faculdade assis gurgacz – fag jussara schafaschek prevalência da

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FACULDADE ASSIS GURGACZ – FAG
JUSSARA SCHAFASCHEK
PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE G EM
AMOSTRAS DE SANGUE EM DOADORES DO SEXO FEMININO DO
MUNICÍPIO DE CASCAVEL – PR.
CASCAVEL – FAG
2009
5
FACULDADE ASSIS GURGACZ – FAG
JUSSARA SCHAFASCHEK
PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE G EM
AMOSTRAS DE SANGUE EM DOADORES DO SEXO FEMININO DO
MUNICÍPIO DE CASCAVEL – PR.
Trabalho apresentado como requisito
para obtenção do titulo de Bacharel do
Curso de Ciências Biológicas
da
Faculdade Assis Gurgacz
FAG Cascavel, PR.
Prof. Orientador:
Coral de Oliveira
CASCAVEL – FAG
2009
Carlos
Eduardo
6
FACULDADE ASSIS GURGACZ
JUSSARA SCHAFASCHEK
PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE G EM AMOSTRAS
DE SANGUE EM DOADORES DO SEXO FEMININO DO MUNICÍPIO DE
CASCAVEL – PR.
Trabalho apresentado à banca avaliadora como requisito para a obtenção do título de bacharel
em Ciências Biológicas da Faculdade Assis Gurgacz, sob a orientação do Professor
Farmacêutico.
BANCA AVALIADORA
____________________________________________
Carlos Eduardo Coral de Oliveira – Prof.° Orientador
Faculdade Assis Gurgacz – FAG
Coordenador do Curso de Farmácia.
_________________________________________________
Kelen Baratela Simm – Professor(a) Avaliador(a)
Faculdade Assis Gurgacz – FAG
Bióloga.
_________________________________________________
Greicy Kiel – Professor(a) Avaliador(a)
Faculdade Assis Gurgacz - FAG
Bióloga.
__________________________________________________
Alexandre Carvalho de Moura – Professor(a) Substituto
Faculdade Assis Gurgacz – FAG
Biólogo.
Cascavel, 15 de junho de 2009.
7
SUMÁRIO
1. RESUMO .................................................................................................................
04
2. ABSTRACT .............................................................................................................
05
3. INTRODUÇÃO ......................................................................................................
06
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................
08
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES...........................................................................
10
6. CONCLUSÃO.........................................................................................................
13
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................
14
8. ANEXOS ...............................................................................................................
16
8.1
Normas de Publicação ..................................................................................
17
8.2
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos....................
19
8
PREVALÊNCIA DA INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE G EM AMOSTRAS DE
SANGUE EM DOADORES DO SEXO FEMININO DO MUNICÍPIO DE CASCAVEL – PR.
PREVALENCE OF THE INFECTION FOR THE VIRUS OF G HEPATITIS IN SAMPLES OF
FEMALE BLOOD DONORS OF THE CITY OF CASCAVEL – PR.
Jussara Schafaschek1; Carlos Eduardo Coral de Oliveira2.
Resumo
O vírus da hepatite G (HGV) pertence à família Flaviviridae, onde também se encontra o vírus
da hepatite C. Sua transmissão ocorre principalmente através da via parenteral, por meio de sangue
contaminado, sendo que a infecção é assintomática e não apresenta sinais de doença crônica ou aguda
que predispõem ao carcinoma hepatocelular. Investigou-se a presença do RNA do HGV em amostras
de sangue periférico de doadores normais, do sexo feminino, onde o RNA-HGV foi detectado por
reação de transcriptase reversa e reação em cadeia da polimerase (PCR). Os resultados foram
observados após corrida eletroforética e coloração por nitrato de prata. Foram analisadas 49 amostras,
entre diferentes idades, variando de 18 a 65 anos, sendo que 29 amostras (59,18%) apresentaram
resultado positivo para RNA-HGV. A elevada prevalência do vírus da hepatite G na população de
doadores ainda permanece sem explicações. Estima-se que 5 a 25% dos doadores da população em
geral apresentam sinais de infecção presente ou passada pelo vírus HGV, sendo que o impacto da
descoberta deste novo agente está ainda sendo investigado.
