DENV

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL
DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PERFIL DE CITOCINAS PRODUZIDAS POR
MONÓCITOS E CÉLULAS DENDRÍTICAS
INFECTADAS COM VÍRUS DENGUE-2 (DENV),
FEBRE AMARELA VACINAL (FAVac) E
QUIMÉRICOS (FAVac/DENV)
MARIANA GANDINI
Rio de Janeiro
Novembro 2006
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL
DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PERFIL DE CITOCINAS PRODUZIDAS POR
MONÓCITOS E CÉLULAS DENDRÍTICAS
INFECTADAS COM VÍRUS DENGUE-2 (DENV),
FEBRE AMARELA VACINAL (FAVac) E
QUIMÉRICOS (FAVac/DENV)
MARIANA GANDINI
Monografia de graduação apresentada à disciplina de Imunologia do
Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do
Estado do Rio de Janeiro, com vistas à obtenção do Bacharelado em
Biomedicina, com área de concentração em Imunologia.
Rio de Janeiro
Novembro 2006
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
Gandini, Mariana
Perfil De Citocinas Produzidas Por Monócitos E Células Dendríticas Infectadas
Com Vírus Dengue-2 (DENV), Febre Amarela Vacinal (FAVac) E Quiméricos
(FAVac/DENV)/ Gandini, Mariana-2006 xvii 90fls
Orientadora: Claire Fernandes Kubelka
Monografia – Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde
1. Dengue. 2. Células dendríticas. 3. Vírus quiméricos. 4. Citocinas. I. Kubelka,
Claire Fernandes. II. Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro. III. Título.
iii
Monografia realizada sob orientação científica da Drª. Claire Fernandes
Kubelka, pesquisadora titular do Laboratório de Imunologia Viral do
Departamento de Virologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, e
orientação acadêmica da Profª. Drª. Rosa Maria Tavares Haido, professora
adjunta da disciplina de Imunologia do Departamento de Microbiologia e
Parasitologia da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
(UNIRIO).
iv
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL
DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PERFIL DE CITOCINAS PRODUZIDAS POR MONÓCITOS E CÉLULAS
DENDRÍTICAS INFECTADAS COM VÍRUS DENGUE-2 (DENV), FEBRE
AMARELA VACINAL (FAVac) E QUIMÉRICOS (FAVac/DENV)
MARIANA GANDINI
ORIENTADOR CIENTÍFICO:
__________________________________
Drª. Claire Fernandes Kubelka
ORIENTADOR ACADÊMICO:
__________________________________
Profª. Drª. Rosa Maria Tavares Haido
BANCA AVALIADORA:
________________________________
Profª. Drª. Rosa Maria Tavares Haido
_________________________________
Drª. Elzinandes Leal de Azeredo
__________________________________
Drª. Luzia Maria de Oliveira Pinto
Aprovado em 27 de Novembro de 2006
Rio de Janeiro
Novembro 2006
v
DEDICATÓRIA
Dedico esta monografia a minha mãe e ao meu
pai, que sempre me incentivaram desde pequena
a estudar e a seguir os meus sonhos, não
importando as dificuldades da vida. Obrigada por
sempre me guiarem no caminho do
conhecimento e por acreditarem na minha
capacidade.
vi
AGRADECIMENTOS
À Deus pela força para suportar todos os percalços do caminho.
Aos meus pais Luiz e Miriam e irmãos Felipe e Gabriel pelo amor, carinho,
apoio, amizade e, principalmente, pelo aprendizado em família, que é a principal escola da
vida. Mãe e Biel, obrigada por suportarem sem reclamar o meu mau humor.
Aos meus queridos avós Therezinha e Miranda, por todo incentivo e carinho
dispensados em todos os momentos da vida.
Ao Pedro, Igor e Juan, que sempre estiveram ali todas as vezes que as forças
me faltaram, sempre com palavras de incentivo e carinho. Obrigada pelos momentos felizes e
pelo alento que vocês me proporcionam.
À todos meus amigos de Cabo Frio, principalmente Lilia e Marcela, por
simplesmente terem feito a diferença. Apesar da distância, sempre os guardo na lembrança.
À toda equipe do Laboratório de Imunologia Viral, que mais que colegas de
trabalho, são amigos: Sônia e Patrícia (pelos experimentos com monócitos e pela paciência
em ensinar), Naide (pela grande ajuda no citômetro), Denise (pela ajuda com as DCs e com os
vírus), Amanda, Fábio (pelas altas horas e fins de semana de trabalho), Allan, Mariana,
Alessandro, Karina, Nathalia, Cynthia, Maryrose e Waldir (pelas inúmeras caronas). Meu
muito obrigado pelas inúmeras horas de trabalho, risos e brincadeiras.
À Drª. Claire Kubelka, por ter aceitado me orientar neste trabalho, pelas
oportunidades concedidas e por todo ensinamento ministrado.
À Drª. Myrna Bonaldo, ao Dr. Ricardo Galler e à equipe do Laboratório de
Biologia Molecular de Flavivírus pelo fornecimento do vírus quimérico utilizado neste
trabalho.
vii
Ao Dr. Marcos Freire e à equipe do LATEV/Biomanguinhos pelo apoio no
crescimento das massas virais e titulação dos vírus.
À todos professores da UNIRIO pela paciência e pelos conhecimentos
ministrados. Obrigada àqueles que ultrapassam os limites de mestres e se tornaram
companheiros.
À todos funcionários do Departamento de Virologia, que direta e indiretamente
participaram deste trabalho.
Ao CNPq e à FIOCRUZ pelo apoio científico e financeiro.
À todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a minha formação.
viii
RESUMO
O vírus Dengue causa a mais comum arbovirose do mundo. As manifestações clínicas
causadas pelo Dengue variam das formas brandas, como a Febre do Dengue, às mais graves,
ou Febre Hemorrágica do Dengue/Síndrome do Choque do Dengue - caracterizadas pela febre
aguda, mialgia e extravasamento de plasma, onde tem sido destacado o papel dos mediadores
imunológicos. As células dendríticas e os monócitos são alvos do vírus Dengue que induz a
produção de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral – alfa (TNF-α) e
também do interferon – alfa (IFN-α), uma citocina antiviral. Um vírus quimérico candidato à
vacina contra o Dengue foi criado utilizando o vírus Febre Amarela Vacinal e uma cepa de
Dengue-2. Para melhor compreender a interação do sistema imunológico humano com esses
vírus, foi utilizado um modelo de infecção in vitro, primeiramente em monócitos e também
em células dendríticas. Foi possível verificar que o vírus Dengue-2 (cepa 16681) foi capaz de
reproduzir em monócitos um perfil de citocinas semelhante ao encontrado em pacientes. Em
células dendríticas, observamos a maior detecção de antígenos para o Dengue-2 genótipo
asiático (16681) em comparação ao Dengue-2 genótipo brasileiro (44/2), vírus Febre Amarela
Vacinal e ao vírus quimérico, demonstrando a alta virulência cepa asiática, suportada pelas
altas concentrações de TNF-α encontradas. O vírus Dengue-2 genótipo brasileiro (44/2)
exibiu infecção produtiva quando uma alta carga viral foi inoculada, além da alta produção de
TNF-α. Ambos os vírus Dengue-2 apresentaram produção tardia de IFN-α, corroborando a
inibição exercida pelo Dengue na via de sinalização desta citocina. Para os vírus Febre
Amarela Vacinal e quimérico, o IFN-α induzido foi precoce e em altos níveis. Além disso, foi
possível visualizar, em um painel de citocinas, a baixa produção de TNF-α e IL-6 por estas
cepas. A alta produção de IFN-α indica que esta citocina possa estar envolvida na imunidade
vacinal induzida pelo vírus Febre Amarela Vacinal. A semelhança desse perfil observada na
cepa quimérica indica um bom prognóstico deste vírus como candidato à vacina.
