manejo integrado das doenças de fruteiras tropicais: Abacaxi, banana e mamão, p. 279-352. In L. Zambolim (ed.) Manejo integrado; fruteiras tropicais - doenças e pragas. Viçosa, UFV, 672p, 2002. YOUNES, N. A.; ALY, MM El-Sheikh; ABOUL-NASR, M. H. Heat and freezing pre-thermal treatments as a means of freeing potatoes from mosaic virus and its effects on potato plants quality characters. Journal of Phytopathology and Pest Management, v. 1, n. 2, p. 44-52, 2014 II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste Fortaleza, 10-13 de novembro de 2015