Palavras-Chave: Hepatite G. Doadores de Sangue. Reação em Cadeia da Polimerase. Via Parenteral.
1
Aluna de Graduação do Curso de Ciências Biológicas-Bacharelado, Faculdade Assis Gurgacz – FAG, Brasil.
Endereço Residencial: Rua Arnaldo Busatto, 730 – Centro, Céu Azul – Paraná. CEP 85840-000.
Telefone: (45) 3266-1657 e (45) 9973-7745 e-mail: [email protected]
2
Mestre em Patologia Experimental, pela Universidade Estadual de Londrina, Brasil (2006); Atuação em
Imunopatologia; Professor da Faculdade Assis Gurgacz – FAG, Brasil.
Endereço: Avenida das Torres, 500 – Cascavel – Paraná. CEP 85800-000.
Telefone: (45) 3321-3998 e-mail: [email protected]
9
Abstract
The hepatitis G virus (HGV) belongs to the family Flaviviridae, which also is the virus of hepatitis C.
Its transmission is mainly through the parenteral route, through contaminated blood, and the infection
is asymptomatic and shows no signs of acute or chronic disease that predispose to hepatocellular
carcinoma. Investigated the presence of HGV RNA in peripheral blood samples from normal donors
were female, where the HGV-RNA was detected by reaction of reverse transcriptase and polymerase
chain reaction (PCR). The race results were observed after electrophoresis and staining by silver
nitrate. We analyzed 49 samples from different ages, ranging from 18 to 65 years, and 29 samples
(59.18%) were positive for HGV-RNA. The high prevalence of hepatitis G virus in the population of
donors is still without explanation. It is estimated that 5 to 25% of donors in the general population
show signs of present or past infection by the virus HGV, and the impact of the discovery of this new
agent is still being investigated.
Keywords: Hepatitis G. Blood donors. Polymerase Chain Reaction. Parenteral route.
10
Introdução
O vírus da hepatite G surgiu pela primeira vez em meados da década de 90, onde pesquisadores
divulgaram a existência de um novo vírus em pacientes com hepatite, o qual aparentemente não
possuía similaridade com os tipos conhecidos até então (STAPLETON et al, 2004). Alguns anos antes,
por volta de 1967, alguns cientistas utilizaram o soro de um paciente doente por hepatite para suas
pesquisas em cobaias de primatas e constataram que o tipo de hepatite prevalente era diferente dos
tipos A-B, conhecidos até o momento (BASSIT et al, 1997). Tratava-se de dois novos vírus,
designados como VGB tipo A (VGB-A) e tipo B (VGB-B), os quais eram incapazes de infectar o
homem. Posteriormente um novo vírus foi identificado, este capaz de infectar o organismo humano e
com características muito semelhantes aos dois tipos já descritos. Para esse vírus deu-se o nome de
VGB tipo C ou VGB-C. Em 1996 os cientistas que designaram a hepatite G isolaram o novo vírus e
compararam aos vírus anteriormente descritos, e constataram que se tratava do mesmo vírus
(NISHUYA et al., 2003).
Os genomas recém descobertos foram analisados e apresentaram homologia em 85 a 90% dos
nucleotídeos, e similaridade de 90% nas seqüências de aminoácidos; tais achados propuseram a idéia
de que se tratavam do mesmo vírus, provavelmente isolados em locais diferentes. A partir disso, o
novo vírus passou a ser chamado de HGV, o vírus da hepatite G (FILHO, 2006).
