ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO EM MODELO ANIMAL

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO
EM MODELO ANIMAL DE COLITE INDUZIDA
POR DEXTRAN SULFATO DE SÓDIO
CARLOS ROBERTO DAMIANI
CRICIÚMA – SANTA CATARINAC
2006
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO
EM MODELO ANIMAL DE COLITE INDUZIDA
POR DEXTRAN SULFATO DE SÓDIO
CARLOS ROBERTO DAMIANI
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul
Catarinense para obtenção do Título de Mestre em
Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck
Co-orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol
CRICIÚMA – SANTA CATARINA
2006
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ESTRESSE OXIDATIVO E METABOLISMO
EM MODELO ANIMAL DE COLITE INDUZIDA
POR DEXTRAN SULFATO DE SÓDIO
Carlos Roberto Damiani
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul
Catarinense para obtenção do Título de Mestre em
Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Emílio Luiz Streck
Co-orientador:
Prof.
Dr.
CRICIÚMA – SANTA CATARINA
2006
Felipe
Dal
Pizzol
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4
À Tânia, minha amada esposa, que com extrema dedicação e infinita
compreensão, soube me incentivar e auxiliar nas horas em que os tentáculos do
desânimo pairavam sobre meus ombros.
Ao Rafael e Rodrigo, filhos queridos, que souberam entender o significado de um
projeto de pesquisa, inclusive com auxílio prático em determinadas ocasiões, e
que em momento algum cobraram minha constante ausência, embora fisicamente
presente, absorto nos estudos que me encontrava.
5
“Nenhum empreendimento lhe pareceu indigno de seu esforço. Em todos, levou
como única tocha seu ideal. Teria preferido morrer de sede a se saciar no
manancial da rotina”.
“O sábio busca a Verdade por buscá-la e se satisfaz, arrancando à natureza
segredos inúteis ou perigosos. O artista também busca a sua, porque a Beleza é
uma Verdade animada pela imaginação, mais que pela experiência. O moralista a
persegue no Bem, que é uma justa lealdade da conduta para consigo mesmo e
para com os outros. Ter um ideal é servir à sua própria Verdade. Sempre”
José Ingenieros, in O Homem Medíocre
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Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Emílio, pela sabedoria, força e beleza dedicados à
orientação deste trabalho.
Ao meu co-orientador, Prof. Felipe, pela objetividade e tranqüilidade
transmitidas durante o curso.
Ao César e Cristhopher, bolsistas do Laboratório de Bioquímica
Experimental, pela dedicação e competência desprendidas no desenvolvimento
deste projeto.
Ao Vilson, colega de curso, responsável pelo biotério, e sobretudo amigo de
infindáveis horas de estudo e trabalho madrugada a dentro.
À Silvana, coordenadora do Curso de Medicina da UNESC, que oportunizou
minha entrada no mundo acadêmico.
A todos os colegas do Curso de Mestrado em Ciências da Saúde, que com
companheirismo e afinidade faziam as horas de aulas teóricas tornarem-se
segundos de satisfação.
A todos os colegas do Laboratório, que souberam compreender minhas
eventuais ausências em virtude de motivos profissionais.
À Mônica, secretária do Mestrado em Ciências da Saúde, que com
simpatia, zelo e competência, resolvia de imediato todos os problemas à ela
dirigidos.
A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde.
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À Universidade do Extremo Sul Catarinense que possibilitou a realização
deste projeto de pesquisa.
A meus alunos do Curso de Graduação em Medicina, que mesmo sem
perceberem, são orientadores.
Aos meus preceptores dos idos tempos de Residência Médica, Nilo Cerato
e Valério Garcia, que semearam o germe da pesquisa no meu ser.
A meus Pais, pela oportunidade de vida, tudo mais é mera conseqüência.
À minha esposa, pelo apoio irrestrito em toda atividade que gera
enriquecimento da alma.
A meus filhos, por todas as horas de felicidade que me proporcionaram na
vida.
Ao Grande Arquiteto do Universo que tornou tudo isto possível.
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RESUMO
A
colite
ulcerativa
é
uma
doença
inflamatória
crônica
do
trato
gastrointestinal. A sua etiologia ainda é pouco conhecida, mas parece resultar de
uma resposta imune e inflamatória exacerbada, com infiltração de leucócitos
fagocitários na mucosa intestinal. A produção e liberação de espécies reativas de
oxigênio pelos fagócitos desempenham um papel importante na fisiopatologia da
colite ulcerativa. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da N-acetilcisteína
e da deferoxamina no tratamento da colite induzida por dextran sulfato de sódio,
através da medida de parâmetros de estresse oxidativo, função mitocondrial e
avaliação visual micro e macroscópica tecidual em cólon de ratos. Além disso, foi
realizada a avaliação da resposta imune e inflamatória, através da contagem de
leucócitos. Os resultados demonstraram que o dextran sulfato de sódio aumentou
a contagem de leucócitos em 300% em relação ao controle,
e que a N-
acetilcisteína e a deferoxamina não preveniram esse efeito. No entanto, os
animais tratados com dextran sulfato de sódio apresentaram aumento de 80% da
atividade do complexo IV da cadeia respiratória
e a N-acetilcisteína e a
deferoxamina preveniram essa alteração. Além disso, a medida de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico, um marcador de lipoperoxidação, estão
aumentadas em 40% no cólon de ratos tratados com dextran sulfato de sódio. Nacetilcisteína e deferoxamina, quando usadas em conjunto, preveniram o efeito. A
atividade do complexo II da cadeia respiratória e da succinato desidrogenase,
além do dano oxidativo a proteínas, não foram alteradas pelo dextran sulfato de
sódio. Especula-se que o uso de N-acetilcisteína e deferoxamina no tratamento da
colite possa ser importante. No entanto, mais estudos são necessários para
esclarecer esses efeitos.
Palavras-chave: Colite ulcerativa. Estresse oxidativo. Antioxidantes. Dextran
sulfato de sódio.
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ABSTRACT
Ulcerative colitis is a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal
tract. Its etiology remains unclear, but it appears to result from a dysregulated
immune response, with infiltration of phagocytic leukocytes into the mucosal
interstitium. The production and release of reactive oxygen species by immune
cells seems to play a crucial role in phisiopathology of colitis. The aim of this work
was to evaluate the effects of N-acetylcysteine and deferoxamine in the treatment
of colitis induced by dextran sulfate sodium by measuring intestinal parameters of
oxidative stress and mitochondrial function, inflammatory response and bowel
histopathological alterations. The results show that dextran sulfate sodium
increased white blood cells count in 300 percent in relation to the control and that
N-acetylcysteine and deferoxamine did not prevent this effect. However, dextran
sulfate sodium increased 80 percent of the activity of mitochondrial respiratory
chain complex IV in colon of rats and N-acetylcysteine and deferoxamine
prevented this alteration. Besides, thiobarbituric acid reactive substances were
increased in 40 percent in the colon of dextran sulfate sodium -treated rats. Nacetylcysteine and deferoxamine, when taken together, prevented this effect.
Complex II and succinate dehydrogenase were not affected by dextran sulfate
sodium, as protein carbonyl content. We speculate that N-acetylcysteine and
deferoxamine might be used for treatment of colitis, but further research is
necessary to clarify these effects.
Key words: Ulcerative colitis. Oxidative stress. Antioxidants. Dextran sulfate
sodium
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LISTA DE ABREVIATURAS
5-ASA – ácido 5-aminosalicílico
Acetil-CoA – acetil coenzima A
ADP – adenosina difosfato
ATP – adenosina trifosfato
CAT – catalase
DFX – deferoxamina
DII – doença inflamatória intestinal
DNA – ácido desoxirribonucléico
ERN – espécies reativas de nitrogênio
ERO – espécies reativas de oxigênio
FADH2 – flavina adenina dinucleotídeo
GPX – glutationa peroxidase
GSH – glutationa reduzida
GTP – guanosina trifosfato
LPO – lipoperoxidação
NAC – N-acetilcisteína
NADH – nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
SDH – succinato desidrogenase
SOD – superóxido dismutase
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cadeia respiratória mitocondrial............................................................ 22
12
SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO ................................................................................................... 13
1 - Doença Inflamatória Intestinal ..................................................................... 13
1.1 – Conceitos Fundamentais......................................................................... 13
1.2 – Epidemiologia ........................................................................................... 13
1.3 - Apresentação Clínica................................................................................ 14
1.4 - Diagnóstico Diferencial ............................................................................ 16
1.5 – Fisiopatologia ........................................................................................... 16
1.6 - Tratamento Clínico.................................................................................... 20
2 - METABOLISMO E CADEIA RESPIRATÓRIA ............................................... 23
3 - RADICAIS LIVRES E ESTRESSE OXIDATIVO............................................. 28
3.1 - Radicais Livres .......................................................................................... 28
3.2 - Defesas Antioxidantes.............................................................................. 30
3.3 - Estresse Oxidativo .................................................................................... 32
3.4 - Colite e Estresse Oxidativo ...................................................................... 33
3.5 - N-acetilcisteína .......................................................................................... 35
3.6 – Deferoxamina............................................................................................ 36
4 – OBJETIVOS................................................................................................... 37
4.1 Geral .............................................................................................................. 37
4.2 Especificos ................................................................................................... 37
II RESULTADOS.................................................................................................. 38
1. Artigo: Oxidative stress and metabolism in animal model of colitis induced
by dextran sulfate sodium ................................................................................. 38
III DISCUSSÃO .................................................................................................... 60
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 60
6 CONCLUSÕES ................................................................................................. 65
7 PERSPECTIVAS............................................................................................... 66
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 67
13
I – INTRODUÇÃO
1. DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL
1.1 Conceitos Fundamentais
As doenças inflamatórias intestinais (DII) compreendem um amplo
espectro de afecções causadas por inflamação crônica do trato gastrintestinal,
podendo ter ou não uma causa ou agente patogênico específico. O termo DII nãoespecífica refere-se àquelas que não possuem uma etiologia conhecida. Incluídas
nesta classificação estão a colite ulcerativa, que envolve exclusivamente o cólon e
reto e é caracterizada por infiltrado leucocitário na mucosa e ulceração epitelial.