ix
ABSTRACT
Dengue virus causes the most common arbovirosis worldwide. Dengue clinical
manifestations range from mild (Dengue Fever) to severe forms (Dengue Haemorrhagic
Fever/Dengue Shock Syndrome). Among the classical symptoms are acute fever, mialgia and
plasma leakage where immunological mediators play a key role in pathogenesis. Dendritic
cells and monocytes are targets for Dengue virus that induces proinflammatory cytokines,
such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and also an antiviral cytokine interferon-alpha
(IFN-α). A chimeric virus vaccine candidate was constructed using vaccinal Yellow Fever
virus as backbone and one Dengue-2 strain. An in vitro infection model was used with
monocytes and dendritic cells to further understand interactions of the immune system with
those viruses. We could observe that DENV-2 (16681 strain) induced in monocytes a similar
cytokine profile as one of these found in patients. Dendritic cells exhibit higher antigen
detection for DENV-2 Asian genotype (16681 strain) than Dengue-2 Brazilian genotype
(44/2), vaccinal Yellow Fever virus and chimeric virus. High virulence of Asian strain is
supported by enhanced TNF-α production. Dengue-2 Brazilian genotype (44/2) infected
productively with TNF-α production when inoculated with high viral loads. Both Dengue-2
viruses demonstrated low and late IFN-α concentrations, supporting the concept of IFN-α
signaling inhibition by Dengue virus. On the other hand, high and early IFN-α concentrations
and low proinflammatory TNF-α and IL-6 were found for vaccinal Yellow Fever and
chimeric viruses. A participation of IFN-α in vaccinal immunity indicates a good prognostic
value for this chimeric virus vaccine.
x
LISTA DE ABREVIATURAS
ADE = Facilitação dependente de anticorpo (do inglês antibody-dependent enhancement)
AP-1 = Fator de transcrição proteína ativadora-1 (do inglês activating protein-1)
APC = Célula apresentadora de antígeno (do inglês antigen-presenting cell)
BDCA-2 = Antígeno de célula dendrítica plasmacitóide
CCL = Ligante de quimiocina motivo CC
CCR = Receptor de quimiocina motivo CC
CD80 = do inglês cluster differentiation
cDC = Célula dendrítica convencional
CMV = Citomegalovírus
CXCR = Receptor de quimiocina motivo CXC
DC = Célula dendrítica (do inglês dendritic cell)
DC-SIGN = Ligante de molécula de adesão intercelular não integrina específica de DC (do
inglês DC-specific ICAM-grabbing nonintegrin)
DENV = Vírus Dengue
DSAC = Dengue com sinais associados ao choque
ELISA = Método Imunoenzimático (do inglês Enzime-linked Immunossorbent Assay)
FAV = Vírus Febre Amarela Vacinal
Fc = Fragmento cristalizado
FcαR, FcγR, FcεR = Receptor para porção Fc de anticorpos classe A (α), γ (G), ε (E)
FD = Febre do Dengue
FHD = Febre Hemorrágica do Dengue
GM-CSF = Fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (do inglês
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
GRP78/BIP = Proteína reguladora de glicose 78
HCV = Vírus da Hepatite C
HIV = Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA = Antígeno leucocitário humano (do inglês human leukocyte antigen)
IFN = Interferon
IL = Interleucina
imDC = Células dendríticas imaturas
iNOS = óxido nítrico sintetase induzida
JAK = quinase de Janus (do inglês Janus Kinase)
LC = Célula de Langerhans (do inglês Langerhans cells)
LPS = Lipopolissacarídeo
MDDC = Células dendríticas derivadas de monócitos (do inglês monocyte-derived dendritic
cells)
MFI = Intensidade média de fluorescência (do inglês mean fluorescence intensity)
MHC = Complexo de histocompatibilidade principal (do inglês major histocompatibility
complex)
MIP-3β = Proteína inflamatória de macrófago-3β (do inglês macrophage inflammatory
protein-3β)
MOCK = Sobrenadante de cultura celular
MOI = multiplicidade de infecção (do inglês multiplicity of infection)
NC = Nucleocapsídeo
NF-κB = Fator de transcrição nuclear κB (do inglês nuclear factor-κB)
xi
NK = Célula Natural Killer
OMS = Organização Mundial de Saúde
OPAS = Organização Panamericana de Saúde
ORF = do inglês open reading frame
pDC = Célula dendrítica plasmacitóide
Proteína C = Proteína do capsídeo
Proteína E = Proteína do envelope
Proteína M = Proteína de membrana
Proteína NS = Proteína não estrutural (do inglês nonstructural)
PRR = Receptores de reconhecimento de padrões moleculares (do inglês pattern recognition
receptors)
RIG-I = do inglês retinoic-acid inducible gene-I
RNA = Ácido ribonucléico (do inglês ribonucleic acid)
SCD = Síndrome do Choque do Dengue
SFB = Soro Fetal Bovino
SIV = Vírus da Imunodeficiência dos símios
STAT = Transdutor de sinal e ativador de transcrição (do inglês signal tranducer and
activator of transcription)
TAP = Transportador associado ao processamento antigênico
TCR = Receptor de célula T
TGF-B = Fator de crescimento transformante-β (do inglês transforming grownth factor-β)
Th = do inglês T helper
TLR = Receptor Toll-like
TNF-α = Fator de necrose tumoral-α (do inglês tumor necrosis factor-α)
YFV = Vírus da Febre Amarela
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura I: Sorotipos circulantes do Dengue por estados, Brasil, 2004
4
Figura II: Flavivírus: Sorocomplexos, Clades e Clusters dos vetores de
5
transmissão
Figura III: Organização estrutural do DENV
7
Figura IV: Função efetora das células dendríticas
24
Figura 1: Titulação em monócitos infectados com DENV-2
52
Figura 2: Cinética em monócitos infectados com DENV-2
53
Figura 3: TNF-α produzido por monócitos infectados com DENV-2 detectados por
53
ELISA
Figura 4: Cinética da produção de citocinas em monócitos infectados com DENV-
54
2 detectados por Luminex®
Figura 5: Caracterização fenotípica das populações de monócitos e de células
55
dendríticas originados de PBML
Figura 6: Caracterização da população de células dendríticas pela expressão de
56
CD1a
Figura 7: Caracterização da população de células dendríticas mediante a adição de
57
LPS e IFN-γ
Figura 8: Padrões do FACS para antígenos de DENV e FAVac durante infecção in
vitro de células dendríticas por diferentes vias (doador 1)
xiii
58
Figura 9: Comparação da infecção de DCs pelas cepas virais DENV-2 AS, DENV-
59
2 BR, FAVac e FAVac/ DENV-2 em dois doadores infectados com MOI 4
Figura 10: Produção de TNF-α por DCs infectadas pelas cepas virais DENV-2 AS,
60
DENV-2 BR, FAVac e FAVac/ DENV-2 com MOI 4
Figura 11: Produção de IFN-α por DCs infectadas pelas cepas virais DENV-2 AS,
61
DENV-2 BR, FAVac e FAVac/ DENV-2 com MOI 4
Figura 12: Infecção e produção de IFN-α e TNF-α em DCs infectadas pelas cepas
62
virais DENV-2 AS, FAVac e FAVac/DENV-2 com MOI 4 (Doador 1)
Figura 13: Cinética de infecção e produção de TNF-α e IFN-α por DCs infectadas
63
pela cepa viral DENV-2 BR com MOI 15
Figura 14: Cinética da produção de citocinas em DCs infectadas com DENV-2 AS
64
®
(16681), FAVac/DENV-2 (44/3) e FAVac (17DD) detectados por Luminex
(doador 2)
Figura 15: Esquema de hipótese para a interação vírus-células dendríticas
xiv
73
ÍNDICE
1 – INTRODUÇÃO
1
1.1 – Histórico e epidemiologia do dengue
1
1.2 – O Vírus dengue
4
1.2.1 – A família Flaviviridae
4
1.2.2 – Variações genéticas do vírus dengue
6