O vírus da hepatite G assemelha-se ao vírus da hepatite C, porém sem propriedades de hepatite
aguda ou crônica que predispõem ao carcinoma hepatocelular, apenas causa infecção crônica que pode
perdurar por décadas, embora 60 a 70% dos infectados eliminem o vírus e desenvolvam anticorpos
(KONEMAN et al, 2001; STEVENS et al, 2002).
O HGV é um vírus pertencente à família Flaviviridae, onde se encontram também o vírus da
hepatite C, dengue, febre amarela e encefalite japonesa. Sua maquinaria genética é constituída por
RNA de cadeia simples com envelope, polaridade positiva, com aproximadamente 9400 nucleotídeos
e 2900 aminoácidos, onde até o momento apenas 4 genótipos foram descritos (ESTEVENS, 2003).
Segundo o mapeamento genético do vírus HGV, duas glicoproteínas são codificadas no envólucro
viral, as proteínas E1 e E2. Estudos e análises realizados em amostras sangüíneas mostram que a
11
presença do RNA do HGV determina a presença do vírus no organismo do indivíduo; enquanto que a
presença de anticorpos contra as proteínas E1 e E2 presentes no envoltório viral identificam uma
infecção passada. Normalmente o RNA do HGV não se encontra detectável no soro de
indivíduos/amostras que já tiveram contato com o vírus e desencadearam resposta imune. Apenas
possuem anticorpos contra a proteína E1 e E2 do HGV (anti-HGV), concluindo a teoria de que quando
há o anti-HGV a viremia está finalizada (como se fossem neutralizantes). Com o passar dos anos, em
média 11 anos, o anti-HGV pode desaparecer do organismo imunocompetente e em imunodeprimidos,
não deixando vestígios da infecção passada. Sendo assim, o RNA-HGV determina o marcador da
infecção atual, e o anti-HGV um marcador de infecção passada (CHEN et al., 1999).
O vírus é transmitido pelo contato através de sangue contaminado, sendo os pacientes
politransfundidos ou hemofílicos; transmissão vertical (perinatal); contato sexual sem o uso de
preservativos e através do compartilhamento de seringas pelos usuários de drogas intravenosas
(STAPLETON et al, 2004; FILHO, 2006). A infecção pelo vírus da hepatite G tem como célula alvo
os linfócitos B e linfócitos T (CD4 e CD8), ao contrário, o vírus da hepatite C tem como célula alvo os
hepatócitos (LEVINSON, 2005; BORTOLIERO et al., 2006). O presente trabalho investiga a presença
do RNA HGV a partir de amostras de sangue de doadores saudáveis do sexo feminino, bem como
expõe sua prevalência em dados estatísticos.
12
Materiais e Métodos
Amostras Biológicas
As amostras de sangue de doadoras normais foram coletadas com a aprovação do Comitê de
Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade Assis Gurgacz-Cascavel/PR e, autorização do
termo de consentimento livre e esclarecido, estando de acordo com a Resolução 196/96-CNS. Foram
coletados 5mL de sangue periférico com sistema Vacuteiner® (coleta com tubos a vácuo) de cada
participante do projeto com idade entre 18 a 65 anos, nas dependências do Laboratório de Análises
Clínicas da Fag. Após a sedimentação, transferiu-se a papa de leucócitos para tubos cônicos,
acrescentou-se solução lise de hemácias e centrifugou-se por 7 minutos a 3.500 rpm’s.
Extração do RNA – Obtenção de RNA GBV-C
Fez-se a extração total de RNA a partir do plasma, utilizando o reagente TRIzol-LS (GibcoBRL, Grand Island, NY, U.S.A.) de acordo com as instruções do fabricante.
