Alteração molecular

ALTERAÇÕES MOLECULARES
COMO CAUSA DE DOENÇAS
GENÉTICAS
Profa. Dra. Vanessa Silveira
Genoma Humano - DNA
§  Variações genéticas
§  Alterações
§  Erros de replicação do DNA
§  Erros durante a divisão celular
§  Agentes externos
§  Mutagênicos químicos
§  Vírus
Alterações genéticas - mutações
Ø  Somáticas: não
transmissíveis
Ø  Germinativas:
herdáveis
Tecido
somático
Progênie
normal
Tecido
germinativo
Setor
mutante
Progênie
normal
Setor
mutante
Progênie
com mutação
1. Marcadores genéticos
Qualquer característica situada na mesma região em um par de cromossomos
homólogos que permite distinguir um homólogo do outro
Ø  Um locus que tenha alelos facilmente classificáveis e que possa ser usado em
estudos genéticos.
Ø  Pode ser um gene ou um sítio de enzima de restrição, bem como qualquer
característica do DNA que permita que versões diferentes de um locus (ou seu
produto) sejam distintas umas das outras e seguidas nas famílias
Variabilidade genética
Variabilidade genética
q  Modificação no material genético de um organismo
q 
Alteração fenotípica?
q  Fonte da variabilidade
q  Variações no genoma - novos alelos
q  Matéria prima para o processo de evolução
q  Recombinação: Rearranjo da variabilidade
§  Desenvolvimento de marcadores genéticos
Marcadores moleculares - Definição
q  Sequências de DNA herdáveis e distintas
q  São baseados na ocorrência natural de polimorfismos de DNA
q  Adições/deleções de poucas bases
q  Substituições, inserções
q  Deleção/Duplicação
q  Repetições
I. 
Informativos
Polimórficos
II.  Herança co-dominante
III.  Distribuídos aleatoriamente pelo genoma
IV.  Fácil detecção
V.  Reprodutibilidade
2. Tipos de marcadores moleculares
Mutações
Polimorfismos genéticos
SSLP
Microssatélite
STR
SNP
Minissatélite
VNTR
RFLP
CNV
3. Identificação de genes de
doenças humanas
Perspectiva histórica
Linha do Tempo
1865
Gregor Mendel, Leis da hereditariedade
1866
Johann Miescher, Purificação do DNA
1949
Anemia Falciforme, Mutação
1953
Watson and Crick, Estrutura do DNA
1970
Tecnologia do DNA Recombinante
1977
Sequenciamento de DNA
1985
Amplificação In Vitro do DNA (PCR)
2001
Projeto Genoma Humano
Evolução histórica:
¤ 1953: Watson e Crick - Estrutura do DNA
¤ 1956: Estabelecimento do número de cromossomos
¤  A genética especialidade clínica;
¤ 1959:
¤  Síndrome de Down.
¤  Anormalidades cromossômicas
¤  Translocação, mosaicos, triploidias e microdeleções.
Evolução Histórica:
q  1960-1973: Cromossomo Filadélfia
q  Técnicas de identificação de cromossomos
q  Citogenética-molecular
q  Mapeamento citogenético
q  Hibridização in situ
•  Técnicas de mapeamento:
•  1968: Gene do Daltonismo
•  1980: Análise de células somáticas através do uso de sondas
•  1983-1993: Mapeamento do 1º gene - Doença de Huntington
Mapeamento gênico
Mapa gênico humano
§  30.000 genes nos 24 cromossomos
§  Identificação de genes responsáveis por doenças humanas
§  Aplicação ao diagnóstico a aconselhamento genético
Mapeamento genético
Análise de ligação
Mapeamento físico
Reflexo da distância física
Era Pós Genoma
Métodos de mapeamento
Método
Objetivo
Híbridos de células somáticas (roedor/ Localização no cromossomo
humana)
Mapeamento de híbrido de radiação Localização regional
Análise de dosagem gênica
Cromossomo X e regional
Hidridização in situ com fluorescência Cromossomo/regional dentro de uma
(FISH)
banda
FISH de fibra de cromatina/restrição Mapeamento fino da região gênica
de longo alcance
C l o n a g e m e m c r o m o s s o m o s Clonagem gênica (fragmentos
artificiais/ bactérias
grandes ou médios e pequenos)