1.2.3 – Características estruturais do vírus dengue
6
1.2.4 – Sítios de infecção
8
1.2.5 – Ciclo de transmissão
9
1.2.6 – Manifestações clínicas
9
1.2.6.1 – Febre do dengue
9
1.2.6.2 – Febre hemorrágica do dengue, síndrome do choque do
10
dengue e outras formas graves
1.2.7 – Patogênese do dengue
11
1.2.7.1 – Teoria da facilitação dependente de anticorpos
11
1.2.7.2 – Teoria da virulência viral
12
1.2.7.3 – Teoria do “pecado original”
13
1.2.7.4 – Teoria do mimetismo molecular
13
1.2.7.5 – Teoria do polimorfismo genético
14
1.2.7.6 – Teoria da interação multifatorial
14
1.2.7.7 – Imunopatologia do dengue
14
1.3 – Células do sistema fagocitário mononuclear
16
1.3.1 – Monócitos e macrófagos
16
1.3.2 – Células dendríticas
18
1.3.2.1 – Origem in vivo e subpopulações das células dendríticas
18
1.3.2.2 – Captura de antígenos pelas células dendríticas
20
1.3.2.3 – Maturação e migração das células dendríticas
22
1.3.2.4 – Células dendríticas e citocinas
23
1.3.2.5 – Células dendríticas nas infecções virais
27
1.4 – Vacinas
28
1.4.1 – Vacinas para o dengue
29
xv
2 – OBJETIVOS
32
3 – MATERIAL E MÉTODOS
33
3.1 – Cepas virais
33
3.2 – Produção de massas virais
33
3.2.1 – Meio de cultura e cultivo de células C6/36
33
3.2.2 – Produção do estoque viral em células C6/36
34
3.2.3 – Titulação viral por ensaios de diluição seriada
34
3.2.4 – Meio de cultura e cultivo de células vero
35
3.2.5 – Produção do estoque viral em células vero
36
3.2.6 – Titulação por unidades formadoras de placa
36
3.3 – Leucócitos mononucleares do sangue periférico
3.3.1 – Monócitos
37
37
3.3.1.1 – Obtenção de monócitos
37
3.3.1.2 – Infecção de monócitos
38
3.3.2 – Células dendríticas
38
3.3.2.1 – Cultura de células dendríticas
38
3.3.2.2 – Infecção de células dendríticas
38
3.4 – Citometria de fluxo
39
3.4.1 – Marcação extracelular para marcador de superfície
39
3.4.2 – Marcação intracelular para antígeno viral
39
3.5 – Detecção de citocinas nos sobrenadantes das culturas
40
3.6 – Material e reagentes
42
3.6.1 – Meios de cultura
42
3.6.2 – Reagentes
42
3.6.3 – Soluções
43
3.6.4 – Anticorpos
45
4 – RESULTADOS
46
4.1 – Padronização da infecção in vitro de DENV-2 em monócitos
46
4.1.1 – Titulação da diluição do inóculo viral do DENV-2 (cepa 16681)
46
4.1.2 – Cinética viral do DENV-2
47
4.1.3 – Cinética de produção de citocinas induzidas pelo DENV-2 em
47
monócitos
4.2 – Caracterização morfológica e fenotípica das culturas de monócitos e de
xvi
48
células dendríticas
4.3 – Interações entre as células dendríticas e os vírus DENV-2, FAVac e
49
quimérico (FAVac/DENV-2)
4.3.1 – Cinéticas de infecção dos vírus DENV-2, FAVac e quimérico
49
(FAVac/DENV-2)
4.3.2 – Produção de citocinas pelas células dendríticas infectadas com os
50
vírus DENV-2, FAVac e quimérico (FAVac/DENV-2)
5 – DISCUSSÃO
65
6 – CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
74
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
ANEXO
89
Anexo 1: Curvas padrões e cálculos do ELISA
xvii
90
1
1 - INTRODUÇÃO
A Febre do Dengue (FD) e suas formas graves como a Febre Hemorrágica do Dengue
(FHD) são causadas pelos vírus Dengue, pertencentes à família Flaviviridae do gênero
Flavivirus. Existem quatro sorotipos do vírus: Dengue-1 (DENV-1), Dengue-2 (DENV-2),
Dengue-3 (DENV-3) e Dengue-4 (DENV-4), que são classificados de acordo com critérios
imunológicos e biológicos (Halstead, 1990; Malavige, Fernando et al., 2004) e todos capazes
de causar os variados quadros patológicos do Dengue (Gubler, 1997).
Antigamente uma doença de ocorrência esporádica, a FD se tornou a arbovirose
(doença transmitida por artrópodes) mais difundida no mundo e está presente em todos os
continentes, exceto na Europa. As áreas tropicais são as mais atingidas pelo fato de estarem
densamente povoadas pelo mosquito transmissor Aedes aegypti, que é responsável pela
manutenção do ciclo de transmissão do vírus (Gubler, 1998). Atualmente, existem de dois e
meio a três bilhões de pessoas com risco de contrair a doença. As estimativas indicam que
anualmente ocorram cem milhões de casos da Febre do Dengue e quinhentos mil casos da
Febre Hemorrágica do Dengue (Malavige, Fernando et al., 2004).
1.1 - Histórico e epidemiologia do dengue
Estudos relatados na literatura propõem que o DENV teria sido originado em um ciclo
silvestre entre mosquitos do gênero Aedes e primatas inferiores. Sabe-se que esses vírus são
muito bem adaptados aos mosquitos hospedeiros. Sendo assim, a dispersão do vírus estaria
intimamente ligada ao povoamento do vetor pelo mundo. Com a expansão das fronteiras
habitacionais, o vírus iniciou um ciclo peri-doméstico nas áreas rurais, intensificando o
contato com os humanos. A expansão comercial através de navios possibilitou a colonização
de outros continentes pelo Aedes e, consequentemente, a dispersão do vírus (Gubler, 1997).
Vários casos de FD foram registrados nos séculos dezessete, dezoito e dezenove, e a
partir de 1780, foram relatados casos esporádicos com manifestações hemorrágicas graves ou
fatais. Em razão dos intervalos relativamente longos entre as epidemias apresentando os casos
hemorrágicos, não foram consideradas importantes ao ponto de caracterizarem um problema
de saúde pública mundial (Gubler, 1997).
A emergência de epidemias FD/FHD começou no continente asiático, na região do
Pacífico. O cenário da Segunda Guerra Mundial propiciou a mudança da estrutura
2
epidemiológica local, decorrente dos desmatamentos e do aumento da população, o que
intensificou o contato do Aedes aegypti com o homem. Epidemias periódicas ocorreram na
região e um quadro de hiperendemicidade (co-circulação de multiplos sorotipos do vírus
Dengue) se estabeleceu em diversos países (Gubler, 1997).
A FD surgiu nas Américas ainda durante a Segunda Guerra Mundial e evidências
apontam uma endemia pelo DENV-2 na região do Caribe (Ehrenkranz, Ventura et al., 1971),
porém, a primeira epidemia americana foi registrada em 1963. Uma das explicações para este
fenômeno é a erradicação do mosquito transmissor na região, visto que uma intensa campanha
de combate ao vetor Aedes aegypti estava sendo realizada, nas décadas de 40 e 50, pela
Organização Panamericana de Saúde (OPAS), que tinha por objetivo diminuir a transmissão
urbana do vírus da Febre Amarela. Com a descontinuação do programa, foi possível a
reinfestação do mosquito e ressurgimento das epidemias de FD (Gubler, 1997).
A primeira epidemia de FD nas Américas ocorreu em 1963 na Jamaica e em Porto
Rico e o DENV-3 foi o sorotipo responsável (Gubler, 1987). Até o início da década de 80, a
FD foi caracterizada como hipoendêmica (circulação de um sorotipo por vez em um
determinado país) e além das epidemias causadas pelo sorotipo DENV-3, também foram
registradas incidências do DENV-2 na Jamaica e Porto Rico (1969) e do DENV-1 na Jamaica
e em Cuba (1977), e em Porto Rico e na Venezuela (1978). Em 1981, Cuba registra a primeira
epidemia de FHD com a Síndrome do Choque do Dengue (SCD) nas Américas, seguida pela
Venezuela em 1989/90. O sorotipo DENV-2 causador foi relacionado com os casos fatais e
provavelmente era um cepa proveniente do Vietnã (Rico-Hesse, 1990).