Outra forma importante de DII é a doença de Crohn, que pode afetar qualquer
segmento do trato digestivo e é caracterizada por um processo inflamatório
transmural freqüentemente granulomatoso (Ahn et al.; 2001; Podolski, 1991;
Strober, 1998). Acredita-se que a primeira descrição da colite ulcerativa tenha sido
feita por Samuel Wilks em 1859 (Corman, 2005).
1.2. Epidemiologia
A colite ulcerativa afeta ambos os sexos e ocorre em todas as idades,
com um pico de ocorrência entre a segunda e quarta décadas, e um segundo pico
de ocorrência na sexta década de vida (Corman, 2005; Mazier, 1995).
14
Até o presente momento, o entendimento da epidemiologia dos
pacientes com colite ulcerativa é limitado. Pequeno é o conhecimento sobre a
distribuição e menor ainda sobre a natureza da doença. Estudos sobre a colite
ulcerativa são difíceis, provavelmente por que casos leves podem ser
negligenciados (Gordon, 1992), bem como em locais onde as diarréias infecciosas
são muito prevalentes pode ocorrer uma superestimativa da doença. Existe ainda
a dificuldade de diferenciar a colite ulcerativa da doença de Crohn, podendo
passar anos de evolução até o diagnóstico definitivo (Keighley, 1998). A incidência
das DII sofre diferenças geográficas e étnicas, sendo mais comum em brancos e
população originária do norte da Europa, e um pouco menos comum na América
do Sul, União Soviética e Japão. Assim como o câncer de cólon, indivíduos de
baixo risco para a doença, quando emigram para regiões de maior prevalência da
doença, passam a apresentar um risco aumentado de desenvolver a doença,
sugerindo o envolvimento de fatores ambientais (Corman, 2005). De uma maneira
geral, pode-se considerar uma incidência aproximada de 10 casos para 100.000
habitantes para a colite ulcerativa (Seril et al., 2003) e 3 casos para cada 100.000
habitantes para a doença de Crohn (Cotran et al., 2000).
1.3. Apresentação Clínica
A colite ulcerativa geralmente apresenta-se pela primeira vez como um
ataque agudo ou uma recaída em um paciente com uma história passada de um
episódio de diarréia sanguínea. A diarréia na colite ulcerativa usualmente associase com exsudação de soro, secreção de muco e perda de sangue da mucosa
15
inflamada. Perturbações graves da homeostasia hídrica podem ocorrer na colite
aguda. As perdas diárias do cólon inflamado variam de 100 a 1500 mL de líquido,
10 a 100 mmol de sódio e 20 a 50 mmol de potássio. Além disso, a terapia
esteróide pode aumentar a perda de potássio.
A apresentação clínica da doença é composta de ataques intermitentes
de sangramento retal, diarréia, eliminação de muco, dor abdominal e perda de
peso. A doença tem gravidade e curso clínico variáveis; geralmente os ataques
começam na segunda à quarta década de vida, porém qualquer idade pode ser
afetada. Em 60 a 70% dos casos há ausência completa dos sintomas entre os
ataques, mas a doença recidiva com freqüência variável. Ocasionalmente, são
vistos pacientes assintomáticos que possuem alterações à endoscopia colorretal.
Os pacientes com DII podem apresentar anemia leve que passa despercebida
clinicamente até quadro de dispnéia decorrentes da baixa taxa de hemoglobina.
Existem eventualmente manifestações extra-intestinais, tais como:
doença hepática (icterícia, colangite, hepatomegalia, coagulopatia), artrite
(grandes articulações), lesões oculares (irite, episclerite, ceratite, blefarite, retinite,
neurite retrobulbar), manifestações cutâneas (eritema nodoso, piodermite
gangrenosa, ulceração aftóide), doença renal (pielonefrite, nefrolitíase) e
amiloidose secundária.
Não raro, os pacientes portadores de DII são levados à cirurgia de
urgência devido a complicações como perfuração intestinal, hemorragia,
megacólon tóxico ou eletivamente como alternativa à falha do tratamento clínico
ou como prevenção do câncer colorretal. Pacientes portadores de DII têm um risco
aumentado de desenvolvimento de câncer colorretal, principalmente na doença de
16
longa
duração,
comprometimento
anatômico
extenso
e
presença
de
manifestações extra-intestinais (Itzkowitz e Yio, 2004).
1.4. Diagnóstico Diferencial
Na condução clínica das DII, além da colite ulcerativa e doença de
Crohn, outros diagnósticos diferenciais se impõem, tais como: colite isquêmica,
colite infecciosa, colite desfuncionalizante (conseqüência de ostomia prévia), colite
actínica, colite eosinofílica e colite de colágeno (Keighley, 1998).
1.5. Fisiopatologia
Dentro do processo fisiopatológico da colite ulcerativa, sabe-se que a
diarréia sanguinolenta é conseqüência da destruição tecidual resultante da
infiltração leucocitária na mucosa colônica e superprodução de mediadores próinflamatórios, como citocinas e metabólitos do ácido araquidônico (Lobos et al.,
1987; Pravda, 2005; Sartor, 1991; Volwinker et al., 2004; Yavuz et al., 1999). No
entanto, o gatilho inicial neste processo permanece desconhecido. Inúmeros
fatores têm sido apontados como desencadeantes das DII, em especial a colite
ulcerativa.
Fatores microbiológicos envolvidos na gênese da colite ulcerativa,
através de estudos virais e bacteriológicos, mostraram algumas diferenças em
relação à população normal. No entanto, ainda está pouco claro se esses fatores
são causa ou conseqüência da doença. Alterações em número, atividade ou
17
distribuição da microflora colônica também são vistos em pacientes portadores de
colite ulcerativa. Estudos genéticos mostraram associação entre colite ulcerativa e
antígenos do complexo maior de histocompatibilidade classe II (Pravda, 2005).
Embora a colite ulcerativa e a doença de Crohn não serem desordens genéticas
clássicas, a ocorrência de DII em membros de uma mesma família que vivem em
áreas distantes e a incidência aumentada entre judeus, além da tendência de
agregação familiar de casos com espondilite anquilosante na doença de Crohn,
sugerem um mecanismo geneticamente mediado na causa destas condições.
Vinte e nove por cento daqueles com colite ulcerativa e 35% daqueles com
doença de Crohn têm uma história familiar positiva para DII. O primeiro lócus de
suscetilibilidade para DII foi encontrado no cromossomo 16 e identificado como
IBD1 (Corman, 2005). Estudos imunológicos encontraram a presença de
anticorpos anti-células endoteliais e anti-citoplasma neutrofílico em pacientes com
colite ulcerativa.
Fatores dietéticos, especialmente leite de vaca, têm sido implicados
como uma possível causa do desenvolvimento de DII. Estudos recentes têm
mostrado um elevado nível de anticorpo anti-proteína do leite em pacientes com
colite ulcerativa. No entanto, outros estudos falharam em mostrar qualquer
relação. Outros fatores que têm sido investigados incluem aditivos químicos
alimentares, ingesta de mercúrio, quantidade inadequada de fibras e excesso de
açúcar refinado. Atualmente não existe um consenso sugerindo fatores
alimentares como desenvolvedores de um papel na etiologia tanto da colite
ulcerativa quanto da doença de Crohn (Corman, 2005).
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Curiosamente, o fumo tem um papel protetor na colite ulcerativa. Em
alguns casos, a remissão completa dos sintomas foi obtida através do uso de
goma de mascar com nicotina, e em outros casos houve exacerbação da doença
quando os pacientes cessaram o fumo. Inversamente, a doença de Crohn é mais
comum em fumantes do que naqueles que nunca fumaram. Da mesma forma
existem estudos mostrando que apendicectomia está associada inversamente
com o desenvolvimento de colite ulcerativa, sugerindo algum papel na imunidade
da mucosa (Corman, 2005; Pravda, 2005). Outros fatores, como o uso de
contraceptivos orais sugerindo uma possível base isquêmica, estão em estudo.
Fatores psicológicos envolvidos no desencadeamento ou exacerbação da colite
ulcerativa apresentam resultados conflitantes, onde alguns estudos mostram uma
alta incidência de esquizofrenia em pacientes portadores de colite ulcerativa, e
outros estudos não demonstram qualquer relação com a gênese da doença
(Corman, 2005).
Evidências recentes sugerem que o metabolismo oxidativo anormal
pode ter uma significância grande na atividade da DII. Atenção aumentada tem
sido dada ao papel dos radicais livres no metabolismo normal e defesa contra
doenças. Aparentemente, os metabólitos reativos de oxigênio são produzidos em
excesso na DII em atividade (Carrier et al., 2002; Poussios et al., 2003; Reifen et
al., 2004; Yavuz et al., 1999). Os efeitos de anti-inflamatórios antioxidantes
específicos, como os aminosalicilatos, são compatíveis com a proposição que
radicais livres têm um papel importante na patogênese das DII (Pravda, 2005;
Seril et al., 2003).
