PESQUISA CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE

http://dx.doi.org/10.18593/eba.v16i2.12767
PESQUISA
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE ISOLADOS BACTERIANOS
DE SOLO DE CULTIVO DE VIDEIRA (Vitis sp.)
Alchieri, MS*, Gelinski, JMLN**, Minotto, E***
Resumo
A viticultura é uma atividade importante para a sustentabilidade da pequena propriedade no Brasil,
produzindo uvas de mesa e para o processamento. Nesse sentido, realizou-se um estudo biosprospectivo para avaliar a diversidade da microbiota de solos utilizados no cultivo da videira. Foram coletadas amostras de solo de cultivares de municípios da zona rural do Meio-Oeste de Santa Catarina.
Foram obtidos 21 isolados bacterianos. A identificação bioquímica revelou que 88,88% dos isolados
gram-negativas foram da espécie Shigella dysenteriae soro grupo A e 11,11% da espécie Pseudomonas oryzihabitans. Em relação ao perfil de sensibilidade a antimicrobianos, 100% dos isolados foram
sensíveis a três dos antibióticos (Gentamicina, Pipemídico e Cloranfenicol), mas 100% dos isolados
foram resistentes aos antibióticos Ceftazidina e Aztreonam. Para as gram-positivas foram identificadas as espécies Bacillus cereus, B. megaterium, Corynebacterium xerosis e C. pseudodiphtheriticum. Em
* Graduada em Engenharia de Alimentos pela Universidade do Oeste de Santa Catarina de Videira; [email protected]
**
Doutora em Ciência dos Alimentos pela Universidade de São Paulo; Mestre em Genética pela Universidade Federal do Rio Grande do
Sul; Professora do Programa de Pós-graduação em Ciência e Biotecnologia na Universidade do Oeste de Santa Catarina; Rua Paese, 198,
Universitário, 89560-000, Videira, Santa Catarina, Brasil, Pós-doutora pela Universidade Federal do Paraná; [email protected]
***
Doutora em Microbiologia Agrícola e do Ambiente pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Mestre em Fitossanidade pela
Universidade Federal de Pelotas; Professora do Programa de Pós-graduação em Ciência e Biotecnologia na Universidade do Oeste de
Santa Catarina; [email protected]
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
101
Alchieri, MS, Gelinski, JMLN, Minotto, E
ambos os grupos observaram-se características de importância para a seleção de microorganismos
com potencial para a disponibilização de nutrientes no solo, contribuindo para o desenvolvimento de
plantas, destacando-se as espécies P. oryzihabitans e B. megaterium. Considera-se que a caracterização
desses microorganismos contribui para a avaliação da diversidade da microbiota do solo, bem como
para a definição de uso desses microorganismos em outros estudos de interesse biotecnológico.
Palavras-chave: Uva. Biodiversidade. Biotecnologia. Agricultura.
Biochemical characterization of bacterial isolates of vine cultivation soil (vitis sp.)
Abstract
Viticulture is an important activity for the sustainability of small properties in Brazil, producing table
grapes and for processing. In this sense, a preliminary biosprospective study was carried out to evaluate
the diversity of soil microbiota used in vine growing. Soil samples were collected from several cultivars
of municipalities in the rural area of ​​Santa Catarina. Twenty-one bacterial isolates were obtained. Biochemical identification revealed that 88.88% of the gram negative isolates were Shigella dysenteriae serum group A and 11.11% as Pseudomonas oryzihabitans. Regarding the antimicrobial sensitivity profile,
100% of the isolates were sensitive to three of the antibiotics (Gentamicin, Pipemidic and Chloramphenicol), but 100% of the isolates were resistant to the antibiotics Ceftazidine and Aztreonam. For the gram
positive isolates the species Bacillus cereus, B. megaterium, Corynebacterium xerosis and C. pseudodiphtheriticum were identified. In both groups important characteristics were observed for the selection of
microorganisms with potential for the availability of nutrients in the soil, contributing to the development
of plants, especially the species P. oryzihabitans and B. megaterium. It is considered that the characterization of these microorganisms contributes to the evaluation of soil microbiota diversity as well as for
definition of the use of these microorganisms in other studies of biotechnological interest.
Keywords: Grape. Biodiversity. Biotechnology. Agriculture.
102
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
Caracterização bioquímica...