Sendo um dos países que aderiram ao programa de erradicação da OPAS, o Brasil
conseguiu erradicar o mosquito Aedes nas décadas de 50 e 60 (Franco, 1961). Este fato
explicaria o ressurgimento do vírus no país apenas no início da década de 80, já que existem
relatos de doenças similares a FD registradas em 1923 (Figueiredo, 2000).
Em 1981, em Boa Vista no estado de Roraima, ocorreu a primeira epidemia de FD
diagnosticada laboratorialmente no Brasil e os sorotipos responsáveis foram o DENV-1 e o
DENV-4 (Osanai, Travassos Da Rosa et al., 1983). O vírus DENV-1 continuou a se
disseminar pelo Brasil, causando epidemias no Rio de Janeiro, Ceará e Alagoas em 1986
(Schatzmayr, Nogueira et al., 1986); e Mato Grosso do Sul, Bahia e Pernambuco em 1987
(Vasconcelos, Mota et al., 2000). Em 1990, foi detectado o sorotipo DENV-2 pela primeira
vez no Brasil, no estado do Rio de Janeiro, e a circulação simultânea do DENV-1 e DENV-2
foi correlacionada com o aparecimento dos primeiros casos de FHD no estado (Nogueira,
Miagostovich et al., 1990). No Ceará, em 1994, foi relatada a circulação do sorotipo DENV-2
3
e foram diagnosticados dezenas de casos de FHD em Fortaleza (Vasconcelos, Lima et al.,
1998). Nos anos de 1996 e 1997, foram relatados respectivamente, casos de DENV-1 e
DENV-2 no estado do Pará totalizando 17.440 indivíduos infectados (Trravassos Da Rosa,
Vasconcelos et al., 2000).
O sorotipo DENV-3 foi inserido no país em Limeira (1999), estado do São Paulo, de
um caso importado da Nicarágua, mas casos autóctones só foram relatados em 2001 no estado
do Rio de Janeiro (De Simone, Nogueira et al., 2004). Em 2002, o DENV-3 foi responsável
pela maior epidemia no Rio de Janeiro de FD, sendo registrados no Brasil 780.644 casos de
FD e 2.607 casos de FHD (O.P.A.S., 2002). Casos de FHD foram relatados nos anos
seguintes, mas com incidências menores que o ano de 2002 (Secretaria-de-Vigilância-emSaúde, 2005a). No ano de 2005 mais de 200 mil casos foram registrados no país (SecretariaDe-Vigilância-Em-Saúde, 2005b). Neste ano de 2006, no período de Janeiro a Março, no
Brasil, 77.847 casos de FD foram notificados, sendo 57 de FHD (Secretaria-de-Vigilânciaem-Saúde, 2006).
Foi constatada uma mudança no panorama epidemiológico dos casos de FD/FHD no
Brasil caracterizada pela transição de surtos epidêmicos (1986-1993) para um quadro de
endemia com subseqüentes epidemias periódicas (Siqueira, Martelli et al., 2005). O aumento
da incidência de FHD tem sido associado com a presença de infecções seqüenciais na
população, uma vez que foi constatado um maior número de casos após a introdução do
terceiro sorotipo no país. Com base neste argumento, o surgimento do sorotipo DENV-4 no
país poderá agravar o número de casos de FHD nas próximas epidemias, já que a circulação
autóctone pelos sorotipos 1, 2 e 3 está estabelecida em 24 estados de acordo com a figura I
(Secretaria-de-Vigilância-em-Saúde, 2005a).
4
Fonte: Serviço de Vigilância Epidemiológica/Ministério da Saúde
Figura I: Sorotipos circulantes do DENV por estados, Brasil, 2004.
1.2 - O vírus dengue
1.2.1 - A família Flaviviridae
Inicialmente os flavivírus foram classificados como arbovírus do grupo B na família
Togaviridae juntamente com os alfavírus (grupo A). Os dois grupos eram diferenciados
através de testes de inibição de hemaglutinação. Ensaios bioquímicos e testes moleculares
demonstraram diferenças suficientes nos flavivírus para a criação de uma nova família: a
Flaviviridae. Recentemente o gênero Pestivirus, que inclui o vírus da Hepatite C, foi
classificado na família. Em resumo, a família é composta de três gêneros: Pestivirus,
Hepacivirus e Flavivirus (Solomon e Mallewa, 2001).
O gênero Flavivirus é o maior da família compreendendo mais de 70 vírus, sendo
aproximadamente a metade destes causadores de doenças. A maioria dos flavivírus são
arbovírus (vírus transmitidos por artrópodes), sendo 40 transmitidos por mosquitos, 16 por
carrapatos e 18 vírus têm vetor desconhecido. Em geral, os flavivírus são zoonoses, que não
dependem do ser humano para sua manutenção, com a exceção do DENV. Os seres humanos
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são hospedeiros acidentais que não contribuem para o ciclo de transmissão natural.
Entretanto, o DENV se adaptou completamente aos seres humanos, sendo mantido em
grandes áreas urbanas através da transmissão pelo vetor e não dependendo de reservatórios
animais (Mackenzie, Gubler et al., 2004). Existem vários hospedeiros intermediários que
podem estar envolvidos como reservatórios dos flavívirus na natureza: pássaros para alguns e
roedores, primatas e marsupiais, para outros vírus (Monath e Heinnz, 1996).
Podemos classificar os integrantes desse gênero de acordo com critérios sorológicos
em complexos antigênicos ou em cluster e clades de acordo com a filogenia molecular como
demonstra a figura II. Os vírus mais importantes do gênero, transmitidos por mosquito são o
DENV, o vírus da febre amarela (YFV) e os vírus do sorocomplexo da encefalite japonesa
(Mukhopadhyay, Kuhn et al., 2005). Além disso, os flavivírus também podem ser agrupados
de acordo com a síndrome clínica que causam. Em geral, são três as síndromes descritas para
esses vírus: febre-artralgias-eritema; febre hemorrágica com ou sem hepatite; e doenças
neurológicas. O DENV é um agente etiológico clássico da síndrome febre-artralgias-eritema,
sendo também causador de febres hemorrágicas assim como o vírus da Febre Amarela. O
grupo sorológico da encefalite japonesa está relacionado com os sintomas neurológicos
(Simpson, 1996; Solomon e Mallewa, 2001).
Fonte: Extraído de Mukhopadhyay, Kuhn et al., 2005
Figura II: Flavivírus: Classificação de acordo com Sorocomplexos, Clades e Clusters dos vetores de
transmissão.
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1.2.2 – Variações genéticas do vírus dengue
Critérios sorológicos foram utilizados para detectar quatro sorotipos do DENV. Na
escala evolutiva, o primeiro a se diferenciar foi o DENV-4, seguido pelo DENV-2, DENV-3 e
DENV-1 (Mackenzie, Gubler et al., 2004). Técnicas moleculares possibilitaram a
classificação dos vírus em genótipos baseada em estudos moleculares do genoma viral. Os
genótipos refletem o acúmulo de mudanças evolucionárias sofridas pelos vírus. Foram
descritos por Rico-Hesse (1990), baseando-se no sequenciamento de 240 nucleotídeos na
região E/NS1, cinco grupos genotípicos para o DENV-1 e também para o DENV-2 (RicoHesse, 1990). Quatro grupos genéticos foram descritos para o DENV-3 e dois para o DENV-4
(Lanciotti, Lewis et al., 1994; Lanciotti, Gubler et al., 1997). Estudos relatados na literatura
apontaram genótipos específicos sendo capazes de causar maior incidência de FHD. Por
exemplo, o genótipo asiático do DENV-2 está intimamente ligado à dispersão de FHD no
Sudeste Asiático, enquanto o genótipo Americano foi isolado de pacientes apresentando FD
(Rico-Hesse, Harrison et al., 1997).