19
Considerando-se que o interior do cólon é um dos locais, ou o local
mais contaminado do planeta, é surpreendente imaginar o sistema de defesa que
deve possuir, sendo que a função de barreira colônica, separando o lúmem
intestinal de suas células estéreis, com muco formado por glicoproteínas, é o
principal meio pelo qual a mucosa colônica é preservada do ataque antigênico e,
como veremos mais adiante, está diretamente envolvida na etiopatogenia das DII
(Pravda, 2005; Seril et al.,2003).
Como comentado anteriormente, a sintomatologia clínica da colite
ulcerativa é decorrente da infiltração neutrofílica no epitélio colônico. Esta
infiltração leucocitária é devido à ruptura da barreira colônica com conseqüente
invasão bacteriana e estímulo antigênico. Ocorre liberação de mediadores
inflamatórios, como algumas citocinas e metabólitos do ácido araquidônico (Lobos
et al., 1987; Sartor, 1991; Vowinkel et al., 2004), bem como liberação de radicais
livres de oxigênio, o que poderia levar ao dano oxidativo, realimentando o ciclo
patogênico (Fiocchi, 1997; Fiocchi et al., 1994; Grisham e Yamada, 1992).
Os metabólitos do ácido araquidônico têm grande influência na função
intestinal e na reação inflamatória. O ácido araquidônico é liberado por
fosfolipases e metabolizado pela via da cicloxigenase para prostaglandinas e
tromboxanos, e também pela via da lipoxigenase, produzindo leucotrienos, que
são mediadores do processo inflamatório (Rampton e Hawkey, 1984). Pacientes
com DII em atividade apresentam uma resposta exagerada a estímulo externo
para produção de prostaglandinas (Riddell, 1985; Rubio et al., 1984).
20
1.6 – Tratamento clínico
Até os dias atuais não existe uma terapia clínica definitiva para colite
ulcerativa; os fármacos em uso visam produzir e manter estados de remissão da
doença, porém sem curá-las. Ao se instituir o tratamento clínico da doença,
levamos em consideração a severidade da doença (Corman, 2005).
Há muitos anos os fármacos mais utilizados para o tratamento da colite
ulcerativa leve e moderada são os aminosalicilatos, em especial a sulfassalazina.
Inicialmente acreditava-se que a melhora do quadro era devido ao efeito
antibiótico da mesma; hoje se sabe que existe uma atividade farmacológica
múltipla (inibição da síntese de prostaglandinas, inibição de enzimas proteolíticas
e imunossupressão); é utilizada na dose de 2 a 4 g por dia. Possui como efeitos
colaterais: “rash” cutâneo, depressão da medula óssea, náuseas, cefaléia,
hemólise em pacientes com deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase,
anorexia, deficiência de ácido fólico, hepatite, pancreatite, pneumonite, eosinofilia,
alveolite fibrosante, colite e anormalidades nos espermatozóides, podendo levar à
infertilidade masculina. Esses efeitos podem ser dose-dependentes ou devido à
reação idiossincrásica. A fração ativa mais importante da sulfassalazina é o ácido
5-aminosalicílico (5-ASA), sendo efetiva para tratamento e manutenção da
remissão (Corman, 2005; Dallegri et al, 1990; Miyachi et al., 1987; Pearson et al.,
1996).
Na colite ulcerativa moderada à severa, ou nos casos que não
respondem aos aminosalicilatos, empregam-se os corticosteróides, geralmente
numa dose diária inicial de 20 mg de prednisona. A budenosida é um
21
glicocorticóide que possui menos efeitos colaterais sistêmicos, porém o custo é
maior.
Para
terapia
de
manutenção
não
é
recomendado
o
uso
dos
corticosteróides, que podem ser utilizados também na forma de enemas para a
colite distal (colite esquerda). Os efeitos tóxicos dos corticosteróides dependem da
dose e duração do tratamento e incluem o mascaramento de abdomem agudo,
doenças metabólicas ósseas e retardo no crescimento em crianças (Corman,
2005).
Os imunomoduladores (azatioprina, mercaptopurina, ciclosporina) são
fármacos aceitos como apropriados para o manejo por longo tempo em pacientes
com DII. Seu uso racional é baseado na observação de mecanismos imunes
envolvidos na patogênese da doença. O tempo necessário para o medicamento
tornar-se efetivo é em torno de três meses, o que os contra-indicam para o
tratamento agudo. A ciclosporina é mais potente e
tem início de ação mais
imediato, porém com mais efeitos colaterais (disfunção renal, neurotoxicidade e
infecções oportunistas), sendo reservada para o tratamento da doença severa,
refratária e com contra-indicações para tratamento cirúrgico (Corman, 2005).
Mais recentemente, o uso de agente anti-fator de necrose tumoral
(TNF- ), tem demonstrado efetividade em casos de doença de Crohn em
pacientes corticóide-dependente ou pacientes intratáveis, bem como aqueles com
fístulas crônicas. O TNF-
está associado com injúria tecidual associada à
endotoxemia, estimula o crescimento de fibroblastos humanos, ativa neutrófilos e
osteoclastos, e é responsável pela indução de interleucina-1 e prostaglandina E2
(Corman, 2005; Wallace, 1992).
22
Outros agentes e medidas utilizadas na condução clínica das DII
incluem enema de sucralfato, enema de butirato, probióticos, nicotina, agentes
antidiarréicos, medidas dietéticas e psicoterapia (Corman, 2005).
23
2 – METABOLISMO E CADEIA RESPIRATÓRIA
Hans Krebs propôs, em 1937, uma série de reações do metabolismo
intermediário de carboidratos. Atualmente, o ciclo proposto por Krebs leva o seu
nome. Há aproximadamente meio século, Kennedy e Lehninger descobriram que
as mitocôndrias contêm as enzimas do ciclo de Krebs e as enzimas de oxidação
dos ácidos graxos, além dos complexos respiratórios. Alguns anos depois, Palade
e Sjöstrand, através da microscopia eletrônica, mostraram que a mitocôndria
apresenta duas membranas, uma externa e uma interna, muito dobrada. Em 1961,
Peter Mitchell propôs a teoria quimiosmótica, sugerindo que o transporte de
elétrons e a síntese de ATP estão acoplados a um gradiente de prótons na
membrana mitocondrial interna. Mitchell sugeriu que bombas de prótons criariam
esse gradiente de prótons, que seria a força motriz para a síntese de ATP (Berg et
al., 2004).
Os seres vivos precisam de energia para realizar várias funções, como,
por exemplo, o transporte ativo de íons e moléculas, síntese de macromoléculas e
outras biomoléculas a partir de precursores simples e para a contração muscular.
A energia necessária para realizar essas funções é proveniente da oxidação de
substâncias na respiração celular. O ATP é o principal combustível da célula na
maioria dos processos que precisam de energia. A energia é liberada pela
hidrólise de ATP e serve para impulsionar uma série de reações (Nelson e Cox,
2000).
24
A glicose é a principal fonte de energia utilizada pela maioria das
células e ocupa uma posição central no metabolismo. A glicose é transportada
para dentro das células por proteínas transportadoras específicas. Ao entrar na
célula, a glicose pode ser metabolizada em diferentes rotas metabólicas. A
principal via de degradação da glicose é a glicólise, uma rota que envolve uma
seqüência de reações que ocorre no citosol e forma como produto final o piruvato.
Uma molécula de glicose gera duas moléculas de piruvato e de ATP. Além disso,
a glicose pode participar do ciclo das pentoses, que tem como objetivo formar
NADPH, um doador de elétrons de fundamental importância em biossínteses
redutoras, e ribose-5-fosfato, precursor na biossíntese de nucleotídeos. Quando a
célula está com elevados níveis de ATP, a glicose pode ser armazenada na forma
de glicogênio, que pode ser liberado e utilizado rapidamente se a
célula
necessitar de energia, ou formar triacilglicerol (Berg et al., 2004; Clark et al., 1993;
Marks et al., 2005; Nelson e Cox, 2000).
Em organismos superiores, o piruvato, formado na glicólise a partir de
glicose, pode seguir duas rotas metabólicas distintas. Quando há baixa quantidade
de oxigênio, como no trabalho muscular forçado ou na hipóxia, o piruvato pode ser
convertido em lactato pela enzima lactato desidrogenase, formando ATP e
consumindo NADH. No entanto, só uma pequena quantidade de energia da
glicose é liberada pela conversão de piruvato a lactato (Berg et al., 2004; Marks et
al., 2005; Nelson e Cox, 2000).
Em condições aeróbicas, o piruvato é transportado para dentro da
mitocôndria e sofre ação do complexo enzimático da piruvato desidrogenase, que
forma acetil coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA inicia o ciclo de Krebs. É
25
importante salientar que a acetil-CoA pode ser formada também pela oxidação de
ácidos graxos e aminoácidos (Berg et al., 2004; Clark et al., 1993; Marks et al.,
2005; Nelson e Cox, 2000).