1 INTRODUÇÃO
A viticultura é uma atividade importante para a sustentabilidade da pequena propriedade no
Brasil, como geração de emprego em grandes empreendimentos que produzem uvas de mesa e uvas
para processamento.1 No Brasil, a atividade se iniciou no século XVI, em 1535, durante o período da
colonização portuguesa. Porém, o estímulo maior para a produção ocorreu com a imigração italiana
para São Paulo e para o Rio Grande do Sul, em fins do século XIX.2
A viticultura é uma atividade de extrema importância mundial. Segundo Melo,3 no Brasil,
a videira é cultivada em uma grande diversidade de solos, sejam cultivos em solos altamente intemperizados, sejam cultivos em solos jovens com adequado suprimento de nutrientes. Por se tratar de um
ambiente desafiador para estudos da ecologia microbiana, o solo abriga comunidades microbianas que
aumentam em complexidade de acordo com a abundância delas.1 Os microorganismos são responsáveis
pelos processos de mineralização, constituindo uma fonte de nutrientes potencialmente disponíveis para
as plantas.2 Contudo, o uso de agentes químicos no combate a invasores da videira, assim como o cultivo
intenso do solo ao longo dos anos, vêm modificando a microbiota original dos solos.4
No solo, a população microbiana é constituída principalmente por bactérias mas, apesar
disso, a contribuição destas para a biomassa microbiana total é reduzida.5 No entanto, a biodiversidade
presente pode fornecer isolados com características bioquímicas importantes para o desenvolvimento ou
inibição de outros organismos, como produtoras de antibióticos, auxinas, solubilizadoras de fosfato, etc.4,6
A discussão sobre grupos que compõem as comunidades microbianas em solos ainda não
está corretamente definida.1 Portanto, uma vez que estudos de identificação e avaliação de perfil bioquímico de isolados bacterianos de solo ainda são necessários, buscou-se avaliar parte dessa diversidade microbiana, contribuindo, assim, para a bioprospecção da biodiversidade bacteriana de solos.
2 MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos de laboratório foram efetuados no Núcleo Biotecnológico da
Universidade do Oeste de Santa Catarina de Videira.
2.1 COLETA DAS AMOSTRAS
Foram coletadas oito amostras de solo de diferentes cultivares de videiras localizadas nas Cidades de Arroio Trinta (n=3), Salto Veloso (n=2) e Videira (n=3), em Santa Catarina. As coletas foram
realizadas em maio de 2015. Todas as amostras de solo foram retiradas de áreas de parreirais entre
quatro e 15 anos de produção. As amostras foram coletadas e transportadas para o laboratório para a
realização das análises microbiológicas.
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
103
Alchieri, MS, Gelinski, JMLN, Minotto, E
2.2 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS
Para a pesquisa foram pesados 25 g de cada amostra e adicionados 225 mL de solução salina
a 0,85% estéril. Em seguida, foram realizadas diluições decimais seriadas (10-1, 10-2 e 10-3), em seguida, alíquotas de 0,1 mL foram transferidas em placas com Ágar PCA (Merck, Alemanha) (contagem
total em placas) espalhamento com alça de Drigalski. Seguiu-se incubação a 30 °C. Aos meios foram
previamente adicionados 20 µg de Anfotericina B a cada 10 mL de Ágar para inibição de microbiota
fúngica. Posteriormente, foram selecionadas as placas que continham entre 10 e 100 colônias, separando-se cerca de 10% do total de colônias obtidas em cada amostragem para análise morfofisiológica.
As análises microbiológicas iniciais consistiram em avaliação macroscópica de colônias crescidas em ágares, seleção de colônias isoladas e coloração de Gram. As análises bioquímicas foram
realizadas considerando os dois grupos de bactérias: gram-positivas e gram-negativas.
