Transgenia de Plantas

Transgenia de Plantas e
Interações com Insetos
Eliseu J. G. Pereira
Prof. de Entomologia
Prédio da Entomologia, 103b
Ramal 3899-4016
[email protected]
Alguns Conceitos
• Biotecnologia
– Conjunto de tecnologias que possibilitam utilizar, alterar e otimizar
organismos vivos para gerar produtos, processos e serviços
– Áreas de saúde, agropecuária e meio ambiente
• Engenharia genética
– Modificação de um genótipo pela manipulação direta do DNA;
sinônimo de tecnologia do DNA recombinante
– Permite isolar, transferir, duplicar e ativar genes
– Produção de vacinas, de proteínas por microorganismos, terapia
gênica, produção de plantas ou animais transgênicos
• Transgênico
– Denominado organismo geneticamente modificado (OGM) pela
legislação brasileira, é aquele cujo material genético (DNA/RNA)
foi modificado por meio de engenharia genética
Por que utilizar plantas
transgênicas?
O que essas plantas tem a ver
com insetos?
Transgenia de Plantas
• Evolução das plantas silvestres Ö importância da
mutação e seleção natural
• Agricultura Ö origem das plantas cultivadas
• Descoberta do princípios de hereditariedade
• Melhoramento genético
–
–
–
Variabilidade genética silvestre
Indução de mutação
Transgenia
Transgenia para Controle de
Populações de Insetos
• Transgenia de
plantas
• Transgenia de
insetos e inimigos
naturais
Como se Faz uma Planta
Transgênica?
Como se Transfere Genes
de Outros Organismos para
Plantas?
Transferência de Genes
Mediada por Agrobactérias
Fonte: Zanettini & Pasquali, 2004
• Simples, processo
natural
• Exige
compatibilidade
hospedeira
• Apenas plantas
dicotiledôneas
Eletroporação - Transferência de DNA
para células vegetais através de poros
abertos por choque elétrico
Fonte: Zanettini & Pasquali, 2004
Transformação por Aceleração de
Partículas
Fonte: Zanettini & Pasquali, 2004
Após a Transformação…
As células são crescidas em meio de cultura e
a planta é regenerada!
1a Geração de Plantas Transgênicas
para Controle de Insetos
• Proteínas com atividade inseticida
• Principal fonte: Bacillus thuringiensis (Bt)
Colônia de Bt
Célula de Bt
Estrutura
molecular de
Cry1Aa
O que é Bt?
• Bactéria encontrada em solo, folhas de plantas, etc.
• Produz proteínas cristalinas (Cry) durante
esporulação
• São muito tóxicas a larvas de alguns insetos
• Diferentes isolados de Bt produzem diferentes
toxinas, cada uma codificada por um gene
• Nomenclatura das toxinas baseada na atividade e
estrutura
Especificidade e Diversidade de Bt
• Toxinas Cry tem definido espectro de ação
–
–
–
–
Cry1 Ö Lepidoptera
Cry2 Ö Lepidoptera e Diptera
Cry3 Ö Coleoptera
Cry4 Ö Diptera
• Especificidade depende de fatores do inseto:
– pH intestinal
– Enzimas digestivas
– Receptores de membrana no intestino
• Grande diversidade mais de 90 de genes de toxinas
Cry identificados
Como Toxinas de Bt Matam
Insetos?
Ingestão da Toxina
Solubilização pelo pH Alcalino
Ativação Proteolítica
Ligação ao Receptor
Formação de Poro
Lise de Células
Mortalidade
Bt como Agente de Controle
Biológico ou Inseticida
• Disponível há mais de 50
anos
• Não-tóxico para mamíferos e
organismos não-alvo
• Muito específico e age por
ingestão
• Baixa persistência no campo
• Desvantagens superadas
pelo uso em plantas
transgênicas
Desenvolvimento de Plantas Bt
• Eficiente modo de ação e segurança de Bt era
promissor
• Em 1981 – Isolado o 1º gene de Bt
• Em 1987 genes cry1A, de Bt, foram inseridos em
fumo, tomate e batata por meio de transformação
com Agrobaterium tumefasciens
• Expressão ainda insuficiente para proteção das
plantas e foi necessário otimização
E as Monocotiledôneas?