O ciclo de Krebs ocorre na matriz mitocondrial e consiste de uma
seqüência de reações onde, em cada volta do ciclo, são formadas três moléculas
de NADH, uma de FADH2, duas de CO2 e uma de GTP. O NADH e FADH2
produzidos no ciclo de Krebs são carreadores de elétrons e são utilizados na
cadeia respiratória para a produção de ATP na fosforilação oxidativa (Marks et al.,
1996; Stryer, 1996; Nelson e Cox, 2000). Altos níveis de ATP inibem o ciclo de
Krebs por mecanismos complementares em vários locais do ciclo. Um dos pontos
de controle é a conversão de piruvato a acetil-CoA pela enzima piruvato
desidrogenase, inibida por ATP, acetil-CoA e NADH (Williamson e Cooper, 1980).
A cadeia respiratória e a fosforilação oxidativa, assim como o ciclo de
Krebs, ocorrem nas mitocôndrias. A cadeia respiratória é formada por uma série
de complexos protéicos, onde ocorre a transferência de elétrons doados por
NADH e FADH2. A transferência de elétrons pela cadeia respiratória leva ao
bombeamento de prótons da matriz para o lado citosólico da membrana
mitocondrial interna. O gradiente de prótons é usado para impulsionar a síntese de
ATP (Erecinska e Dagani, 1990; Heales et al., 1999; Wallace, 1999; Nelson e Cox,
2000).
A cadeia respiratória é composta de quatro complexos (I, II, III e IV) e
da ATPsintase (fig.2.1). O complexo I, também chamado de NADH: ubiquinona
oxirredutase, realiza a transferência de elétrons do NADH para a ubiquinona,
formando ubiquinol. Essa reação faz com que dois prótons sejam bombeados para
26
o espaço intermembrana. O complexo II, também denominado de succinato:
ubiquinona oxirredutase, é formado pela enzima succinato desidrogenase (SDH) e
três subunidades hidrofóbicas. Esse complexo participa do ciclo de Krebs
e
transfere elétrons do succinato para a ubiquinona e também forma ubiquinol. O
complexo III, ou citocromo c oxirredutase, transfere elétrons do ubiquinol para o
citocromo c, reação que serve para o bombeamento de mais quatro prótons. O
complexo IV, mais conhecido como citocromo c oxidase, transfere elétrons do
citocromo c para o oxigênio e forma água. Nessa etapa os últimos dois prótons
são bombeados (Berg et al., 2004; Voet e Voet, 1995; Wallace, 1999).
O gradiente eletroquímico formado pelo bombeamento de prótons
durante a cadeia respiratória mitocondrial é utilizado como força motriz para a
ATPsintase, formar ATP (fosforilação oxidativa). O ATP é transportado para fora
da mitocôndria com o concomitante transporte de ADP para dentro da mitocôndria,
através de um sistema antiporte (Berg et al., 2004; Heales et al., 1999; Wallace,
1999; Nelson e Cox, 2000; Voet e Voet, 1995).
Deficiências
no
funcionamento
normal
da
cadeia
respiratória
mitocondrial levam à diminuição da síntese de ATP (Heales et al., 1999). Sabe-se
também que o dano causado à mitocôndria leva a uma rápida queda na produção
de energia e morte celular (Ankarcrona et al., 1995).
27
Figura 1. Cadeia respiratória mitocondrial (Adaptado de Heales et al., 1999).
28
3 RADICAIS LIVRES E ESTRESSE OXIDATIVO
3.1 Radicais livres
Em 1954, Gersham e Gilbert propuseram que alguns efeitos tóxicos do
oxigênio poderiam ocorrer pela formação de radicais livres de oxigênio. McCord e
Fridovich, em 1968, descreveram a enzima antioxidante superóxido dismutase,
uma descoberta muito importante no estudo de radicais livres. A teoria da
toxicidade do oxigênio pelo ânion superóxido, desenvolvido por Fridovich, em
1975, sugeria que a formação dessa espécie reativa de oxigênio “in vivo” seria
responsável pelos efeitos tóxicos do oxigênio (Halliwell e Gutteridge, 1984; Pryor,
1988).
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz
de existir de forma independente e que contenha um ou mais elétrons
desemparelhados. Por isso, são muito reativos e atacam moléculas, como
lipídeos, proteínas e DNA. Dentre os radicais livres, podem-se destacar dois
grupos: as espécies reativas de oxigênio (ERO) e as espécies reativas de
nitrogênio (ERN). As ERO mais importantes são o ânion superóxido, radical
hidroxila, peróxido de hidrogênio, ânion hipoclorito e o oxigênio “singlet”. O óxido
nítrico e o peroxinitrito constituem as principais ERN (Halliwell e Gutteridge, 1999).
Os radicais livres são gerados em processos de oxidação biológica. A
redução do oxigênio à água forma radicais livres, e o ânion superóxido é o
primeiro radical livre formado nesse processo. Na cadeia respiratória mitocondrial,
29
5% do oxigênio utilizado não é completamente reduzido à água, e ocorre a
formação de ânion superóxido. Essa ERO é muito reativa e é removida
rapidamente pela enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), formando
peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio forma o radical hidroxil e não
existe nenhuma enzima que o remova. Por isso, as enzimas que decompõem o
peróxido de hidrogênio, como a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPX),
são tão importantes (Halliwell e Gutteridge, 1999; Cadenas e Davies, 2000).
Os radicais livres são gerados em muitos processos fisiológicos e
exercem funções importantes no organismo. Eles participam da fagocitose,
processos de sinalização celular e estão envolvidos na síntese e regulação de
algumas proteínas, em condições fisiológicas (Ward e Peters, 1995; Halliwell e
Gutteridge, 1999). O óxido nítrico desempenha funções importantes no sistema
nervoso central, tais como neurotransmissão, plasticidade sináptica e aprendizado
e memória. O óxido nítrico também tem função importante no controle da pressão
arterial (Heales et al., 1999).
Os radicais livres podem provocar reações em cadeia e causar dano a
um grande número de moléculas. O ataque de radicais livres a lipídios de
membrana é chamado de lipoperoxidação (LPO). Na LPO, um radical livre reage
com um lipídio insaturado (as membranas celulares são formadas principalmente
por lipídios insaturados e proteínas), provocando uma reação em cadeia (com
lipoperóxidos como produtos intermediários) e modificações das propriedades da
membrana, como permeabilidade e fluidez, além de causar dano a proteínas
transmembrana, como enzimas e receptores. A LPO tem como produto final, entre
outros, o malondialdeído, que pode ser quantificado e usado para avaliação desse
30
processo. Os radicais livres também podem atacar proteínas, principalmente nos
resíduos de cisteína. As proteínas podem sofrer alterações na sua conformação e
perda na sua função. O DNA também pode ser alvo de ataque de radicais livres
(Halliwell e Gutteridge, 1999).
3.2 Defesas antioxidantes
Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, em baixas
concentrações em relação ao substrato oxidável, retardam ou previnem a
oxidação desse substrato. Desse modo, os antioxidantes atuam como protetores
da oxidação de biomoléculas por radicais livres e impedem a propagação da
reação em cadeia provocada pelos mesmos (Halliwell e Gutteridge, 1999; Fang et
al., 2002).
As principais defesas enzimáticas antioxidantes são a SOD, CAT e
GPX. Além disso, antioxidantes não-enzimáticos, como a glutationa reduzida
(GSH), tocoferol (vitamina E) e ácido ascórbico (vitamina C), entre outros, auxiliam
no combate às ERO.
Os antioxidantes estão amplamente distribuídos nos organismos vivos e
constituem um sistema de defesa muito importante em condições aeróbicas
(Halliwell e Gutteridge, 1999; Fang et al., 2002).
A SOD constitui a primeira linha de defesa enzimática contra a
produção intracelular de radicais livre, catalisando a dismutação do ânion
superóxido (Hollander et al., 2000). Está presente na matriz mitocondrial (MnSOD), no citosol (CuZn-SOD) e no meio extracelular. Embora o ânion superóxido
31
não seja altamente danoso, pode extrair elétrons de diversos componentes
celulares causando reações em cadeia de radicais livres (Halliwell e Gutteridge,
1999). O produto resultante da reação catalisada pela SOD é o peróxido de
hidrogênio que deve se retirado do meio o mais rápido possível.
A CAT catalisa a degradação do peróxido de hidrogênio. Na reação,
uma das moléculas de peróxido de hidrogênio é oxidada a oxigênio molecular e a
outra é reduzida à água (Chance et al, 1979). Está localizada, principalmente, no
peroxissoma, entretanto, outras organelas como as mitocôndrias podem conter
alguma atividade da CAT. A catálise do peróxido de hidrogênio é importante pois,
na presença de Fe+2, leva à formação de radical hidroxil (reação de Fenton),
altamente reativo e danoso às biomoléculas.
A GPX é uma enzima selênio-dependente que catalisa a redução do
peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos para água e álcool, usando a
GSH como doadora de elétrons e está localizada tanto no citosol quanto na matriz
mitocondrial (Halliwell e Gutteridge, 1999).
A GSH é um dos mais abundantes agentes antioxidantes biológicos,
atua na conversão de dissulfidas para tióis e serve como um substrato para a GPX
e glutationa S-transferase. O nível intracelular de GSH é regulado pelo equilíbrio
entre sua utilização e síntese (Halliwell e Gutteridge, 1999).