2.3 COLORAÇÃO DE GRAM E ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Para análise de coloração de Gram, duas a três colônias foram repicadas para as placas de
PCA, incubadas a 30 °C por 24 a 48 horas, seguindo-se a coloração de Gram.
a) teste catalase: para a prova da catalase foram preparados tubos com Caldo TSB (Triptico de
Soja) e incubados a 30 °C por 24 horas. Em seguida, culturas de cada placa foram testadas
em lâminas, colocando de três a quatro gotas de H202 a 3%. A formação de bolhas foi indicativa da ação da catalase (catalase positiva);
b) teste indol: o teste do indol determina a capacidade que certas bactérias possuem de hidrolisar o triptofano e reduzi-lo a indol a partir da enzima triptofanase. A presença de
indol é detectada pela adição do Reativo de Kovacs, em que ocorre a formação de um anel
de coloração vermelha na superfície do meio, indicando uma reação positiva; ausência de
mudança de cor indica que o triptofano não foi hidrolisado, portanto, a reação é negativa;
c) reação de hemólise: a partir de tubos contendo Caldo TSB (Himedia, Índia) foram feitas
estrias nas placas contendo Ágar base (Himedia, Índia) suplementado com sangue de carneiro a 7%. As placas foram incubadas a 30 °C por 48 horas para avaliar as colônias típicas
que apresentassem um halo transparente de hemólise;
d) teste de motilidade: foram inoculadas em Ágar SIM (Sulfeto Indol Motilidade) (Himedia,
Índia) culturas de cada microorganismo a ser testado quanto à motilidade; na motilidade
positiva, observa-se aspecto do meio turvo, e na motilidade negativa, o crescimento apenas
no local de inoculação. Incubadas a 30 °C por 48 horas para análise dos resultados.
104
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
Caracterização bioquímica...
2.4 TESTES REALIZADOS COM ISOLADOS DE GRAM-NEGATIVAS
a) identificação bioquímica: alíquotas de cada isolado identificado como gram-negativa foram
suspensas em água destilada estéril com pH entre 6,8 e 7,2 até uma turbidez equivalente à
escala de 0,5 de MacFarland. A partir disso, foi inoculado 1,0 mL da suspensão bacteriana
a cada conjunto de provas de identificação bioquímica rápida (Laborclin, Brasil): ADH
(Arginina), LDC (Lisina), ODC (Ornitina), H2S (Tiossulfato de sódio), URE (Ureia), com
incubação a 30 ºC por 24 horas. Após incubação e complementação das reações conforme
indicação do fabricante, fez-se a leitura em software disponível on-line;7
b) antibiograma: para o teste antibiograma foram utilizadas as culturas crescidas em caldo
TSB e inoculadas com o auxílio de swab estéril em placas de Ágar Mueller Hinton (Kasvi,
Itália). Após 15 minutos foram postos discos de cada um dos seguintes antibióticos (DME,
Brasil): Ceftriaxona (CRO), Tetraciclina (TET), Cefepima (CPM), Pipemídico (PIT), Cefoxitina (CFO), Amoxicilina + Ac. Clavulânico (AMC), Sulfonamidas (SUL), Ciprofloxacino
(CIP), Cefalotina (CFL), Gentamicina (GEN), Cloranfenicol (CLO), Ceftazidima (CAZ),
Ampicilina (AMP), Aztreonam (ATM) e Amicacina (AMI). As placas foram incubadas a
30 ºC por 24 horas.
2.5 TESTES REALIZADOS APENAS COM ISOLADOS DE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS
a) solubilização de fosfatos inorgânicos (Ca3(PO4)2): utilizou-se o método conforme Nautiyal8 para avaliar a capacidade dos isolados em solubilizar fosfato inorgânico. Os isolados
foram repicados em placas de Ágar com incubação por dias a 30 °C. Após o período de
incubação, foi observada a presença ou ausência de halo de solubilização em torno das
colônias;
b) produção de sideróforos: os ensaios foram realizados em meio King B,9 adicionado ao meio
a solução indicadora de cromo azurol (CAS). Segundo a metodologia descrita e adaptada
por Biasiolo,10 os isolados foram cultivados em tubos de ensaio contendo 5 mL de meio
King B, mantidos por 24 horas a 30 °C sob agitação constante. Uma alíquota de 100 μL foi
transferida para placas contendo o mesmo meio. As placas foram incubadas a 30 °C por 72
horas. A presença de halo amarelo/laranja ao redor das colônias foi indicativo de resultado
positivo para produção de sideróforos.
