Texto completo - Fiocruz Minas

Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS
COM A IMUNIDADE INATA EM CÉLULAS HUMANAS INFECTADAS COM Apeu
virus
por
Jorge Gomes Goulart Ferreira
Belo Horizonte
Fevereiro/2015
DISSERTAÇÃO MBCM-CPqRR
J.G.G. FERREIRA
2015
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS
COM A IMUNIDADE INATA EM CÉLULAS HUMANAS INFECTADAS COM Apeu
virus
por
Jorge Gomes Goulart Ferreira
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do
Título de Mestre em Ciências na área de
concentração em Biologia Celular e Molecular.
Orientação: Dr. Carlos Eduardo Calzavara Silva.
Coorientação: Dra. Jaquelline Germano de Oliveira
e Dra. Fernanda Nobre Amaral Villani.
Belo Horizonte
Fevereiro/2015
II Catalogação-na-fonte
Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ
Biblioteca do CPqRR
Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975
F383a
2015
Ferreira, Jorge Gomes Goulart.
Análise de alterações na expressão de genes
relacionados com a imunidade inata em células
humanas infectadas com Apeu virus / Jorge Gomes
Goulart Ferreira, 2015.
XV, 79 f: il.: 210 x 297 mm.
Bibliografia: 87 – 94
Dissertação (mestrado) – Dissertação para
obtenção do título de Mestre em Ciências pelo
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
do Centro de Pesquisas René Rachou. Área de
concentração: Biologia Celular e Molecular.
1. Infecções por Vírus de RNA/imunologia 2. Vírus
de RNA/patogenicidade 3. Bunyaviridae/isolamento e
purificação I. Título. II. Silva, Carlos Eduardo
Calzavara (Orientação). III. Oliveira, Jaquelline
Germano de (Co-orientação) IV. Villani, Fernanda
Nobre Amaral (Co-orientação).
CDD – 22. ed. – 579.25
III Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas René Rachou
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
ANÁLISE DE ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS
COM A IMUNIDADE INATA EM CÉLULAS HUMANAS INFECTADAS COM Apeu
virus
por
Jorge Gomes Goulart Ferreira
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Dr. Carlos Eduardo Calzavara Silva (Presidente)
Prof. Dr. Edward José de Oliveira
Prof. Dr. Paulo César Peregrino Ferreira
Suplente: Dra. Marina de Moraes Mourão
Dissertação defendida e aprovada em: 27/02/2015
IV Dedico este trabalho a Deus que até aqui tem me
sustentado e aos meus pais, por todo amor, carinho e
dedicação oferecidos ao longo de toda minha vida.
V AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por todas as obras maravilhosas que tem
feito em minha vida, pela saúde, capacidade e boa vontade para superar os meus
limites e nunca desistir dos meus objetivos. Muitos foram os desafios enfrentados
até então, mas a presença do Senhor sempre esteve comigo me dando forças para
que eu pudesse chegar até aqui. Um agradecimento especial aos meus pais Jorge
Goulart dos Santos Ferreira e Denise Valéria Gomes Goulart por toda dedicação e
ensinamentos. Meus pais sempre foram exemplo de vida, pessoas guerreiras que
muitas vezes abriram mão de seus próprios sonhos para que eu pudesse seguir os
meus. Pai e mãe, amo muito vocês!
Agradeço a minha avó Maria de Lurdes por todo afeto e carinho, sei quantas
vezes a senhora rezou por mim e me apoiou em pensamentos, acreditando que seu
neto é capaz de ir muito além. Um muito obrigado a minha avó Dagmar por todo
amor. Agradeço aos meus irmãos Fernando e Carolina por me apoiarem nos
momentos difíceis, sempre prontos a me ajudar. Quão difícil seria essa vida se não
fosse o laço de amizade e ternura que existe entre nós meus irmãos amados.
Agradeço a minha namorada Juliana por ser uma pessoa tão especial em
minha vida, por oferecer tanto amor e acreditar tanto em mim. Grande parte do meu
esforço vem dos sonhos que compartilhamos Ju... Te amo!
Agradeço aos meus amigos Marcus, Moisés e Gustavo por muitas vezes me
fazerem esquecer as dificuldades, amigos especiais que ao meu lado sonham com
um futuro muito melhor, vocês tornam esta caminhada muito mais agradável. Muito
obrigado Priscila, por fazer parte da minha vida e sempre acreditar em meu
potencial. Agradeço com muito carinho as amigas Camila, Marina e Ana, que
sempre me apoiam, mesmo quando não mereço. Obrigado a minha amiga Renata
Bottrel, que me ensinou grande parte do que sei sobre ciência e sobre a vida.
Agradeço ao Dr. Rodrigo Corrêa-Oliveira pela oportunidade de ser aluno no
ICM, a Dra. Soraya Torres Gaze Jangola, que de forma efetiva me auxiliou no
desenvolvimento deste projeto e muito contribuiu para meu crescimento profissional,
a Dra Érica Alessandra Rocha Alves, pessoa muito especial que sempre mostrou
boa vontade em sanar minhas dúvidas e me ajudar no que fosse preciso.
Agradeço a Luciana Lisboa, Ana Pacheco, Ricardo, Vinicius por toda boa
vontade, e por garantirem que o trabalho de nós, pesquisadores e futuros
VI pesquisadores, possa sempre ser realizado com muita qualidade. Vocês foram
fundamentais no desenvolvimento deste projeto.
Obrigado aos amigos do Laboratório de Imunologia Celular e molecular: Anna
Carolina, Vitor, Ester, Guilherme, Carolina, Yasmin, Eneida, Roberta, Nayara, Luiza,
Teresiama, Jaqueline Fiuza, Dirli, Izabella, Emerson, Talita, Stella e muitos outros
que já fizeram parte desta equipe, vocês me fizeram crescer muito através do
aprendizado, amizade e companheirismo.
Agradeço muito a Dra. Fernanda Nobre Amaral Villani, que mais que uma
professora, tem sido uma amiga muito dedicada. A Dra. Jaquelline Germano de
Oliveira, que desde minha iniciação cientifica tem sido uma pessoa extremamente
presente, agindo não somente como orientadora, mas como alguém que realmente
se preocupa com meu crescimento pessoal e profissional, me ensinando a ser um
“laser”.
Um agradecimento especial ao meu orientador Dr. Carlos Eduardo Calzavara
Silva ou simplesmente Kdu, que me acolheu em um momento que muito precisei e
que tem me ensinado muito sobre ciência e vida. Obrigado Kdu por ter se tornado
um grande amigo!
Enfim, agradeço a todos que de forma direta ou indireta contribuíram ao longo
de minha vida para que eu chegasse até aqui.
VII Agradeço ao apoio financeiro das instituições FAPEMIG, CNPq e
FIOCRUZ que permitiram a realização do projeto.
VIII SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... XI
LISTA DE TABELAS.............................................................................................................. XII
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS .......................................................................... XIII
RESUMO ..............................................................................................................................XIV
ABSTRACT............................................................................................................................XV
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16
2
JUSTIFICATIVA ............................................................................................................. 19
3
OBJETIVOS ................................................................................................................... 21
4
5
3.1
Objetivo Geral ......................................................................................................... 21
3.1
Objetivos Específicos .............................................................................................. 21
REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 22
4.1
Arbovírus ................................................................................................................. 22
4.2
Família Bunyaviridae ............................................................................................... 25
4.2.1
Biologia molecular dos membros da família Bunyaviridae............................... 26
4.2.2
Ciclo de multiplicação viral ............................................................................... 29
4.2.3
Rearranjo em vírus da família Bunyaviridae .................................................... 31
4.3
Gênero Orthobunyavirus ......................................................................................... 33
4.4
Orthobunyavirus do grupo C ................................................................................... 34
4.5
Apeu virus ............................................................................................................... 35
4.6
Imunologia das Infecções Virais.............................................................................. 36
MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 44
5.1
Desenho metodológico............................................................................................ 44
5.2
Amostras de vírus ................................................................................................... 45
5.2.1
Origem ............................................................................................................. 45
5.2.2
Produção de estoques virais e mock ............................................................... 45
5.2.3
Titulação Viral por TCDI 50 (Tissue Culture Infectious Doses 50%) ............... 46
5.3
Amostras de células ................................................................................................ 51
5.3.1
PBMC ............................................................................................................... 51
5.3.2
Células A549 e Vero ........................................................................................ 53
5.4
Infecção viral ........................................................................................................... 54
5.4.1
Infecção de PBMC ........................................................................................... 54
5.4.2
Infecção de células A549 com APEUV e VSV nos períodos de 4 e 8 horas ... 55
5.4.3
Infecção de células A549 com APEUV e VSV no período de 4 horas ............. 56
5.5
Extração de RNA..................................................................................................... 57
5.6
Avaliação da Integridade do RNA ........................................................................... 58
IX 5.7
Síntese de cDNA ..................................................................................................... 59
5.8
Quantificação da expressão de genes por PCR quantitativa em tempo real. ......... 60
5.9
Análise dos dados ................................................................................................... 61
6
RESULTADOS ............................................................................................................... 62
6.1
Titulação Viral.......................................................................................................... 62
6.2
Obtenção de PBMC ................................................................................................ 62
6.3
PBMC infectadas com APEUV................................................................................ 62
6.4
Células A549 infectadas com APEUV e VSV nos períodos de 4 e 8 horas ............ 63
6.5
Infecção de células A549 com APEUV e VSV no período de 4 horas .................... 65
7
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ................................................................................ 74
8
CONCLUSÃO ................................................................................................................. 83
9
CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 84
10
PERSPECTIVAS ........................................................................................................ 86
11
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 87
X LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de transmissão dos arbovírus....................................................................
23
Figura 2: Distribuição dos Arbovírus..................................................................................
24
Figura 3: Estrutura de um vírus da família Bunyaviridae...................................................
26
Figura 4: Representação esquemática do RNA genômico pertencentes aos cinco
gêneros da família Bunyaviridae........................................................................................
27
Figura 5: Multiplicação de vírus da família Bunyaviridae...................................................
31
Figura 6: Desenho esquemático do processo de rearranjo genômico entre vírus da
família Bunyaviridae...........................................................................................................
33
Figura 7: Sinalização celular via TLR.................................................................................
39
Figura 8: Esquema metodológico......................................................................................
44
Figura 9: Fluxograma do preparo das amostras de vírus e do controle mock...................
46
Figura 10: Esquema da placa de titulação.........................................................................
48
Figura 11: Separação de PBMC por gradiente descontínuo de densidade.......................
51
Figura 12: Cultura de células A549....................................................................................
54
Figura 13: Placa personalizada TaqMan®Assays (Applied Biosystems)…………………..
61
Figura 14: Os níveis de expressão dos genes TLR9 e IFNβ estão aumentados em
PBMC infectadas por APEUV............................................................................................
63
Figura 15: Níveis de expressão de genes envolvidos na resposta imune inata humana
(células A549)....................................................................................................................
65
Figura 16: Avaliação da Integridade do RNA extraído de células A549 infectadas com
APEUV e VSV no período de 4 horas em gel de agarose a 1%........................................ 66
Figura 17: Seleção do gene constitutivo (housekeeping gene).........................................
67
Figura 18: Nível de expressão dos genes avaliados.........................................................
67
Figura 19: Avaliação da expressão de TLR3.....................................................................
68
Figura 20: Avaliação da expressão de TLR9.....................................................................
69
Figura 21: Avaliação da expressão de IFIH1 (MDA-5)......................................................
70
Figura 22: Avaliação da expressão de ROBO3 (RIG-1)....................................................
71
Figura 23: Avaliação da expressão de MyD88..................................................................
71
Figura 24: Avaliação da expressão de TICAM1................................................................. 72
Figura 25: Avaliação da expressão de IRF9......................................................................
72
Figura 26: Avaliação da expressão de IFNb1 (IFNβ).........................................................
73
XI LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação sorológica dos vírus do grupo C..................................................
35
Tabela 2: TLR sua localização e respectivos agonistas....................................................
38
Tabela 3: Tabela para cálculo TCID50 para APEUV.........................................................
48
Tabela 4: Tabela para cálculo TCID50 para VSV..............................................................
50
XII LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
APEUV: Apeu virus
BUNV: Bunyamwera virus
cDNA: Sigla em inglês para Complementary DNA (DNA complementar)
CHIKV: Chikungunya virus
CPE: Sigla em inglês para Cytopathic effect (Efeito citopático)
DAMP: Sigla em inglês para Damage-associated molecular pattern molecules (Padrões moleculares
associados a perigo)
DENV: Dengue virus
dsRNA: Sigla em inglês para Double-stranded RNA (RNA dupla fita)
HSV-1: Herpes simplex virus - 1
IFN: Interferon
IFNα: Interferon alfa
IFNβ: Interferon beta
IFNy: Interferon gama
IRF: Sigla em inglês para interferon regulatory factor (Fator regulador de interferon)
mRNA: Sigla em inglês para Messenger RNA (RNA mensageiro)
OROV: Oropouche virus
PAMP: Sigla em inglês para Pathogen-associated molecular pattern (Padrão molecular associado a
patógeno)
PBMC: Sigla em inglês para peripheral blood mononuclear cell (Célula mononuclear do sangue
periférico)
PBS: Sigla em inglês para phosphate buffered saline (Tampão Salina fosfato)
PFU: Sigla em inglês para plaque-forming unit (Unidade formadora de placa)
PRR: Pattern recognition receptors (Receptores de reconhecimento padrão)
qPCR: PCR quantitativa
RLR: Sigla em inglês para RIG-I-like receptor (Receptor tipo RIG-I)
SBV: Schmallenberg virus
ssRNA: Sigla em inglês para single-stranded RNA (RNA fita simples)
TLR: Sigla em inglês para Toll-like receptors (Receptor tipo Toll)
vRNA: Sigla em inglês para viral RNA (RNA viral)
VSV: Vesicular stomatitis virus
WHO: Sigla em inglês para World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)
WNV: West Nile Virus
m.o.i.: Sigla em inglês para multiplicity of infection (multiplicidade de infecção)
XIII RESUMO
A família Bunyaviridae consiste em uma das maiores e mais diversificadas
famílias de vírus de RNA, contendo cerca de 350 vírus sorologicamente distintos. O
Apeu virus (APEUV) é um vírus da família Bunyaviridae que se destaca por seu
grande potencial emergente. Isolado pela primeira no Brasil, este vírus pode causar
uma doença que apresenta sintomas semelhantes aos da gripe, como febre alta, dor
de cabeça e mialgia, associadas geralmente a náuseas, vômitos, fraqueza e
fotofobia. Entretanto, apesar de seu potencial patogênico, pouco se sabe sobre a
sua interação com o sistema imunológico humano. Com o objetivo de estudar alguns
aspectos da resposta imune, principalmente a reposta inata desencadeada pela
infecção do APEUV, a expressão de 19 genes (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, MyD88,
IRF3, IRF5, IRF7, IRF9, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TICAM1, JUN, ROBO-3(RIG-1),
IFIH1(MDA-5), IFNα, IFNβ, IFNy) foi analisada. Para tal, foram feitos ensaios de
qPCR baseados na metodologia TaqMan®, utilizando cDNA obtido a partir de RNA
total extraído de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e de células
A549 (linhagem derivada de carcinoma pulmonar humano), infectadas ou não com
APEUV por períodos de 4 ou 8 horas. Como controles, foram utilizadas células
infectadas com o vírus da estomatite vesicular (VSV) como controle positivo de uma
infecção por vírus de RNA fita simples, e células tratadas com o mock das amostras
de vírus como controle negativo. Os dados obtidos foram analisados em software
específico. Nossos resultados indicam que PBMC infectadas com APEUV por 4
horas (m.o.i.=1 e m.o.i.=3) induzem um aumento na expressão de TLR9 e IFNβ.
Quando quantificada a expressão de genes em células A549 infectadas com APEUV
(m.o.i.=1 por 4 horas) comparadas com o mock, verificou-se um aumento da
expressão dos genes TLR9, IRF3 e IRF7 e no período de 8 horas, também
comparando com o mock, verificou-se aumento de forma significativa na expressão
de TLR 9, além de um aumento na expressão de TLR3, TLR7, TRAF3 , IRF7 e IFNβ.
Verificamos ainda que, após escolher um gene housekeeping através de método
estatístico, células A549 infectadas com APEUV em uma m.o.i.=1, tende a aumentar
a expressão dos genes IFNβ eTICAM-I, fundamentais na indução de um estado
celular antiviral. Estudos posteriores são necessários para a determinação dos
mecanismos envolvidos na resposta imune inata humana contra o Apeu virus.
XIV ABSTRACT
The Bunyaviridae family consists of the largest and most diverse families of
RNA viruses, containing about 350 serologically distinct viruses. The Apeu virus
(APEUV) is a member of the Bunyaviridae family that stands out for its large
emerging potential. First isolated in Brazil, this virus can cause a flu-like disease with
symptoms such as fever, headache and myalgia, usually associated with nausea,
vomiting, weakness and photophobia. However, despite their pathogenic potential,
little is known about their interaction with the human immune system. In order to
study some aspects of the immune response, especially the innate response
triggered by APEUV infection, the expression of 19 genes (TLR3, TLR7, TLR8,
TLR9, MyD88, IRF3, IRF5, IRF7, IRF9, IRAK4, TRAF3, TRAF6, TICAM1, JUN,
robot-3 (RIG-1) IFIH1 (MDA-5), IFNα, IFNβ, IFNy) was analyzed. For that, qPCR
assays were performed based on the TaqMan method using cDNA obtained from
mRNA extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and A549 cells
(cell line derived from human lung carcinoma) infected or not by APEUV for 4 or 8
hours. Cells infected with vesicular stomatitis virus (VSV) were used as a positive
control of infection with single stranded RNA viruses; also mock infected cells were
used as controls. The data were analyzed using specific software. Our results
suggested that APEUV infection on PBMC induce an increase of TLR9 and IFNβ
expression on both situations with m.o.i=1 or m.o.i=3. On the A549 cell line, APEUV
infection increased the expression of TLR9, TLR3, TLR7, TRAF3, IRF7 and IFNβ
using m.o.i=1 and 4h infection condition, compared to mock control. After using a
statistical methodology to choose a housekeeping gene, we verified that APEUV
infection with m.o.i=1, increase the expression of IFNβ and IRF9 in A549 cells. A cell
antiviral state is induced by the presence of IFNβ and IRF9. Further studies are
needed to determine the mechanisms involved in human innate immune response
against APEUV.
XV 1 INTRODUÇÃO
O termo arbovírus é uma contração da expressão arthropod borne virus,
empregada para denominar um grupo de vírus, distribuídos em todo o mundo e que
são transmitidos por vetores artrópodes. Neste grupo, já foram registrados mais de
500 vírus, muitos destes apresentando como principal hospedeiro seres vivos
vertebrados, sendo, a maioria, considerada como agente etiológico de viroses
humanas, representando um grave problema de saúde pública (GUBLER, 2001).
Os arbovírus possuem grande facilidade de dispersão sendo capazes de
manter seu ciclo verticalmente, onde adultos transmitem os vírus para sua prole, ou
para outros de sua espécie durante a cópula e/ou através da transmissão horizontal,
contaminando o vetor invertebrado durante o processo de hematofagia em
vertebrados incluindo aves, primatas e pequenos mamíferos que atuam como
hospedeiros amplificadores, garantindo assim, o ciclo enzoótico do vírus (COFFEY,
2013).
Este grupo de vírus é composto predominantemente por vírus de genoma de
RNA. Vírus com este tipo de genoma não possuem mecanismos de reparo
altamente eficientes, e desta forma existe uma alta ocorrência de mutações durante
a replicação. Os altos índices de alterações genômicas, em conjunto com a elevada
população e a rápida replicação viral, conferem a estes vírus a capacidade de se
adaptarem rapidamente a diferentes ambientes. Além disso, os diferentes
mecanismos de replicação que estes vírus utilizam permitem, em conjunto, sua
adaptação a diversos nichos biológicos, o que auxilia na propagação, tornando
eminente o surgimento de novas variantes epidêmicas (STEINHAUER & HOLLAND,
1987; DOMINGO, 2010).