O organismo contém diferentes tocoferóis, mas o mais potente é o tocoferol, também conhecido como vitamina E, e é lipossolúvel. Por isso, o
tocoferol está presente
-
nas membranas celulares, nas mitocôndrias e em
lipoproteínas plasmáticas. Assim, ele quebra as reações em cadeia provocadas
pelos radicais livres. Os lipoperóxidos atacam preferencialmente o -tocoferol, em
32
vez de outro lipídio de membrana. Com a oxidação, forma-se o radical
tocoferoxil, que pode ser regenerado a
-
-tocoferol pelo ácido ascórbico ou pela
GSH (Halliwell e Gutteridge, 1999; Sokol, 1989; Ward e Peters, 1995).
O ácido ascórbico, também conhecido como vitamina C, tem como
principal função a regeneração do
-tocoferol e forma nesse processo a forma
oxidada, denominada ácido deidroascórbico (Ward e Peters, 1995). O ácido
ascórbico tem excelente ação antioxidante “in vitro” e atua como seqüestrador de
vários radicais livres. Além disso, a vitamina C atua como cofator de enzimas
envolvidas com a síntese de colágeno.
3.3 Estresse oxidativo
Os radicais livres são formados normalmente no metabolismo celular.
As defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a
toxicidade dessas espécies e são responsáveis pela manutenção da homeostase
entre a produção e a eliminação de radicais livres. No entanto, em certas
condições, pode ocorrer aumento da produção de radicais livres suficiente para
ultrapassar a capacidade antioxidante ou uma diminuição das defesas
antioxidantes no organismo, favorecendo o que chamamos de estresse oxidativo
(Bondy e Le Bel, 1993; Cadenas e Davies, 2000).
O estresse oxidativo pode provocar perda de função celular, por causar
alterações no metabolismo das células. É importante ressaltar que o estresse
oxidativo pode ocorrer em condições fisiológicas (fagocitose) e patológicas.
33
3.4 Colite e estresse oxidativo
A colite ulcerativa é uma doença inflamatória crônica, cuja etiologia
permanece
desconhecida.
Vários
fatores
etiológicos,
incluindo
genética,
imunológicos e ambientais, têm sido implicados (Kirsner and Shorter, 1982; Jewell
and
Patel,
1985).
Recentemente,
o
estado
alterado
do
mecanismo
oxidante/antioxidante no cólon inflamado tem recebido atenção (Cetinkaya et al.,
2005). Evidências sugerem que ERO, como o ácido hipocloroso e derivados
oxidantes são produzidos em excesso pela mucosa inflamada e podem ser
patogênicos na doença inflamatória intestinal (Grisham, 1994; Keshvarzian et al.,
1990; Millar et al., 1996). As fontes principais de ERO na mucosa inflamada são
neutrófilos e leucócitos fagocitários ativados, capazes de produzir superóxido e
uma cascata de várias espécies reativas levando à formação do radical hidroxila e
peróxido. Esses produtos causam um distúrbio na estabilidade da membrana
celular e morte da célula por peroxidação lipídica nas doenças inflamatórias
intestinais (Buffinton and Doe, 1985; Fantone and Ward, 1982; Flohe et al., 1985).
Estes produtos intermediários do metabolismo do oxigênio (superóxido, radical
hidroxila e peróxido de hidrogênio) são controlados por vários mecanismos
celulares de defesa antioxidante enzimáticas e não-enzimáticas (Cetinkaya et al.,
2005).
Pravda (2005) aponta o peróxido de hidrogênio como o principal
responsável pela cascata de eventos que leva à colite ulcerativa, no que ele
chama de “Teoria da Indução Radical da Colite Ulcerativa”, onde numa primeira
fase, pré-clínica, denominada “indução radical”, os colonócitos são induzidos a
34
gerar um excesso de peróxido de hidrogênio não neutralizado devido ao estresse
oxidativo do metabolismo celular. Radical hidroxila e peróxido de hidrogênio têm
meia vida curta, o que limita sua atividade destrutiva nas moléculas intracelulares
(DNA, enzimas) e estruturas extracelulares adjacentes à célula (membrana basal
e junções comunicantes). Citocinas pró-inflamatórias, entretanto, podem ser
carreadas a sítios distantes para exercer seus efeitos. Desse modo, a difusão
inicial intermitente de peróxido de hidrogênio de células epiteliais compromete a
barreira local da mucosa colônica, e causa uma transitória ativação imune
resultando em produção de citocina e manifestações extra-intestinais, como artrite,
uveíte e manifestações cutâneas (pioderma gangrenoso, eritema nodoso). A
continuação do insulto oxidativo na barreira colônica culmina com infiltração
neutrofílica, iniciando a segunda fase do processo, onde o paciente apresenta
sinais de comprometimento da integridade da mucosa (sangramento). A contínua
estimulação de neutrófilos da mucosa pelas bactérias fecais converte a condição
em uma auto-estimulação e auto-perpetuação do processo que Pravda chama de
“propagação”.
O
aumento
do
estresse
oxidativo
e
diminuição
das
defesas
antioxidantes têm sido demonstrados em biópsias de mucosa colônica de
pacientes com DII (Lih-Brody et al., 1996). Tem sido sugerido que o desequilíbrio
entre mecanismos pró-oxidantes e anti-oxidantes na DII pode ser controlado por
tratamento antioxidante. Alguns agentes provaram ser efetivos em condições
experimentais, tais como vitamina E, selênio, trimetazidina (Ademoglu et al., 2004;
Kuralay et al., 2003; Yoshida et al., 1999) e N-acetilcisteína (NAC) (Cetinkaya et
al., 2005).
35
3.5 N-acetilcisteína (NAC)
A NAC tem sido utilizada largamente como antioxidante “in vivo” e “in
vitro” (Cetinkaya et al. 2005). Ela também é eficiente no tratamento de algumas
situações de overdose de alguns fármacos, como paracetamol (Prescott et al.,
1979), e como mucolitico (De Flora, 2001). A NAC é doadora de grupos tióis que
atua como um precursor da cisteína intracelular, aumentando a produção de
glutationa (GSH) (Pinho et al., 2005), quando a demanda de GSH está
aumentada, como durante excessivo estresse oxidativo, ou durante certos
processos patológicos (Cetinkaya et al., 2005). A maioria dos efeitos benéficos da
NAC é sugerida como sendo um resultado de sua habilidade tanto de reduzir
cistina extracelular em cisteína, ou ser uma fonte de grupos tióis. Como fonte de
grupos tióis, a NAC estimula a síntese de glutationa, aumenta a atividade da
glutationa-S-transferase, e atua nos radicais oxidantes reativos (De Vries e De
Flora, 1993). A NAC é também um poderoso seqüestrador do ácido hipocloroso.
Esse ácido é produzido pela ação da mieloperoxidase no peróxido de hidrogênio
na presença de ânions hipoclorosos e está envolvido na reação inflamatória na
colite (Cetinkaya, 2005). Estudos têm mostrado que o uso de NAC está associado
com prevenção de câncer colorretal associado à colite ulcerativa em associação
com a supressão do dano celular nitrosativo, bem como a prevenção de pólipos
colorretais (De Flora et al., 1996; De Leon e Roncucci, 1997; Serill et al., 2002).
36
3.6 Deferoxamina (DFX)
A deferoxamina (DFX) é empregada rotineiramente para o tratamento
de várias doenças hematológicas, com um bom perfil de segurança. É um potente
quelante de ferro e tem sido estudado em eventos cardiovasculares (Hurn et al.,
1995) e na sépsis (Ritter et al., 2004). Existem evidências que a deferoxamina tem
a capacidade de aumentar a capacidade antioxidante da NAC (Ritter et al., 2004).
A DFX pode prevenir ou reverter os efeitos da produção de radicais
livres, por impedir a geração de radical hidroxila através da reação de Fenton
(Vulcano et al., 2000). Embora o uso crônico possa agravar uma possível anemia
nos pacientes portadores de colite ulcerativa, onde a suplementação de ferro
poderia piorar o quadro clínico, baseados em estudos que demonstram uma
aumento da atividade da doença nesta situação (Uritski et al., 2004),
possivelmente por aumentar a produção das ERO pela reação de Fenton (Carrier
et al., 2002), o uso de DFX por um curto período de tempo poderia ser benéfico ao
produzir sinergismo com NAC (Ritter et al., 2004).
37
4 OBJETIVOS
4.1 Geral
- Estudar o efeito da NAC e da DFX sobre a colite ulcerativa induzida por dextran
sulfato de sódio (DSS) em ratos, através da análise da função mitocondrial
envolvida na geração de ERO.
4.2 Específicos
- Verificar o efeito do tratamento com NAC e DFX sobre os seguintes parâmetros,
em tecido intestinal e sanguíneo de ratos submetidos ao modelo de colite por
DSS:
– Marcadores inflamatórios
– Dano tecidual (Avaliação micro e macroscópica do tecido)
– Metabolismo energético mitocondrial
– Estresse oxidativo
38
PARTE II - RESULTADOS
Oxidative stress and metabolism in animal model of colitis induced by
dextran sulfate sodium
Carlos R. Damiani, César A. F. Benetton, Cristhopher Stoffel, Katrine C.