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
105
Alchieri, MS, Gelinski, JMLN, Minotto, E
2.6 CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA
A classificação das bactérias gram-positivas foi realizada conforme chave de identificação
bacteriana descrita por Brown,11 considerando os testes:
a) formação de endósporos: foram utilizadas culturas crescidas por 24 horas Ágar; alíquotas
(10 μL) foram adicionadas em lâminas de vidro e cobertas com papel toalha, adicionando-se o reagente verde de malaquita. A lâmina foi posta por cinco minutos sobre vapor
fluente, seguindo-se lavagem em água destilada; coloração por 30 segundos com solução
de fucsina e lavagem em água destilada. Por microscopia observou-se a presença ou não
de esporos. Para os isolados formadores de esporos seguiu-se o teste do manitol e para os
isolados não formadores de esporos fez-se o teste do citrato;
b) teste utilização do manitol: os isolados foram inoculados em Ágar Sal Manitol (Oxoid, Inglatera) e incubados a 30 °C por 36 horas para análise dos resultados. A presença de mudança
de cor do meio rosado para amarelo representou resultado positivo para produção de ácidos;
c) teste do Voges-Proskauer-VP e Vermelho de Metila-MR: foram inoculadas os isolados que
obtiveram resultado positivo ao teste do manitol, em caldo VP e caldo MR (HiMedia, Brasil). Incubadas a 30 °C por 24 horas. Para o teste do VP utilizou-se o reagente α-naftol e
hidróxido de potássio a 40% (Sigma- Aldrich, Brasil). Para o teste MR utilizou-se solução
de Vermelho de Metila 0,1% em etanol (95%);
d) teste do Citrato: os isolados que obtiveram resultado negativo ao teste do manitol foram
repicados em tubos com Ágar Citrato Simmons (Merck, Alemanha) inclinado e incubadas
a 30 °C por 24 horas. Observou-se a mudança de coloração do meio verde para azul ou não.
3 RESULTADOS
Dos 21 isolados bacterianos de amostras de solos de diferentes cultivares de videira (Vitis
sp.), 60,86% eram bactérias gram-negativas (n=13), e 39,13% gram-positivas (n=8), predominando
morfologia bacilar.
As bactérias gram-negativas foram avaliadas preliminarmente quanto à produção de indol,
atividade de catalase, reação de hemólise e motilidade (Tabela 1).
106
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
Caracterização bioquímica...
Tabela 1 – Testes bioquímicos preliminares realizados em isolados bacterianos de gram-negativas de amostras de solo de
cultivo de videira†
Isolados
Códigos
BSV 03
BSV 06
BSV 07
BSA 09
BSA 10
BSA 11
BSA 12
BSS 15
BSS 18
BSS 19
BSS 22
BSS 23
BSS 24
Atividade de catalase
Motilidade
Reação de Kovac’s
(Triptofano)
Teste de hemólise
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Em seguida aos testes bioquímicos iniciais, foram realizadas também outras análises bioquímicas com base na assimilação de carboidratos e aminoácidos (Laborclin, São Paulo) de cada isolado.
Os resultados revelaram que 92,3% (n= 12) dos isolados foram identificados como da espécie Shigella
dysenteriae soro grupo A e 7,7% (n=1), da espécie Pseudomonas oryzihabitans.
O perfil de sensibilidade a antimicrobianos foi avaliado para os isolados de gram- negativas
considerando que as duas espécies definidas são patogênicas recorrentes em infecções humanas de
origem ambiental.4 Na Figura 1 apresenta-se o resultado do percentual de sensibilidade/resistência a
cada um dos antimicrobianos testados. Verificou-se que 100% dos isolados foram sensíveis a somente três dos antibióticos (Gentamicina, Pipemídico e Cloranfenicol) testados e tiveram resistência de
100% a outros dois (Ceftazidina e Aztreonam). Destacou-se o isolado BSS 19 como o que mais apresentou inibição aos antibióticos testados (86,66%), enquanto os isolados BSA 11 e BSS 22 tiveram o
menor índice (26%).
A avaliação do perfil de sensibilidade/resistência não interfere necessariamente no desenvolvimento de plantas, mas pode ser um fator a ser considerado se combinações de isolados forem
utilizadas na composição de substratos em solo.
_________________________________________
†
Legenda: (+) = Positivo; (-) = Negativo. Origem: BSV = Videira, BSA = Arroio Trinta e BSS = Salto Veloso.