Os
arbovírus
principalmente
entre
incluem
as
uma
famílias
ampla
variedade
Flaviviridae,
de
vírus
Togaviridae,
distribuidos
Bunyaviridae,
Rhabdoviridae, Reoviridae, Orthomyxoviridae e Asfarviridae (CLETON, 2012; CIOTA
& KRAMER, 2010). Doenças causadas por estes vírus estão entre as mais
importantes doenças infecciosas emergentes, representando aproximadamente 30%
dos casos na última década. Arboviroses são consideradas um problema de saúde
pública, tendo como principais causadores de doenças humanas os vírus
pertencentes às famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae (JONES; et al,
2008).
16 Grandes impactos ambientais decorrentes das mudanças demográficas e
sociais
têm
beneficiado
a
emergência
ou
reemergência
de
arboviroses.
Desmatamentos, instalação de áreas urbanas em ambientes de floresta, aumento do
turismo em áreas exóticas, entre outros, favorecem os mecanismos de migração dos
vírus, auxiliando que estes deixem sua ecologia natural e passem a habitar novas
localizações onde artrópodes vetores e hospedeiros suscetíveis forneçam condições
para o surgimento de epidemias (CLETON, 2012; GUBLER, 2001; MARKLEWITZ,
2013).
A família Bunyaviridae consiste em uma das maiores e mais diversificadas
famílias de vírus de RNA, contendo cerca de 350 vírus sorologicamente distintos. Os
vírions apresentam estrutura esférica, envelopada e com tamanho de 80 a 120 nm.
O genoma é dividido em três segmentos de RNA, de cadeia simples e sentido
negativo, e replicam-se no citoplasma da célula hospedeira (FLORES, 2007).
Dentro da família Bunyaviridae, os vírus do gênero Orthobunyavirus se
destacam por seu grande potencial emergente, entre eles o Apeu virus (APEUV).
Isolado pela primeira no Brasil, no ano de 1955, este vírus pode causar uma doença
que apresenta sintomas semelhantes aos da gripe, como febre alta, dor de cabeça e
mialgia, associadas geralmente a náuseas, vômitos, fraqueza e fotofobia (CAUSEY,
et al; 1961; DE BRITO MAGALHÃES, et al; 2011).
A relação vírus-hospedeiro é um processo complexo e dinâmico no qual os
vírus utilizam estratégias para burlar o sistema imunológico enquanto o hospedeiro
faz o uso de mecanismos que possam prevenir e eliminar a infecção com o mínimo
de danos para si. Para infectar um organismo, inicialmente o vírus precisa
reconhecer, se ligar, e então, penetrar na célula alvo, migrar para o compartimento
celular apropriado onde seu genoma será transcrito, traduzido e replicado para que
então ocorra a montagem e exportação das novas partículas virais, permitindo que a
infecção possa se espalhar para outras células susceptíveis. Por outro lado, o
hospedeiro precisa reconhecer a presença do vírus e eliminá-lo de forma rápida e
eficaz. Este processo geralmente ocorre em uma série de acontecimentos na qual
as células infectadas e o sistema imune desempenham papel fundamental na
formação de uma resposta dependente de componentes da resposta inata e
adaptativa, sendo que, a resposta inata constitui a primeira linha de defesa do
organismo, essencial para ativar a imunidade adaptativa celular e humoral contra
estes agentes (EVERETT & MCFADDEN 1999; GUIDOTTI & CHISARI, 2001).
17 O conhecimento dos principais mecanismos de resposta imune contra os
diversos agentes virais permite a compreensão da patogênese, bem como das
diferentes estratégias do hospedeiro e do vírus envolvidas neste processo. Com o
intuito de contribuir para a compreensão dos mecanismos imunológicos humanos
frente à infecção pelo APEUV este projeto teve como objetivo, avaliar in vitro a
expressão de alguns genes envolvidos na resposta imune de humanos à infecção,
com o propósito de gerar informações que, no futuro, possam contribuir para o
desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem limitar as infecções virais.
18 2 JUSTIFICATIVA
A emergência e reemergência de arboviroses são fenômenos naturais
relacionados à evolução e adaptação das espécies. Entretanto, atualmente ocorre
um crescente aparecimento de doenças virais, sendo algumas relacionadas a
importantes epidemias em humanos. Grandes impactos ambientais decorrentes das
mudanças demográficas e sociais têm beneficiado a emergência ou reemergência
de arboviroses. Destas doenças, muitas são causadas por arbovírus bem
estudados, mas que, até então, não ofereciam risco à saúde pública, e outras
causadas por vírus que pareciam estar controladas, mas tornaram-se doenças
reemergentes, como exemplo mais importante, a dengue (GUBLER, 1998;
GUBLER, 2002; FIGUEIREDO, 2007).
Atualmente, a Dengue é a arbovirose emergente mais prevalente no Brasil,
porém, muitas outras arboviroses também importantes, apresentam grande potencial
emergente (FIGUEIREDO, 2007). Um exemplo de arbovírus emergente é o
Chikungunya virus (CHIKV), um vírus pertencente à família Togaviridae e também
transmitido por mosquitos do gênero Aedes. Desde 2005, tem causado diversos
surtos em todo mundo, incluindo países localizados fora de regiões tropicais. Este
vírus pode causar uma doença que varia desde um estado febril até uma doença
incapacitante que provoca artralgia crônica em até 30% dos afetados pelo vírus e
em alguns casos pode levar o individuo infectado a óbito (ROUGERON, 2014). O
vírus da febre do Nilo Ocidental (West Nile Virus - WNV) é um arbovírus pertencente
à família Flaviviridae, que também apresenta grande potencial epidêmico. É
transmitido por mosquitos, causando infecções que na maioria das vezes são
assintomáticas, mas que, podem causar desde uma doença febril leve até
meningite, encefalite e em alguns casos manifestações neurológicas severas. Este
vírus já causou mais de 1.300 mortes e 12.000 casos de meningite ou encefalite e
em 2012 foram relatados 5.387 casos, destes 51% foram classificados como
infecções neurológicas como meningite ou encefalite (MORELAND, 2014).
Existem ainda, arboviroses que são menos discutidas na literatura, mas que
apresentam grande importância para saúde pública, entre elas, as causadas por
vírus da família Bunyaviridae. Os vírus pertencentes a esta família são os únicos
cujo espectro de hospedeiros inclui invertebrados, vertebrados e plantas, além de
apresentarem altas taxas de recombinação e mutação. Estas características ligadas
às rápidas alterações no meio ambiente contribuem para que alguns membros da
19 família Bunyaviridae, principalmente os pertencentes ao gênero Orthobunyavirus,
sejam atualmente considerados importantes agentes infecciosos (GONZALEZSCARANO & SOLDAN, 2005; NICHOL; et al, 2000). No Brasil, a segunda arbovirose
mais frequente é a febre do Oropouche. Causada pelo vírus Oropouche (OROV), um
vírus da família Bunyaviridae que causa surtos de doença febril aguda em cidades e
aldeias nas regiões da Amazônia e Planalto-Central (BASTOS; et al, 2012).
O APEUV é um dos vírus pertencente ao gênero Orthobunyavirus, que
apresenta grande potencial emergente. Isolado pela primeira vez no Brasil, no ano
de 1955, este vírus pode causar uma doença que apresenta sintomas semelhantes
aos da gripe, e que geralmente é autolimitante durando cerca de dois a cinco dias
(DE BRITO MAGALHÃES, 2011). Porém, devido ao seu potencial emergente, ao
fato de que muito pouco se sabe sobre a interação desse vírus com o sistema
imunológico e que, o estudo da interação de vírus patogênicos com o sistema imune
permite o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem limitar a replicação
viral e eliminar tais infecções, verifica-se a necessidade de estudos envolvendo a
interação do APEUV com o sistema imunológico humano.
20 3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Quantificar, por qPCR, a expressão de genes relacionados à imunidade inata
humana após infecção pelo APEUV.
3.1 Objetivos Específicos
 Quantificar a expressão dos genes relacionados com imunidade inata em PBMC
infectadas com APEUV;
 Quantificar a expressão dos genes relacionados com imunidade inata em células
A549 infectadas com APEUV;
 Comparar a expressão de genes relacionados com imunidade inata em células
humanas infectadas com APEUV com células humanas infectadas com o vírus
controle VSV.
21 4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 Arbovírus
O termo arbovírus é uma contração da expressão arthropod-borne virus e é
empregado para denominar um grupo de vírus transmitidos por vetores artrópodes.
Neste grupo, já foram registradas mais de 500 espécies de vírus, sendo que muitos
destes apresentam seres vivos vertebrados como principal hospedeiro e a maioria
considerada como agente etiológico de viroses humanas, representando um grave
problema de saúde pública (GUBLER, 2001). O termo surgiu em 1942 para referir-se
a vírus que se multiplicavam em artrópodes e que podiam ser ocasionalmente
transmitidos para vertebrados. Em 1967, a WHO (World Health Organization) passou
a considerar como arbovírus, qualquer vírus transmitido por artrópodes a um
vertebrado, mantendo seu ciclo de vida entre artrópodes e vertebrados e, em 1963,
este termo passou a ser oficialmente utilizado para se referir a todos os vírus
carreados por vetores artrópodes (WHO, 1985; WHO, 1967).
Os arbovírus possuem grande facilidade de dispersão, e são capazes de
manter seu ciclo horizontalmente ou verticalmente. A dispersão horizontal é a
principal forma de dispersão utilizada por estes vírus, onde contaminam o vetor
invertebrado durante o processo de hematofagia. A transmissão vertical ocorre
quando artrópodes adultos transmitem os vírus para sua prole, ou para outros de
sua espécie durante a cópula ou de forma interestadial que ocorre quando há a
infecção em um estágio e a transmissão para o estágio seguinte. Estes diferentes
mecanismos de disseminação facilitam sua dispersão, garantindo o ciclo enzoótico
mantido entre vertebrados, incluindo humanos, aves e mamíferos selvagens ou
domésticos, que atuam como hospedeiros amplificadores (Figura 1) (COFFEY,
2013; SIM; et al, 2014; GO; et al, 2014).
22 Figura 1: Ciclo de transmissão dos arbovírus – Os arbovírus possuem grande capacidade de
dispersão, sendo capazes de manter um ciclo horizontal e/ou vertical. (A) A transmissão vertical
ocorre através da transmissão do vírus, de artrópodes adultos para sua prole, para outros de sua
espécie durante a reprodução ou de forma interestadial, onde o vírus é mantido no hospedeiro
durante os diferentes estágios de vida. (B) A dispersão horizontal ocorre quando o vetor invertebrado
infectado pelo vírus transmite este vírus para o hospedeiro vertebrado durante o processo de
hematofagia. Adaptado de: GO; BALASURIYA; LEE, 2014.
O grupo dos arbovírus é composto em sua maioria por vírus de RNA e
incluem uma ampla variedade de vírus distribuídos principalmente entre as famílias
Flaviviridae,
Togaviridae,
Bunyaviridae,
Rhabdoviridae,
Reoviridae,
Orthomyxoviridae e Asfarviridae (Figura 2) (CLETON, 2012; CIOTA & KRAMER,
2010). Doenças causadas por estes vírus estão entre as mais importantes doenças
infecciosas emergentes, representando aproximadamente 30% de todas as doenças
infecciosas emergentes na última década. Estes vírus são considerados um
problema de saúde pública, tendo como principais causadores de doenças humanas
os vírus pertencentes às famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae (JONES;
et al, 2008).
23 Figura 2: Distribuição dos Arbovírus – Os arbovírus são em sua maioria vírus de RNA. De acordo
com sua estrutura gênomica, os arbovírus estão distribuídos principalmente entre as famílias
Togaviridae e Flaviviridae, que inclui vírus de RNA fita simples de sentido positivo; famílias
Bunyaviridae, Rhabdoviridae e Orthomyxoviridae, que incluem vírus de RNA fita simples senso
negativa; e a família Reoviridae, composta por vírus de RNA dupla fita.
Adaptado de: GO;
BALASURIYA; LEE, 2014.
Grandes impactos ambientais decorrentes das mudanças demográficas e
sociais
têm
beneficiado
a
emergência
ou
reemergência
de
arboviroses.
Desmatamentos, instalação de áreas urbanas em ambientes de floresta, aumento do
turismo em áreas exóticas, entre outros, favorece os mecanismos de migração dos
vírus, fazendo com que estes deixem seu ambiente natural e passem a habitar
novas localizações onde vetores artrópodes e hospedeiros susceptíveis forneçam
condições para o surgimento ou ressurgimento de epidemias (CLETON, 2012;
GUBLER, 2001). Muitos esforços têm sido feitos na tentativa de controlar as
infecções causadas por arbovírus, porém a infecção por estes vírus continuam
sendo um importante problema de saúde pública em todo mundo (MACHADO; et al,
2004; SIM; et al, 2014).
Doenças tropicais negligenciadas, como as arboviroses, estão entre as
principais causas de mortalidade causadas por doenças infecciosas, em países
subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Vírus como Dengue virus (DENV),
Chikungunya virus (CHIKV) e vírus do Nilo Ocidental (West Nile Virus - WNV) têm
causado muitos surtos recentes em diferentes regiões, e apesar destes arbovírus
serem considerados um sério problema de saúde pública, atualmente não existem
medicamentos aprovados ou vacinas disponíveis para combater essas doenças
(BHAKAT, 2014). Além disso, muitas outras arboviroses também importantes, mas
menos discutidas na literatura, apresentam grande potencial emergente, entre elas,
infecções causadas pelos vírus da família Bunyaviridae (FIGUEIREDO, 2007).
24 4.2 Família Bunyaviridae
A família Bunyaviridae recebeu este nome devido ao isolamento do primeiro
representante deste grupo em 1943, o Bunyamwera virus (BUNV). Este vírus foi
isolado em mosquitos do gênero Aedes, na Uganda, durante um estudo de febre
amarela. A família Bunyaviridae foi estabelecida em 1975, incluindo um grande
número de vírus que compartilham propriedades antigênicas e morfológicas, com
base em suas reações sorológicas cruzadas. Os vírus desta família são
considerados os de maior distribuição mundial, podendo ser encontrados em todos
os continentes, em qualquer latitude, nas mais diversas condições ambientais e em
diferentes organismos (GONZALEZ-SCARANO & SOLDAN, 2005; ELLIOTT, 2014).
Consiste em uma das maiores e mais diversificadas famílias de vírus de RNA,
contendo cerca de 350 espécies de vírus sorologicamente distintos. Também
chamados de Bunyavirus, estes vírus possuem vírions esféricos ou globulares,
envelopados e com diâmetro entre 80 e 120 nm, replicam-se no citoplasma da célula
hospedeira e o genoma é composto por três segmentos de RNA fita simples e
sentido negativo. Estes segmentos são nomeados de acordo com seu tamanho,
sendo o menor fragmento chamado de S (Small) com cerca de 1000 nucleotídeos, o
fragmento médio com tamanho próximo de 4500 nucleotídeos chamado de M
(Medium)
e
o
maior
fragmento
nomeado
como
L
(Large)
apresenta
aproximadamente 7000 nucleotídeos (Figura 3) (FLORES, 2007).
A família Bunyaviridae é composta por cinco gêneros, denominados
Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus, Phlebovirus e Tospovirus, sendo que, os
quatro primeiros são capazes de causar infecções patogênicas em vertebrados, e o
gênero Tospovirus é capaz de infectar plantas. Os vírus que apresentam potencial
patogênico são agentes de doenças respiratórias, hepatite, nefrite e encefalite, tanto
em humanos quanto em animais (FLORES, 2007; MARKLEWITZ; et al, 2013).
25 Figura 3: Estrutura de um vírus da família Bunyaviridae – Desenho representativo de uma
partícula viral pertencente à família Bunyaviridae, evidencia-se o envelope lipídico; o genoma
composto por três segmentos de RNA fita simples e sentido negativo. O menor fragmento chamado
de S (Small) o médio chamado de M (Medium) e o maior fragmento nomeado como L (Large).
Observam-se ainda as duas glicoproteínas de superfície Gn (ou G2) e Gc (ou G1); a proteína N que
envolve as três formas de RNA viral senso–negativo (vRNA); a proteína L que apresenta atividade de
RNA polimerase dependente de RNA. Adaptado de ELLIOTT, 2014.
4.2.1 Biologia molecular dos membros da família Bunyaviridae
O genoma inserido no capsídeo do vírus possui organização bastante
característica, sendo composto por três fitas simples de RNA de polaridade negativa,
que são nomeadas de acordo com seu tamanho em: pequeno - S (“small”), médio M (“medium”) e grande - L (“large”). Os nucleotídeos da região terminal 3' e 5' de
cada segmento são complementares, permitindo a formação de uma estrutura
chamada de 'panhandle' que atua como promotor tanto para o processo de
transcrição quanto de replicação de cada segmento (Figura 4). Os vírions devem ser
constituídos por cada um dos segmentos genômicos, porém, em alguns casos, nem
sempre quantidades iguais de ribonucleocapsídeos são empacotadas durante a
morfogênese viral, influenciando na diferença de tamanho dos vírions visualizados
em microscópio eletrônico (SCHMALJOHN et al., 2007).
26 Figura 4: Representação esquemática do RNA genômico pertencentes aos cinco gêneros da
família Bunyaviridae – Todos os bunyavirus possuem três segmentos de RNA denominados:
pequeno - S (“small”), médio - M (“medium”) e grande - L (“large”). As setas abaixo de cada segmento
indicam ORFs que utilizam estratégia codificadora de senso negativo. Setas acima indicam ORFs
transcritas no sentido positivo.
Hantavirus, Nairovirus, Orthobunyavirus utilizam estratégia
codificadora de senso negativo. Phlebovírus e Tospovírus estratégia ambisenso. Adaptado de
WALTER; BARR, 2011.
O segmento L codifica uma proteína com atividade de RNA polimerase
dependente de RNA, responsável pela replicação e transcrição do genoma, também
chamada de proteína L ou RdRp - RNA-dependent RNA polymerase. O segmento M
codifica um polipeptídio que dará origem às glicoproteínas de superfície Gn (G2) e
Gc (G1); e a proteína não estrutural NSm. O segmento S codifica duas proteínas, a
nucleoproteína (N) e uma proteína não estrutural menor, NSS (NUNES; et al, 2005).
Destas proteínas codificadas pelo vírus, quatro são comuns a todos os
membros da família: a polimerase viral codificada pelo segmento L; as duas
glicoproteínas de superfície Gn (ou G2) e Gc (ou G1) codificadas pelo segmento M
(que primeiramente codifica uma poliproteína que é posteriormente clivada em Gn e
Gc) e a proteína N codificada pelo segmento S. Os vírus dos gêneros
Orthobunyavirus, Phlebovirus e Tospovirus codificam proteínas não-estruturais,
presentes no segmento M (NSm) ou no segmento S (NSs), por diferentes janelas
abertas de leituras (ORF) (Figura 4) (WALTER & BARR, 2011; SCHMALJOHN et al.,
2007).
27 A função da proteína N consiste em envolver as três formas de RNA viral senso–
negativo (vRNA), além do RNA antigenômico senso-positivo (cRNA), formando
estruturas biologicamente ativas, que recebem o nome de ribonucleoproteínas e que
protegem o genoma da degradação por RNAses. Estudos também já demonstraram
que essa proteína controla a atividade da polimerase durante os processos de
transcrição e replicação. É importante também no processo de empacotamento do
genoma e montagem da partícula viral, uma vez que esse processo exige que a
proteína N esteja ligada às fitas de RNA. Dessa forma, a proteína N tem importante
papel na morfogênese e multiplicação do vírus (SCHMALJOHN & NICHOL, 2007;
WALTER & BARR, 2011; ZHENG & TAO, 2013). As glicoproteínas de membrana Gn
e Gc participam do processo de adsorção viral. Essas proteínas são tipicamente
proteínas de membrana classe 1, cuja porção amino-terminal está exposta na
superfície do vírion e a carboxi-terminal ancorada na membrana. São consideradas
importantes fatores de virulência, influenciando o tipo de célula ou órgão-alvo, e a
eficiência da transmissão do vírus por um determinado artrópode. Sabe-se que a
proteína Gc é responsável pela adsorção do vírus à superfície das células dos
vertebrados, enquanto a proteína Gn é a responsável pela adsorção às células dos
artrópodes. No entanto, é provável que haja requerimento das duas glicoproteínas
em ambos os casos. Apresenta também, papel importante na fusão do envelope
viral à membrana do endossomo após a endocitose da partícula viral pela célula
hospedeira (SCHMALJOHN & NICHOL, 2007)
A proteína NSs atua como um fator de virulência diminuindo a síntese de RNA
do hospedeiro e inibindo a síntese de IFNs e a resposta celular aos IFNs, tendo
importante papel na patogênese viral. Além disso, a NSs também possui a
capacidade de inibir a síntese de RNAi (RNA de interferência), que poderia ser um
possível mecanismo celular de inibição viral. Essa proteína parece estar também,
envolvida com a regulação da função da RdRp (WEBER; et al, 2001; WEBER; et al,
2002).