• Em 1995, 1a transformação de
de milho usando aceleração de
partículas, a qual controlava
lagartas com eficiência
• Em 1996 essa primeira geração
de plantas transgênicas
chegava ao mercado nos EUA,
Canadá e Argentina
Adoção da Tecnologia por
Agricultores a Nível Mundial
Países que Adotam Culturas Transgênicas*
Adoção de Plantas
Transgênicas no Mundo
• 134 milhões de ha plantados em 2009, sendo 32%
para controle de insetos
• Crescimento de 60x desde 1996, numa taxa de 13%
ao ano
• Em ordem de área plantada estão EUA, Brasil,
Argentina, Índia, Canadá e China
• 5 principais culturas: Soja 32%, milho 25%, algodão
13% e Canola 5%
• Alta adoção reflete a satisfação dos agricultores
Plantas Transgênicas em Uso
Comercial no Brasil
Quais os Benefícios e Riscos?
• Benefícios
– Uso de genes úteis de
outras espécies
– Redução no uso de
inseticidas perigosos
ao homem e ao meio
ambiente
– Aumento de
produtividade em
alguns casos
• Possíveis problemas
– Fluxo gênico
•
•
•
Vertical
Horizontal
Não sexual
– Segurança alimentar
– Organismos nãoalvos
– Desenvolvimento de
resistência nos
insetos alvos
Benefícios do Uso de Culturas Bt
• Redução no uso de
inseticidas
– EUA
– China
– India
– Austrália
• Aumento de produtividade
– Índia
Redução no Uso de Inseticidas e Aumento de
Produtividade em Algodão Bt na Índia
Medias ± (desvio padrão). *Indica diferença significativa.
Impacto de Plantas
Trangêncicas no Ambiente,
Organismos Não-Alvo e
Segurança Alimentar
Há Risco de Escape Gênico?
• Sim, por causa do fluxo gênico entre plantas
– Fenômeno comum na natureza, contribui para
surgimento de novas combinações gênicas
– Agentes: pólen, sementes ou plantas voluntárias
do cultivo anterior
– Pode ser:
• Vertical – entre indivíduos da mesma espécie
• Horizontal – entre indivíduos de espécies diferentes
• Não sexual – via incorporação de fragmentos de DNA,
p.ex. por bactérias
Fluxo Vertical entre Plantas
• Varia com a espécie e condições ambientais
• Diferenças de % autofecundação entre espécies
– Autógamas: > 95%
• Ex. Soja Ö Baixo risco, 10-20 m de isolamento
– Alógamas: < 5%
• Ex.: Milho , polinização anemófila Ö Alto risco, 200-300 m
– Intermediárias: entre 5 e 95%
• Ex.: Algodão Ö Risco variável, polinização entomófila,
500-800 m
• Medidas para evitar o fluxo gênico variam de
acordo com esses grupos
Risco de Fluxo Gênico no Brasil
Transferência Gênica para
Microorganismos
• Tem que
passar várias
etapas para se
ter impacto
ambiental
• Somente em
condições
ideais (em
laboratório)
• Frequência
baxíssima
Ö10-17
Conseqüências do Fluxo Gênico
• Melhoramento convencional vs. transgenia
– Pela transgenia se introduz combinações gênicas
novas, geralmente com introdução de um caracter
antes inexistente
• Fluxo gênico para as “cultivares” dos
agricultores, que perderiam a identidade –
Fato ou Ficção?
– Apesar da introdução dos híbridos de milho
melhorados nos anos 30, algumas variedades
“crioulas’’ continuam sendo utilizadas e
mantiveram a identidade
Conseqüências do Fluxo Gênico
• E se o transgene fosse
transferido?
– Talvez Bt tenha vantagem seletiva
pela ocorrência de lagartas, ao
contrário da tolerância a herbicidas
• Transferência para ervas
daninhas
– Preocupação maior com tolerância a
herbicidas
• Soja Roundup-Ready
Efeitos em Organismos Não-Alvo
• Dada a especificidade de Bt, é esperado efeito
adverso significante?