1.2.3 – Características estruturais do vírus dengue
Os vírions DENV, assim como os membros do gênero Flavivirus, têm diâmetro
aproximado de 500Å e o seu genoma é composto de uma fita de RNA simples com senso
positivo. O material genético é envolto pela proteína do capsídeo e mais externamente pela
membrana bilipídica da célula hospedeira com a inclusão de 180 cópias de duas
glicoproteínas virais (Mukhopadhyay, Kuhn et al., 2005).
O genoma de aproximadamente 11Kb possui uma ORF (do inglês Open Reading
Frame) codificando um único polipeptídio. A porção amino terminal do genoma codifica três
proteínas estruturais que constituem a partícula viral – capsídeo (C), membrana (M, que é
transcrita na forma de seu precursor prM) e envelope (E); e o restante do genoma codifica sete
proteínas não-estruturais essenciais na replicação viral – NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,
NS4B e NS5. A poliproteína sofre modificações pós-traducionais para dar origem às dez
proteínas virais (Chang, 1997).
7
A
B
Fonte: A – Extraído de Zhang et al., 2003; B – Extraído de Kuhn e Zhang, 2002.
Figura III: Organização estrutural do DENV. Em A, foi feito um corte longitudinal do vírion que
demonstra o formato icosaédrico da membrana, sendo que quanto mais escura a imagem, maior a
densidade da estrutura visualizada (microscopia eletrônica de criofratura). Em B, Na ilustração
computadorizada da estrutura tridimencional do DENV, os dímeros da proteína E estão representados
em azul, vermelho e amarelo, com áreas de fusão em verde, formando uma concha protetora que
recobre toda a partícula. A superfície é incomumente lisa, revelando uma arquitetura diferente de
qualquer outro vírus visto. (Zhang, Chipman et al., 2003) (Kuhn, Zhang et al., 2002)
A proteína do capsídeo é formada por aproximadamente 120 aminoácidos e está
envolvida na montagem da partícula viral com a formação do nucleocapsídeo (NC). E e prM
são duas glicoproteínas, cada qual contendo duas hélices transmembranares. Estudos com o
Vírus da Encefalite do Carrapato indicam que a proteína prM, antes de ser clivada na
maturação viral, funcionaria como chaperone na montagem da proteína E (Lorenz, Allison et
al., 2002). Vários autores relatam que a proteína E dos flavivírus é constituinte principal da
superfície dos vírions que contém uma região de ligação de receptores e um peptídeo de fusão
(Stadler, Allison et al., 1997; Allison, Schalich et al., 2001).
As proteínas não-estruturais possuem funções ainda não completamente esclarecidas.
A NS1 é encontrada nas membranas das células infectadas e na forma solúvel no plasma de
pacientes infectados (Young, Hilditch et al., 2000). Avirutnan e colaboradores demonstraram
recentemente que a NS1 é capaz de ativar proteínas do sistema complemento (Avirutnan,
Punyadee et al., 2006). A NS5 é uma polimerase, enquanto a NS3 possui funções de
protease/helicase (Johansson, Brooks et al., 2001).
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A penetração do DENV na célula hospedeira é realizada através de endocitose
mediada por receptores. Foram sugeridos como receptores primários para o vírus as moléculas
DC-SIGN (do inglês dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin), GRP78/BiP (proteína reguladora de glicose 78) e moléculas associadas ao CD14
(Chen, Wang et al., 1999; Navarro-Sanchez, Altmeyer et al., 2003; Jindadamrongwech,
Thepparit et al., 2004).
Um modelo de ciclo viral foi sugerido por Mukhopadhyay e colaboradores (2005)
baseado em vários estudos moleculares realizados com flavivírus. O ambiente ácido do
endossoma iniciaria uma mudança conformacional irreversível na proteína E que resultaria na
fusão das membranas viral e celular. Após a fusão, o NC é liberado no citoplasma, ocorrendo
a dissociação da proteína do capsídeo e do RNA, propiciando a replicação do genoma.
Inicialmente, partículas virais imaturas são formadas no lúmen do retículo endoplasmático.
Essas partículas, que são formadas pelas proteínas E e prM, pelo NC e recobertas pela
membrana bilipídica, não são infectantes. A quebra da prM em M ocorre no complexo de
Golgi, criando partículas maduras, que seriam liberadas por exocitose (Mukhopadhyay, Kuhn
et al., 2005).
1.2.4 – Sítios de infecção
Nas infecções naturais, o DENV é inoculado pelo vetor provavelmente no espaço
subcutâneo ou no espaço intradérmico. A replicação viral ocorre no local da inoculação,
provavelmente nas células retículo-endoteliais, células de Langerhans ou nos fibroblastos, que
se encarregam de levar o vírus até os linfonodos regionais, favorecendo sua disseminação no
sangue, preferencialmente nos monócitos (Rothman, 1997). A detecção de RNA e de
antígenos virais na fração das células mononucleares do sangue periférico de pacientes
demonstrou que o DENV é capaz de infectar essas células. Estudos in vitro em monócitos
humanos confirmaram a suscetibilidade de monócitos à replicação pelo DENV (Espina,
Valero et al., 2003; Neves-Souza, Azeredo et al., 2005). Wu e colaboradores (2000)
demonstraram que células dendríticas (DCs) intersticiais e células de Langerhans são mais
permissivas ao vírus que monócitos e macrófagos, fazendo das DCs principais alvos do
DENV (Wu, Grouard-Vogel et al., 2000). Além da linhagem monocítica, já foram
encontrados antígenos virais em células endoteliais (Huang, Lei et al., 2000); e em
macrófagos e células de Kupfer em tecidos de casos fatais de órgãos de como fígado, cérebro,
baço e pulmão (Miagostovich, Ramos et al., 1997; Jessie, Fong et al., 2004).
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1.2.5 – Ciclo de transmissão
Os mosquitos pertencentes ao gênero Aedes (A. aegypti; A. albopictus; A.
polynesiensis) são os principais transmissores do DENV. Dependendo da região geográfica,
podemos encontrar diferentes densidades das espécies, porém o grande vetor é o Aedes
aegypti. Ciclos silvestres e peri-domésticos são mantidos na natureza, tendo como
hospedeiros mosquitos e macacos. Entretanto, o principal ciclo de transmissão envolvido em
epidemias é o urbano.
Após um mosquito picar um ser humano infectado, o DENV penetra na fêmea adulta.
A primeira replicação ocorre no intestino delgado, atinge a hemocele e a hemolinfa, ganhando
acesso aos tecidos do inseto. Ocorre uma segunda replicação nas glândulas salivares,
permitindo a transmissão do vírus aos seres humanos numa próxima alimentação do
mosquito. O vírus também pode infectar o aparelho genital dos vetores, possibilitando a
transmissão trans-ovariana do patógeno. Esse tipo de infecção possivelmente é responsável
pela manutenção do vírus em uma determinada região nos períodos inter-epidêmicos, sem
participação de seres humanos ou outros vertebrados (Malavige, Fernando et al., 2004).
1.2.6 - Manifestações clínicas
Um amplo espectro de quadros clínicos pode ser causado pelo DENV. A doença pode se
manifestar assintomaticamente ou apresentar sintomas brandos como uma febre
indiferenciada e a Febre do Dengue; ou ainda, causar quadros mais graves como a Febre
Hemorrágica do Dengue (FHD) e a Síndrome do Choque do Dengue (SCD) (O.M.S., 2000).
1.2.6.1 – Febre do dengue
A FD é uma doença não fatal que pode ocorrer tanto nas infecções primárias quanto
nas secundárias e afetar crianças e adultos. Caracterizam a doença o aparecimento súbito de
febre alta, dor de cabeça, dor retro-orbital, artralgia, mialgia, anorexia e desconforto
abdominal. Eritemas máculo-papular podem ser detectados em alguns casos. A febre pode ser
bifásica, tendendo a durar de 2 a 7 dias. Manifestações hemorrágicas como petéquias,
epistaxe, gengivorragias, sangramento gastrintestinal, hematúria, hematese, apesar de
incomuns na FD, podem ocorrer em alguns indivíduos (Gubler, 1998; Malavige, Fernando et
al., 2004).