A proteína não estrutural NSm acumula-se no complexo de Golgi da célula
hospedeira de uma foram independente das demais proteínas virais . O fato desta
proteína se deslocar para o local onde ocorre a maturação do vírus sugere que a
NSm possua funções relacionadas com a montagem e brotamento do vírus. Estudos
já mostraram que esta proteína não é essencial para a viabilidade do vírus, mas
vírus que modificados que apresentavam alterações nesta proteína se multiplicavam
mais lentamente que os vírus selvagens (SALANUEVA; et al., 2003). É provável que
28 a região N-terminal desta proteína esteja envolvida na montagem do vírus, sendo
que o domínio C-terminal pode funcionar como uma sequência sinal interna para a
glicoproteína Gc (SHI; et al., 2006).
A RNA polimerase RNA dependente (RdRp) viral é codificada por uma única
janela de leitura do segmento maior L e promove a transcrição e a replicação do
vírus e estas funções dependem da síntese de novas proteínas N durante o ciclo
replicativo do vírus (KOCHS; et al., 2002).
4.2.2 Ciclo de multiplicação viral
Os Bunyavirus se multiplicam exclusivamente no citoplasma da célula
infectada (Figura 5), e o primeiro passo consiste na adsorção da partícula viral. Esta
etapa ocorre com a interação das glicoproteínas Gn e/ou Gc com receptores
presentes na superfície celular. Para maioria dos vírus da família Bunyaviridae, os
receptores aos quais eles se ligam, não foram identificados. Após a adsorção do
vírus, estes entram na célula hospedeira através do processo de endocitose
mantendo-se acondicionados no endossomo. Dentro do endossomo, o ambiente
acidificado faz com que a glicoproteína Gc sofra alterações conformacionais,
fazendo com que o envelope viral se funda a membrana do endossomo, liberando
em seguida, o genoma e a polimerase viral no citoplasma (SCHMALJOHN &
NICHOL, 2007).
Quando ocorre o desnudamento do genoma viral, tem-se início o processo de
transcrição primária. Nesta etapa, o RNA viral senso negativo é transcrito em mRNA
através da interação da RdRp com as ribonucleoproteínas virais.A polimerase viral
(RdRp) catalisa a transcrição do mRNAs, que é ativada por iniciadores derivados da
célula hospedeira. Estes iniciadores são pequenas sequências ligadas ao cap,
derivadas da célula hospedeira, que são obtidos através de clivagens, realizada pela
atividade de endonuclease da proteína L, na extremidade 5’ de mRNA celular. Este
artifício faz com que o mRNA viral apresente em sua extremidade 5’, sequências
pequenas (10 a 20 nucleotídeos) que não estão presentes no RNA viral
(SCHMALJOHN & NICHOL, 2007; REGUERA; et al, 2010).
Os segmentos S e L são traduzidos em ribossomos livres no citoplasma e o
segmento M traduzido em ribossomos associados ao retículo endoplasmático
rugoso. Após a tradução, a proteína L não sofre processamento pós traducional e a
polimerase já é liberada pelos ribossomos com suas atividades funcionais. A
29 proteína M é clivada e as proteínas formadas sofrem glicosilação primária no
complexo de Golgi dando origem as glicoproteínas Gc e Gn (SCHMALJOHN &
NICHOL, 2007).
O processo de replicação do genoma viral só ocorre após a interação da
proteína N com o RNA complementar sintetizado a partir do RNA viral. Nesta etapa,
a polimerase sintetiza uma nova fita, a partir da extremidade 3’ da fita molde, sem a
necessidade de um iniciador (assim como ocorria na transcrição primária), para que
o transcrito formado possua o mesmo tamanho do genoma. Após sua síntese, o
RNA viral associa-se as proteínas L e N formando os nucleocapsídeos que se
acumulam no complexo de Golgi, ocorrendo então a morfogênese. As glicoproteínas
Gc e Gn, também acumulam no complexo de Golgi sofrendo glicosilações terminais.
Após estas etapas, membranas modificadas da célula hospedeira, são incorporadas
através do processo de brotamento, e são liberadas pelo complexo de Golgi. Após o
brotamento da membrana, as partículas virais são levadas até a membrana
plasmática onde se fundem a membrana, sendo liberadas para o meio extracelular e
reiniciando o ciclo. Não se conhece ainda os artifícios utilizados pelo vírus para
selecionar os fragmentos do genoma que serão empacotados, mas alguns estudos
mostram que a proteína N parece ter papel importante nesta etapa. (SCHMALJOHN
& NICHOL, 2007).
30 Figura 5: Multiplicação de vírus da família Bunyaviridae – (1) Ligação do vírus com receptor de
membrana; (2) Adsorção viral que é mediada por uma ou ambas das glicoproteínas virais (Gc e Gn),
ocorrendo em seguida a internalização do vírus através de endocitose; (3) Desnudamento do genoma
viral que ocorre devido à acidificação do endossomo, em seguida a membrana viral se funde com a
membrana do endossomo; (4) Transcrição primária que ocorre catalisada pela enzima RNA
polimerase dependente de RNA (RNA-dependent RNA polymerase – RdRp) sintetizando o mRNA; (5)
Tradução do mRNA. (6) Os três segmentos de sentido negativo do genoma viral são convertidos em
fitas de sentido positivo para que ocorra a replicação do genoma. (7) As ribonucleoproteínas (RNP)
são então transportadas as para membranas do complexo de Golgi modificadas pela inserção das
proteínas Gn e Gc, serão formadas então partículas virais; (8) Vesículas formadas no complexo de
Golgi, contendo partículas de vírus transportam as partículas para a superfície da célula; (9) ocorre à
fusão das membranas vesiculares com a membrana celular, podendo ser facilitada por filamentos de
actina, (10) liberando as partículas virais no meio extracelular. Adaptado de ELLIOTT, 2014.
4.2.3 Rearranjo em vírus da família Bunyaviridae
Vírus com genoma de RNA são os vírus mais presentes no meio ambiente,
são encontrados no meio intracelular de quase todas as formas de vida, de plantas,
animais, fungos e procariotos. O sucesso evolutivo dos vírus de RNA está
relacionado à sua capacidade de utilizar diferentes estratégias de replicação e de
adaptar-se a diferentes nichos biológicos. Além disso, parte dessa capacidade de
31 adaptação relaciona-se a alta taxa de erros da RNA polimerase durante a síntese do
material genético, uma vez que esta polimerase não apresenta mecanismos de
reparo assim como as envolvidas na síntese de genomas de DNA. Dessa forma, o
alto índice de mutações em conjunto com elevada população e rápida replicação
confere a estes vírus a capacidade de se adaptar rapidamente a diferentes
ambientes (STEINHAUER & HOLLAND, 1987).
O vírus com genoma de RNA sentido negativo assim como os outros vírus de
RNA apresentam sua RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) incapaz de
realizar a função de revisão do genoma, gerando uma grande heterogeneidade
genética entre os vírus. Este fato aliado a um genoma segmentado permite a
ocorrência de alterações drásticas no genoma destes vírus, uma vez que a presença
de diferentes segmentos permite que tais vírus possam sofrer, um processo de
recombinação não clássica denominado rearranjo, comum entre vírus de genoma
segmentado do mesmo gênero. O processo de rearranjo pode ocorrer quando,
durante uma coinfecção com dois vírus distintos, como por exemplo, dois vírus da
família Bunyaviridae, trocam segmentos entre si gerando vírus recombinantes
diferentes (Figura 6) (ELLIOTT, 2014).
O processo de rearranjo ocorre apenas em vírus intimamente relacionados e
embora ainda não se saiba a base molecular, existem incompatibilidades de certas
combinações de segmentos do genoma. Sabe-se ainda que mosquitos que são
infectados com dois vírus distintos provavelmente são hospedeiros melhores para
recombinação genética, uma vez que podem se alimentar em diferentes vertebrados
facilitando a chance de infecção com vírus diferentes (ELLIOTT, 2014).
32 Figura 6: Desenho esquemático do processo de rearranjo genômico entre vírus da família
Bunyaviridae. Durante um processo de coinfecção com dois vírus distintos, mas intimamente
relacionados, ocorre à replicação do genoma dos dois vírus, e durante a montagem das partículas
virais, é possível, além da montagem de vírus idênticos aos vírus parentais, ocorra também a troca de
segmentos entre os vírus dando origem a vírus rearranjados. Adaptado de ELLIOTT, 2014.
A grande importância deste processo de rearranjo consiste na capacidade de
alterar as características do vírus. Por exemplo, o segmento M (médio), que codifica
as proteínas Gn, Gc e NSm, têm uma grande influência sobre a competência
vetorial, ou seja, determina a capacidade de uma espécie de artrópodes de
transmitir de forma eficiente o vírus. Um vírus recombinante natural com um
segmento M diferente poderia, portanto, ser transmitido por um artrópode diferente,
e este novo vetor, poderia ainda ter um comportamento biológico diferente,
introduzindo o vírus recombinante natural em diferentes hospedeiros (ELLIOTT,
2014).
4.3 Gênero Orthobunyavirus
Os vírus do gênero Orthobunyavirus, assim como os demais vírus
pertencentes à família Bunyaviridae, são constituídos por três moléculas de RNA fita
simples e polaridade negativa, (S, M e L). Constitui um grupo crescente de vírus
emergentes capazes de causar danos à saúde humana e animal. Existe mais de 170
espécies de Bunyavirus classificados com o gênero Orthobunyavirus, o que faz
deste gênero o maior dentro da família Bunyaviridae. Os Orthobunyavirus são ainda,
33 subdivididos em 18 sorogrupos, classificados de acordo com antígenos presentes na
proteína N, que são determinados através de testes de fixação do complemento. A
classificação inclui os sorogrupos: Anopheles A; Anopheles B; Bakau; Bunyamwera;
Bwamba; California; Capim; Gamboa; Grupo C; Guama; Koongol; Minatitlan;
Nyando; Olifantsvlei; Patois; Simbu; Tete e Turlock. Esta classificação atual pode
sofrer muitas alterações, uma vez que, a maioria dos Orthobunyavirus é pouco
conhecida em relação a sua biologia molecular, e ainda, devido à alta ocorrência de
recombinação genética ao longo de sua evolução (HART; et al, 2009).
Grande parte desses vírus é considerada como agentes zoonóticos, e pelo
menos 30 já foram reconhecidos como patógenos humanos. E, em humanos, estes
vírus são capazes de causar uma variedade de sintomas auto limitantes, mas que
em alguns casos podem ser severos, como por exemplo, doenças febris, encefalite
e febre hemorrágica (HART et al., 2009). Um exemplo de Orthobunyavirus que
apresenta grande potencial patogênico em seres humanos é o Oropouche virus
(ORV), que infectou mais de meio milhão de pessoas. Este vírus é o agente
causador de uma doença febril conhecida como febre do Oropouche, e causou nos
últimos 40 anos, mais de trinta grandes epidemias na América do Sul e Central. O
La Crosse virus (LACV) é um vírus capaz de causar encefalite grave e meningite
asséptica. É um vírus endêmico em toda Região Sul e Centro-Oeste dos Estados
Unidos, mas alguns relatos recentes mostram a ocorrência desse vírus em outras
regiões (BOWDEN; 2013).
Os Orthobunyavirus têm causado também, impactos importantes nos setores
de criação de animais. O Schmallenberg virus (SBV), isolado em 2011 e prevalente
em toda a Europa, vem causando doenças graves e muitas vezes fatais em
carneiros, cabras e gado recém-nascidos. Apesar da importância deste gênero de
vírus para a saúde pública e agroeconomia, muito pouco se sabe sobre os
Orthobunyavirus (BOWDEN, 2013).
4.4 Orthobunyavirus do grupo C
O gênero Orthobunyavirus é subdividido em diferentes grupos sorológicos. O
sorogrupo C foi descrito em 1950 na Amazônia, e os vírus foram isolados
principalmente de seres humanos e animais silvestres. Este grupo compõe 14 vírus
classificados de acordo com suas relações antigênicas (Tabela 1). De acordo com
esta classificação, os vírus do grupo C podem ser divididos em quatro complexos
34 antigênicos, sendo eles: o complexo Caraparu, Madrid, Marituba e Oriboca (NUNES;
et al, 2005).
Os vírus pertencentes ao grupo C ocorrem em regiões tropicais e
subtropicais
das
Américas
(Estados
Unidos,
México,
Panamá,
Honduras,
Guatemala, Trinidad e Tobago, Brasil, Peru, Equador, Venezuela e Guiana
Francesa) e dos 14 vírus registrados 10 são capazes de causar doenças em seres
humanos, sendo eles, Caraparu virus, Oriboca virus, Itaqui virus, Nepuyo virus, Apeu
virus, Marituba virus, Murutucu virus, Restan virus, Ossa virus, Madrid virus (DE
BRITO MAGALHÃES, 2011).
Tabela 1: Classificação sorológica dos vírus do grupo C.
Classificação Sorológica
Espécies de vírus
Complexo Caraparu
Caraparu virus (CARV)
Ossa virus (OSSAV)
Apeu virus (APEUV)
Vinces virus (VINV)
Bruconha virus (BRCV)
Complexo Madrid
Madrid virus (MADV)
Complexo Marituba
Marituba virus - BeAn15 (MTBV)
Marituba virus - 63U-11 (MTBV)
Murutucu virus (MURV)
Restan virus (RESV)
Nepuyo virus (NEPV)
Gumbo limbo virus (GLV)
Complexo Oriboca
Oriboca virus (ORIV)
Itaqui virus (ITQV)
Esta classificação foi baseada nas relações antigênicas, determinadas através das técnicas de
fixação de complemento, neutralização e inibição da hemaglutinação (Nunes; et al, 2005).
4.5 Apeu virus
Outro vírus pertencente ao gênero Orthobunyavirus, de grande potencial
emergente, mas pouco estudado, é o Apeu virus (APEUV). Foi isolado pela primeira
vez em Belém, no Pará, Brasil, em 1955 a partir de um macaco sentinela (Cebus
apella) sob a designação de BeAn848, sendo classificado como um membro do
grupo C, complexo Caraparu (DE BRITO MAGALHÃES; et al, 2011).
35 Este vírus pode causar uma doença que apresenta sintomas semelhantes aos
da gripe, como febre alta, dor de cabeça e mialgia, associadas geralmente a
náuseas, vômitos, fraqueza e fotofobia. Esta doença geralmente é autolimitante e
dura cerca de dois a cinco dias (DE BRITO MAGALHÃES; et al, 2011). Apesar de
ser um vírus patogênico ao homem, ter sido isolado a mais de cinco décadas e
serem considerados potenciais arbovírus emergentes, ainda existem poucos
estudos envolvendo o APEUV.
4.6 Imunologia das Infecções Virais
A relação entre o vírus e o hospedeiro é um processo complexo e dinâmico
no qual o vírus utiliza estratégias para burlar o sistema imunológico enquanto o
hospedeiro faz uso de mecanismos que possam prevenir e eliminar a infecção com
o mínimo de danos para si. Para infectar um organismo, inicialmente o vírus precisa
reconhecer, se ligar, e então entrar na célula alvo, migrar para o compartimento
celular apropriado onde seu genoma será transcrito, traduzido e replicado para que,
então, ocorra a montagem e exportação das novas partículas virais, permitindo que
a infecção possa se espalhar para outras células susceptíveis. Em correspondência
a esta ação, o hospedeiro precisa reconhecer a presença do vírus e eliminá-lo de
forma rápida e eficaz, para evitar que o vírus destrua um grande número de células
e cause danos severos ao organismo. Este processo geralmente ocorre em uma
série de acontecimentos na qual as células infectadas e o sistema imunitário
desempenham papel fundamental (GUIDOTTI & CHISARI, 2001).
A resposta imune desenvolvida contra agentes microbianos, incluindo os
vírus, depende de componentes da resposta inata e adaptativa. A resposta inata é
mediada principalmente por células do sangue que fagocitam organismos
patogênicos, e concomitantemente modulam a resposta do hospedeiro através da
síntese de mediadores inflamatórios e citocinas. Simultaneamente, células
apresentadoras de antígeno, fagocitam o agente infeccioso que é degradado dentro
do fagossoma, e então apresenta às células T os epítopos do agente patogênico.
Este processo, geralmente, irá ativar a resposta imune adaptativa e o
desenvolvimento de uma imunidade protetora de memória (ADEREM & ULEVITCH,
2000).
36 De uma forma geral, o controle inicial das infecções virais ocorre
principalmente através da secreção dos IFN do tipo I (α e β). Macrófagos e células
NK infectadas com os vírus produzem IFN tipo I que interagem com células não
infectadas e induzem genes que promovem um estado antiviral nas células para
protegê-las contra a infecção e, posteriormente, contribuem também com o processo
de resposta imune adaptativa (MACHADO; et al, 2004).
Durante esta cadeia de processos, o principal desafio para o sistema imune
inato consiste no discernimento de um grande número de potenciais patógenos
utilizando apenas um número reduzido de receptores. Desta forma, ao longo do
processo evolutivo o sistema imune inato desenvolveu a capacidade de diferenciar o
próprio do não próprio, utilizando um número limitado de receptores, que são
chamados Receptores de Reconhecimento Padrão - Pattern recognition receptors
(PRR). Os PRR são capazes de identificar sequências moleculares específicas
presentes em microrganismos e que foram conservadas durante a evolução,
conhecidos como Padrão Molecular Associado a Patógenos - Pathogen-associated
molecular pattern (PAMP). Dessa forma a ligação PRR-PAMP é um passo essencial
na ativação da imunidade inata e, consequentemente, no desenvolvimento da
imunidade adquirida contra os antígenos específicos (ADEREM, 2000; PAIVAOLIVEIRA; et al, 2012).
Existem diferentes tipos de PRR, alguns podem ser secretados no plasma,
atuando como proteínas humorais, outros podem estar presentes na membrana
celular e alguns localizados no citoplasma, todos atuando como sensores na
detecção de agentes patogênicos (CREAGH et al., 2006; AKIRA, 2009; PAIVAOLIVEIRA et al., 2012). A resposta imune inata antiviral ocorre principalmente pelo
reconhecimento de componentes virais via duas famílias de PRR: os receptores tipo
toll (Toll-like receptors - TLR) e os receptores tipo RIG (Nucleotide binding and
leucine-rich repeat-containing receptors - RLR) (THOMPSON & LOCARNINI, 2007).
Atualmente foram identificados 13 membros da família TLR em mamíferos.
Os TRL estão presentes principalmente em leucócitos polimorfonucleares e atuam
reconhecendo PAMP, expressos por diferentes agentes infecciosos, como bactérias,
vírus, protozoários e fungos (Tabela 2). Estes receptores são capazes de
reconhecer componentes de microrganismos estimulando a síntese e liberação de
citocinas pró-inflamatórias. Os TRL reconhecem ainda, além dos PAMP, moléculas
endógenas liberadas em resposta ao estresse ou dano tecidual, conhecidas como
Padrão Molecular Associado ao Perigo - Damage-associated molecular pattern
37 molecules (DAMP) ou alarminas. O acoplamento aos TLR irá ativar múltiplas
cascatas de sinalização que irão resultar na indução de genes envolvidos na
resposta imunitária inata (Figura 7). (AKIRA, 2009; LEE; et al, 2012; DE MEDEIROS
PINHEIRO, 2011; KONDO; et al, 2012).