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
107
Alchieri, MS, Gelinski, JMLN, Minotto, E
Figura 1 – Percentual de bactérias gram-negativas em relação ao perfil de sensibilidade a antimicrobiano
Legenda: Resultados expressos em milímetros de diâmetro de inibição. Ceftriaxona (CRO, 30µg), Tetraciclina (TET, 30µg),
Cefepima (CPM, 30µg), Pipemídico (PIT, 110µg), Cefoxitina (CFO, 30µg), Amoxicilina + Ac. Clavulânico (AMC, 30µg),
Sulfonamidas (SUT, 25µg), Ciprofloxacino (CIP, 05µg), Cefalotina (CFL, 30µg), Gentamicina (GEN, 10µg), Cloranfenicol
(CLO, 30µg), Ceftazidima (CAZ, 30µg), Ampicilina (AMP, 10µg), Aztreonam (ATM, 30µg) e Amicacina (AMI, 30µg),
(DME, Brasil).
Em relação aos isolados de bactérias gram-positivas, elas também foram avaliadas preliminarmente quanto à produção de indol, atividade de catalase, reação de hemólise e motilidade (Tabela 2).
Tabela 2 – Teste de identificação bioquímica de bactérias gram-positivas de amostras de solo de parreirais em municípios catarinenses‡
Isolados
Códigos
Atividade de catalase
Teste de
Motilidade
Reação de Kovac’s
(Triptofano)
Teste de Hemólise
BSV 02
+
+
-
+
BSV 04
+
+
-
+
BSV 05
+
+
-
+
BSA 08
+
+
-
+
BSA 13
+
-
-
-
BSA 14
+
+
-
+
BSS 16
+
+
-
+
BSS 17
+
+
-
+
Quanto à capacidade de solubilização de fosfatos inorgânicos (Ca3(PO4)2), somente a amostra BSV05 foi positiva. E para a produção de sideróforos, dois isolados mostraram-se produtores:
BSA08 e BSA13.
_____________________________________
‡
108
Legenda: (+) = Positivo; (-) = Negativo. Origem: BSV = Videira, BSA = Arroio Trinta e BSS = Salto Veloso.
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
Caracterização bioquímica...
Todos os isolados foram identificados em nível de espécie com base nos dados morfofisiológicos. As gram-positivas foram identificadas como: Bacillus cereus (n=1), Bacillus megaterium (n=4)
e Corynebacterium xerosis (n=1) Corynebacterium pseudodiphtheriticum (n= 2). Para as gram-negativas, duas espécies foram determinadas, sendo 92,3% (n= 12) como Shigella dysenteriae soro grupo A
e 7,7% (n=1) como pertencente à espécie Pseudomonas oryzihabitans.
4 DISCUSSÃO
As bactérias gram-positivas e gram-negativas compõem o grupo das Eubactérias (Bacteria)
que têm parede celular composta por uma camada de peptidioglicano, o qual se apresenta estreito nas
gram-negativas (10-15nm) e mais espesso (20-30nm) nas gram- positivas.12 Nestas últimas, a parede
contém polissacarídeos e/ou ácidos teicoicos. Nas gram- negativas existe ainda uma membrana externa composta por proteínas e lipopolissacaridio.13 Na Figura 2 é apresentado um esquema das estruturas das paredes celulares de gram-positivas e de gram-negativas.
Figura 2 – Esquema das estruturas das paredes celulares de gram-positivas e de gram-negativas
Fonte: adaptado de Morreira e Siqueira.13
Entre as bactérias gram-positivas, dois dos isolados apresentaram características fisiológicas
de importância para estudos visando à utilização como coadjuvantes na qualidade do solo e desenvolvimento vegetal. Destacou-se a espécie Bacillus megaterium, pela capacidade de solubilizar fosfatos
naturais existentes no solo. Linhagens dessa espécie têm sido utilizadas também por sua capacidade
de biodegradação, sendo produtoras de Poli-3-hidroxibutirato (P3HB).14
A espécie Pseudomonas oryzihabitans é uma gram-negativa que tem sido associada a enfermidades de saúde pública relacionadas a águas contaminadas.15 No presente estudo, nessas condições
é provável que o manejo do solo em algumas áreas do cultivo esteja falhando nos aspectos de higiene
básica, como, por exemplo, com água contaminada com fezes ou mesmo por contaminação direta
com fezes humanas ou, ainda, outro tipo de matéria orgânica, o que pode se constituir em risco à
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
109
Alchieri, MS, Gelinski, JMLN, Minotto, E
saúde do trabalhador rural. Por outro lado, há registro de que linhagens endofíticas dessa espécie são
promotoras do crescimento vegetal por diferentes mecanismos, como produção de auxinas e solubilização de fosfatos, bem como utilização do glifosato como única fonte de carbono.15 O fornecimento
de fósforo para as plantas por microorganismos solubilizadores de fosfato contribui para o melhor
crescimento e rendimento de culturas vegetais.16
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os microrganismos desempenham papel importante na qualidade do solo em face à diversidade metabólica destes que, por sua vez, contribui para o desenvolvimento vegetal.1 Estima-se que a
diversidade da microbiota de solos utilizados em cultivo de plantas seja grande. Certamente, o manejo
constante do solo e o uso de agroquímicos podem alterar essa biota e sua diversidade. Contudo, muito
ainda há a ser explorado.