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Na maioria dos casos, os achados laboratoriais associados à FD incluem neutropenia
com linfocitose subseqüente, marcado pela presença de linfócitos atípicos. Os níveis de
enzimas hepáticas no soro podem ser elevados. A trombocitopenia é também comum, 34% de
pacientes com FD possuem contagem de plaquetas menor do que 100.000/mm³ (O.M.S.,
1997; Gubler, 1998; Malavige, Fernando et al., 2004).
1.2.6.2 – Febre hemorrágica do dengue, síndrome do choque do dengue e outras formas
graves
As manifestações mais graves da FD são caracterizadas pela FHD/SCD e ocorrem
com maior freqüência nas infecções secundárias. Os sintomas iniciais se assemelham à FD,
porém as manifestações hemorrágicas evoluem rapidamente. A FHD é caracterizada por
quatro grandes manifestações clínicas: febre alta, fenômenos hemorrágicos, e frequentemente,
hepatomegalia e insuficiência circulatória (Gubler, 1998; Malavige, Fernando et al., 2004).
Em geral, são descritas três fases na progressão da doença, que são divididas nas fases
febril, do extravasamento do plasma e da convalescença. A fase crítica da FHD é iniciada no
final da fase febril. Após 2 a 7 dias de febre, a queda brusca da temperatura é geralmente
acompanhada por sinais de distúrbios circulatórios de graus variados. O paciente pode
apresentar sudorese, agitação, extremidades frias, alterações no pulso e queda da pressão
arterial. Em casos menos graves, essas alterações são mínimas e transitórias, decorrentes do
baixo grau de extravasamento do plasma. Alguns pacientes se recuperam espontaneamente e a
maioria, após terapia de reposição de eletrólitos e fluidos. Em casos mais graves, em que a
perda de plasma é crítica, o quadro de choque se instala. O choque é decorrente do aumento
da permeabilidade vascular, seguida de hemoconcentração e falência circulatória, podendo
levar o paciente ao óbito em 12 a 24 horas, se não for devidamente tratado (O.M.S., 1997).
A trombocitopenia e a hemoconcentração (hematócrito elevado) são achados
laboratoriais típicos e são considerados pela OMS como indicadores da FHD. A
hemoconcentração com o hematócrito 20% maior que o normal da população local evidencia
o aumento da permeabilidade vascular e o extravasamento do plasma. A leucopenia
(neutropenia) é detectada no fim da fase febril. Ocorrem mudanças no padrão de coagulação
com aumento do tempo de protrombina, tromboplastina parcial e trombina e diminuição de
fibrinogênio, protrombina, fator VIII, fator XII e antitrombina III. Também são detectados um
aumento nas enzimas hepáticas, hipoprotenemia e distúrbios eletrolíticos. Nos casos de
11
choque profundo, são frequentemente observados acidose metabólica e aumento dos níveis de
uréia do sangue (O.M.S., 1997; Malavige, Fernando et al., 2004)
Baseados em dados laboratoriais e clínicos, a OMS classificou as manifestações da
FHD em quadro graus, sendo o grau III e IV considerados SCD:
Grau I – Febre acompanhada por sintomas não específicos, em que a única
manifestação hemorrágica é a prova do laço positiva.
Grau II – Além das manifestações constantes do grau I, somam-se hemorragias
espontâneas leves.
Grau III – Choque: colapso circulatório com pulso fraco e rápido; hipotensão; pele
pegajosa e fria e inquietação.
Grau IV – Choque profundo com pressão sanguínea e/ou de pulso indetectáveis.
Contrastando com esta classificação da OMS, foram relatados na Nicarágua por Harris
e colaboradores (2000) quadros clínicos de SCD, que não foram enquadrados no esquema
acima. Tendo em vista a dificuldade de classificar os casos graves segundo o critério da OMS,
foi criada uma nova categoria a DSAC (Dengue com Sinais Associados ao Choque), quadro
muito semelhante a SCD, porém sem presença de trombocitopenia e hemoconcentração
(Harris, Videa et al., 2000). Essa dificuldade na classificação dos casos graves tem sido
comum entre países da América Central e América Latina (Azeredo, De Oliveira-Pinto et al.,
2006). Atualmente, os problemas encontrados em seguir os parâmetros da OMS na triagem
dos casos graves de Dengue demonstram a necessidade de um estudo mais amplo que
estabeleça um esquema de classificações que possa ser utilizado por todas regiões endêmicas
(Deen, Harris et al., 2006).
1.2.7 – Patogênese do dengue
O alto grau de variação das manifestações clínicas causadas pelo DENV induziu a
formulação de teorias propostas para explicar as diferentes reações ao vírus nas formas da FD,
FHD e SCD.
1.2.7.1 – Teoria da facilitação dependente de anticorpos
Halstead e colaboradores sugeriram um papel na patogênese para os anticorpos nãoneutralizantes produzidos nas infecções pelo DENV, baseado em dados epidemiológicos
(Halstead, 1988). A teoria da facilitação dependente de anticorpos (ADE) explica porque
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indivíduos que tiveram infecção prévia por um sorotipo de DENV, se infectados por um
sorotipo diferente, teriam maior incidência de FHD em relação aos de infecção primária. Os
anticorpos heterólogos desenvolvidos na infecção do primeiro sorotipo estariam em níveis
sub-neutralizantes durante a infecção pelo segundo sorotipo. A linhagem monocítica foi
descrita como principal alvo de infecção dos DENV e dispõe de alta expressão de receptores
FcRγ. Sendo assim, os anticorpos heterólogos não-neutralizantes ligados aos vírus, seriam
atraídos para a superfície celular através da ligação da porção Fc da imunoglobulina com o
FcRγ, aproximando o vírus de seu receptor e resultando no aumento da infecção das células
(Halstead, 2003). Atualmente, porém, esta teoria foi contestada em alguns trabalhos em que
através de ensaios in vitro, não foram encontradas correlações entre a gravidade da doença
secundária e anticorpos preexistentes no plasma de pacientes com infecção primária
(Laoprasopwattana, Libraty et al., 2005). Outros estudos demonstraram que células
dendríticas, altamente permissivas ao DENV, não sofrem o fenômeno de facilitação in vitro
(Wu, Grouard-Vogel et al., 2000; Libraty, Pichyangkul et al., 2001).
1.2.7.2 – Teoria da virulência viral
Outra teoria sugerida para explicar a patogênese da FD/FHD é a da virulência viral. As
extensas variações genéticas do DENV possibilitaram a classificação desse vírus em grupos
denominados genótipos (Rico-Hesse, 1990). Estudos filogênicos e epidemiológicos
demonstram que genótipos específicos são capazes de produzir maior incidência de FHD em
populações de estado imunológico variado. Evidências podem ser encontradas na comparação
entre os genótipos americanos e asiáticos do sorotipo DENV-2. Estudos realizados no Peru
demonstraram que a FHD e SCD são raramente associadas com as cepas americanas
(Leitmeyer, Vaughn et al., 1999), ocorrendo o oposto com o genótipo asiático (Watts, Porter
et al., 1999). Cologna e colaboradores (2005) propõem que as altas taxas de infecção dos
vírus do genótipo asiático sugerem que vírus com potencial de causar FHD tem vantagem
seletiva sobre as formas menos virulentas, evidenciado pela crescente dificuldade do
isolamento de vírus americanos após a entrada dos vírus asiáticos nas Américas (Cologna,
Armstrong et al., 2005).