Tabela 2: TLR sua localização e respectivos agonistas. (Ferraz; et al, 2011).
TLR
TLR 1 e TLR2
Localização
Extracelular
Agonistas derivados de patógenos
Lipoproteínas, lipopeptídeos, peptideoglicanos e ácido
lipoteicoico.
TLR2 e TLR6
Extracelular
Ácido lipoteicoico de bactérias gram-positivas e zimosan.
TLR3
Intracelular
Fita dupla do RNA viral.
TLR4
Extracelular
Lipopolissacarídeo da parede celular de bactérias gramnegativas, proteína F de alguns vírus e oligossacarídeos
do ácido hialurônico e o fibrinogênio.
TLR5
Extracelular
Flagelina de algumas bactérias gram-positivas e
negativas.
TLR7 e TLR8
Intracelular
RNA viral de fita simples.
TLR9
Intracelular
DNA bacteriano e viral.
38 Figura 7: Sinalização celular via TLR - Os receptores Toll-Like funcionam como receptores de
reconhecimento padrão (PRR), responsáveis pelo reconhecimento dos padrões moleculares
associados a patógenos (PAMP). O dímero TLR1-TLR2 reconhece os PAMP de bactérias grampositivas, incluindo lipoproteínas, lipopeptídeos, peptideoglicanos e o ácido lipoteicoico. A associação
TLR2-TLR6 é responsável pelo reconhecimento do ácido lipoteicoico da parede de bactérias grampositivas e do zimosan (polissacarídeo derivado de fungos). O dímero TLR4-TLR4 reconhece o
lipopolissacarídeo da parede celular de bactérias gram-negativas, a proteína F de alguns vírus e
outros constituintes do hospedeiro como os oligossacarídeos do ácido hialurônico e o fibrinogênio. O
dímero TLR7-TLR8 é responsável pelo reconhecimento do RNA viral de fita simples. TLR2 reconhece
o glicosilfosfatidilinositol de alguns parasitas. TLR3 liga-se à fita dupla do RNA viral. O TLR5
reconhece a flagelina de algumas bactérias gram-positivas e negativas. O TLR9 é responsável pelo
reconhecimento do DNA bacteriano e viral.
Adaptado de: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Receptor+Toll-Like+9&lang=3
39 A estrutura básica de um vírus consiste em ácidos nucleicos (DNA ou RNA),
um capsídeo e, em alguns casos, um envelope. Estas estruturas compõem os
PAMP reconhecidos pelas células através de seus PRR e esta interação PAMP-PRR
pode ocorrer em várias fases do ciclo viral. Alguns TLR de membrana celular podem
reconhecer partículas virais extracelulares, ao interagir com glicoproteínas do
envelope, e após infectar uma célula, dentro do endossomo, alguns TLR
reconhecem ácidos nucléicos virais (THOMPSON & LOCARNINI, 2007).
Os TLR1-9 estão presentes tanto em seres humanos quanto em
camundongos. O TLR10 parece ser funcional apenas em humanos e os TLR11, 12 e
13 estão presentes apenas em camundongos. Os TLR1, 2, 4, 5 e 6 estão presentes
na membrana plasmática enquanto que os TLR 3, 7, 8, 9 e 10 estão nos
endossomos. Em seres humanos, pelo menos seis dos TLR estão envolvidos com o
reconhecimento de componentes virais sendo eles os TLR2, 4, 3, 7, 8 e 9. Sendo
que, TLR3 reconhece RNA de cadeia dupla (dsRNA), TRL 7 e 8 atuam no
reconhecimento de RNA viral de fita simples e TLR9 é responsável pelo
reconhecimento de regiões CpG de DNA viral não metilado. Os TLR2 e 4 parecem
estar envolvidos no reconhecimento de produtos de glicoproteínas virais
(THOMPSON & LOCARNINI, 2007).
A ligação PAMP-TLR ativa várias cascatas de sinalização, que ativam fatores
de transcrição que levam a produção de citocinas pró-inflamatórias, que darão início
ao desenvolvimento de respostas específicas. Com exceção do TLR3, uma via
intracelular, mediada pela proteína adaptadora MyD88, é comum a todos os TLR e é
descrita como ativadora da secreção de citocinas (YAMAMOTO; et al, 2004).
Todos os TLR apresentam uma região intracelular C-terminal conhecida como
Toll/interleukin-1 receptor (TIR). Logo após a ligação de um PPR específico ao seu
TLR correspondente, o TLR se dimeriza e sofre mudanças conformacionais que
angariam moléculas adaptadoras que apresentam um domínio TIR. As principais
moléculas são MyD88 (myeloid differentiation factor 88), TIRAP/MAL (TIRassociated protein MyD88 adaptor-like), TRIF (TIR-domain-containing adaptor
protein-inducing IFNβ) e TRAM (TRIF-related adaptor molecule) (AKIRA & TAKEDA,
2004).
O TLR3 reconhece principalmente RNA viral de dupla fita e ativa uma via
independente de MyD88, utilizando uma via alternativa que envolve a proteína
adaptadora TRIF. Após se ligar a um dsRNA, o TLR3 irá transmitir sinais através do
domínio TIR. Assim, a proteína TRIF é recrutada como molécula adaptadora e ativa
40 um complexo formado pelas subunidades (NAP1, IKKε, TBK1 e TRAF3). Este
complexo promove a fosforilação de diferentes fatores reguladores de IFN como
IRF3, NF-kB, e AP-1, que são translocados para o interior do núcleo induzindo a
expressão de genes de IFN do tipo I, principalmente IFNβ, além de citocinas,
quimiocinas e a multiplicação e maturação de células dendríticas (YAMAMOTO; et
al, 2004; ALEXOPOULOU; et al, 2001; MATSUMOTO & SEYA, 2008).
Alguns vírus possuem seu genoma composto de RNA de fita dupla (dsRNA) e
muitos vírus apresentam este tipo de ácido nucleico como um intermediário no
processo de replicação, isto faz com que os dsRNA sejam um frequente PAMP viral,
tornando o TLR3 um importante PRR no reconhecimento dos vírus (THOMPSON &
LOCARNINI, 2007).
A estimulação do receptor tipo Toll 4 (TLR4) ocorre através de sua interação
com o lipopolissacarídeo (LPS) que, por sua vez, induz a liberação de citocinas próinflamatórias. Este receptor ao reconhecer o padrão molecular de LPS virais inicia
uma cascata de sinalização em células apresentadoras de antígeno, que pode ser
desencadeada tanto por uma via dependente de MyD88, que resulta na ativação de
NF-kB e na expressão de genes de resposta inflamatória, quanto por uma via
independente de MyD88 e responsável por ativar os fatores IRF3 e IRF7,
culminando na síntese de IFN envolvidos na resposta antiviral (LU; et al, 2008).
Os receptores TLR7, TLR8 e TLR9 utilizam a via MyD88 para induzir a
expressão de citocinas pró-inflamatórias e IFN I. Após o reconhecimento do ácido
nucleico, a molécula MyD88 forma um complexo de sinalização com a IRAK1,
IRAK4, TRAF6, TRAF3, IKKα e um precursor de osteopontina (OPN). O complexo
MyD88-IRAK4-TRAF6 ativa NF-kB e a proteína de ativação 1 (AP-1). E, além disso,
o recrutamento de IRAK1, TRAF3, IKKα e OPN permite que os receptores TLR7, 8 e
9 ativem IRF7, que se transloca para o núcleo para regular a expressão de genes,
especialmente IFNI. É notável a importância destes receptores, visto que, em
humanos sabe-se que os receptores TLR7, TLR9 e IRF7 são fortemente expressos
pelas células dendríticas plasmocitóides (PDC), um subconjunto de células
dendríticas capazes de secretar grandes quantidades de IFN tipo-I em resposta à
infecção viral (THOMPSON & LOCARNINI, 2007).
Os TLR7 e TLR8 (TLR7/8) são receptores que apresentam grande homologia,
sendo ambos capazes de reconhecer RNA fita simples (ssRNA). Alguns estudos
demonstraram que o receptor TLR7 é ativado principalmente em camundongos e
TLR8 em humanos. TLR7 e TLR8 são PRR intracelulares, que se localizam no
41 endossomo (THOMPSON; LOCARNINI, 2007). É possível o reconhecimento de
ssRNA endógenos por estes receptores, porém o hospedeiro se protege desta
resposta através de um mecanismo de compartimentalização da expressão do
receptor. Além disso, os ssRNA são normalmente sujeitos a degradação por
RNAses extracelulares quando liberados no meio extracelular e assim raramente
atingem o endossomo (THOMPSON & LOCARNINI, 2007).
O Receptor tipo toll 9, é um receptor envolvido no reconhecimento de regiões
CpG não metilados presente no DNA. Esta região não metilada é rara em
vertebrados, mas comum em microrganismos como bactérias e vírus de DNA. Assim
como TLR7, TLR9 também é bastante expresso em células dendríticas
plasmocitóides, sendo importante na resposta contra vírus com genoma rico em
regiões CpG como, por exemplo, o Herpes simplex virus - 1 (HSV - 1) (THOMPSON
& LOCARNINI, 2007).
Outro grupo de PRR, envolvidos no reconhecimento de PAMP virais são os
Receptores tipo RIG ou receptores RIG-I-like (RLR). Estes receptores são helicases
de RNA citoplasmáticos no qual estão incluídos três grupos: RIG-I, Mda5 e LGP-2.
Diferente dos TLR os RLR não estão ligados à membrana, eles se localizam no
citoplasma e agem como detectores de replicação viral (KAWAI & AKIRA, 2008).
Assim como os TLR antivirais, os RLR são capazes de reconhecer ácidos
nucleicos virais e dessa forma, ativar certos fatores reguladores de interferon (IRF).
Por conseguinte, RLR específicos podem desencadear um subconjunto das
respostas similares a TLR, e provavelmente atuam coordenadamente nestas
circunstâncias (CREAGH; et al, 2006).
O RNA dupla fita é um intermediário comum gerado durante o ciclo de
replicação de muitos vírus de RNA e estes receptores podem reconhecer diferentes
formas de dsRNA, e consequentemente diferentes vírus de RNA. RIG-I e Mda5
detectam replicação viral através da interação direta com o dsRNA, presente no
genoma de vírus de RNA ou presente como uma parte do ciclo de replicação de
alguns vírus, quando ativados estes receptores induzem vias que se convergem na
ativação de NF-kB, MAPK e IRF induzindo a produção de IFN tipo I e citocinas pró
inflamatórias (CREAGH; et al, 2006; THOMPSON & LOCARNINI, 2007; KAWAI &
AKIRA, 2008).
Embora a LGP-2 também seja uma helicase, ela não é capaz de se ligar ao
dsRNA, porém alguns estudos indicam que esta proteína funciona como um
42 regulador das respostas desenvolvidas por RIG-I e Mda5, dependendo do tipo de
vírus de RNA infectante (KAWAI & AKIRA, 2008).
Estas duas famílias de PRR (TLR e RLR) são os principais sensores de
agentes virais no processo de resposta inata, sendo responsáveis por modular
respostas inflamatórias que resultam na produção de IFN do tipo I e citocinas próinflamatórias que atuam na eliminação do vírus. Entender a interação de agentes
patogênicos com o sistema imune permite o entendimento de como funciona o
sistema imunológico inato e adaptativo e esse conhecimento pode permitir o
desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem limitar a replicação viral e
eliminar infecções virais (THOMPSON & LOCARNINI, 2007).
43 5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Desenho metodológico
Figura 8: Esquema metodológico – Representação das principais etapas envolvidos no
projeto
44 5.2 Amostras de vírus
5.2.1 Origem
O APEUV (BeAn848 clone 5) e o Vesicular stomatitis virus (VSV) foram
gentilmente cedidos pelo Dr. Paulo César Peregrino Ferreira, do Laboratório de
Vírus, Departamento de Microbiologia localizado no Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). As amostras foram levadas para
o Centro de Pesquisas René Rachou e foram mantidas em freezer -80°C até o
momento do uso.
5.2.2 Produção de estoques virais e mock
Todos os procedimentos descritos a seguir foram feitos utilizando material
estéril e em capela de fluxo laminar. Em garrafas de cultura de poliestireno T-75
(Sarstedt) com área 75 cm², pescoço inclinado, tampa de ventilação, estéreis e
isentas de pirógenos foram previamente cultivadas células de linhagem Vero,
utilizando meio de cultura DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco®) e as
incubando a 37°C, atmosfera umidificada com 5% de CO2, até que atingissem
confluência de 90%. Em seguida, o meio presente nas garrafas foi descartado, e foi
adicionada solução tampão fosfato-salino - PBS (phosphate buffered saline),
homogeneizando e descartando, para eliminar os resíduos do meio de cultura
anterior. Foram adicionados, separadamente, em diferentes garrafas de cultura, os
vírus APEUV e VSV. Para adsorção dos vírus, foi utilizado uma multiplicidade de
infecção (m.o.i.) igual a 0,1 em 2 mL de meio DMEM (Gibco®) e em seguida, as
células foram incubadas a 37°C, atmosfera umidificada com 5% de CO2, realizando
homogeneização em intervalos regulares de 10 minutos, durante um período de 1
hora. Completado este intervalo, foram adicionados 17 mL de DMEM (Gibco®)
suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco®) e 1% de PSA - AntibióticoAntimicótico (Gibco®), tendo ao final um volume de 20 mL. As garrafas foram
incubadas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2, observando-as diariamente até
ocorrer à presença de efeito citopático. Este processo ocorreu em 72 horas para o
APEUV e em 24 horas para o VSV. Após esse período, o sobrenadante foi
transferido de cada garrafa para um tubo de polipropileno, fundo cônico e
capacidade de 50 mL (Sarstedt), centrifugando-os em centrifuga 5810R, Rotor A-445 62, por um período de 15 minutos a 1800 x g e temperatura de 4°C. O sobrenadante
contendo os vírus foi transferido para microtubos de 1,5 mL e estes congelados a
uma temperatura de -80ºC, para posterior titulação e uso (Figura 9).
Paralelamente aos vírus, foram preparados os controles de sobrenadante de
cultura de células Vero não infectadas (mock), para os dois tipos de vírus
multiplicados. Os controles mock dos dois vírus multiplicados (APEUV e VSV) foram
tratados da mesma forma que as células infectadas com os vírus, porém sem a
infecção com as amostras virais (Figura 9).
Figura 9: Fluxograma do preparo das amostras de vírus e do controle mock – O esquema
evidencia as principais etapas para o preparo das amostras de vírus e do mock. Para o preparo do
vírus, células Vero previamente cultivadas são infectadas com o vírus e incubadas pelo período
necessário para presença do efeito citopático e em seguida a amostra é centrifugada para obtenção
do sobrenadante de cultura onde está presente o vírus. O mock consiste em células que passam por
todas as etapas descritas para o preparo do vírus, porém, estas amostras não são infectadas com o
vírus.
5.2.3 Titulação Viral por TCDI 50 (Tissue Culture Infectious Doses 50%)
Para determinar a quantidade de vírus obtida no processo de multiplicação do
vírus, foi utilizado o método de diluição limite (end-point-dilution), este método
consiste na inoculação de sucessivas diluições crescentes de uma suspensão viral,
em células susceptíveis, e dessa forma é identificada a diluição em que é possível
detectar o efeito citopático em 50% das culturas inoculadas (TCID 50).
46 A titulação das diferentes partidas de vírus APEUV (vírus multiplicado e vírus
cedido pela UFMG) pelo método TCID 50 foi feita em placa de 96 poços, fundo
chato e estéril (Linbro®), onde foram adicionados por poço, 2 x 105 células Vero e
100 µL de meio DMEM (Gibco®) suplementado com 5% de soro fetal bovino
(Gibco®) e 1% de PSA - Antibiótico-Antimicótico (Gibco®). Em seguida, a placa foi
incubada em estufa a 37°C e atmosfera com 5% de CO2, até que as células
atingissem uma confluência de 90% (1 dia). As duas amostras de vírus foram
diluídas através de diluição seriada, nos fatores de diluição de 10-1 a 10-11. A diluição
seriada foi feita utilizando uma placa de 96 poços de fundo chato e estéril (Linbro®),
chamada de placa espelho. Nesta placa, os poços receberam 180 µL de meio
DMEM (Gibco®). Em seguida, foi adicionado ao primeiro poço uma quantidade igual
a 20 µL de solução viral. A partir deste poço foram retirados e transferidos 20 µL de
solução viral já diluída para o poço seguinte. Este procedimento foi feito até que
atingisse a diluição de 10-11. As diluições foram feitas em quadriplicatas para as duas
amostras de vírus.
Da placa contendo células Vero com confluência de 90%, foi retirado o meio
de cultura e adicionado 100µL de novo meio de cultura DMEM (Gibco®)
suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco®) e 1% de PSA - AntibióticoAntimicótico (Gibco®). Foram adicionados aos seus respectivos poços 100 µL das
diluições virais feitas na placa espelho. A quatro poços foram adicionados 100 µL de
solução viral sem diluição (controle viral – CV) e a quatro poços 100 µL de meio de
cultura DMEM (controle de células – CC). O esquema da placa está representado
abaixo (Figura 10). Todos os procedimentos foram feitos mantendo as mostras de
vírus em banho de gelo.
A titulação do vírus VSV foi realizada da mesma forma que a descrita para o
vírus APEUV, porém a diluição utilizada na titulação iniciou-se na diluição de 10-4
uma vez que este vírus atinge títulos de valores elevados.
47 Figura 10: Esquema da placa de titulação – Titulação de vírus realizada em placa de 96 poços,
onde na primeira coluna foram adicionadas aos oito poços, as amostras de vírus em uma diluição
igual a 10-1, na segunda coluna uma diluição igual a 10-2 e assim sucessivamente, até a coluna 11
onde foi adicionada a diluição de 10-11. Na coluna 12, foram adicionados aos poços de A até D, o
controle de células, onde células Vero receberam apenas meio de cultura, e nos poços de E até H o
controle de vírus, onde células Vero foram tratadas com o vírus sem nenhum tipo de diluição.
Após o preparo, a placa foi incubada em estufa úmida a 37°C e atmosfera
com 5% de CO2, e observada diariamente até verificar presença de efeito citopático.
A placa ficou incubada por aproximadamente 3 dias, e após este intervalo, a placa
foi avaliada através de microscopia óptica para anotação dos poços em que houve
ou não efeito citopático. Para confirmar a presença de efeito, a placa foi corada com
cristal violeta.
Os títulos dos vírus foram então determinados utilizando o cálculo Reed &
Münch endpoint calculation method conforme descrito por Reed & Münch (1938). Os
valores obtidos com a titulação do APEUV clone 5 cedido pelo laboratório de vírus
da UFMG, foram sobrepostos na tabela 3.
Tabela 3: Tabela para cálculo TCID50 para APEUV
48 De acordo com a tabela 3, o logaritmo da primeira diluição que apresentou um
percentual de infecção acima de 50% é -5. Desta forma, encontra-se o valor de
100% para a % positivo acima 50% e 20% para a % abaixo 50%. O resultado da
distância proporcional é de 0,625.
Distância proporcional =
100 - 50 = 50
100 - 20
80
= 0,625
Como o fator de diluição varia de -1 em -1, foi considerado Logaritmo do fator de
diluição = -1, ao calcular o logaritmo na base 10 do título viral encontrou-se o valor 5,625.
Log. do TCID 50 = -5 + (0.625 x -1) = -5,625
TCID 50 = 105,625
Foi ainda aplicado o fator de correção relacionado ao volume e diluição do
vírus: como foram adicionados 100 µL de vírus em 100 µL de meio, totalizando 200
µL (diluição ½) – por isso o log. do título viral foi multiplicado por dois. Como o
cálculo é feito para um volume de 1 mL, o valor foi multiplicado por 5 (200 µL x 5 =
1000 µL ou 1 mL). Logo:
Título viral = 2 x 5 x 105,625 = 10 x 105,625 = 106,625
O título viral encontrado para a amostra de APEUV cedida pelo Laboratório de Vírus
da UFMG é de 106,625 PFU/mL.