• Extensivos testes com fitófagos não-alvos e
insetos benéficos não tem detectado efeito
adverso
• Baixo efeito na biota do solo, como minhocas,
colêmbolas, e microorganismos em geral
• Porém é necessário mais pesquisa de efeito em
processos ecológicos, como decomposição
Processo
para
Determinar
Efeitos de
Plantas Bt
em Inimigos
Naturais
Fonte:
Romeis et al. 2001
Plantas Transgênicas e Inimigos
Naturais de Insetos-Alvo
• Duas tendências gerais
– Nenhuma indicação de efeito direto em IN
– Efeitos adversos observados apenas em estudos com
hospedeiro/presas que são fitófagos suscetíveis às
toxinas Cry
• Mais provável do efeito advir da má qualidade da presa
• Menor ou maior impacto comparado àquele
causado pelo uso de inseticidas químicos?
Segurança Alimentar de Plantas Bt
• Antes da liberação comercial é avaliada a segurança
• Começa desde a concepção da idéia de utilização de
uma proteína inseticida
• Comparado a similaridade com a seqüência de
aminoácidos com algum alergênico e/ou toxina
• Estudos toxicológicos com animais (OMS/FAO)
• Equivalência substancial da proteína a outras da
dieta normal
Segurança Alimentar de Plantas Bt
• Rotulagem
– Europa Ö rotulagem se conter > 1% de soja
ou milho transgênicos
– Brasil Ö também > 1% produtos embalados,
granel ou in natura
• Deve ser informado a espécie doadora do gene
• Se animal, informar se alimentado com ração tendo
ingrediente transgênico
• A cargo da CTNBio – Comissão Técnica
Nacional de Biossegurança
Há Risco de
Adaptação dos
Insetos a Plantas
Transgênicas?
Alta persistência
Alta exposição
Pouco refúgio
Alta Dose
Intensa
Pressão
de Seleção
Resistência a Bt em Insetos
• Seleção em laboratório
– 11 de 18 populações desenvolveram
significativos níveis de resistência (>10x)
• 2 casos de sobrevivência em plantas transgênicas
• No campo
– Traça das crucíferas, Plutella xylostella
– Resistência a plantas transgênicas
• Spodoptera frugiperda em Porto Rico
• Pectinophora gossypiella na Índia
Como o Inseto Alvo Pode se
Tornar Resistente?
• Enzimas digestivas
– Alteração na ativação
ou
– Degradação da toxina
• Ligação ao Receptor
– Redução de ligação,
ou
– Redução de No. sítios
de ligação
• Outros
Fatores que Afetam o
Desenvolvimento de Resistência
• Ecológicos e comportamentais
– Taxa de reprodução, mobilidade/dispersão,
refúgio de exposição
• Genéticos
– Freqüência inicial de genótipos tolerantes,
dominância, número de genes, custo fisiológico
da resistência
• Operacionais
– Uso das plantas transgênicas
– Estratégia de manejo da resistência
RIPPI
National Research
Plantas Transgênicas
Resistentes a Insetos – Avanços
Recentes e Perspectivas para o
Futuro
Institute for Plant-Pest
Interaction
Eliseu José G. Pereira
Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Novas Plantas Transgênicas
Resistentes a Insetos
• Expressão em toda planta ou tecidoespecífica?
– Expressão no floema e epiderme
– Indução por substâncias químicas (p.ex.,
etanol, cobre, tetraciclina, etc.)