Síntese do DNA complementar (DNAc)
A reação de transcriptase reversa foi realizada a partir de 6µL de RNA de cada amostra e 3µL de
oligonucleotídeos iniciadores antisense (outter) HGV-B, seguindo as condições do GeneAmp RNA
PCR (Perkin Elmer Part number N808-0017), com um ciclo de 42°C durante 60 minutos.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Para a amplificação, utilizou-se 2,5µL de solução tampão 10x; 0,75µL de MgCl² (50mM);
1,5µL de DNTP (10mM); 2,5µL de HBA (2,5µM); 2,5µL de HBB (2,5µM); 10,25µL de H²O
ultrapura e 2,5µL de TacPolimerase, e no termociclador os ciclos consistiram de desnaturação inicial a
13
94ºC por 5 minutos, seguida de 40 ciclos de um minuto respectivamente a 94ºC, a 45ºC e a 72ºC com
extensão final de 10 minutos a 72ºC. Os oligonucleotídeos iniciadores do HGV utilizados para a
amplificação foram direcionados para amplificar uma região conservada na extremidade 5’ (5´UTR)
do
genoma
(outer
sense
5’
GGTAGGTCGTAAATCCCGGT
3’;
outer
antisense
5’
CCCACTGGTCCTTGTCAACT 3’; inner sense 5’ TGGTAGCCACTATAGGTGG 3’; inner
antisense 5’ GCCTATTGGTCAAGAG 3’).
Detecção dos produtos de PCR
O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%, corado por
coloração de nitrato de prata e visualizado.
14
Resultados e Discussões
Neste trabalho detectou-se a presença do RNA-HGV em 59,18% das amostras de doadores
saudáveis, sendo que de um total de 49 amostras, 29 apresentaram positividade para o vírus (Figura 1).
L
101
L 101 102 121 122 103 104 106 110 111 119 127 150 151
B
217pb
Figura 01. Fragmento de 217 pares de base visualizado após eletroforese em gel de
poliacrilamida 10%. L: ladder (marcador de peso molecular); B: branco da reação (controle
negativo).
As amostras foram separadas por faixa etária, como mostra o Gráfico 01.
Gráfico 01. Demonstrativo do número total de amostras coletadas e número de amostras
positivas com sua respectiva taxa percentual.
TOTAL
50
40
30
20
POSITIVOS
PORCENTAGEM
40,82
35
20
9
10
12,24
6
1 1 2,04
3 1 2,04
0 0 0
0 0 0
1 1 2,04
0 0 0
31 - 35
36 - 40
41 - 45
46 - 50
51 - 55
56 - 65
0
18 - 24
25 - 30
Intervalo de Idades
Os dados foram calculados e chegou-se ao valor da média de 24,12 anos e desvio padrão de
7,03.
15
Houve maior incidência do vírus na faixa etária que compreende as idades de 18 a 24 anos
devido ao maior número de amostras em relação às outras faixas etárias.
A incidência da infecção pelo HGV possui dados superiores aos da infecção pelo vírus da
hepatite B (VHB) ou pelo vírus da hepatite C (VHC) (FILHO, 2006). Algumas pesquisas apontam a
prevalência de 9 a 10% em doadores de hemocentros da região Sudeste do Brasil, assim como a cifra
de 1 a 2% nos Estados Unidos e 19% na África. Um dado diz que na Espanha 6% das crianças
saudáveis apresentam sinais da infecção por HGV (FILHO, 2006; NISHUYA et al, 2003). Outras
pesquisas mostram que 5 a 25% dos doadores de sangue da população em geral, apresentam sinais de
infecção presente ou passada pelo vírus HGV (CHEN et al., 1999).