Os cálculos de TCID50 para APEUV multiplicado para estoque foram
realizados da mesma forma que os cálculos descritos para titulação do APEUV
clone 5 cedido pelo laboratório de vírus da UFMG. O título viral encontrado para a
amostra de APEUV multiplicado para estoque foi de 107,73 PFU/mL.
Os resultados obtidos com a titulação do vírus VSV cedido pelo Laboratório
de Vírus da UFMG, foram sobrepostos na tabela 4, a placa foi montada a partir da
diluição de 10-4 uma vez que se sabe que este vírus atinge títulos elevados.
49 Tabela 4: Tabela para cálculo TCID50 para VSV
De acordo com a tabela 4, o logaritmo da primeira diluição que apresentou um
percentual de infecção acima de 50% é -8. Desta forma, encontrou-se o valor de
85,71% para a % positivo acima 50% e 14,28% para a % abaixo 50%. O resultado
da distância proporcional é de 0,50.
Distância proporcional =
85,71 - 50
85,71 - 14,28
= 35,71
71,43
= 0,50
Como o fator de diluição varia de -1 em -1, considerou-se o Logaritmo do fator de
diluição = -1, ao calcular o logaritmo na base 10 do título viral encontrou-se o valor 8,5.
Log. do TCID 50 = -8 + (0.5 x -1) = -8,5
TCDI 50 = 108,5
O fator de correção relacionado ao volume e diluição do vírus foi aplicado:
como foram adicionados 100 µL de vírus em 100 µL de meio, totalizando 200 µL
(diluição ½) por isso o log. do título viral foi multiplicado por dois. Como o cálculo foi
feito para um volume de 1 mL, multiplicou-se o valor por 5 (200 µL x 5 = 1000 µL ou
1 mL). Logo:
Título viral = 2 x 5 x 108,5 = 10 x 108,5 = 10 8,5
O título viral encontrado para a amostra de VSV cedida pelo Laboratório de Vírus da
UFMG é de 108,5/mL.
50 5.3 Amostras de células
5.3.1 PBMC
Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram extraídas de
cinco voluntários saudáveis, dos quais foram colhidos aproximadamente 30 mL de
sangue através de punção venosa em tubos a vácuo contendo heparina e
devidamente identificados. Os voluntários assinaram termo de consentimento livre e
esclarecido, previamente aprovado pelo comitê de ética, com número de CAAE:
32379314.0.0000.5091. Estas células foram utilizadas como modelo experimental
para avaliação molecular da resposta imune inata contra APEUV.
Para a extração de PBMC, foi utilizado, a metodologia de separação em
gradiente descontínuo de densidade e o reagente Histopaque® 1077 (Sigma-Aldrich)
e todo procedimento foi feito em capela de fluxo laminar e utilizando material estéril
(Figura 11).
Em tubo para centrifuga de polipropileno, fundo cônico e capacidade de 50
mL (Sarstedt), foram adicionados 8 mL de Histopaque® 1077 a temperatura
ambiente. Foram adicionados 16 mL de sangue sobre o Histopaque® 1077, sem que
ocorresse a mistura do sangue com o reagente. A amostra foi centrifugada em
centrifuga 5810R, Rotor A-4-62 (Eppendorf), durante 40 minutos a 400 x g,
temperatura ambiente. A centrífuga foi programada para desaceleração mínima,
para que não ocorresse perturbação da fase onde se encontram as PBMC durante a
frenagem.
Figura 11: Separação de PBMC por gradiente descontínuo de densidade – O desenho
esquemático da amostra de sangue adicionada ao Histopaque®-1077 antes e após a centrifugação.
Adaptado de http://www.quazoo.com/q/Ficoll
51 Após a centrifugação, a camada no qual se localizavam as PBMC foi retirada
e as células coletadas foram transferidas para novos tubos estéreis para centrífuga
de polipropileno, fundo cônico e capacidade de 50 mL, contendo 5 mL de meio de
cultura MEM Gibco® - Minimum Essential Media (Life Technologies Corporation) a 4
°C. O volume foi completado para 45 mL com meio de cultura MEM a 4 °C e as
amostra foram centrifugadas em centrifuga 5810R, Rotor A-4-62, durante 10 minutos
a 400 x g, a temperatura de 4°C. Descartou-se o meio de cultura obtendo o
precipitado de células formado no fundo do tubo. O precipitado foi suspenso e em
seguida, foram adicionados 30 mL de meio de cultura MEM a 4 °C e as amostras
foram centrifugadas em centrifuga 5810R, Rotor A-4-62, durante 10 minutos a 400 x
g, a temperatura de 4°C. O meio de cultura foi descartado obtendo o precipitado de
células formado no fundo do tubo. O precipitado foi resuspendido, em seguida,
foram adicionados 20 mL de meio Gibco® RPMI 1640 (Life Technologies
Corporation) a 4°C, centrifugando em seguida por 10 minutos a 400 x g, 4°C. Todo o
RPMI foi retirado, ficando apenas o precipitado de células. Foi acrescentado uma
quantidade de RPMI suficiente para resuspender as células em um volume final de 1
mL.
Para fazer a contagem e ajuste do número de células, foi adicionado, em um
microtubo de polipropileno com capacidade de 0,6 mL (Eppendorf), 190 µL de azul
de Turcks, e em seguida 10 µL da suspensão celular, obtendo uma diluição de 1:20.
10 µL desta solução foram transferidos para uma câmara de Neubauer e
aguardando 2 minutos para que todas as células se precipitassem, logo após, foi
realizado a contagem de células em microscópio óptico, contando os quatro
quadrantes presentes na extremidade da câmara.
Para obter a quantidade de células presentes nas amostras, foi realizado o
seguinte cálculo. O valor total encontrado na contagem dos quatro quadrantes,
dividido pelo número de quadrantes contados e multiplicado pelo fator de diluição
(20), volume final 103 e pelo fator de correção da câmara (101):
N° de células/mL = N° de células contadas x 103 x 101 x 20
N° e quadrantes contatos
Este procedimento foi feito com todas as amostras.
52 5.3.2 Células A549 e Vero
As linhagens celulares Vero (ATCC ® CCL-81™)
e A549 (ATCC® CCL-
185™) foram cedidas pelo Dr. Paulo Peregrino do laboratório de Vírus, ICB/UFMG.
A linhagem celular Vero foi utilizada para os processos de multiplicação e titulação
viral. Esta linhagem de células foi iniciada a partir de células renais de macaco verde
africano (Cercopithecus aethiops) adulto normal em 1962, por Y. Yasumura e Y.
Kawakita na Universidade Chiba no Japão. Este tipo de célula não secreta IFN do
tipo I (SHEETS, 2000) e, portanto, é adequado para procedimentos onde se
pretende isolar amostras virais, já que o principal mecanismo de resposta imune
contra infecções por vírus está bloqueado, permitindo assim a obtenção de
partículas de vírus viáveis (EMENY; MORGAN, 1979).
As células A549 foram utilizadas como modelo experimental de células
humanas para avaliação molecular da resposta imune inata frente à infecção por
APEUV. Esta linhagem foi iniciada em 1972, por Giard e colaboradores, através da
cultura de tecidos de células de carcinoma pulmonar de um indivíduo de sexo
masculino, caucasiano e 58 anos de idade. Estas células apresentam tempo de
duplicação de aproximadamente 22 horas, permitindo sua multiplicação em um curto
período de tempo (GIARD; et al, 1973).
As células A549 e Vero foram descongeladas e mantidas em garrafas de
cultura de poliestireno T-75 (Sarstedt), meio de cultura DMEM (Gibco®)
suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco®) e 1% de PSA - AntibióticoAntimicótico (Gibco®). As células foram repicadas sempre que atingiram confluência
de 90%, sendo transferidas para garrafas novas. Para o repique, o meio de cultura
foi retirado e a garrafa lavada adicionando PBS, homogeneizando e em seguida
descartando o PBS. Adicionou-se 1 mL de solução de tripsina (2,500 g/L)/EDTA
(250 mg/L) (Cultilab), e em seguida a tripsina foi homogeneizada para que formasse
uma película sobre a monocamada celular, e retirou-se o excesso de tripsina. Em
seguida, a garrafa contendo as células e a solução de tripsina foi coloca em estufa
úmida a 37°C e 5% de CO2, por um período de 2 minutos, para que a solução de
tripsina fosse ativada desprendendo as células da monocamada. Observou em
microscópio óptico para verificar se as células haviam se desprendido e as células
foram, então, ressuspendidas em 6 mL de DMEM (Gibco®) suplementado com 5%
de soro fetal bovino (Gibco®) e 1% de PSA - Antibiótico-Antimicótico (Gibco®),
homogeneizando para garantir que as células se separem umas das outras. Em
53 seguida o volume foi distribuído igualmente em três garrafas de cultura de
poliestireno T-75 (Sarstedt), (2 mL em cada garrafa), completando o volume em
seguida para 12 mL com meio DMEM (Gibco®), 5% de soro fetal bovino (Gibco®),
1% de PSA - Antibiótico-Antimicótico (Gibco®). As garrafas foram incubadas em
estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. Todo procedimento foi feito em capela de fluxo
laminar e utilizando material estéril.
Tanto as células A549 quanto as células Vero apresentaram crescimento
adequado para serem utilizadas nos processos de infecção viral. Foram cultivadas
até que as mesmas atingissem confluência de 90% (Figura 15), sendo repicadas e
transferidas para outras garrafas sempre que necessário e mantidas até o final do
projeto.
Figura 12: Cultura de células A549 – Células A549, em confluência de 90%, observadas em
microscópio óptico invertido no aumento de 40 vezes. (FERREIRA, 2015)
5.4 Infecção viral
5.4.1 Infecção de PBMC
Para estimular as PBMC, estas foram separadas em cinco grupos diferentes
feitos em triplicatas, todos contendo 106 células. Cada grupo foi depositado em um
poço de uma placa de 6 poços, fundo chato, estéril (Sarstedt®). Os grupos
consistiram em:
 m.o.i=1 – Células infectadas com um m.o.i. = 1 (proporção de 1 vírion para 1
célula);
54  m.o.i=3 – Células infectadas com um m.o.i. = 3 (proporção de 3 vírion para 1
célula);
 mock – Células em contato com o controle negativo de produção viral mock;
 N.I. – Células que receberam apenas meio de cultura;
 T0 – Células que não passaram pelo tempo de incubação, tiveram seu RNA
extraído antes do processo de infecção.
Inicialmente foram realizados os cálculos para determinar qual o volume de
vírus necessário para infectar as células com as m.o.i. determinadas. Em seguida,
os vírus ou controles de células foram adicionados. As PBMC (1x106 células) foram
incubadas com APEUV com m.o.i.=1; APEUV com m.o.i.=3; com sobrenadante de
cultura de células Vero sem o vírus (mock); e com meio RPMI sem adição de soro
fetal bovino (controle negativo). Todos os grupos tiveram seu volume completado
para 2 mL utilizando meio RPMI médium 1640 (Gibco®) suplementado com 5% de
soro humano, sexo masculino, plasma AB (Sigma®) e 1% de PSA - AntibióticoAntimicótico (Gibco®) e incubadas durante 4 horas, em atmosfera de 5% de CO2, a
37°C. Durante a primeira hora a placa foi homogeneizada de 10 em 10 minutos para
que ocorresse a adsorção dos vírus. Após o período de incubação, as placas foram
centrifugadas em centrifuga 5810R, Rotor A-4-62 (Eppendorf), durante 10 minutos a
350 x g, 4 °C. Após a centrifugação, o meio de cultura foi removido e o precipitado
de células formado foi imediatamente utilizado para extração de RNA total.
5.4.2 Infecção de células A549 com APEUV e VSV nos períodos de 4 e 8 horas
A infecção foi realizada, a partir de células A549 previamente cultivadas em
garrafas de cultura de poliestireno T-75 (Sarstedt), até que as mesmas atingissem
confluência de 90%. O meio de cultura foi retirado das garrafas, descartando-os, e
adicionando em seguida PBS, homogeneizando e descartando-o em seguida. Foram
adicionados 1 mL de solução de tripsina (2,500 g/L), EDTA (250 mg/L) (Cultilab), e
em seguida a tripsina foi homogeneizada para que formasse uma película sobre a
monocamada celular e o excesso de tripsina foi retirado. Em seguida, a garrafa
contendo as células e a solução de tripsina foi coloca em estufa úmida a 37°C e
atmosfera com 5% de CO2, por um período de 2 minutos, para que a solução tripsina
fosse ativada, desprendendo as células da monocamada. As células foram então
ressuspendidas em 5 mL de DMEM (Gibco®) suplementado com 5% de soro fetal
55 bovino (Gibco®) e 1% de PSA - Antibiótico-Antimicótico (Gibco®), homogeneizando
para garantir que as células se separem umas das outras. A suspensão de células
foi transferida para um tubo de polipropileno, fundo cônico e capacidade de 50 mL
(Sarstedt) e, em seguida, foi centrifugado em centrifuga 5810R, Rotor A-4-62
(Eppendorf), durante 10 minutos a 350 x g e uma temperatura de 4°C. O
sobrenadante foi desprezado e o precipitado formado foi resuspendido em 1 mL de
DMEM (Gibco®) suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco®) e 1% de PSA Antibiótico-Antimicótico (Gibco®). A contagem das células foi realizada em
microscópio óptico, utilizando uma câmara de Neubauer e conforme descrito
anteriormente no item 7.3.1. Após determinar a quantidade de células presentes na
suspensão, o cálculo foi realizado para definir o volume de suspensão necessário
para adicionar em cada poço 8 x 105 células. As placas foram preparadas para
infecção das células, adicionando em uma placa de 6 poços, fundo chato, estéril
(Sarstedt®), 2 mL de DMEM (Gibco®) suplementado com 5% de soro fetal bovino
(Gibco®) e 1% de PSA - Antibiótico-Antimicótico (Gibco®) e, em seguida, foi
adicionado o volume de suspensão celular contendo 8 x 105 células. Após este
processo, as placas foram incubadas em atmosfera de 5% de CO2, a 37°C por um
período de 18 horas para que as células pudessem aderir à placa.
Após o período de incubação, o meio de cultura foi retirado, as células foram
lavadas com PBS, adicionando em seguida 2 mL de meio de cultura DMEM (Gibco®)
suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco®) e 1% de PSA - AntibióticoAntimicótico (Gibco®). As placas foram, então, separadas em quatro pares, onde o
primeiro par recebeu APEUV (m.o.i. = 1); o segundo recebeu mock do APEUV; o
terceiro VSV (m.o.i. = 1) e o quarto mock do VSV. Um dos pares de cada grupo foi
incubado por um período de 4 horas e o outro por um período de 8 horas em
atmosfera de 5% de CO2, a 37°C.
5.4.3 Infecção de células A549 com APEUV e VSV no período de 4 horas
As células A549 foram cultivadas em garrafas de cultura de poliestireno T-75
(Sarstedt), até que as mesmas atingissem confluência de 90%. Todas as garrafas
foram cultivadas a partir de um mesmo repique onde se adicionou o mesmo volume
de suspensão celular em todas as garrafas, para que todas atingissem um nível de
confluência de 90% no mesmo período, mantendo uma quantidade de células bem
próximas entre as garrafas. O meio de cultura foi retirado de três garrafas e
56 descartados, em seguida foram adicionados 5 mL de PBS, homogeneizando em
seguida para realizar a lavagem da garrafa retirando os resíduos de meio de cultura,
descartando-os em seguida. Foi adicionado 1 mL de solução de tripsina (2,500
g/L)/EDTA (250 mg/L) (Cultilab), homogeneizando para que formasse uma película
sobre a monocamada celular, o excesso foi retirado e descartado. Em seguida, a
garrafa contendo as células e solução de tripsina foi coloca em estufa úmida a 37°C
e 5% de CO2, por um período de 2 minutos, para que a solução de tripsina seja
ativada desprendendo as células da monocamada. Observou em microscópio óptico
para verificar se as células haviam se desprendido e as células foram, então,
ressuspendidas em 5 mL de DMEM (Gibco®) suplementado com 5% de soro fetal
bovino (Gibco®) e 1% de PSA - Antibiótico-Antimicótico (Gibco®), homogeneizando
para garantir que as células se separem umas das outras. As células, então, foram
contadas para verificar a quantidade média de células presente em cada garrafa. As
garrafas possuíam uma quantidade média de células igual a 7,5 x 106 células.
Foram utilizadas 6 garrafas para realizar a infecção. A primeira garrafa foi
identificada como grupo APEUV (m.o.i.=1) e recebeu APEUV em uma proporção de
1 vírion por célula. O segundo grupo identificado como APEUV mock, recebendo o
sobrenadante de cultura utilizado como controle na produção de APEUV. O terceiro
grupo recebeu o nome de VSV (m.o.i.=1) e recebeu o vírus VSV em um m.o.i. de 1.
O quarto grupo recebeu o mock do VSV e foi nomeado como VSV mock. O quinto
grupo recebeu apenas meio de cultura e foi identificado como não infectado (N.I.).
Após a infecção ou não, as garrafas (APEUV m.o.i.=1, APEUV mock, VSV m.o.i.=1,
VSV mock e N.I.) foram incubadas por um período de 4 horas em atmosfera de 5%
de CO2, a 37°C.
5.5 Extração de RNA
A extração do RNA das células (PBMC ou A549) cultivadas em contato com
os APEUV ou VSV, com o mock, ou cultivadas apenas com meio de cultura (grupo
controle não infectado), bem como o das células T0 (que tiveram o RNA extraído no
momento antes da infecção) foi realizada utilizando TRIzol® Reagent (Life
Technologies Corporation), conforme as recomendações do fabricante.
Para realizar a extração de RNA, a placa de cultura foi centrifugada a 350 x g,
4°C por 5 minutos, em centrífuga 5810R, Rotor A-4-62. Em seguida, foram
descartados os sobrenadantes e resuspendidos os precipitados formados em 100 µL
57 de TRIzol, em seguida, foram transferidos para microtubos de polipropileno com
capacidade de 1,5 mL (Eppendorf) e adicionando em seguida, 900 µL de TRIzol em
cada
amostra,
completando
o
volume
para
1
mL.
As
amostras
foram
homogeneizadas e incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente.
Após esta etapa, foram adicionados 200 µL de clorofórmio e os tubos em
agitados vigorosamente em agitador vórtex por 15 segundos e, em seguida, as
amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 3 minutos. As amostras
foram centrifugadas a uma velocidade de 12.000 x g em microcentrífuga 5415C
(Eppendorf) durante 15 minutos a temperatura ambiente. A fase superior e aquosa
de cada tubo, contendo o RNA total, foi transferida para novos microtubos de
polipropileno com volume de 1,5 mL, evitando a movimentação da interfase para que
não houvesse contaminação do RNA com moléculas presentes na fase inferior.
Foram adicionados 500 µL de isopropanol, homogeneizando em agitador por 15
segundos, e incubando, em seguida, por 10 minutos à temperatura ambiente, para
que o isopropanol permitisse a precipitação do RNA. As amostras foram
centrifugadas em microcentrífuga 5415C a 12.000 x g, por 10 minutos a temperatura
ambiente.
Os sobrenadantes foram descartados e ao precipitado foi adicionado 1 mL de
etanol 75% as amostras foram homogeneizadas em agitador vórtex por 15 segundos
e centrifugadas em seguida, em microcentrífuga 5415C a 7500 x g por 5 minutos. Os
sobrenadantes foram descartados e as amostras incubadas em temperatura
ambiente, em fluxo laminar, e com a tampa aberta por 10 minutos, para que
ocorresse a eliminação de todo etanol. Os precipitados de RNA foram
resuspendidos em 20 L de água livre de RNAse, incubando-os em seguida, em
banho-maria a 60ºC por 10 minutos. O RNA obtido foi dosado em NanoDrop 2000
(Thermo Scientific), e armazenado em freezer a -80 ºC.