13
1.2.7.3 – Teoria do “pecado original”
Uma outra explicação para a maior incidência de FHD em infecções secundárias seria
pela resposta dos linfócitos T. A chamada teoria do “pecado original” também observado para
outras doenças. Durante a infecção primária, ocorre a expansão clonal da população de células
T com maior afinidade pelos epítopos presentes no sorotipo infectante, ocasionando a
formação de células de memória para este sorotipo. Entretanto, na infecção secundária por
outro sorotipo, as células de memória geradas na primeira infecção seriam ativadas e se
expandiriam mais rapidamente que as células virgens específicas para o sorotipo infectante.
Por terem menor afinidade pelos antígenos virais da infecção secundária, os clones de células
T de memória seriam menos efetivos na eliminação viral, porém teriam alta capacidade de
liberação de citocinas pró-inflamatórias, influenciando na imunopatologia da doença
(Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al., 2003). Novas evidências para essa hipótese foram
obtidas em um estudo com crianças do Sudeste Asiático apresentando infecção aguda por
DENV, em que células T específicas para o DENV de reatividade cruzada demonstraram
níveis abaixo do normal de degranulação, porém alta produção de citocinas que pode
contribuir para o extravasamento de plasma característico da FHD (Mongkolsapaya,
Duangchinda et al., 2006).
1.2.7.4 – Teoria do mimetismo molecular
Recentemente, foi proposta a teoria do mimetismo molecular. A comparação entre o
gene da proteína E e de proteínas da coagulação humana revelaram trechos com homologia
entre eles (Bielefeldt-Ohmann, 2000). Sendo assim, anticorpos de reatividade cruzada
estariam influenciando nas cascatas de coagulação e a presença desses anticorpos foi
correlacionada com as manifestações hemorrágicas, mas não com a FHD (Chungue, Poli et
al., 1994). Lin e colaboradores (2003) demonstraram que anticorpos contra a proteína viral
NS1 podem reagir com antígenos presentes na superfície de células endoteliais e induzir o
processo de apoptose, o que causaria dano ao endotélio (Lin, Lei et al., 2003).
14
1.2.7.5 – Teoria do polimorfismo genético
Foi postulado que indivíduos de etnia negra têm maior resistência a FHD. Fatores
suportando esta hipótese são encontrados no Haiti, onde se observa a ausência de FHD apesar
da transmissão hiperendêmica do FHD. Na África, onde ocorre a co-circulação dos quatro
sorotipos e freqüentes epidemias de FD ocorrem, são observados raros casos de FHD
(Halstead, Streit et al., 2001). Sendo assim, verificou-se que fatores genéticos do hospedeiro
também podem influenciar na patogênese da FD/FHD. Foram descritos polimorfismos nos
genes do antígeno leucocitário humano (do inglês Human Leukocyte Antigen - HLA)
correlacionados com o aumento ou diminuição da suscetibilidade a FHD (Loke, Bethell et al.,
2001). Estudos de polimorfismos nos genes do fator de necrose tumoral (do inglês tumor
necrosis factor-alpha - TNF-α) e receptor IIA de FcRγ correlacionaram alguns alelos com a
ocorrência de FHD (Loke, Bethell et al., 2002; Fernandez-Mestre, Gendzekhadze et al.,
2004). Estudos também foram realizados em grupos étnicos tailandeses, em que foi
demonstrada uma associação entre um alelo do promotor da molécula DC-SIGN e a
freqüência de FD e FHD (Sakuntabhai, Turbpaiboon et al., 2005).
1.2.7.6 – Teoria interação multifatorial
Alguns autores acreditam que os riscos do desenvolvimento da FHD são resultantes
multifatoriais, ou seja, fatores como sorotipo e virulência viral, idade, sexo, status do sistema
imunológico, fatores nutricionais e fatores genéticos do hospedeiro estariam interagindo para
dar origem a resposta contra a infecção, sendo ela benéfica ou prejudicial para o hospedeiro
(Guzman e Kouri, 2002; Malavige, Fernando et al., 2004).
1.2.7.7 – Imunopatologia do dengue
Os principais mecanismos pela qual a infecção pelo DENV causa a FHD têm
ocasionado muitas controvérsias desde que a síndrome foi descoberta. Entretanto,
observações feitas por vários grupos de pesquisa forneceram indícios do papel patológico de
componentes da resposta imunológica à infecção pelo DENV no desenvolvimento da FHD.
Como descrito anteriormente, o DENV infecta monócitos, macrófago e células dendríticas
que são células apresentadoras de antígenos e podem produzir diferentes citocinas e outros
fatores solúveis quando infectadas. Dentre as citocinas pró-inflamatórias encontradas in vivo e
15
in vitro pode-se destacar o TNF-α. Vitarana e colaboradores foram os primeiros a demonstrar
os altos níveis de TNF-α em pacientes com FHD, sendo sugerido um papel fundamental no
choque hipovolêmico (Vitarana, De Silva et al., 1991). Desde então, vários grupos detectaram
a presença do TNF-α em soro de pacientes com FD/FHD (Hober, Poli et al., 1993; Kuno e
Bailey, 1994; Kubelka, Borges et al., 1995; Pinto, Oliveira et al., 1999; Nguyen, Lei et al.,
2004; Chakravarti e Kumaria, 2006) e altos níveis dessa citocina foram correlacionados com
as manifestações hemorrágicas (Braga, Moura et al., 2001).
Altos níveis de interleucina-6 (do inglês interleukin-6 ou IL-6) têm sido encontrados
em pacientes com FHD/SCD e vários autores correlacionaram a presença da citocina com a
gravidade da doença (Juffrie, Meer et al., 2001; Avila-Aguero, Avila-Aguero et al., 2004;
Chen, Lei et al., 2006). Nguyen e colaboradores (2004) relataram níveis significantemente
elevados de IL-6 em recém-nascidos com infecção fatal e a citocina foi fortemente
correlacionada com ativação da via extrínseca de coagulação em casos de FHD/SCD
(Nguyen, Lei et al., 2004). Níveis de IL-6 foram associados com marcadores de coagulação e
fibrinólise (Suharti, Van Gorp et al., 2002).
Elevados níveis de IL-10 e de interferon-gama (do inglês interferon-gamma ou IFN-γ)
têm sido relatados em pacientes com FD e FHD. Foi proposto que a geração de citocinas antiinflamatórias estaria ocorrendo na tentativa de balancear a inflamação (Azeredo, Zagne et al.,
2001; Nguyen, Lei et al., 2004). A IL-10 possui papel imunomodulador e pode ser capaz de
inibir a função apresentadora de células dendríticas infectadas com DENV (Palmer, Sun et al.,
2005).
Também foram descritas altas concentrações de IFN-α tanto em pacientes com FHD
quanto com FD, porém seu papel na gravidade da doença ainda não foi totalmente elucidado
(Kurane, Innis et al., 1993). O IFN-α é uma citocina que induz resistência aos vírus por ativar
vias intracelulares não citolíticas que limitam a dispersão viral e atenuam a infecção
(Grandvaux, Tenoever et al., 2002). Diamond e colaboradores (2000) demonstraram que os
interferons α e β podem proteger células contra infecção pelo DENV in vitro (Diamond,
Roberts et al., 2000) e Shresta e colaboradores relataram que o IFN-α limita replicação do
DENV no sistema nervoso central de camundongos (Shresta, Kyle et al., 2004). Contrariando
a hipótese do papel protetor do IFN-α, pesquisadores demonstraram que o DENV escapa do
sistema imunológico através da inibição da via do IFN-α e que outros flavivírus utilizam o
mesmo mecanismo (Lin, Liao et al., 2004; Foy, Li et al., 2005). Jones e colaboradores (2005)
indicam que o DENV inibe a ação do IFN-α e não do IFN-γ, através da diminuição da
expressão do transdutor de sinal e ativador de transcrição 2 (do inglês STAT-2) (Jones,
16
Davidson et al., 2005), sendo esses resultados também encontrados por outros autores (Ho,
Hung et al., 2005). Munoz-Jordan e colaboradores (2005) demonstraram que a proteína não
estrutural NS4B inibe a expressão dos elementos de resposta ao estímulo pelo interferon (do
inglês interferon stimulated response elements - ISRE) e que a co-expressão de NS4A e
NS4B aumenta essa inibição (Munoz-Jordan, Laurent-Rolle et al., 2005).
