Cultura Celular - ICB-USP

ICB/ DEPTO. DE MICROBIOLOGIA/ VIROLOGIA
Cultivo de vírus animais
O cultivo de um determinado vírus animal é limitado pela necessidade de um tecido vivo em
que as células possuam receptores apropriados, e que sejam suscetíveis à replicação dos vírus após a
penetração no citoplasma. Inicialmente dispunha-se apenas de animais de experimentação em que
se conseguia obter a multiplicação dos vírus, como o vírus da Raiva em coelhos. Hoje em dia essa
prática persiste, sendo um exemplo importante a vigilância de arboviroses (de “artropod-born” ou
veiculado por artrópodes, como os vírus da dengue e febre amarela, transmitidos por mosquitos do
gênero Aedes). Nesse procedimento hemolinfa de mosquitos ou sangue de animais silvestres são
inoculados em cérebro de camundongos neonatos, observando-se ocorre o aparecimento de
sintomas de paralisia quando há presença de um arbovírus. Uma alternativa é a inoculação desses
fluidos nas cavidades (ex.: alantóide) de ovos embrionados (Figura 1), cujo epitélio ou
eventualmente o próprio tecido embrionário seja sucetível à infecção por determinados vírus (por
exemplo, os vírus do Sarampo, Influenza, Polio e Herpes crescem bem nessas condições).
Figura 1- Esquema de inoculação de vírus em ovos embrionados.
O estudo dos vírus animais teve um grande avanço a partir dos anos 40, quando se começou
a utilizar as culturas celulares, desenvolvidas inicialmente por Enders e colaboradores, para a
multiplicação in vitro do vírus da poliomielite.
As células podem ser obtidas a partir de culturas de explante. Essa técnica consiste na
utilização de fragmentos de tecidos ou órgãos, que são cultivados em meio adequado de
crescimento celular. Os fragmentos aderidos à superfície de um frasco apropriado vão liberar
espontaneamente as células, de maneira a formar uma camada monocelular. Essas culturas de
células em monocamada podem também ser preparadas pelo tratamento do tecido original, ou da
linhagem estabelecida já cultivada em frascos, com agentes dispersantes tais como: enzimas
proteolíticas (ex.: tripsina) e/ou substâncias quelantes (ex.: EDTA). Assim, com a retirada das
proteínas, do cálcio e do magnésio, necessários para a ligação na estrutura do tecido ou à superfície
de cultivo (plástico ou vidro), as células são dispersas. Isso é feito em meio nutritivo, sendo que
após algumas horas de incubação as células aderem-se à superfície do novo frasco, e multiplicam se
formando outra camada celular. A esse procedimento é dado o nome de sub-cultivo, passagem ou
repique (Figura 2).
As culturas primárias são derivadas diretamente dos tecidos. Esse tipo de cultura celular é
constituído por células diplóides (contém o mesmo número de cromossomos da espécie que deu
origem à cultura). A cultura primária é geralmente mais sensível que as demais para o cultivo de
vírus, e pode ser utilizada para a produção de vacinas. Entretanto, apresenta algumas desvantagens,
entre elas, a maior dificuldade de obtenção, o alto custo e a possibilidade de contaminação por vírus
latentes. As culturas primárias quando sub-cultivadas, em geral, degeneram e morrem após a
segunda ou terceira passagem.
Figura 2 Esquema indicando como é realizado um subcultivo para propagação de cultura
celular. Um exemplo será realizado através de um filme em sala de aula.
No decorrer de sub-cultivos das culturas primárias, pode haver a seleção de clones, capazes
de sobreviver e se multiplicar por 50 ou mais passagens. Esses clones dão origem às chamadas
linhagens celulares, também denominadas de linhagens estabelecidas ou contínuas, que podem ser
aneuplóides (com número de cromossomos alterado). São sensíveis para o isolamento de vírus e são
de manutenção relativamente fácil. Os estoques devem ser congelados em baixo número de
passagens, e reativados quando necessário, mantendo assim a mesma sensibilidade à infecção.
Quando a cultura de explante é feita a partir de tecido tumoral, em geral as linhagens celulares são
obtidas mais rapidamente e são aneuplóides. Estas podem ser úteis para fins de diagnóstico,
isolamento e propagação de vírus, produção de reagentes, mas não para produção de vacinas.
Outro método, utilizado para a obtenção de culturas celulares, baseia-se no cultivo de células
em suspensão, obtidas de tecido originalmente não aderente ou adaptadas a essa condição. Neste
caso, grandes populações de células podem ser obtidas, sendo úteis para o preparo de grandes
volumes de vírus com altos títulos, como na produção de antígenos para confecção de vacinas ou
reagentes para diagnóstico.
Isolamento de vírus de material clínico
Como vimos acima, os sistemas celulares mais utilizados para o isolamento dos vírus são: as
culturas de células in vitro, os ovos embrionados de galinha e os animais de laboratório. A grande
variedade de métodos e sistemas utilizados no isolamento de vírus de amostras de material clínico
reflete, de fato, que as condições ótimas de isolamento são distintas para cada vírus. Se um
hospedeiro insensível é inoculado com uma amostra contendo determinado vírus, este
provavelmente não será isolado, e um resultado falso negativo será obtido. As culturas celulares
apresentam grande variação na sua suscetibilidade aos diferentes vírus, por exemplo: para o
isolamento de poliovírus as culturas mais indicadas são as culturas primárias de rim de macaco ou
as linhagens celulares de rim de macaco (GMK - rim de macaco verde ou LLC-MK2 - rim de
Macaca mulata) ou ainda linhagens celulares humanas (RD - rabdomiosarcoma humano). Para
adenovírus a linhagem mais indicada é a HEp-2 (carcinoma epitelial humano); para o vírus do
sarampo e o vírus Herpes, a linhagem celular mais indicada é a VERO (rim de macaco verde).
Quando pequenas quantidades de vírus estão presentes numa amostra, um resultado positivo
só pode ser obtido quando o sistema mais sensível é utilizado. Portanto, é muito importante que o
laboratório seja informado da síndrome clínica, ou do vírus suspeito, para que se possa utilizar o
melhor método de detecção. Nenhuma técnica laboratorial (ou cultura celular) no entanto, será
eficiente, se a amostra não for colhida, transportada, armazenada e processada de forma adequada.
As amostras precisam ser colhidas na fase aguda da infecção e sua escolha deve ser
apropriada: fezes, para vírus entéricos; secreção nasal para vírus respiratórios; sangue, para vírus de
transmissão sangüínea, etc. As amostras, quando colhidas com "swab" (tipo de cotonete), devem ser
imediatamente colocadas em solução salina tamponada ou meio de cultura, para evitar que
ressequem com a conseqüente desnaturação dos vírus. De forma geral, todas as amostras devem ser
transportadas em temperatura de geladeira para o laboratório imediatamente, e assim conservadas
até o momento do diagnóstico, para evitar a inativação dos vírus pelo calor.As amostras, antes da
inoculação em culturas celulares, ou antes de serem usadas em qualquer teste de diagnóstico,
deverão ser processadas adequadamente. Esse processamento, de modo geral, inclui fases de
eluição dos vírus da amostra, com uso de salina tamponada; clarificação por centrifugação, para
eliminação de resíduos indesejáveis, e descontaminação com agentes antibacterianos e/ou
antifúngicos. Evita-se assim, que resíduos tóxicos ou microrganismos contaminantes interfiram no
isolamento dos vírus e no diagnóstico.