5.6 Avaliação da Integridade do RNA
O RNA das amostras obtidas no experimento de Infecção in vitro de células
A549 com APEUV e VSV no período de 4 horas (infecção em garrafas - 7,5 x 106
células) teve sua integridade testada em gel de agarose 1%. 0,3 g de agarose
(Sigma) foi dissolvido em 30 mL de TAE (Tris-acetate-EDTA) 0,5X. A solução foi
aquecida até a completa dissolução da agarose. Após, foram adicionados 1,5 µL de
SYBR® Safe DNA Gel Stain (Life Technologies) à solução, transferindo-a para cuba
58 de eletroforese. Sobre o gel, foi adicionado TAE 0,5X até cobri-lo por completo. À
primeira canaleta do gel foi adicionado o padrão de peso molecular 0.5-10 Kb RNA
Ladder (Invitrogen) e nas canaletas de 2 a 7 foram adicionados o RNA das amostras
APEUV m.o.i.1, APEUV mock, VSV m.o.i.1, VSV mock, N.I. e T0 respectivamente.
As amostras presentes no gel foram então submetidas à eletroforese no
equipamento Mupid-exU Systeme (Advance) em voltagem de 100 V por um período
de 1 hora e em seguida visualizado em transluminador, Safe Imager™ 2.0 Blue Light
Transilluminator (Invitrogen).
5.7 Síntese de cDNA
O cDNA das PBMC, foi sintetizado a partir de 1,0 μg do RNA total. O RNA
extraído foi transcrito reversamente utilizando 200 U/μL da enzima Superscript III
reverse transcriptase (Invitrogen), iniciadores randômicos hexâmeros (Invitrogen) e o
inibidor de RNAse, RNAse out 40 U/μL (Invitrogen), seguindo o protocolo
estabelecido pelo fabricante. As amostras foram incubadas por 5 minutos a 65°C,
seguidos por 1 minuto a 4°C. Foram adicionados: tampão apropriado para a reação
de transcrição reversa contendo 10 mM MgCl2 e 8mM DTT; 40 U de RNAse e 200 U
de transcriptase reversa (Superscript III RT). A reação ocorreu por 50 minutos a
50°C, seguida por 5 minutos a 85°C. Logo após, as amostras foram tratadas com 2
U RNAse H de E. coli por 20 minutos a 37°C. O cDNA foi armazenado a -80ºC.
O RNA extraído das células A549 (8 x 105 células) foi ajustado para uma
quantidade de 70 ng e o RNA extraído das células A549 (7,5 x 106 células) foi
ajustado para utilizar uma quantidade 5 μg na síntese do cDNA. O cDNA foi
sintetizado utilizando SuperScript® VILOTM cDNA Synthesis Kit (Invitrogen) de acordo
com o protocolo estabelecido pelo fabricante. Para cada reação foram adicionados,
4 µL de 5X VILOTM Reaction Mix; 2 µL de 10X SuperScript® Enzyme Mix; 10 µL de
RNA (700 µg) e 4 µL de água destilada livre de DNAse Ultrapure e RNAse
(Invitrogen). Os tubos foram homogeneizados e em seguida as amostras foram
incubadas a 25°C por 10 minutos, 42°C por 60 minutos e 85°C por 5 minutos. Ao
final, as amostras foram armazenadas a -20 °C.
59 5.8 Quantificação da expressão de genes por PCR quantitativa em tempo real.
Para realizar a quantificação da expressão de genes das amostras de PBMC
e de células A549 infectadas com APEUV e VSV nos períodos de 4 e 8 horas
(infecção em placa - 8 x 105 células), foi utilizado o kit de amplificação baseado no
sistema TaqMan®Assays (Applied Biosystems). As reações de qPCR foram
realizadas em triplicatas seguindo os ajustes-padrão do equipamento em um volume
final de 25 uL, otimizadas para o equipamento StepOnePlusTM Real-Time PCR
System (Applied Biosystems), a partir de 50 ng de cDNA obtido do mRNA extraído
de células mononucleares do sangue periférico. Em todas as reações foram
utilizados o gene β-actina como controle endógeno e o corante ROX utilizado como
normalizador de sinal. Para as amostras de PBMC foram feitos ensaios para análise
da expressão dos genes TLR3, TLR7, TLR9, IFNβ e IFNy. Os genes avaliados nas
células A549, foram TLR3, TLR7, TLR9, MyD88, IRF3, IRF5, IRF7, IFN-β, IRAK4,
TRAF3, TRAF6, TICAM1 e JUN.
A análise da expressão de genes por PCR quantitativa em tempo real de
células A549 infectadas com APEUV e VSV nos períodos de 4 e 8 horas (infecção
em garrafa - 7,5 x 106 células) também foram realizadas utilizando kits de
amplificação baseados no sistema TaqMan®Assays (Applied Biosystems) e em
placas customizadas (Figura 13), utilizando 50 ng de cDNA, realizando todas as
reações em triplicatas e seguindo os ajustes-padrão do equipamento em um volume
final de 10 uL, otimizadas para o equipamento StepOnePlusTM Real-Time PCR
System (Applied Biosystems). Em todas as reações foram utilizados os genes
GAPDH, HPRT1, 18S e GUSB como controles endógenos e o corante ROX utilizado
como normalizador de sinal. Foram feitos ensaios para análise da expressão dos
genes IRF9, TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, ROBO-3(RIG-1), IFIH1(MDA-5), IFNα, IFNβ,
IFNy, MyD88, TICAM1.
60 Figura 13: Placa personalizada TaqMan®Assays (Applied Biosystems) – Esquema da placa
personalizada, onde pode ser feita a análise de duas amostras. Cada amostra é colocada em uma
metade da placa, onde é possível fazer a quantificação em triplicada da expressão dos genes IRF9,
TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, ROBO-3(RIG-1), IFIH1(MDA-5), IFNα, IFNβ, IFNy, MyD88, TICAM-1.
5.9 Análise dos dados
Os dados de detecção e quantificação foram coletados e analisados em
software ABI SDS (versão 2.0 - Applied Biosystems), e utilizando o método ∆∆Ct. Foi
utilizado o método estatístico teste t de student com 95% de confiança, não pareado
e assumindo desvios iguais. Os gráficos foram elaborados utilizando o software
GraphPad Prism versão 4.0.
61 6 RESULTADOS
6.1 Titulação Viral
Os resultados obtidos demonstraram que tanto o vírus APEUV quanto o vírus
VSV, apresentaram títulos que permitiam a continuidade do projeto.
6.2 Obtenção de PBMC
As amostras de PBMC extraídas dos cinco voluntários foram extraídas nas
seguintes concentrações.
Amostra 1: 1,13 x 107 células/mL;
Amostra 2: 2,5 x 107 células/mL;
Amostra 3: 1,38 x 107 células/mL;
Amostra 4: 1,4 x 107 células/mL;
Amostra 5: 1,25 x 107 células/mL.
6.3 PBMC infectadas com APEUV
Foram realizados ensaios de qPCR baseados na metodologia TaqMan,
utilizando cDNA obtido a partir de mRNA extraído de um pool de células
mononucleares do sangue periférico (PBMC), oriundas de cinco voluntários
saudáveis. Estas células foram divididas em cinco grupos, sendo eles, células
infectadas com uma m.o.i.=1, um grupo infectado com uma m.o.i.=3, um grupo
controle contendo apenas meio de cultura utilizado na multiplicação viral (mock), um
grupo não infectado, contendo apenas meio de cultura novo (N.I.) e também um
grupo onde as células não passaram por nenhum processo de incubação, ou seja, o
RNA foi imediatamente extraído após a separação das PBMC (T0). Todos os
grupos, com exceção do T0 foram incubados durante 4 horas. Os resultados foram
analisados utilizando o método estatístico ∆∆Ct, e mantendo T0 como referência. Os
grupos N.I. e mock, não apresentaram alterações significativas na expressão dos
genes avaliados. Verificou-se que houve um aumento significativo da expressão de
TLR9, aproximadamente 4 vezes, nos grupos infectados, tanto com m.o.i.=1 quanto
com m.o.i.=3 quando comparados com o T0. A expressão de IFNβ, foi ainda mais
62 elevada nestes grupos, apresentando um aumento de aproximadamente 15 vezes
em relação ao T0. Ao avaliar a expressão dos genes TLR3, TLR7 e IFNy, não foram
verificadas alterações significativas comparando-os com o T0 (Figura 14).
Figura 14: Os níveis de expressão dos genes TLR9 e IFNβ estão aumentados em PBMC
infectadas por APEUV – Observa-se que não ocorreram alterações significativas na expressão
gênica dos grupos não infectados e mock. O gene TLR9 e principalmente o gene IFNβ (4 e 15 vezes,
respectivamente), foram significativamente mais expressos em ambos os grupos infectados (m.o.i.=1
e m.o.i.=3). Não foram observadas alterações significativas na expressão dos genes TLR3, TLR7 e
IFNy.
6.4 Células A549 infectadas com APEUV e VSV nos períodos de 4 e 8 horas
Os resultados descritos referem-se aos ensaios de qPCR baseados na
metodologia TaqMan, utilizando cDNA obtido a partir de mRNA extraído de células
A549 após 4hs ou 8hs da infecção com APEUV ou VSV virus (vírus ssRNA
controle), além de um grupo controle negativo (mock) usado como referência para
avaliar os níveis de expressão (Figura 15).
Ao avaliar os resultados de células A549 infectadas com APEUV, por um
período de 4 horas, comparando-os com os resultados do grupo controle negativo
mock, observou-se que APEUV induziu um aumento de aproximadamente três
vezes na expressão de TLR9. Um aumento discreto na expressão dos genes
TRAF3, IRF3, IRF7 foi verificado. Os genes TLR3, TLR7, MYD88, TICAM1, IRAK4,
IRF5 e JUN, apresentaram uma pequena diminuição na expressão gênica quando
63 comparados com o grupo controle negativo. TRAF6 e IFNβ não mostraram
alterações relevantes nos níveis de expressão.
Após o período de 8 horas de infecção com APEUV apresentou aumento
ainda mais significativo na expressão do mRNA de
TLR9. Além disso, houve
pequeno aumento na expressão dos genes TLR3, TLR7, TRAF3, IRF3, IRF7 e
IFNβ. Os genes MYD88, TICAM1, IRAK4, TRAF6 e JUN, não apresentaram
alterações significativas em suas expressões quando comparados com o grupo
controle negativo. Nesta comparação, o gene IRF5 mostrou pequena redução no
nível de expressão (Figura 15 A).
Os grupos infectados com o vírus controle (VSV), no período de 4 horas
demonstraram aumento de aproximadamente oito vezes na expressão de TLR7 e de
aproximadamente seis vezes de IFNβ, além de um aumento de aproximadamente
duas vezes, na expressão de IRF3 e IRF7. Os genes MYD88, TICAM1, IRAK4 e
JUN apresentaram diminuição da expressão quando comparados com o grupo
mock, sendo que TICAM1 apresentou uma expressão próximo de 0 nesta
comparação. TLR3, TLR 9, TRAF3, TRAF6 e IRF5 apresentaram alterações na
expressão pouco significativas.
No período de 8 horas, quando comparados com o grupo controle negativo, o
grupo infectado com VSV apresentou elevação na expressão dos genes TLR3
(aproximadamente três vezes maior), TLR7 (aproximadamente duas vezes), IRF5
(aproximadamente oito vezes maior) e IFNβ (aproximadamente três vezes maior).
Um discreto aumento no nível de expressão dos genes IRF7 e JUN também foi
observado. Os genes MYD88, TICAM, TRAF3 e IRF3 não apresentaram alterações
importantes e os genes TLR9, IRAK4 e TRAF6 apresentaram uma pequena redução
no nível de expressão quando comparados com o grupo controle (Figura 15 B).
64 Figura 15: Níveis de expressão de genes envolvidos na resposta imune inata humana (células
A549) – Os gráficos representam as alterações nos níveis de expressão, quando comparado o RNA
total extraído de células A549 e quantificado por qPCR, após 4 horas ou 8 horas de infecção com
APEUV (A) ou com o vírus controle VSV (B) com os do grupo controle negativo (mock).
6.5 Infecção de células A549 com APEUV e VSV no período de 4 horas
O RNA extraído das células foi analisado através de eletroforese para verificar
a integridade do mesmo. O RNA mensageiro presente na amostra corresponde a
cerca de 3% do RNA total na amostra, sendo assim sua integridade não pode ser
facilmente confirmada. Porém, O RNA ribossomal, representa cerca de 80% do DNA
total de uma mostra, tornando fácil sua detecção. A maior parte deste RNA é
composta pelas moléculas 18S e 28S (em mamíferos), e uma das formas mais
recorrentes de avaliar a integridade do RNA presente em uma amostra é através da
eletroforese do RNA total para em seguida verificar a presença dos segmentos 18S
65 e 28 S que apresentam, respectivamente, fragmentos de aproximadamente 1,8 Kb e
5 Kb. Quando nítidas, as bandas 18S e 28S são indicativos de que o RNA está
intacto (LIFE TECHNOLOGIES, 2015). Neste caso, é possível ver que o RNA das
amostras analisadas apresentou certo grau de degradação, devido os rastros
presentes no gel, porém grande parte ainda mostrou-se íntegro, uma vez que as
bandas 28S e 18S foram visualizadas no gel, sendo assim o RNA estava viável para
síntese do cDNA (Figura 16).
Figura 16: Avaliação da Integridade do RNA extraído de células A549 infectadas com APEUV e
VSV no período de 4 horas em gel de agarose a 1% – O gel mostra a viabilidade das amostras
para realizar RT-qPCR,
através da visualização da presença dos segmentos 18S e 28S que
apresentam, respectivamente, fragmentos de aproximadamente 1,8 Kb e 5 Kb.
Após a reação de qPCR, os genes utilizados como controle endógenos para a
normalização interna dos dados de expressão dos genes alvo foram submetidos a
uma análise estatística no Software BestKeeper©. Para determinar qual dos quatro
genes testados apresenta melhor resultado para ser utilizado como controle
endógeno, determinando como melhor gene para avaliação, o gene HPRT1 (Figura
17).
Os genes estudados foram então avaliados utilizando o gene HPRT1 como
controle endógeno, e comparando os resultados dos grupos infectados com seus
respectivos mock e mantendo como referência para avaliação da diferença de
expressão o grupo não infectado (N.I.) gerando os resultados observados na figura
66 18. A expressão dos genes IFNy, IFNα e TLR7, foi indeterminada em todos os
grupos analisados.
Figura 17: Seleção do gene constitutivo (housekeeping gene) – Análise da expressão dos genes
constitutivos, para seleção do gene que apresenta expressão mais homogênea dentro dos grupos
analisados.
Figura 18: Nível de expressão dos genes avaliados – Análise da expressão dos genes avaliados
nas amostras infectadas com APEUV em um m.o.i.=1; em contato com o mock do APEUV; infectadas
com o vírus VSV e em contato com o mock do vírus VSV. Todas as amostras forma comparadas com
o grupo não infectado.
67 Em células infectadas com APEUV e em células em contato com o mock
deste vírus, verifica-se um aumento da expressão de TLR3 quando comparados
com o grupo não infectado. Porém, quando comparados o grupo infectado com
APEUV e seu mock, é possível ver que não houve diferenças significativas entre
esses dois grupos. Além disso, pode-se observar uma diminuição em relação a
expressão deste gene em células infectadas com VSV quando comparado com a
expressão em células não infectadas, além de uma diminuição significativa da
expressão deste gene em células infectadas com VSV quando comparado com o
seu mock. O mock do VSV não apresentou variação da expressão de TLR3 quando
comparado com as células não infectadas (Figura 19).
Figura 19: Avaliação da expressão de TLR3 – Expressão do gene TLR3 em células infectadas com
APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão deste gene em
células não infectadas (N.I.).
A avaliação do gene TLR9 evidenciou que em células infectadas com APEUV,
não existem alterações significativas na expressão deste gene quando comparado
com a expressão deste gene em células que estiveram em contato com o mock
deste vírus, porém existe um pequeno aumento (2X) da expressão deste gene no
grupo mock quando comparado com o grupo não infectado. Em células em contato
com o mock do VSV, verificou-se um aumento da expressão de TLR9 quando
comparado com o grupo N.I., e uma diferença significativa na expressão deste gene
quando comparados o grupo infectado com o vírus VSV com um m.o.i.=1 e o grupo
que esteve em contato com o mock (Figura 20).
68 Figura 20: Avaliação da expressão de TLR9 – Expressão do gene TLR9 em células infectadas com
APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão deste gene em
células não infectadas (N.I.).
A expressão do gene IFIH1 (MDA-5), utilizando o grupo N.I. como
comparação, não mostrou alterações em células infectadas com APEUV, porém em
células que receberam o mock, verificou-se um aumento de aproximadamente 4
vezes em relação ao grupo controle. Além disso, comparando o grupo infectado com
seu mock, observou-se que o mock apresenta um aumento significativo na
expressão do gene IFIH1 em relação ao grupo infectado. No grupo infectado com
VSV e em seu respectivo mock, não foram observadas alterações significativas na
expressão do gene IFIH1 (Figura 21).
69 Figura 21: Avaliação da expressão de IFIH1 (MDA-5) – Expressão do gene MDA-5 em células
infectadas com APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão
deste gene em células não infectadas (N.I.).
O gene ROBO3 (RIG-1), não apresentou mudanças em sua expressão, em
células infectadas com APEUV, porém, células que receberam o controle mock do
APEUV, mostraram um pequeno aumento da expressão, quando comparados com
células não infectadas. Além disso, entre o grupo infectado com APEUV e o grupo
que recebeu apenas o mock, verificou-se uma diferença significativa na expressão
deste gene, onde células em contato com o mock aumentaram a expressão do
gene. Em células infectas com o vírus VSV e em células que receberam o mock, não
ocorreram alterações consideráveis na expressão deste gene (Figura 22). O gene
MyD88, apresentou-se aumentado em todos os grupos, quando comparados com o
grupo não infectado (Figura 23).
70 Figura 22: Avaliação da expressão de ROBO3 (RIG-1) – Expressão do gene RIG-1 em células
infectadas com APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão
deste gene em células não infectadas (N.I.).
Figura 23: Avaliação da expressão de MyD88 – Expressão do gene MyD88 em células infectadas
com APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão deste gene
em células não infectadas (N.I.).
Para o gene TICAM1, quando os grupos foram comparados com o grupo N.I.,
foi observado alterações na expressão em células infectadas com o APEUV, e
nenhuma alteração na expressão deste gene, nos demais grupos. Comparando
ainda o grupo infectado com APEUV com o grupo mock deste vírus, verificou-se que
ocorreu um aumento significativo na expressão do gene TICAM1 nas células
infectadas (Figura 24).
71 Figura 24: Avaliação da expressão de TICAM1 – Expressão do gene TICAM1 em células
infectadas com APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão
deste gene em células não infectadas (N.I.).
Em células infectadas com o APEUV, observou-se um aumento de
aproximadamente 3 vezes do IRF9 e em células que tiveram contato com o mock
deste vírus, um aumento de aproximadamente 2,5 vezes. Em células infectadas com
o vírus VSV e em contato com o seu mock, não foram observadas alterações na
expressão do gene IRF9 (Figura 25).
Figura 25: Avaliação da expressão de IRF9 – Expressão do gene IRF9 em células infectadas com
APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão deste gene em
células não infectadas (N.I.).
O gene IFNβ (IFNb1), mostrou um aumento em células infectadas tanto com o
APEUV, quanto em células infectas com VSV (6X e 5X respectivamente), quando
comparadas com o grupo não infectado. Células que receberam o mock dos vírus
72 não apresentaram alterações na expressão de IFNβ. Comparando os grupos
infectados com APEUV e VSV com os seus respectivos mock, verifica-se um
aumento significativo na expressão do gene nos grupos infectados (Figura 26).
Figura 26: Avaliação da expressão de IFNb1 (IFNβ) – Expressão do gene IFNβ em células
infectadas com APEUV ou VSV e em seus respectivos controles mock, comparado com a expressão
deste gene em células não infectadas (N.I.).
73 7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
A infecção por arbovírus geralmente acontece através da inoculação do vírus
na pele durante o processo hematofágico feito pelo vetor, no qual o vírus irá infectar
inicialmente células dendríticas, como as células de Langerhans, abundantes na
epiderme. Estas células infectadas migram para linfonodos próximos, permitindo que
o vírus então vá para corrente sanguínea (LE MAY; BOULOY, 2011).