Em locais onde a hepatite B e C apresentam grande incidência, constata-se um percentual de
17% de prevalência pela infecção viral da hepatite G. A nível mundial, a prevalência do HGV em
populações saudáveis é extremamente elevada, variando em 2% na Alemanha e 14,2% no Oeste
Africano. Os níveis da infecção se mostram altos em indivíduos que se submeteram a múltiplas
transfusões sangüíneas, dependentes de drogas intravenosas, histórico apresentando DST’S, portadores
dos vírus B, C, HIV, e descendentes primários de genitores com RNA-HGV. Um outro dado mostra
que essa incidência é de aproximadamente 14 a 38% em pais com RNA-HGV, sendo que destes, 50%
possuem o anti-HGV, o que significa uma infecção passada; os que estão no quadro das DST’S
apresentam 11% de indivíduos com o vírus propriamente dito e 25% vestígios da infecção passada,
embora a maior incidência esteja nos grupos de indivíduos homossexuais e em prostitutas (MORRIS
et al., 2005; ESTEVENS, 2003; NISHUYA et al., 2003).
A elevada prevalência do vírus da hepatite G na população de doadores ainda permanece sem
explicações (AMARANTE et al., 2004). O impacto da descoberta deste novo agente está ainda sendo
investigado (BERNARDINI et al., 1996)
Uma pesquisa realizada no hospital Sírio-Libanês em São Paulo, no período de agosto a
novembro de 1997, mostra que a prevalência da infecção pode estar relacionada com a raça / etnia e
parâmetros educacionais e sociais dos doadores. Esse trabalho contou com o apoio de 545 doadores de
sangue, sendo 380 amostras do sexo masculino e 165 amostras do sexo feminino, com faixa etária
variando entre 18 e 59 anos. Os resultados obtidos sugeriram a hipótese de que indivíduos de raça
16
negra e mulata são mais frequentemente infectados pelo vírus, bem como indivíduos que se encontram
em condições de baixa escolaridade (LEVI, 1997).
Estudos sugerem que a melhor via de transmissão do vírus seja o contato com sangue
contaminado (via parenteral), uma vez que a maioria dos casos associa-se a pacientes
politransfundidos, hemofílicos e hemodialisados (AMARANTE, 2004; STAPLETON, 2004; FILHO,
2006; BERNARDINI et al, 1996). Porém, a transmissão também pode ser observada na via vertical,
de mãe para filho (AMARANTE, 2004), transmissão horizontal e via sexual (PINHO, 1999).
Com relação a outras patologias, segundo AMARANTE, 2004 e STAPLETON, 2004,
indivíduos infectados com HIV apresentaram estabilização ou processo muito lento no
desenvolvimento da doença, devido ao fato do vírus HGV replicar-se nos linfócitos e inibir a
replicação do vírus HIV, resultando na diminuição da mortalidade dos indivíduos que apresentam
quadro de HIV positivo (AMARANTE, 2004; STAPLETON, 2004).
Até o presente momento não há indícios de que a hepatite G influencie consideravelmente em
doenças hepáticas, uma vez que podem ser encontrados indivíduos sadios apresentando positividade
para o RNA-HGV. Mesmo assim, é importante que se instituam medidas de avaliação da prevalência
da infecção por este e outros vírus na população, uma vez que a co-infecção entre este e outros vírus
podem promover efeitos associados benéficos, como na infecção concomitante com HIV, ou efeitos
sinérgicos, como na co-infecção pelo vírus da hepatite B e o HGV.
17
Conclusão
Este trabalho apresentou um índice muito elevado de positividade para o RNA-HGV, ainda mais
se comparado ao pequeno número de amostras que foram coletadas para a pesquisa.
Observa-se que o quadro de indivíduos infectados com o vírus vem aumentado gradativamente
em toda a população, especialmente em pessoas que se submeteram a transfusões sanguíneas, embora
indivíduos sadios também apresentem alta prevalência para o HGV.
Não se sabe ao certo o motivo pelo qual a hepatite G vem sendo disseminada entre doadores de
sangue, mas salienta-se a importância de realizar testes sorológicos para tal agente patógeno em
bancos de sangue e hemocentros, como medida preventiva, a fim de minimizar os índices de
prevalência da infecção pelo vírus HGV, uma vez que estudos ainda não comprovam se os seus efeitos
podem ser benéficos ou sinérgicos a população em geral.