Neste estudo, um pouco dessa microbiota bacteriana pôde ser avaliada, prospectando-se linhagens com potencial para estudos que envolvam o desenvolvimento de plantas de interesse econômico.
REFERÊNCIAS
1. Andreote FD, Cotta SR, Dias ACF. Microbioma de solos brasileiros: uma visão geral. Revista Microbiologia in Foco [Internet]. 2015 [acesso em 10 out 2016 ; 6(26): 22-39. Disponível em: http://
sbmicrobiologia.org.br/wp-content/uploads/2015/09/REVISTA-SBM-EDI----O-26-p-site.pdf
2. Gava AJ, Silva CAB, Gava JRF. Tecnologia de alimentos: princípios e aplicações. São Paulo: Nobel; 2009.
3. Melo GW. Adubação e manejo do solo para a cultura da videira. Embrapa Uva e Vinho. [Internet]. 2003. [acesso em 10 out 2016] . Disponível em: http://www.cnpuv.embrapa.br/publica/
sprod/viticultura/adubvid.html
4. JAY JM. Microbiologia de alimentos. 6a ed. Porto Alegre: Artmed; 2005.
5. Martins KF. Determinação da população de fungos e bactérias do solo contaminado com petróleo e armazenado sob refrigeração e congelamento [dissertação]. Curitiba: Universidade Federal
do Paraná, Setor de Ciências Agrárias; 2002.
6. Pelczar M Jr, Chan ECS, Krieg, NR. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2a ed. 8a reimp. São
Paulo: Pearson Education do Brasil; 2013. v.2.
110
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
Caracterização bioquímica...
7. Laborclin Produtos para Laboratórios Ltda. Kit Para Enterobactérias. Pinhais. [acesso em 10 out
2016 . Disponível em: http://www.laborclin.com.br/produto.asp?id=510918
8. Nautiyal CS. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing
microorganisms. FEMS Microbiol Lett. 1999 Jan; 170(1): 265-70.
9. King EO, Ward MK, Raney DE. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J Lab Clin Med. 1954; 44(2): 301-7.
10. Biasiolo GAD. Isolamento, caracterização e seleção de bactérias promotoras de crescimento vegetal de videira (Vitis sp) [dissertação]. Videira: Universidade do Oeste de Santa Catarina; 2015.
11. Brown AE. Benson’s Microbiological Applications. Laboratory manual in general microbiology.
10a ed. New York: McGraw Hill; 2007.
12. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA; Staley JT, Williams ST. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins; 1994.
13. Morreira FMS, Siqueira JO. Microbiologia dos solos. 2a ed. Lavras: UFLA; 2006.
14. Luvizetto DJ. Cultivo da bactéria Bacillus megaterium para a produção do biopolímero poli(2-hidroxibutirato) e modelagem matemática do bioprocesso [dissertação]. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul; 2007.
15. Sobral JK. A comunidade bacteriana endofítica e epifítica de soja (Glycine max) e estudo da interação endófitos-planta [tese]. Piracicaba: Universidade de São Paulo; 2003.
16. Silva Filho GN, Vidor C. Solubilização de fostatos por microrganismos na presença de fontes de
carbono. R Bras Ci Solo 2000; 24: 311-9.
Data da submissão: 01 de dezembro de 2016
Aceito em: 14 de dezembro de 2016
Evidência, Joaçaba v. 16, n. 2, p. 101-112, jul./dez. 2016
111