Por se tratar de um arbovírus, a via de infecção do APEUV, ocorre através da
infecção vetorial, ocorrendo no momento da hematofagia. Sendo assim, a maneira
mais correta de avaliar os primeiros passos da resposta imune inata contra este
vírus seria reproduzindo de forma legítima os passos envolvidos no processo
infeccioso. O presente projeto objetivou avaliar esta resposta imunológica em seres
humanos, e até o presente momento não há metodologias que permitem avaliar este
processo tão precoce da infecção em seres humanos. Uma vez que, muito pouco se
sabe sobre a interação desses vírus com o sistema imunológico, gerar dados a
respeito da resposta celular, mesmo que in vitro, é um passo muito importante para
entender os mecanismos envolvidos, tanto na infecção viral, quanto na resposta
imune do hospedeiro contra o vírus. Desta forma, realizar a infecção in vitro de
células mononucleares do sangue periférico e de uma célula de linhagem bem
estabelecida (A549) com o APEUV, pode induzir importantes alterações na
expressão de genes envolvidos na resposta imune inata humana e essas alterações
podem ser detectadas pela técnica de qPCR durante as etapas inicias da infecção,
gerando dados significativos que no futuro, podem contribuir para o entendimento da
infecção por este vírus.
Na fase aguda de uma infecção viral, o controle da multiplicação e
disseminação do vírus é feito principalmente por macrófagos, células NK e IFN tipo I
(IFNα e IFNβ) (CHADHA; 2004). Utilizar PBMC neste estudo permite uma análise
mais próxima do que realmente acontece no organismo após o contato com o vírus,
podendo avaliar a alteração da expressão de genes envolvidos com a resposta
precoce que ocorre nestas células quando em contato com o APEUV.
Para avaliar a expressão gênica em células mononucleares do sangue
periférico após a infecção pelo APEUV por um período de 4 horas. As PBMC foram
divididas em cinco grupos, onde um grupo foi infectado com o vírus alvo do estudo
(APEUV) com um m.o.i.=1 (m.o.i.1); o segundo grupo infectado com um m.o.i.=3
(m.o.i.3), o terceiro grupo foi utilizado como grupo controle e recebeu apenas o
74 sobrenadante de meio de cultura utilizado na multiplicação viral (mock), o quarto,
utilizado também como controle, recebeu apenas o meio de cultura utilizado no
processo da infecção (N.I.) e o quinto grupo, consiste em células que não passaram
por nenhum processo de incubação, ou seja, o RNA foi imediatamente extraído após
a separação das PBMC (T0).
Ao analisar os resultados utilizando o método estatístico ∆∆Ct e mantendo
como valor de referência o T0, foi possível observar que os grupos N.I. e mock, não
sofreram alterações significativas na expressão dos genes avaliados em relação ao
T0. Células infectadas com o vírus tanto em m.o.i.=1 quanto em células infectadas
com
m.o.i.=3,
apresentaram
um
aumento
na
expressão
de
TLR9,
de
aproximadamente 4 vezes.
Sabe-se que TLR9 é um PRR capaz de reconhecer principalmente regiões
CpG não metiladas em moléculas de DNA, muito comuns em algumas bactérias e
em vírus que possuem genoma de DNA, e induzir a expressão de IFN do tipo 1
(BOWIE; HAGA, 2005). Estas informações despertam a atenção para o dado obtido
em relação ao aumento da expressão de TLR9, uma vez que, o APEUV, assim
como os demais vírus da família Bunyaviridae, possuem seu genoma composto por
três segmentos de RNA fita simples. Para vírus de RNA, esperava-se que a célula,
induzisse a expressão de PRR envolvidos com o reconhecimento de vírus de RNA,
ou seja, TLR3 capaz de reconhecer RNA de fita dupla e/ou TLR7 capaz de
reconhecer RNA de fita simples (THOMPSON; LOCARNINI, 2007).
Os receptores de reconhecimento padrão são capazes de identificar
componentes de microrganismos estimulando a síntese e liberação de citocinas próinflamatórias, mas além disso, os TLR reconhecem ainda, além dos PAMP,
moléculas endógenas liberadas em resposta ao estresse ou dano tecidual,
conhecidas como Padrão Molecular Associado ao Perigo (DAMP). O acoplamento
destas moléculas aos TLR irá ativar múltiplas cascatas de sinalização que irão
resultar na indução de genes envolvidos em respostas imunitárias inatas. (AKIRA,
2009; LEE; AVALOS; PLOEGH, 2012; DE MEDEIROS PINHEIRO, 2011; KONDO;
KAWAI; AKIRA, 2012).
Sendo assim, este resultado inicial indica que TLR9 pode estar envolvido com
a resposta antiviral de um vírus de RNA. Mas também é possível que estes dados
tenham relação com a liberação de moléculas próprias das PBMC durante todo o
processo de extração e cultura. Ao retirar as células de seu ambiente natural, uma
série de fatores exógenos, como temperatura, pH, além da própria manipulação das
75 células podem ter causado a morte de algumas células, liberação de moléculas de
DNA no meio extracelular, induzindo o aumento da expressão de TLR9.
A expressão de IFNβ, nos grupos infectados (m.o.i.=1 e m.o.i.=3) foi ainda
mais elevada, apresentando um aumento de aproximadamente 15 vezes em relação
ao T0. De acordo com a literatura, estes dados são concordantes com o esperado,
uma vez que, em geral, após a infecção viral a primeira resposta contra o vírus
consiste em uma reação inflamatória, onde serão secretados mediadores solúveis
tais como citocinas e quimiocinas. Entre estes mediadores, os IFN (principalmente
os IFN I), apresentam grande importância na montagem de uma resposta
imunológica rápida que tem como objetivo bloquear a replicação viral. Os IFN tipo I,
ao interagir com uma célula não infectada, irão de protegê-la contra a infecção viral,
e ainda, colaborar com a resposta imune adaptativa (LE MAY; BOULOY, 2011).
Ao avaliar a expressão dos genes TLR3, TLR7 e IFNy, verifica-se que não
ocorreram alterações significativas comparando-os com o T0. Estes resultados
indicam que os genes TLR9 e IFNβ podem estar relacionados com alterações na
resposta imune humana em fases iniciais da infecção por APEUV.
Para verificar se as alterações ocorridas na expressão dos genes
relacionados com a resposta imune inata em PBMC realmente estavam
relacionadas com a infecção por APEUV, foi feito o segundo experimento que
consiste em utilizar uma linhagem de cultura celular bem estabelecida que não
passasse por tantos processos de manipulação para sua obtenção, reduzindo assim
o estresse sofrido pela célula. Optou-se então em trabalhar com a linhagem celular
A549.
As células A549, apesar de serem originadas de carcinoma, apresentam as
características de células alveolares, sendo capazes de secretar IFN. Estas células
têm sido amplamente utilizadas na avaliação de respostas antivirais, incluindo
estudos feitos com Orthobunyavirus (ARNOLD et al, 1994; BRASIER, 2004;
MOHAMED; MCLEES; ELLIOTT, 2009; VAN KNIPPENBERG; CARLTON-SMITH;
ELLIOTT, 2010). As vantagens de se utilizar estas células neste projeto consistem
no fato de que, além de reduzir a manipulação das células, ao utilizar uma cultura
celular bem estabelecida, garante-se que haja uma redução na variabilidade entre
os diferentes grupos, uma vez que em PBMC, existe uma grande diferença entre os
indivíduos avaliados como, por exemplo, fator nutricional, processos infecciosos,
idade, sexo, população celular diferenciada, entre outros. Estas variações podem
interferir na expressão dos genes estudados. Ao trabalhar com células A549 todas
76 as células apresentam características muito semelhantes umas às outras, uma vez
que são originadas do mesmo clone. Além disso, quando comparadas com as
PBMC, observa-se uma facilidade maior em se obter o número de células,
permitindo reproduzir os experimentos com maior facilidade quando necessário.
Além de utilizar células mais homogêneas, incluiu-se neste experimento um
vírus controle. O vírus da estomatite vesicular (VSV) é um membro da família
Rhabdoviridae, e apresenta genoma de RNA fita simples, não segmentado e de
sentido negativo (FLORES, 2007). É um vírus muito sensível a resposta antiviral
desencadeada pelos IFN do tipo, o que faz com que as células sejam induzidas a
produzir IFN tipo I quando desafiadas com VSV (HUANG; et al, 1993; MULLER; et
al, 1994; TROTTIER; REISS; LYLES, 2007). Por este motivo, o VSV foi utilizado
como vírus controle da indução de IFN.
A fim de verificar os primeiros passos do APEUV na indução da ativação do
sistema imune inato, foram feitos ensaios de qPCR baseados na metodologia
TaqMan, utilizando cDNA obtido a partir de mRNA extraído de células A549 após
4hs ou 8hs da infecção com APEUV ou VSV virus (vírus ssRNA controle), além de
um grupo controle (mock) que foi mantido como referência para as análises.
Verificou-se que o APEUV induziu um aumento da expressão de TLR9,
diferentemente do VSV que aumentou a expressão de TLR7. O vírus controle (VSV)
apresentou resultados dentro do esperado, induzindo o aumento da expressão de
um gene relacionado a um receptor do tipo toll envolvidos com o reconhecimento de
vírus de RNA, o TLR7 capaz de reconhecer RNA de fita simples (THOMPSON;
LOCARNINI, 2007). Porém, o APEUV, que também é um vírus de RNA, induziu o
aumento de TLR9, e como descrito anteriormente, o TLR9 é um receptor capaz de
reconhecer moléculas de DNA e diante uma infecção com um vírus de RNA, como o
APEUV não esperava-se um aumento da expressão deste PRR.
Observa-se também, que após 4 horas de infecção, ocorre a redução da
expressão de TICAM tanto em APEUV quanto em VSV, TICAM I, também chamado
de TRIF, é uma molécula adaptadora, essencial para sinalização independente de
MyD88 mediada pelos receptores TLR3 e 4 (OSHIUMI; et al, 2003; SEYA; et al,
2005). A redução na expressão deste gene provavelmente se deve ao fato de que,
tanto os receptores TLR7 quanto o TLR9, que estão sendo mais expressos diante da
infecção com VSV e APEUV respectivamente, dependem da molécula adaptadora
MyD88 e não de TICAM I, para induzir a expressão de IFN I, sendo assim, é possivel
77 que a expressão da molécula TICAM I não seja necessária neste período da
infecção (THOMPSON; LOCARNINI, 2007).
Os fatores reguladores de interferon (IRF) 3 e 7, desempenham papel
importante na resposta inata antiviral. A ativação destes IRF desencadeia a
expressão de IFNβ (DE LENDONCK; MARTINET; GORIELY, 2014). No período de
4 horas verifica-se um pequeno aumento na expressão de IRF3 e 7, tanto em
células infectadas com APEUV quanto em células infectadas com VSV enquanto
que, no tempo de 8 horas de infecção, verifica-se que estes genes sofrem uma
redução em seu nível de expressão nos dois grupos infectados. Existe a
possibilidade, de este resultado ocorrer, devido à necessidade da expressão destas
moléculas no período de quatro horas, para que haja um aumento da expressão de
IFN, e consequentemente a eliminação do vírus, enquanto que, no período de 8
horas, já foram sintetizadas moléculas IRF3 e 7 suficientes para resposta inata
contra o vírus.
Os dois vírus foram capazes de aumentar a expressão de TLR3 no período
de 8 horas. O TLR3 reconhece principalmente RNA viral dupla fita e ativa uma via
independente de MyD88, utilizando uma via alternativa que envolve a proteína
adaptadora TRIF. A proteína TRIF ativa um complexo de moléculas e este complexo
promove a fosforilação de IRF que são translocados para o interior do núcleo
induzindo a expressão de genes de IFN do tipo I, principalmente IFNβ. O RNA dupla
fita é um intermediário gerado durante o ciclo de replicação do APEUV e VSV
(YAMAMOTO; et al, 2004; ALEXOPOULOU; et al, 2001; MATSUMOTO; SEYA,
2008; CREAGH; et al, 2006; THOMPSON; LOCARNINI, 2007; KAWAI; AKIRA,
2008). É provável que neste período de 8 horas, os vírus já iniciaram o processo de
replicação, induzindo a célula a expressar o gene responsável pelo TLR3.
Observou-se também o aumento de 8 vezes na expressão IRF5 após 8hs da
incubação com VSV. O IRF5 é essencial para a indução de citocinas inflamatórias e
também funciona em conjunto com IRF3 e IRF7 para mediar a produção de IFN tipo
I nas respostas contra infecções virais (REN; CHEN; CHEN, 2014).
Finalmente, é possível observar a indução da expressão do gene IFNβ em
células infectadas com VSV, mas não em células infectadas com APEUV, no tempo
de 4 horas de infecção. No período de 8 horas de infecção, há uma redução, da
expressão de IFNβ
em células infectadas com VSV, mas ainda assim, mais
expresso que no grupo mock. Já em células infectadas com APEUV, percebe-se
78 aumento discreto na expressão de IFNβ, mas baixo quando comparado com o grupo
controle VSV.
O principal mecanismo da resposta imune inata para o controle das infecções
virais ocorre através da secreção dos IFN do tipo I que induz um estado antiviral nas
células para protegê-las contra a infecção (MACHADO et al, 2004). Este resultado
indica que o IFNβ, em células infectadas com APEUV em um período de até 8
horas, ou não está sendo muito expresso, devido a expressão de outro tipo de IFN,
ou ainda não recebeu o estimulo para o aumento de sua expressão.
Comparando o vírus VSV com APEUV, é possível que estes vírus sejam
capazes de reconhecer diferentes gatilhos e vias de sinalização intracelular
conduzindo para a diferenças nas respostas imunitárias e, consequentemente, na
determinação do potencial patogênico dos vírus testado.
Na tentativa de melhorar os resultados obtidos, foi realizada uma busca na
literatura onde se verificou a necessidade de um normalizador que possua grande
eficiência para evitar erros analíticos referentes à quantidade de DNA alvo presente
em cada amostra. Constatou-se então que seria preciso preparar um modelo exato e
competente de normalização.
A eficiência e fidelidade dos resultados obtidos através de técnicas avançadas
de biologia molecular, como a qPCR é um reflexo da normalização adequada dos
dados quantificados. Sendo assim, alguns parâmetros devem ser levados em
consideração, como por exemplo, a utilização da mesma quantidade inicial de
amostra, a padronização da síntese de cDNA, e a escolha do gene de referência e
do modelo matemático para a análise dos dados (THELLIN; et al, 1999).
Genes normalizadores (genes de referência) são genes constitutivos também
chamados de housekeeping, são genes responsáveis por funções essenciais na
manutenção do funcionamento celular. Para que um gene seja utilizado como um
normalizador, deve apresentar expressão constante independente dos estágios de
desenvolvimento, tipos celulares e condições fisiológicas. No entanto, para utilizar
estes genes como referência, é necessária uma validação prévia da estabilidade de
sua expressão, evitando interpretações erradas dos resultados obtidos (PFAFFL; et
al, 2004).
Os genes constitutivos quantificados foram submetidos à análise em Software
BestKeeper© onde foi possível observar que dentre os quatro genes avaliados (18S,
GAPDH, GUSB e HPRT1), o gene HPRT1 foi o gene que manteve sua expressão
79 menos variável, dentro dos grupos avaliados e por esse motivo, foi o escolhido para
ser o gene normalizador.
De acordo com os dados observados na quantificação da expressão de genes
por PCR quantitativa em tempo real de células A549 infectadas nos períodos de 4
horas com APEUV e VSV (Infecção em garrafas - 7,5 x 106 células). Observou-se
que em tanto em células infectadas com APEUV, como em células em contato com
o mock deste vírus, ocorreu um aumento da expressão de TLR3. Como descrito
anteriormente, o TLR3 é um PRR responsável por reconhecer RNA de fita dupla,
sendo assim, é possível que estes dados indiquem que o vírus já tenha infectado a
célula com o período de quatro horas, e que a replicação viral, que gera fitas de
RNA dupla fita, induz a célula a expressar o receptor responsável por reconhecer
esta molécula. Porém, o que se observa é que o mock deste vírus também está
induzindo a expressão deste gene, dificultando a corroboração desta hipótese. Além
disso, este gene não está sendo induzido em células infectadas com VSV, que
também é um vírus de RNA fita simples e que durante a replicação gera um
segmento de RNA fita dupla, e que também deveria induzir a expressão de TLR3.
Sendo assim, é possível que o dado indique que o vírus VSV ainda não tenha dado
início a sua replicação no período de quatro horas, ou seja, o tempo para o início da
replicação do VSV é mais longo que o do APEUV. Outra hipótese provável para este
dado, é que tanto no sobrenadante que continha o APEUV, quanto no mock, existe a
presença de alguma molécula que induz a expressão de TLR3.
É interessante observar que o gene TLR9 também se mostrou mais expresso
em células que receberam o controle mock do que em células infectadas com os
vírus. Este gene reconhece principalmente regiões CpG não metiladas de DNA.
Durante o processo de multiplicação viral, o mock é feito consecutivamente, de
forma que, células Vero, passam por todo processo de manipulação e incubação
pelo qual passaram as células Vero que foram infectas pelo vírus no processo de
multiplicação. As células ficam incubadas por aproximadamente três dias até que
ocorra efeito citopático e o vírus possa ser coletado no sobrenadante de cultura. É
possível que durante este processo, as células não infectadas sofram, não com o
vírus, mas com um estresse causado pela falta de nutrientes e pela própria
manipulação, e que dessa forma, libere uma série de citocinas solúveis no meio
extracelular. Estas citocinas, quando em contato com outras células, como no
presente projeto, onde o a adição do mock pode estar induzindo a transcrição de
genes envolvidos com a resposta imunológica. Além disso, células mortas irão
80 liberar moléculas que, como citado anteriormente, serão reconhecidas pelos PRR
como DAMP e dessa forma irão ativar a expressão de genes da resposta imune
inata.
Além dos genes envolvidos com a expressão dos TLR3 e 9, nota-se que os
genes IFIHI (MDA-5), ROBO3 (RIG-I) e MyD88, ficaram mais expressos no grupo
que recebeu o mock do APEUV. Estes dados reforçam a ideia de que existem
moléculas presente no mock deste vírus que induzem a expressão de genes da
reposta imune inata das células em contato com o mesmo. Esta teoria faz ainda
mais sentido, quando se observa que o APEUV tem um tempo de incubação de 72
horas antes de ser coletado, dessa forma, as células Vero que não recebem o vírus,
ou seja, que terão seu sobrenadante utilizado como mock, passam pelo mesmo
período de incubação, podendo sofrer um estresse que induz a morte celular e
liberação de moléculas no meio de cultura, que mais tarde será recolhido para
compor o mock. O mock do VSV não induz a expressão desses genes, e o motivo
mais provável é que o vírus VSV é recolhido com apenas 24 horas de incubação,
sendo que seu mock também é recolhido dentro do mesmo período, dessa forma, as
células Vero utilizadas no processo de multiplicação do VSV e da obtenção do mock
passam por um tempo de cultura muito menor e consequentemente um estresse
menor, não liberando ou liberando uma quantidade muito pequena de moléculas que
possam ser reconhecidas como DAMP.
Outro dado que reforça essa hipótese é o fato de que, como o título do VSV é
muito mais alto que o do APEUV utilizado para infectar as células (VSV = 108,5
PFU/mL e APEUV = 106,62 PFU/mL), o volume de suspensão viral para infectar as
células com VSV foi menor que o volume utilizado para infectar as células com
APEUV. Como se utilizou o mesmo volume usado da suspensão viral para o seu
respectivo mock, o volume de mock usado para o controle do VSV foi muito menor
que o utilizado para o controle do APEUV, e dessa forma, a quantidade de
moléculas que poderiam ser reconhecidas como DAMP foi muito maior para o
controle do APEUV.
Dados que corroboram com os dados obtidos anteriormente, refere-se ao
aumento da expressão de IFNβ tanto em células infectadas com APEUV, quanto em
células infectadas com VSV, mostrando que no período de quatro horas de infecção,
os vírus induzem uma resposta antiviral nas células onde ocorre a secreção de IFN.