Bardini, Vilson H. Cardoso, Gabriela Di Giunta, Ricardo A. Pinho, Felipe DalPizzol, Emilio L. Streck
Artigo submetido à revista Journal of Gastroenterology and Hepatology
39
Oxidative stress and metabolism in animal model of
colitis induced by dextran sulfate sodium
1
1
1
Carlos R. Damiani , César A. F. Benetton , Cristhopher Stoffel ,
2
1
1,2
Katrine C. Bardini , Vilson H. Cardoso , Gabriela Di Giunta ,
3
2
Ricardo A. Pinho , Felipe Dal-Pizzol , Emilio L. Streck
1
1
Laboratório de Bioquímica Experimental, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil;
2
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil;
3
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício, Universidade do
Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil
Correspondence: Prof. Emilio L. Streck, Laboratório de Bioquímica Experimental,
Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-003, Criciúma, SC, Brazil. Fax:
55 48 3341 2750. E-mail: [email protected]
40
ABSTRACT
Ulcerative colitis is a chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract. Its
etiology remains unclear, but it appears to result from a dysregulated immune
response, with infiltration of phagocytic leukocytes into the mucosal interstitium.
The production and release of reactive oxygen species by immune cells seems to
play a crucial role in phisiopathology of colitis. The aim of this work was to evaluate
the effects of N-acetylcysteine (NAC) and deferoxamine (DFX) in the treatment of
colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) by measuring intestinal parameters
of oxidative stress and mitochondrial function, inflammatory response and bowel
histopathological alterations. The results show that DSS increased white blood
cells count and that NAC and DFX did not prevent this effect. However, DSS
increased mitochondrial respiratory chain complex IV in colon of rats and NAC and
DFX prevented this alteration. Besides, thiobarbituric acid reactive substances
were increased in colon of DSS-treated rats. NAC and DFX, when taken together,
prevented this effect. Complex II and succinate dehydrogenase were not affected
by DSS, as protein carbonyl content. We speculate that NAC and DFX might be
used for treatment of colitis, but further research is necessary to clarify these
effects.
Key words: colitis, oxidative stress,
deferoxamine, dextran sulfate sodium.
respiratory
chain,
N-acetylcysteine,
41
INTRODUCTION
Inflammatory bowel disease (IBD) consists of a group of illnesses with
chronic inflammation of the gastrointestinal tract, which causes life-impairing
symptoms, necessitates long-term dependence on powerful drugs and often
results in debilitating surgery and even death. However, IBD etiology remains
unclear and appears to result from a dysregulated immune response.
1,2
One of the hallmarks of IBD is the infiltration of large numbers of phagocytic
3
leukocytes into the mucosal interstitium. Besides the enhanced inflammatory
infiltrate, extensive mucosal injury occurs, resulting in production and release of
reactive oxygen species (ROS), such as superoxide and hydrogen peroxide. These
species interact in the presence of transition metals such as iron in order to
generate the highly reactive and cytotoxic hydroxyl radical. Hydroxyl radical is one
of the most potent oxidants produced in biological systems and is capable of
oxidizing and peroxidizing a wide variety of biomolecules, such as proteins,
carbohydrates, lipids and DNA. In addition to classic ROS, activated neutrophils
and monocytes also secrete the hemoprotein myeloperoxidase into the
extracellular medium, where it catalyzes the oxidation of chloride ions via hydrogen
peroxide to yield the highly reactive oxidizing and chlorinating agent hypochlorous
acid. The latter has been shown to degrade gastrointestinal mucin, enhance
mucosal permeability, and injure intestinal epithelial cells.
2–6
In addition, it was
42
demonstrated overproduction of ROS in the colon of IBD patients. These evidence
suggest that colonic inflammation may produce high levels of oxidants
that probably exceed the low antioxidant capacity and lead to epithelial cell
5
disruption.
A number of studies have demonstrated the antioxidant role of NAC,
including IBD animal models. Thus, NAC supplementation was found to reduce
oxidative stress by improving the thiol redox status, to inhibit neutrophil and
monocyte chemotaxis and oxidative metabolism and to scavenge superoxide,
hydrogen peroxide and hydroxyl radicals. It has been recently shown that NAC
2
attenuates acute colitis induced by intraretal acetic acid administration, and that
NAC also prevented ulcerative colitis-associated colorectal cancer induced by
7
dextran sulfate sodium (DSS). On the other hand, isolated administration of NAC
8
could produce pro-oxidant effects. For example, the oxidative metabolism of NAC
+3
can generate thiyl free radicals and NAC can reduce Fe ions to participate in the
9
generation of hydroxyl radical via Fenton reaction. We recently demonstrated that
the combination of N-acetylcysteine (NAC) plus deferoxamine (DFX), but not their
isolated use, is an effective treatment for several inflammatory diseases.
10–12
This
is of great importance in IBD, since iron seems to be involved in the oxidative
damage during colitis development.
We here describe the effects of NAC, DFX or both in the treatment of colitis
induced by DSS by measuring intestinal parameters of oxidative stress and
43
mitochondrial
function,
degree
of
inflammatory
response
and
bowel
histopathological alterations.
Methods
Animals
Male Wistar rats (100–120 g) obtained from Central Animal House of
Universidade do Extremo Sul Catarinense were housed individually under standard
conditions (12-h light/dark cycles with room temperature of 22–24°C). All studies
were performed in accordance with National Institutes of Health guidelines and
with the approval of Ethics Committee from Universidade do Extremo Sul
Catarinense.
DSS-induced colitis
After 7 days of acclimation, acute colitis was induced in all rats by including
50 g/L of dextran sulfate sodium (DSS) (MW 8000; Sigma-Aldrich) in drinking water
for 5 days. Rats were divided into the following eight groups, each consisting of five
rats: normal control group (group I), normal control group treated with NAC 20
mg/kg s.c. (group II), DFX 20 mg/kg s.c. (group III) or both (group IV), DSSinduced colitis group (group V), DSS-induced colitis group treated with NAC 20
mg/kg s.c. (group VI), DFX 20 mg/kg s.c. (group VII) or both (group VIII). NAC was
44
administered twice a day and DFX once a day during the period of induction of
6,10–12
colitis by DSS.
Tissue and homogenate preparation
On the fifth day of the study, all rats were anesthetized by intraperitoneal
administration of sodium pentobarbital (50 mg/kg) and killed by cardiac puncture.
Blood was collected and white blood cells (WBC) count obtained with a
hemacytometer chamber immediately after the obtaining of the sample. Colon was
removed from the colocecal junction to the anal verge. The colon was then
opened, rinsed with ice-cold isotonic saline, and the mucosal lesions were
examined macroscopically. After that, the colon was cut longitudinally in two pieces
for histological evaluation and tissue measurements, respectively. For histological
examinations, the colon was fixed in 10% formalin, embedded in paraffin and
stained with hematoxylin and eosin. The remaining colon were homogenized (1:10,
w/v) in SETH buffer, pH 7.4 (250 mM sucrose, 2 mM EDTA, 10 mM Trizma base,
50 IU/ml heparin). The homogenates were centrifuged at 800 x g for 10 min and
o
the supernatants kept at −70 C until used for enzyme activity determination. The
maximal period between homogenate preparation and enzyme analysis was
always less than five days. Protein content was determined by the method
described by Lowry and colleagues (1951) using bovine serum albumin as
13
standard.
45
Determination of colonic damage
Macroscopic scoring of the colonic damage was performed using the criteria
outlined
in
Table
1.
14
Histological
assessment
was
performed
by
the
15
criteria outlined in Table 2. Macroscopic and microscopic scoring of tissue
5
samples were performed by an observer unaware of the treatment groups.
Respiratory chain enzyme activities
The activities of the respiratory chain enzyme complexes succinate: DCIP
oxireductase (complex II) and succinate: phenazine oxireductase (soluble
succinate dehydrogenase (SDH)) were determined according to the methods of
16
Fischer and colleagues (1985).
Complex II (succinate: DCIP oxireductase)
activity was measured by following the decrease in absorbance due to the
reduction of 2,6-DCIP) at 600 nm with 700 nm as reference wavelength ( = 19.1
−1
−1
mM x cm ). The reaction mixture consisting of 40 mM potassium phosphate, pH
7.4, 16 mM succinate and 8
M DCIP was preincubated with 40–80
g
o
homogenate protein at 30 C for 20 min. Subsequently, 4 mM sodium azide and 7
M rotenone were added and the reaction was initiated by addition of 40 M DCIP
and was monitored for 5 min. The activity of succinate: phenazine oxireductase
(soluble SDH) was measured following the decrease in absorbance due to the
reduction of 2,6-DCIP at 600 nm with 700 nm as reference wavelength ( = 19.1
−1
mM
−1
x cm ) in the presence of phenazine methasulphate (PMS). The reaction
mixture consisting of 40 mM potassium phosphate, pH 7.4, 16 mM succinate and 8
46
o
M DCIP was preincubated with 40–80 g homogenate protein at 30 C for 20 min.
Subsequently, 4 mM sodium azide, 7
M rotenone and 40 microM DCIP were
added and the reaction was initiated by addition of 1 mM PMS and was monitored
for 5 min. The activity of cytochrome c oxidase). The reaction buffer contained 10
mM potassium phosphate, pH 7.0, 0.6 mM n-dodecyl-d-maltoside, 2–4
g
homogenate protein and the reaction was initiated with addition of 0.7 g reduced
cytochrome c. The activity of complex IV was measured at 25C for 10 min.
17
(complex IV) was measured by the method of Rustin and colleagues (1994).
Complex IV activity was measured by following the decrease in absorbance due to
the oxidation of previously reduced cytochrome c at 550 nm with 580 nm as
−1
reference wavelength ( = 19.1 mM x cm
−1o
Oxidative stress parameters
The formation of TBARS during an acid-heating reaction was measured as
18
an index of oxidative stress as previously described.