Reação em cadeia da polimerase Clonagem e mapeamento gênico
(PCR)
Sequenciamento de DNA
Sequência de nucleotídeos
Ø  Cromatografia Líquida desnaturante
Ø  Sequenciamento
Indivíduo com alteração
4. Diagnóstico de doenças
genéticas
Diagnóstico molecular
q  Detecção de alterações no DNA ou RNA
q  Viabilizar o diagnóstico, detecção, sub-classificação,
prognóstico, etc
q  Expansão do conhecimento científico
q  Identificação de indivíduos e determinação de risco
de doenças específicas
q  Diagnóstico molecular - Revolução
Base do diagnóstico molecular
Causa
Mecanismo
(Patogênese)
Alterações estruturais
Consequências funcionais
Impacto
Hematologia
Oncologia
Farmacogenômica
Marcadores
moleculares
Identificação
Indivíduos
Doenças
genéticas
Entendimento da patogênese molecular das doenças
humanas permite o uso efetivos dos ensais moleculares
q  Diagnóstico
q  Prognóstico
q  Terapia: predição de resposta terapêutica
q  Mutações que diminuem a eficiência do tratamento em
cancêr de pulmão por exemplo (k-ras, p53)
Hemoglobinopatias
Ø Anemia Falciforme
Ø  Talassemias
Ø  Medicina Forense
Ø  Mapeamento genético
Ø  Medicina clínica
Ø Interferência na expressão gênica
Ø  eQTL - Expression quantitative trait loci
Ø  Variantes genéticas que interferem com a expressão de
genes associados a doenças complexas
Ø  Ex. Obesidade
Anemia Falciforme
Hemáceas normais
¤  Causa:
¤  Substituição de um único
nucleotídeo
¤  cadeia B da hemoglobina
¤  Linus Pauling
¤  Determinou o início do
diagnóstico molecular
Hemáceas
falciformes
¤  Genótipos:
¤  HbA HbA – Hemáceas normais
¤  HbS HbS – Anemia servera; hemáceas em forma de foice
¤  HbA HbS – Não ocorre anemia, mas hemáceas adquirem
forma de foice sob baixas concentrações de oxigênio
q  Alelos: HbA, HbS
q  Códon CAG- CTG
Hemáceas normais
Hemáceas falciformes
Hemoglobinopatias
Ø  Variantes
Ø  S, Anemia falciforme
Ø  C, D Los Angeles
Ø  Talassemias
Ø  Alfa
Ø  Beta
Desordens neuromusculares
Ø  Distrofia Muscular de Duchene
Ø  Distrofia de Becker
Ø  Atrofia muscular espinhal (SMN1)
Ø  Deteção de portadores
Procedimento
cirúrgico
Teste para aberrações
cromossômicas
Distrofia Muscular de Duchene
Microssatélites X Desordens de repetição
¤  Doença de Huntington
¤  Autossômica dominante
Huntington
¤  Acúmulo de Repetições ..CAG..
¤  Penetrância influenciada pela idade
Normal
Desordens genéticas
Ø  Desordens trombóticas
Ø  Mutações
Ø  Fator de Leyden
Ø  Fator II
Ø  Demais desordens
Ø  Fibrose cística: 4 mutações
Ø  Doença de Tay Sachs
Ø  Síndrome do X Frágil
Ø  Síndrome de Frederich (Ataxia)
Ø  Distrofia muscular miotônica
Ø  PCR
Ø  Sequenciamento
Oncologia
q  Diagnóstico
q  Estratificação de grupos de risco
q  Seguimento terapêutico
q  Amplificação MYCN – Neuroblastoma
q  Translocações
q  Síndrome mielodisplásica
q  t9;22
q  t4;11
q  Leucemia mielóide crônica
q  t12;21
q  Leucemia linfóide aguda
q  Doença residual mínima
q  Marcadores de rearranjos de imunoglobulina
q  Identificação clonal
Cromossomo filadélfia- Ph1
Leucemia mielóide crônica
ü  Tirosino quinase
46, XX, t(9;22)(q34; q11.2)
ü  Imatinibe
Aplicação em genética médica
Ø  Utilização como marcador genético: análise de ligação
Ø  Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas
Ø  Detecção de portador heterozigoto
Ø  Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças
complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete
Ø  Teste de paternidade e aplicações forenses
Ø  Tipagem tissular para transplante de órgão
Exercício de fixação
q  Descrever uma aplicação do uso de alterações moleculares em
medicina clínica
q  Caracterização da alteração molecular
q  Doença