– A idéia é criar refúgio dentro da própria
planta, ou em plantas não induzidas ou
que tiveram a expressão interrompida
Plantas Transgênicas com Vários
Genes de Resistência
• Objetivos
– Evitar adaptação pelos insetos - mais de um gene
contra uma mesma espécie de inseto
– Controlar várias espécies de insetos
– Ex.: Expressão Cry1Ac, Cry2A e GNA em arroz
para controle de mastigadores e sugadores
Ampliação do Espectro de Ação
de Toxinas Cry de Bt
• Toxinas Cry tem 3
domínios
– Domínio I
• inserção na membrana
celular do inseto
– Domínio II
• ligação ao receptor,
importante para
especificidade
– Domínio III
• também auxilia na
interação com o
receptor
Diversidade
de proteínas
Cry permite
fazer
modificações
na estrutura
delas
Uso de Lectinas de Plantas
• Atividade inseticida contra insetos sugadores
de seiva, fora do espectro de ação de Bt
• GNA pode também servir como proteína
carreadora de peptídeos inseticidas e
proteínas até a hemolinfa
– Alatostatina-GNA
– SF1-GNA, uma neurotoxina
de Segestria florentina
Segestria florentina
Exemplo de Lectina com Potencial
de Uso
• Lectina de folhas de
alho
– Similaridade com
GNA
– 10x mais potente
– Expressa em fumo,
reduz sobrevivência
de Mizus persicae
Fonte: Guta et al. 2005
Plant Biotech J 3: 601–611
Uso de Inibidores de Enzimas
Digestivas
• Até o presente, plantas transgênicas expressando
IPs têm mostrado eficácia marginal contra insetospraga
• Capacidade adaptativa em insetos fitófagos por
causa da diversidade genética em proteases e baixa
potência de inibidores específicos
• Poderão ser efetivos se adaptação a eles puder ser
superada
Fontes de Outras Toxinas para
Resistência a Insetos
• Toxinas Vip de Bt produzidas na fase
vegetativa da bactéria
–
–
–
Espectro mais amplo
Baixa similaridade com a toxinas convencionais
Algodão transgênico com essas toxinas deve
ser comercializado em breve
• Toxinas de bactérias simbiontes de
nematóides entomopatogênicos
– Photorhabdus e Xenorhabdus
Expressão de Toxina de
Photorhabdus em Plantas
• Lepidoptera: alta
atividade inseticida
• Coleoptera: atividade moderada
Fonte: Liu et al. 2003
Nature Biotech 21: 1307–1313
Mecanismos Endógenos de
Resistência de Plantas
• Existência de estratégias de defesa comuns contra
patógenos e insetos fitófagos
• Conhecimento de mecanismos de resistência nãohospedeira contra patógenos podem ser exploradas
contra insetos
• Entendimento das bases moleculares da resposta a
estresses bióticos devem propiciar manipulação de
genes, padrões de expressão, etc.
Manipulação de Defesas Endógenas
• Elucidar mecanismos
moleculares determinantes da
resposta das plantas à herbivoria
• Decifrar os sinais que regulam a expressão gênica de
resposta
• Moléculas sinalizadoras tais como ácido salicílico, ácido
jasmômico e etileno estabelecem complexas interações
que determinam respostas específicas
O Futuro de Plantas Transgênicas no
Controle de Insetos - Síntese Geral
• Novas fontes de resistência
– Bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus
• Novas estratégias de expressão
– Tecido-específica
– Induzível
• Novas construções gênicas
–
–
–
Expressão de diferentes toxinas na planta
Fusão de proteínas para ampliar espectro de ação
Fusão de proteínas para carrear
neurotoxinas/peptídeos
• Manipulação de defesas endógenas da planta
Fontes de Genes para Resistência
de Plantas a Insetos
• Bactérias
– Bacillus thuringiensis
– Photorhabdus e Xenorhabdus
• Plantas
– Inibidores enzimáticos
– Lectinas
• Animais
–
–
–
Avidina
Peptídeos hormonais
Neurotoxinas
O que Pretendemos no Futuro
• Pesquisas para garantir estável e durável uso
de plantas transgênicas
• Investigação sobre defesas endógenas das
plantas ao ataque de insetos
– Defesas induzidas
– Nível molecular ao ecológico
Sugestões de Leitura
CTNBio - Comissão Técnica Nacional de Biossegurança. 2009.
Disponível na página www.ctnbio.gov.br
Plantas transgências. In: Mir, L. (Ed.), Genômica. Editora Atheneu,
São Paulo, p. 721-734 (Capítulo 35).
Considerações sobre segurança de alimentos geneticamente
modificados. In: Mir, L. (Ed.), Genômica. Editora Atheneu, São
Paulo, p. ? (Capítulo 36).
Organismos geneticamente modificados: impacto do fluxo gênico
modificado. In: Mir, L. (Ed.), Genômica. Editora Atheneu, São
Paulo, p. ? (Capítulo 38).
James, C., 2009. Status Global of Culturas Tansgêncicas: 2009.
ISAAA, Ithaca. Disponível em
www.isaaa.org/resources/publications/briefs/default.asp
Shelton, A.M., Zhao, J.Z., Roush, R.T., 2002. Economic, ecological,
food safety, and social consequences of the deployment of Bt
transgenic plants. Annu Rev Entomol 47, 845-881.