Observa-se ainda que as células que foram incubadas com o mock expressam esse
gene em uma quantidade muito menor, indicando que as moléculas presentes no
81 mock, que induziram a expressão de outros genes, não estão induzindo a expressão
de IFNβ. Além disso, esse dado indica que no tempo de quatro horas já houve o
reconhecimento do vírus e a indução da expressão de IFN tipo I.
O gene TICAM I em APEUV mostrou elevação significativa quando
comparado com o mock deste vírus, indicando que provalvelmente uma via
dependente desta molécula será importante na resposta contra este vírus,
provavelmente a via TLR3, que será induzida pelas moléculas dsRNA produzidas na
replicação do vírus.
Em células infectadas com o APEUV, observou-se um aumento de
aproximadamente 3 vezes do IRF9. O gene IRF9 é um fator regulador de IFN que
medeia à sinalização de IFN tipo I, após a sinalização que ocorre da ligação de IFN
tipo I a receptores celular de superfície. Ou seja, este IRF estimula a expressão de
IFN tipo I em resposta à presença de IFN tipo I no meio extracelular (REICH, 2002).
A expressão desse gene indica que, provavelmente a célula já está secretando IFN I
em resposta a presença do vírus o que induz a expressão do gene IRF9 para
auxiliar na indução de um estado antiviral na célula. Este resultado mostra que o
tempo de 4 horas não é o ideal para avaliar a expressão de genes que são ativados
mais precocemente na resposta imune inata contra o vírus APEUV.
82 8 CONCLUSÃO
Células A549 infectadas com APEUV com um m.o.i.=1 e em um período de
quatro horas tendem a induzir a expressão dos genes IFNβ e TICAM I, importantes
na indução de um estado celular antiviral.
83 9 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao infectar PBMC com o APEUV ocorreram alterações na expressão de
genes envolvidos na resposta imune inicial, e estas alterações foram detectadas
através da metodologia de qPCR. Porém, apesar de representar de forma mais
fidedigna o processo natural de infecção pelo vírus, as PBMC apresentam um
grande número de variáveis, que podem levar a interpretações errôneas a respeito
da resposta imune contra o vírus estudado.
Utilizar uma linhagem celular bem estabelecida permite eliminar um grande
número de variáveis, auxiliando no estudo da resposta imune inicial contra o
APEUV. Sendo necessário também, determinar um gene constitutivo que apresente
expressão constante independente dos estágios de desenvolvimento, tipos celulares
e condições fisiológicas, sendo que, este gene seja previamente validado evitando
interpretações erradas dos resultados obtidos.
No período de 4 horas de infecção em células A549 apresentaram um
aumento da expressão de IRF9, indicando que este é um período onde já houve a
secreção de IFN pela célula. Um estudo de cinética em diferentes tempos, para
verificar a ativação de genes envolvidos com a resposta imune inata é necessário
para verificar quais os melhores tempos para analisar as vias de ativação da
resposta imune inata em células humanas infectadas com este vírus.
O mock utilizado como controle da produção viral, consiste no sobrenadante
de cultura coletado de células idênticas às utilizadas na multiplicação viral, e que
passaram pelo mesmo processo de incubação. Este controle tem como objetivo
detectar alterações que possam ocorrer pela indução de alguma molécula presente
no meio de cultura. Porém, o que ficou evidenciado neste projeto é que, os
estresses sofridos pelas células usadas no preparo do mock, durante o processo de
incubação podem causar a liberação de moléculas que irão induzir a expressão de
genes que participam da resposta inata. Fazendo com que células em contato com o
mock também mostrem alterações na expressão desses genes. Dessa forma, a
melhor maneira para avaliar a expressão de genes da resposta imune inata frente à
infecção por um vírus, seria utilizar o vírus purificado, ou seja, sem meio de cultura,
eliminando a necessidade de um controle do meio utilizado (mock).
Foi possível quantificar, por qPCR, a expressão de genes relacionados à
imunidade inata humana após infecção pelo APEUV. Porém, ainda não foi possível
identificar as vias dos mecanismos que fornecem a primeira linha de defesa contra o
84 vírus. É necessário empregar métodos mais apurados para que seja possível o
conhecimento dos principais mecanismos de resposta imune contra o vírus
estudado, auxiliando assim na compreensão da patogênese das doenças causadas
por este vírus, bem como das diferentes estratégias do hospedeiro e do vírus
envolvidas neste processo.
85 10 PERSPECTIVAS
 Deseja-se obter um número de voluntários maior, para realizar a análise da
expressão de genes envolvidos com a imunidade inata em PBMC infectadas com
APEUV;
 Multiplicar, purificar e titular os APEUV e VSV, eliminando assim a necessidade
do controle mock;
 Realizar a análise da expressão de diferentes genes constitutivos, para seleção
de genes que apresentam expressão homogênea nas células que serão
estudadas determinando o melhor gene housekeeping, para o estudo;
 Pretende-se ainda, realizar um estudo de cinética em diferentes tempos inferiores
há quatro horas, para verificar a ativação de genes envolvidos com a resposta
imune inata, por qPCR, em PBMC e A549 na fase aguda da infecção com o Apeu
virus e utilizando ainda como controle de vírus ssRNA o VSV;
 Identificar as vias dos mecanismos que fornecem a primeira linha de defesa
contra o APEUV em células humanas.
86 11 REFERÊNCIAS
ARNOLD, R.; HUMBERT, B.; WERCHAU H.; GALLATI, H.; KONIG, W. Interleukin-8,
interleukin-6, and soluble tumour necrosis factor receptor type I release from a
human pulmonary epithelial cell line (A549) exposed to respiratory syncytial virus.
Immunology, 1994.82(1):126–133.
BASTOS, M.S., FIGUEIREDO L.T., NAVECA F.G., MONTE R.L., LESSA N., PINTO
DE FIGUEIREDO R.M., GIMAQUE J.B., PIVOTO JOÃO G., RAMASAWMY R.,
MOURÃO M.P. Identification of Oropouche Orthobunyavirus in the cerebrospinal
fluid of three patients in the Amazonas, Brazil. The American Journal of Tropical
Medicine an Hygiene, 2012. 86(4):732-735.
BHAKAT, S.; KARUBIU, W.; JAYAPRAKASH, V.; SOLIMAN, M.E.S. A perspective
on targeting non-structural proteins to combat neglected tropical diseases: Dengue,
West Nile and Chikungunya viruses. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014.
87:677-702.
BOWDEN, T.A., DAVID, B.D.; MCLEES, A.; YEROMONAHOS, C.; ELLIOTT, R.M.
Orthobunyavirus Ultrastructure and the Curious Tripodal Glycoprotein Spike. PLoS
Pathog, 2013. 9(5).
BOWIE, A.G.; HAGA, I.R. The role of Toll-like receptors in the host response to
viruses. Molecular immunology, 2005.42(8):859-867.
BRASIER, A.R.; SPRATT, H.; WU, Z.; BOLDOGH, I.; ZHANG, Y.; GAROFALO, R.P.;
CASOLA, A.; PASHMI, J.; HAAG, A.; LUXON, B.; KUROSKY, A. l. Nuclear heat
shock response and novel nuclear domain 10 reorganization in respiratory syncytial
virus-infected
a549
cells
identified
by
high-resolution
two-dimensional
gel
electrophoresis. Journal of virology, 2004.78(21):11461-11476.
CALISHER, C.H. History, classification, taxonomy of viruses in the family
bunyaviridae. In: The Bunyaviridae. Elliott RM, 1996. New York: Plenum Press, 1–17.
87 CAUSEY, O.R.; CAUSEY, C.E.; MAROJA, O.M.; MACEDO, D.G. The isolation of
arthropod-born viruses including members of two hitherto undescribed serological
groups, in the Amazon Region of Brazil. Am J Trop Med Hyg, 1961. 10:227-249
CHADHA, K.C.; AMBRUS, J.L.J.; DEMBINSKI, W.; AMBRUS, J.L.
IFN and
interferon inhibitory activity in disease and therapy. Exp Biol Med., 2004. 229:285290.
CIOTA, A.T.; KRAMER, L.D. Insights into arbovirus evolution and adaptation from
experimental studies. Viruses, 2010. 2(12):2594-2617.
CLETON, N.; KOOPMANS, M.; REIMERINK, J.; GODEKE, G.J.; REUSKEN, C.
Come fly with me: Review of clinically important arboviruses for global travelers.
Journal of Clinical Virology, 2012. 55(3):191-203.
COFFEY, L.L.; FORRESTER, N.; TSETSARKIN, K.; VASILAKIS, N.; WEAVER, S.C.
Factors shaping the adaptive landscape for arboviruses: implications for the
emergence of disease. Future Microbiology, 2013. 8(2):155-176.
DE BRITO MAGALHÃES, C.L.; DRUMOND, B.P.; NOVAES, R.F.V.; QUINAN, B.R.,
DE MAGALHÃES, J.C.; DOS SANTOS, J.R.; FERREIRA, P.C.P. Identification of a
phylogenetically distinct orthobunyavirus from group C. Archives of virology, 2011.
156(7):1173-1184.
DE LENDONCK, L.Y.; MARTINET, V.; GORIELY, S. Interferon regulatory factor 3 in
adaptive
immune
responses. Cellular
and
molecular
life
sciences,
2014.
71(20):3873-3883.
DOMINGO, E. Mechanisms of viral emergence. Sciences, 2010. 41(6); 38-52.
ELLIOTT, R.M. Orthobunyaviruses: recent genetic and structural insights. Nat Rev
Microbiol., 2014. 12(10):673-685.
88 EMENY, J.M.; MORGAN, M.J. Regulation of the interferon system: evidence that
Vero cells have a genetic defect in interferon production. Journal of General Virology,
1979. 43(1):247-252.
EVERETT, H.; MCFADDEN, G. Apoptosis: an innate immune e response to virus
infection. Trends in microbiology, 1999. 7(4):160-165.
FERRAZ, E.G.; SILVEIRA, B.B.B.; SARMENTO, V.A.; SANTOS J.N. Receptores
Toll-Like: ativação e regulação da resposta imune, RGO, 2011. 59(3):483-490.
FIGUEIREDO, L.T.M. Emergent arboviruses in Brazil. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 2007. 40(2):224-229.
FLORES, EF. Virologia veterinária. Santa Maria: UFSM; 2007. 54-55.
GIARD, D.J.; AARONSON, S.A.; TODARO, G.J.; ARNSTEIN, P.; KERSEY, J.H.;
DOSIK, H.; PARKS, W.P. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell
lines derived from a series of solid tumors. J Natl Cancer Inst., 1973. 51(5):14171423.
GO, Y.Y.; BALASURIYA, U.B.R.; LEE, C.K. Zoonotic encephalitides caused by
arboviruses: transmission and epidemiology of alphaviruses and flaviviruses. Clin
Exp Vaccine Res, 2014. 3(1): 58-77.
GONZALEZ-SCARANO, F.; SOLDAN, S.S. Emerging Infectious diseases: the
Bunyaviridae. Journal of Neurovirology Reviews, 2005.11(5):412-423.
GONZALEZ-SCARANO, F.; NATHANSON, N. Bunyaviridae. In BN Fields, DM Knipe
(eds), Fields Virology. Raven Press, New York, 1996. 1473-1504.
GUBLER, D.J. Dengue and hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev, 1998. 11(3):480496.
GUBLER, D.J. Human arbovirus infections worldwide. Annals of the New York
Academy of Sciences, 2001. 951(1):13-24.
89 GUBLER, D.J. The global emergence/resurgence of arboviral diseases as public
health problems - Reviews. Archives of Medical Research, 2002. 33(4):330-342.
GUIDOTTI, L.G.; CHISARI, F.V. Noncytolytic control of viral infections by the innate
and adaptive immune response. Annual review of immunology, 2001. 19(1):65-91.
HART, T.J.; KOHL, A; ELLIOTT, R.M. Role of the NSs protein in the zoonotic
capacity of Orthobunyaviruses. Zoonoses Public Health, 2009. 56(6-7):285-296.
HUANG, S.; HENDRIKS, W.; ALTHAGE, A.; HEMMI, S.; BLUETHMANN, H.;
KAMIJO, R.; VILCEK, J.; ZINKERNAGEL, R.M.; AGUET, M. Immune response in
mice that lack the interferon-gamma receptor. Science, 1993. 259:1742–1745.
LE MAY, N.; BOULOY, M. Antiviral escape strategies developed by bunyaviruses
pathogenic for humans. Frontiers in bioscience (Scholar edition), 2011. 4:1065-1077.
LIFE TECHNOLOGIES. Assessing RNA Quality. TechNotes 11(1). Acesso em: 03 de
fevereiro
de
2015.
Disponível
em:
http://www.lifetechnologies.com/br/en/home/references/ambion-tech-support/rnaisolation/tech-notes/assessing-rna-quality.html
MACHADO, P.R.L.; ARAÚJO, M.A.S.; CARVALHO, L.; CARVALHO, E.M. Immune
response mechanisms to infections. Anais Brasileiros de Dermatologia, 2004.
79(6):647-662.
MARKLEWITZ, M.; ZIRKEL, F.; RWEGO, I.B.; HEIDEMANN, H.; TRIPPNER, P.;
KURTH, A.; JUNGLEN, S. Discovery of a unique novel clade of mosquito-associated
bunyaviruses. Journal of virology, 2013. 87(23):12850-12865.
MATSUMOTO, M; SEYA, T. TLR3: interferon induction by double-stranded RNA
including poly (I: C). Advanced drug delivery reviews, 2008. 60(7):805-812.
MOHAMED, M.; MCLEES, A.; ELLIOTT, R.M. Viruses in the Anopheles A,
Anopheles B, and Tete serogroups in the Orthobunyavirus genus (family
90 Bunyaviridae) do not encode an NSs protein. Journal of virology, 2009. 83(15):76127618.
MORELAND, N.C.; HEMMER, L.B.; KOHT, A. West Nile virus infection and
postoperative neurological symptoms: a case report and review of the literature.
Journal of Clinical Anesthesia, 2014. 26: 410-413.
MULLER,
U.;
STEINHOFF,
U.;
REIS,
L.F.;
HEMMI,
S.,
PAVLOVIC.
J.;
ZINKERNAGEL, R.M.; AGUET, M. Functional role of type I and type II IFN in antiviral
defense. Science, 1994;264:1918–1921.
NICHOL, S.T.; ARIKAWA, J.; KAWAOKA, Y. Emerging viral diseases. Proc Natl
Acad USA, 2000. 97(23):12411-12412.
NUNES, M.R.; DA ROSA, A.P.T.; WEAVER, S.C.; TESH, R.B.; VASCONCELOS,
P.F. Molecular epidemiology of group C viruses (Bunyaviridae, Orthobunyavirus)
isolated in the Americas. Journal of virology, 2005. 79(16):10561-10570.
OSHIUMI, H.; MATSUMOTO, M.; FUNAMI, K.; AKAZAWA, T.; SEYA, T. TICAM-1,
an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3–mediated interferon-β
induction. Nature immunology, 2003. 4(2):161-167.
PFAFFL, M.W; TICHOPAD, A; PRGOMET, C.; NEUVIANS T.P. Determination of
stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample
integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology
letters, 2004. 26(6):509-515.
REICH, N.C. Review: Nuclear/cytoplasmic localization of IRFs in response to viral
infection or interferon stimulation. Journal of interferon & cytokine research, 2002,
22(1):103-109.
REN, J.; CHEN, X.; CHEN, Z. J. IKKβ is an IRF5 kinase that instigates inflammation.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014. 111(49):17438-17443.
91 REGUERA, J.; WEBER, F.; CUSACK, S. Bunyaviridae RNA polymerases (L-protein)
have an N-terminal, influenza-like endonuclease domain, essential for viral capdependent transcription. PLoS Pathog. 2010.16;6(9):1001101
ROUGERON, V.; SAM, I.C.; CARON, M.; NKOGHE, D.; LEROY, E.; ROQUES, P.
Chikungunya, a paradigm of neglected tropical disease that emerged to be a new
health global risk. J Clin Virol, 2014.1-9.
SALANUEVA,
I.J.;
NOVOA
R.R.;
CABEZAS
P.;
LÓPEZ-IGLESIAS
C.;
CARRASCOSA, J.L.; ELLIOTT R.M.; RISCO C. Polymorphism and structural
maturation of bunyamwera virus in Golgi and post-Golgi compartments. J Virol.
2003.77(2):1368-1381.
SCHMALJOHN, C. S.; NICHOL, S.T. The Bunyaviridae. In Fields Virology, 5th ed.
D.M. Knipe, P.M. Howley (eds.), Wolters Kluwer, Lippincott Williams & Wilkins,
Philadelphia, 2007.1741-1780.
SEYA, T.; OSHIUMI, H.; SASAI M.; AKAZAWA T.; MATSUMOTO M. TICAM-1 and
TICAM-2: toll-like receptor adapters that participate in induction of type 1 IFN. Int J
Biochem Cell Biol., 2005. 37(3):524-529.
SHEETS, R; History and characterization of the Vero cell line. The Vaccines and
Related Biological Products Advisory Committee Meeting. CBER/FDA, 2000.
SHI, X; KOHL, A; LÉONARD, VH; LI, P; MCLEES, A; ELLIOTT, RM. Requirement of
the N-terminal region of orthobunyavirus nonstructural protein NSm for virus
assembly and morphogenesis. J Virol., 2006. 80(16):8089-8099.
SIM, S.; JUPATANAKUL, N.; DIMOPOULOS, G. Mosquito Immunity against
Arboviruses. Viruses, 2014. 6:4479-4504.
SIMMONS, C.P.; FARRAR, J.J.; NGUYEN, V.V.; WILLS, B. Dengue. N Engl J Med,
2012. 366:1423-1432.
92 STEINHAUER, D.A.; HOLLAND, J.J. Rapid evolution of RNA viruses. Ann. Rev.
Microbial., 1987. 41:409-33.
THELLIN O.; ZORZI W.; LAKAYE B.; DE BORMAN B.; COUMANS B.; HENNEN G.;
GRISAR T.; IGOUT A.; HEINEN E. Housekeeping genes as internal standards: use
and limits. Journal of biotechnology, 1999. 75(2):291-295.
THOMPSON, A.J.V.; LOCARNINI, S.A. Toll-like receptors, RIG-I-like RNA helicases
and the antiviral innate immune response. Immunology and cell biology, 2007.
85(6):435-445.
TROTTIER M.D.; LYLES D.S.; REISS C.S. Peripheral, but not central nervous
system, type I interferon expression in mice in response to intranasal vesicular
stomatitis virus infection. J Neurovirol., 2007.13:433–445.
VAN KNIPPENBERG, I.; CARLTON-SMITH, C.; ELLIOTT, R.M. The N-terminus of
Bunyamwera
orthobunyavirus
NSs
protein
is
essential
for
interferon
antagonism. Journal of General Virology, 2010. 91(8):2002-2006.
WALTER, C.T.; BARR, J.N. Recent advances in the molecular and cellular biology of
bunyaviruses. Journal of General Virology, 2011. 92:2467-2484.
WEBER, F.; BRIDGEN, A.; FAZAKERLEY, J.K.; STREITENFELD, H.; KESSLER, N.;
RANDALL, R.E.; ELLIOTT, R.M. Bunyamwera Bunyavirus Nonstructural Protein NSs
Counteracts the Induction of Alpha/Beta Interferon. Journal of Virology, 2002.
76:7949-7955.
WEBER, F.; DUNN E.F.; BRIDGEN, A.; ELLIOTT, R.M. The Bunyamwera virus
nonstructural protein NSs inhibits viral RNA synthesis in a mini-replicon system.
Virology, 2001. 281:67-74.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Dengue and severe dengue. Fact sheet,
2014.117. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs117/en/.
93 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Scientific Group on Arboviruses, and Human
Disease. Arboviruses and Human Diseases: Report of a WHO Scientific Group,
1967. 369.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Scientific Group. Arthropod-borne and rodentborne viral diseases. World Health Organization Tech. Rep. Ser. 1985. 719.
ZHENG, W.; TAO Y.J. Genome encapsidation by orthobunyavirus nucleoproteins.
PNAS, 2013.110(22):8769-8770.
94