Briefly, the samples were
mixed with 1 mL of trichloroacetic acid 10% and 1 mL of thiobarbituric acid 0.67%
(Sigma Chemical, St. Louis, MO) and then heated in a boiling water bath for 15
mins. Malondialdehyde equivalents were determined by the absorbance at 535 nm
using 1,1,3,3-tetramethoxypropane (Sigma Chemical) as an external standard.
Results were expressed as malondialdehyde equivalents per milligram of protein.
The oxidative damage to proteins was assessed by the determination of carbonyl
groups based on the reaction with dinitrophenylhidrazine (Sigma Chemical) as
previously described.
19
Briefly, proteins were precipitated by the addition of 20%
47
trichloroacetic acid and redissolved in dinitrophenylhidrazine, and the absorbance
was read at 370 nm.
Statistical analysis
Data were analyzed by Student’s t-test or one-way analysis of variance
followed by the Duncan multiple range test when F was significant. All analyses
were performed using the Statistical Package for the Social Science (SPSS)
software.
Results
In the present work, we evaluated the effects of NAC and DFX on the
treatment of ulcerative colitis caused by DSS. Our results showed that DSS caused
a significant increase in white blood cells (WBC) count and that NAC and DFX did
not prevent such effect (F(7,32)=21.40; p<0.01), when compared to group without
DSS administration. However, by evaluating only DSS-treated groups, we verified
that WBC count was significantly higher in NAC-treated rats, when compared to
DSS control group (F(3,16)=4.83; p<0.01) (Figure 1).
As seen on Figure 2, the microscopic evaluation of the colonic damage
showed increased score in DSS-treated rats. Besides, NAC and DFX, when
administered alone, did not prevent this increase. When the drugs were
administered together, we verified a decrease in colonic damage score, similar to
48
that obtained in control group (F(7,32)=5.75; p<0.01). However, when we evaluate
only DSS-treated groups, we verified that NAC and DFX, alone or together, did not
prevent
the
increase
in
microscopic
score
caused
by
DSS
administration (F(3,16)=4.37; p=0.29). The macroscopic evaluation showed
the same effect of DSS, but in this case the use of NAC and DFX, alone or
together, decreased the levels of damage, also similar to control group
(F(7,32)=5.77; p<0.01). The statistical analysis with DSS-treated groups showed
the same prevention by NAC and DFX taken alone or together (F(3,16)=4.18;
p<0.05).
We also evaluated the activity of mitochondrial enzymes in colon of DSStreated rats. We observed that mitochondrial respiratory chain complex II
(F(8)=0.53, p=0.80) and succinate dehydrogenase (F(8)=0.13, p=0.24) (Table 3)
activities were not affected by DSS. However, the activity of complex IV was
increased by DSS and NAC and DFX prevented this effect, when compared to
control group (F(7,32)=6.12; p<0.01). Besides, by evaluating only DSS-treated
groups, we verified that complex IV activity was significantly decreased in NAC and
NAC plus DFX treated rats, when compared to DSS control group (F(3,16)=8.86;
p<0.01) (Figure 3).
Besides, we showed that DSS increased TBARS, when compared to control
group (Figure 4). NAC alone did not prevented TBARS increase, but DFX alone or
together with NAC prevented lipoperoxidation (F(7,32)=2.65; p<0.05). Finally, the
statistical analysis of DSS-treated groups showed that NAC plus DFX treated rats
presented significantly increased levels of lipoperoxidation, when compared to DSS
49
control group (F(3,16)=2.70; p<0.05). On the other hand, protein carbonyl content
was
not
affected
by
DSS
treatment
(F(8)=0.19,
p=0.96)
(Table
3).
Discussion
Because
therapeutic
agents
such
as
sulfasalazine,
steroids
and
immunosuppressive agents are not fully satisfactory, the development of safer and
more effective therapeutic agents is greatly needed. There are some studies
showing that NAC and iron chelators had some benneficial effects on the treatment
20–22
of colitis.
It is believed that ROS such as superoxide and hydrogen peroxide
interact in the presence of iron and may enhance hydroxyl ion production via
3
Fenton reaction. It was also demonstrated that overproduction of ROS occurs in
colon of IBD patients. In conclusion, colonic inflammation probably produce high
levels of oxidants that exceed the antioxidant capacity and lead to epithelial cell
5
disruption. So, we tested NAC and DFX on the treatment of ulcerative colitis
induced by DSS in rats.
As seen on Figure 1, our results showed that WBC count were increased in
DSS-treated rats. However, NAC and DFX did not prevent this effect. Besides, we
verified that DSS-treated rats presented higher colonic damage score, micro and
macroscopically. In this case, the histological tissue evaluation showed that NAC
and DFX, when used alone or together, prevented the increase of the score. In
50
Figure 5, some representative histological slides from rats receiving water (control
group) and DSS (colitis group) are shown. The colon of a rat from the control group
is showed in Panel 5A. The colon of a rat from the colitis group can be observed in
Panel 5B, where extensive mucosal necrosis and marked inflammatory infiltrate is
shown. In Panel 5C and 5D the colon of rats with colitis and treated only with NAC
or with NAC plus DFX are shown, respectively. As can be seen, there is less
extensive mucosal injury in Panel 5C, and in Panel 5D, light inflammatory infiltrate.
The macroscopic evaluation showed that NAC and DFX did not have the same
effect, when used alone, but together were much more effective. These findings
suggest that NAC nad DFX may prevent colonic damage, specially when used in
association.
We observed similar results by evaluating mitochondrial respiratory chain
complex IV in colon, where DSS-treated rats presented a higher activity of this
enzyme, and NAC and DFX, alone or in association, prevented the effect. It is
possible that the process of cellular lesion and inflammation requires a higher
production of ATP for tissue regeneration. As we observed, NAC and DFX seems
to decrease the inflammation (by colonic damage score), and may also decrease
ATP needs. Consequently, ATP production is similar to control animals. Besides,
we verified that mitochondrial respiratory chain complex II and succinate
dehydrogenase were not affected in colon of rats with colitis induced by DSS.
An interesting finding was observed in oxidative stress parameters
evaluation. TBARS, a marker of lipoperoxidation, was increased in DSS-treated
rats. When used alone, NAC did not prevent such effect and DFX, alone or in
association with NAC, prevented. So, it is tempting to speculate that the use of
51
NAC and DFX in association may be more interesting for the treatment of colonic
damage in colitis. Evidence from literature show that NAC may enhance the
We believe that the use of DFX, an iron chelator, blocked the pro-oxidant effect of
NAC. Besides, we verified that protein carbonyl content, a marker of oxidative
damage to proteins, were not altered by DSS. producton of ROS via Fenton
8
reaction.
The hypothesis is based on the inflammatory reaction caused by DSS. It is
possible that mucosal injury enhances ATP production for tissue regeneration.
Consequently, more oxygen is consumed and more ROS are produced. The
antioxidant capacity of colon is relatively low, and oxidative stress occurs. More
tissue injury and inflammatory cells infiltration occurs, resulting in exacerbation of
inflammatory response and mucosal damage. We believe that whether oxidative
stress is prevented, this circle may be broken. Finally, our results suggest that NAC
and DFX play an important role in prevention of oxidative damage in colon of rats
with colitis.
These findings clearly demonstrate that NAC and DFX have important
effects on treatment of ulcerative colitis. Our results showed that these drugs
prevented many effects caused by DSS.
Acknowledgements
This work was supported by CNPq and UNESC
52
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27–30.
55
Figure 1 – White blood cells (WBC) count in animal model of colitis induced
by DSS. Data are expressed for five animals.
# – Different from control (group without DSS administration) p<0.01
a – Different from DSS-control (group wit DSS administration) p<0.01
56
Figure 2 – Micro and macroscopic evaluation on colonic damage animal
model of colitis induced by DSS. Data are expressed as score points, for five
independent experiments.
# – Different from control (group without DSS administration) p<0.01
a – Different from DSS-control (group wit DSS administration) p<0.05
61
Figure 3 – Mitochondrial respiratory chain complex IV activity in colon of rats
treated with DSS. Data are expressed as nmol/min.mg protein, for five
independent experiments performed in duplicate.
# – Different from control (group without DSS administration) p<0.01
a – Different from DSS-control (group wit DSS administration) p<0.01
62
Figure 4 – Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in colon of rats
treated with DSS. Data are expressed as nmol MDA/min.mg protein, for five
independent experiments performed in duplicate.
# – Different from control (group without DSS administration) p<0.05
a – Different from DSS-control (group wit DSS administration) p<0.05
63
Figure 5 – Representative histological slides from rats receiving DSS. Colitis
was induced in Wistar rats by DSS oral administration for five days as described
under Methods. Panel A: Water (control); Panel B: DSS (colitis); Panel C: DSS
plus NAC; Panel D: DSS plus NAC plus DFX. (Hematoxylin and eosin; 400x).
5A: no tissue damage; 5B: extensive mucosal necrosis and marked inflammatory
infiltrate; 5C: less extensive mucosal injury; 5D: light inflammatory infiltrate.