18
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STEVENS, A.; LOWE, J. Patologia. 2.ed. São Paulo: Manole, 2002
20
ANEXOS
Anexo 1:
Normas para publicação revista Semina – Universidade Estadual de Londrina
Anexo 2:
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos
21
Busca
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· Agrárias · Biológicas/Saúde · Sociais/Humanas
Normas Editoriais para Publicação
Apresentação dos Trabalhos
1. Os originais devem ser enviados em disquete (3 ½ ), acompanhado de três có
impressas, com entrelinhamento duplo. O trabalho deverá ser elaborado no editor de texto Micr
Word for Windows, fonte Times New Roman, tamanho 11, normal; com margens de no mínimo
respeitando-se o número de páginas de acordo com a categoria do trabalho e devem
devidamente numeradas.
2. Categorias dos Trabalhos:
a)
artigos
e
revisões
no
máximo
40
pág
b)
comunicações;
divulgações
e
resenhas
no
máximo
20
pág
c) resenhas de livros e revistas no máximo 4 páginas; e
3. Na primeira lauda do original deverá constar o título do trabalho, nome completo do autor princ
minicurrículo, endereço postal, número do telefone e/ou fax e e-mail; categoria do trabalho; áre
publicação
da
Semina
e
classificação
das
áreas/sub-áreas
do
CNPq/CA
3.1. Título do trabalho: o título, acompanhado de sua tradução para o inglês, deve ser bre
suficientemente específico e descritivo, contendo as palavras-chave que representem o conteúd
texto.
3.2. Nome(s) completo(s) do(s) autor(es): Os demais dados como título e/ou credenciais, carg
ocupado(s) pelo(s) autor(es) e local de realização do trabalho deverão constar em nota de rod
3.3. Resumo: deve ser incluído um resumo informativo de aproximadamente 200 palavras,
português, acompanhado de sua tradução para o inglês, digitado com entrelinhamento duplo
segunda
lauda
do
original.
(NBR
6028
da
A
3.4. Agradecimentos: agradecimentos a auxílios recebidos para a elaboração do trabalho deverã
mencionados
no
final
do
ar
3.5. Notas: notas referentes ao corpo do artigo devem ser indicadas com um asterisco
imediatamente depois da frase a que diz respeito. As notas deverão vir no rodapé do t
3.6. Apêndices: apêndices podem ser empregados no caso de listagens extensivas, estatísticas e o
elementos
de
sup
3.7. Materiais gráficos: fotografias nítidas e gráficos (estritamente indispensáveis à clareza do te
poderão ser aceitos e deverão ser assinalados, no texto, pelo seu número de ordem, os locais
devem ser intercalados. Se as ilustrações enviadas já tiverem sido publicadas, mencionar a fonte
permissão
para
reprodu
3.8. Quadros e Tabelas: os quadros e/ou tabelas deverão ser acompanhados de cabeçalho que per
22
compreender o significado dos dados reunidos, sem necessidade de referência ao texto. Assinala
texto, por seu número de ordem, os locais onde os quadros e/ou tabelas devem ser intercala
3.9. As grandezas, unidades e símbolos deverão obedecer às normas nacionais corresponde
(ABNT).
3.10. Citações: deverão seguir o sistema de chamada alfabética (NBR 10520 da AB
3.11. Referências bibliográficas: as referências bibliográficas, redigidas segundo a norma
6023/2000 da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), deverão ser listadas na or
alfabética no final do artigo. A exatidão e adequação das referências a trabalhos que tenham
consultados e mencionados no texto do artigo são da responsabilidade do autor.
4. O autor principal deverá enviar, junto com o original, autorização para publicaçã
trabalho na SEMINA, comprometendo-se a não publicá-lo em outro periódico.
5. A publicação dos trabalhos depende de parecer da Assessoria Científica "Ad hoc" da
Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UEL.
6. Após impressa a revista, o autor principal receberá gratuitamente um (1) exempla
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