60
PARTE III
5 DISCUSSÃO
Apesar de aproximadamente cento e cinqüenta anos terem se
passado desde que Samuel Wilks descreveu a colite ulcerativa (Cormam,
2005), uma terapia que possa ser considerada altamente satisfatória do ponto
de vista de remissão da doença associada com baixa taxa de recidiva, e
mínimos efeitos colaterais, ainda é objeto de inúmeros estudos. Talvez a
dificuldade em encontrar um fármaco realmente eficaz resida no entendimento
incompleto da patogênese da moléstia. Sabe-se que inúmeros fatores estão
implicados, tais como a infiltração neutrofílica e a produção elevada de
mediadores inflamatórios, ocorrendo uma produção excessiva de espécies
reativas de oxigênio que ocasionaria ou perpetuaria o processo de dano
tecidual (Pearson et al., 1996; Pravda, 2005; Yavuz et al.,1999).
Neste estudo utilizou-se como marcadores da atividade inflamatória
a contagem de leucócitos e dosagem da proteína C reativa. O processo
inflamatório desencadeia uma resposta quimiotáxica levando à liberação
medular de glóbulos brancos, geralmente ocasionando leucocitose. Os
resultados mostraram que no grupo de ratos que recebeu somente água para
beber, não houve aumento do número de leucócitos, sugerindo ausência de
processo inflamatório neste grupo de animais. Além disso, a administração de
NAC e DFX
isoladamente ou em conjunto, não interferiu na contagem de
61
leucócitos. No grupo de ratos com colite induzida por DSS, houve aumento da
contagem leucocitária em todos os animais, demonstrando a existência de
processo inflamatório nos mesmos. O tratamento com NAC e DFX isolada ou
conjuntamente não reverteu este parâmetro inflamatório. Não houve diferença
estatística no grupo DSS, porém nota-se uma tendência a um maior número de
leucócitos nos ratos que receberam apenas NAC.
A proteína C reativa é uma proteína cuja concentração plasmática
aumenta durante estados inflamatórios, uma característica que tem sido
longamente empregada com propósitos clínicos. Ela rapidamente aumenta sua
síntese após injúria tecidual ou infecção, sugerindo que contribua para defesa
do hospedeiro e que seja parte de uma resposta imune inata, podendo ativar a
via clássica do complemento,
estimular a fagocitose
e
se ligar a
imunoglobulinas receptoras. (Black et al., 2004). No presente estudo, em
contraste com o esperado, não se evidenciou qualquer diferença dos níveis de
proteína C reativa entre o grupo controle e o grupo que recebeu DSS, talvez
por ter sido utilizado um modelo de colite aguda, o que não daria tempo da
síntese hepática de proteína C reativa.
O dano tecidual, seguindo escores previamente descritos por Yavuz
e colaboradores (1999), foi analisado conforme parâmetros micro e
macroscópicos. Nos animais que receberam apenas água para beber, não
houve diferença intergrupos, independente de terem sido tratados ou não com
NAC e/ou DFX. A análise microscópica do tecido evidenciou um dano tecidual
nos ratos que receberam DSS, dano este que não foi amenizado pelo uso de
NAC ou DFX usados isoladamente. Entretanto, nos animais com colite induzida
pelo DSS que receberam NAC associada ao DFX, as alterações microscópicas
62
são estatisticamente idênticas ao grupo controle, demonstrando um efeito
protetor do dano tecidual sinérgico entre os dois fármacos, fato este que
corrobora com achados de estudos prévios (Ritter et al., 2004; Vulcano et al.,
2000).
A análise macroscópica do dano tecidual, no grupo DSS não tratado
com NAC e/ou DFX mostrou alterações em relação ao grupo controle. Chama
a atenção o fato de que NAC e DFX isoladamente ou em associação,
preveniram o aparecimento de lesões macroscópicas, levando à níveis
idênticos ao grupo que não recebeu DSS, em contraste com o achado
microscópico, onde somente a associação NAC + DFX produziu melhora do
dano.
O complexo II da cadeia respiratória mitocondrial não foi alterado
nos ratos que tiveram colite induzida pelo DSS, bem como a SDH não sofreu
alterações. O complexo IV da cadeia respiratória no grupo com colite induzida
por DSS e que recebeu salina como tratamento, apresentou um aumento
estatisticamente significante de sua atividade, sugerindo uma maior produção
de ATP, possivelmente como resposta ao processo lesão/regeneração tecidual.
Os ratos com colite induzida por DSS que receberam tratamento antioxidante
tiveram uma atividade do complexo IV idêntica ao grupo controle.
O dano oxidativo a lipídeos, medido pelo TBARS, foi evidente no
grupo colite que recebeu salina e no grupo colite que recebeu somente NAC
como tratamento, confirmando estudos prévios que mostram um efeito próoxidante da NAC, presumivelmente pela reação de Fenton, com formação de
radical hidroxil, efeito este que foi neutralizado pela DFX, por se tratar de um
63
quelante de ferro (Vulcano, 2000). Além disso, não foi detectado dano à
proteínas nos animais tratados com DSS.
No presente estudo, ficou evidente a atividade inflamatória existente
nos ratos com colite induzida por DSS, pelo aumento da contagem leucocitária
e pela análise macro e microscópica dos espécimes, simulando claramente o
que acontece em humanos. O uso de NAC e DFX foi capaz de amenizar os
danos macroscópicos nos ratos. No entanto, em nível microscópico, apenas o
grupo que utilizou a associação NAC + DFX mostrou redução do dano tecidual.
Isto sugere muito fortemente que a associação NAC + DFX é superior que a
utilização isolada dos mesmos, embora em nível macroscópico tenha ocorrido
redução dos níveis de lesão tecidual. O que se deseja no tratamento dos
pacientes não é apenas a redução dos sintomas, mas também a melhora
histológica das lesões, até por razões de prevenção do aparecimento de
tumores secundários às DII (Itzkowitz e Yio, 2004).
O papel dos radicais livres nas DII tem sido relatado em vários
estudos (Carrier et al., 2002; Poussios et al., 2003; Reifen et al., 2004; Yavuz et
al., 1999), fazendo crescer o interesse pelo efeito benéfico dos antioxidantes
como terapia da colite ulcerativa. Neste estudo conseguiu-se demonstrar o
dano oxidativo em lipídeos através do TBARS, porém o dano oxidativo em
proteínas não ficou demonstrado pela medida de grupos carbonil. A NAC não
foi capaz de diminuir o dano oxidativo em lipídeos, quando utilizada
isoladamente e a DFX foi efetiva em diminuir o dano oxidativo a lipídeos,
conforme demonstrado em nossos resultados.
A colite induzida por DSS produz processo inflamatório, ocasionando
um ciclo de lesão e regeneração tecidual, produzindo uma maior necessidade
64
tecidual de ATP, como foi demonstrado no presente estudo. Isto leva a um
maior consumo de oxigênio pela cadeia respiratória mitocondrial, que por sua
vez, aumenta a produção de ERO, que ao superar a atividade antioxidante do
organismo, vai aumentar a atividade inflamatória e consequentemente o ciclo
de lesão e regeneração tecidual será perpetuado. O uso de substâncias
antioxidantes visa à diminuição de radicais livres circulantes e a melhora do
status inflamatório da doença. No presente estudo, a associação NAC + DFX
mostrou ser capaz de reduzir o dano tecidual e diminuir o dano oxidativo a
lipídeos.
O uso de antioxidantes como terapia de diversas doenças, dentre
elas, as DII, abre novas perspectivas como alternativas no tratamento dessas
patologias que promovem sintomas altamente debilitantes ao paciente, e
produzem sentimentos de frustração aos profissionais da área da saúde que
lidam com estes pacientes e muitas vezes não vêem resultados satisfatórios ao
tratamento empregado.
65
6 CONCLUSÕES
1- A colite induzida por DSS produziu aumento da contagem leucocitária.
2- NAC e DFX não interferiram na contagem leucocitária.
3- Não houve diferença nos níveis de proteína C reativa entre os grupos
sem colite e os com colite induzida por DSS.
4- O dano tecidual macroscópico foi amenizado pelo uso de NAC e DFX
utilizados em conjunto ou isoladamente.
5- O dano tecidual microscópico foi mantido quando utilizamos NAC e DFX
isoladamente, e foi amenizado somente no grupo que utilizou NAC
associada ao DFX.
6- Os ratos com colite induzida por DSS apresentaram um aumento da
atividade do complexo IV da cadeia respiratória, que foi neutralizado
pelo uso de NAC e DFX isoladamente ou em associação.
7- A atividade do complexo II da cadeia respiratória, bem como a atividade
da SDH não foi modificada pelo DSS.
8- Não houve dano oxidativo em proteínas, nos ratos com colite induzida
por DSS.
9- Os ratos com colite induzida por DSS apresentaram dano oxidativo a
lipídeos.
10- O uso de DFX ou DFX + NAC preveniu o dano oxidativo a lipídeos.
11- O uso de NAC isoladamente não preveniu o dano oxidativo a lipídeos.
66
7 PERSPECTIVAS
A partir do presente trabalho pretende-se continuar as pesquisas
realizando estudos com fármacos de uso corrente no tratamento das DII, tais
como sulfassalazina, ácido 5-aminosalicílico e corticosteróides, fazendo
comparações quanto à melhora do quadro de dano tecidual e oxidativo em
modelo animal de colite e/ou enterite, em relação aos antioxidantes. Pode-se,
assim, esclarecer mais dados da fisiopatologia e tratamento das DII, visando
identificar novos agentes terapêuticos que apresentem melhora do quadro da
doença com custos e efeitos indesejáveis menores que os fármacos
atualmente disponíveis.
67
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