Outros mediadores da resposta inflamatória foram encontrados em pacientes com
Dengue. Neves-Souza e colaboradores (2005) descreveram a expressão da enzima óxido
nítrico sintetase induzida (do inglês inducible nitric oxide synthase - iNOS) em pacientes
com infecção aguda pelo DENV. Também foi demonstrado que o vírus DENV-1 foi
suscetível ao óxido nítrico produzido pelos monócitos humanos infectados (Neves-Souza,
Azeredo et al., 2005). Esses resultados contribuem para um papel protetor do óxido nítrico,
sendo esse mediador associado com casos brandos de FD (Valero, Espina et al., 2002).
Conforme descrito anteriormente, vários autores relataram evidências que confirmam
a ativação de clones de células T de reatividade cruzada durante a infecção secundária pelo
DENV. Essas células de memória são em geral específicas contra a proteína NS3 do DENV
(Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al., 2003), sendo também descritas reatividade cruzada
contra outros flavivírus como o vírus da febre amarela e o vírus da encefalite japonesa (Scott,
Eckels et al., 1983). Células T de pacientes com FHD/SCD na fase aguda exibiram fenótipo
altamente ativado e apoptótico (Mongkolsapaya, Dejnirattisai et al., 2003). Células CD4+ e
CD8+ específicas para o DENV produzem predominantemente altos níveis de IFN-γ, TNF-α e
TNF-β, além de quimiocinas, após interação com células apresentadoras de antígenos
infectadas (Gagnon, Ennis et al., 1999). Células NK expressando precocemente marcadores
de ativação, citotoxicidade e moléculas de adesão em pacientes com FD foram
correlacionadas com bom prognóstico da doença (Azeredo, De Oliveira-Pinto et al., 2006).
1.3 – Células do sistema fagocitário mononuclear
1.3.1 – Monócitos e macrófagos
Os monócitos fazem parte do sistema fagocítico mononuclear e possuem origem
mielóide. No sangue se apresentam como uma população heterogênea, variando no tamanho
celular, granulosidade e morfologia nuclear. São encontradas populações de células CD14+
CD16-, chamados monócitos clássicos, que expressam o receptor de quimiocina CCR2, e
células CD14+ CD16+, que se assemelham a macrófagos tissulares maduros. Além disso,
17
uma população CD14+ CD16+ CD64+ também foi descrita, em que essas células apresentam
características típicas de monócitos e células dendríticas, como alta expressão de CD86 e
moléculas de MHC classe II (Gordon e Taylor, 2005).
Os monócitos originam a maior parte dos macrófagos tissulares e ainda células
especializadas como as células dendríticas e os osteoclastos. A heterogenicidade das
populações de macrófagos geradas reflete as diversas especializações adotadas por essas
células nos tecidos, em que o microambiente tissular influencia o fenótipo dos macrófagos
residentes. Dentre as funções dos macrófagos estão: manter a homeostase tecidual através da
remoção de células velhas, remodelamento e reparo de tecidos após inflamação; remoção de
vírus, bactérias e partículas, por exemplo, por macrófagos alveolares, que expressam altas
concentrações de receptores de padrões moleculares e “scavengers”; eliminação de linfócitos
apoptóticos, gerados durante a resposta imunológica, nos centros germinativos por
macrófagos tímicos especialmente localizados; e alta fagocitose de macrófagos da lâmina
própria do intestino, com baixa produção de citocinas pró-inflamatórias, refletindo também,
papel na tolerância (Gordon e Taylor, 2005).
Assim, os macrófagos são células especializadas em fagocitose, mas expressam em
sua superfície celular moléculas de MHC de classe II, sendo também células apresentadoras
de antígenos. Entretanto, a grande função destas células é a eliminação de patógenos
invasores. Através de receptores para carboidratos que não são normalmente expostos pelos
antígenos próprios, os macrófagos conseguem reconhecer as substâncias não próprias e as
eliminam. Além disso, a alta expressão de receptores para complemento e anticorpos, facilita
reconhecimento de patógenos pela célula. Uma vez fagocitadas, essas partículas são sujeitas à
substâncias tóxicas produzidas pelos macrófagos que auxiliam na sua eliminação, como
superóxidos, radicais hidroxila, ácido hipocloroso, óxido nítrico, proteínas e peptídeos
catiônicos antimicrobiais e lisozimas (Delves e Roitt, 2000).
Estudos in vitro demonstraram a existência de diferentes estados de ativação existente
em macrófagos inflamatórios. Porém fenótipos mais complexos são esperados in vivo.
Quando ativados com IFN-γ e LPS, os macrófagos exibem alta produção de TNF-α, assim
como produção de outras citocinas pró-inflamatórias; imunidade celular; alta atividade
microbicida com aumento de produção de radicais de oxigênio e da expressão da enzima
óxido nítrico sintetase induzida. Este estado de ativação foi denominado de clássico. Na
ativação alternativa, os macrófagos cultivados com IL-4 e IL-13 estão associados com reparo
tecidual e imunidade humoral. Já a ativação inata é mediada por ligação dos agonistas de
receptores de padrões moleculares, é associado com atividade microbicida e também com a
18
produção de citocinas pró-inflamatórias. A desativação é induzida pela presença de IL-10 ou
TGF-β ou pela ligação de receptores inibitórios como o CD200 ou CD172a, e é associada
com a produção de citocinas anti-inflamatórias (IL-10, TGF-β) e diminuição da expressão de
moléculas de MHC classe II (Gordon e Taylor, 2005).
1.3.2
– Células dendríticas
As células dendríticas (do inglês dendritic cells – DCs) são células apresentadoras de
antígenos (do inglês antigen-presenting cells – APCs) que compreendem menos de 1% do
número total de células do sangue periférico (Steinman, 1991) e têm importância crucial na
ligação entre a resposta imunológica inata e adaptativa. Após o reconhecimento e
processamento do antígeno, as DCs os apresentam às células T e dirigem a resposta a ser
desencadeada frente ao antígeno: tolerância, imunidade ou memória (Kelsall, Biron et al.,
2002).
1.3.2.1 – Origem in vivo e subpopulações das células dendríticas
As DCs formam um grupo heterogêneo de células com localização em vários órgãos e se
originam de uma linhagem distinta no desenvolvimento dos leucócitos. Uma das
particularidades constatadas na geração de DCs é a plasticidade de sua formação, sendo as
células originadas através de precursores mielóides e linfóides (Manz, Traver et al., 2001;
Steinman, 2003).
Células pluripotentes CD34+ localizadas na medula óssea originam os precursores das
DCs, que durante a diferenciação em suas subpopulações, migram pela corrente sangüínea
indo se alojar nos órgãos específicos. Tradicionalmente, as células dendríticas têm sido
classificadas de acordo com localização anatômica, expressão de moléculas de superfície e
função no sistema imunológico. A importância dos vários grupos de DCs tem sido atribuída
principalmente pelas diferentes capacidades de ação na resposta imunológica envolvendo
produção de citocinas e quimiocinas, receptores de fagocitose de antígenos e receptores de
reconhecimento de microorganismos (Lipscomb e Masten, 2002).
Em seres humanos, foram descritos três subtipos principais de células dendríticas
imaturas: as células de Langerhans (do inglês Langerhans cells – LCs), as DCs intersticiais e
as DCs plasmacitóides (Lipscomb e Masten, 2002). Entretanto, atualmente além dessa
classificação, as DCs são agrupadas em DCs convencionais (cDCs) e DCs plasmacitóides (do
19
inglês plasmacytoid dendritic cells – pDCs), sendo diferenciadas pelo marcador mielóide
CD11c (Klechevsky, Kato et al., 2005).
Duas das populações que constituem o grupo das DCs convencionais podem ser
encontradas nos tecidos da pele: as LCs e as DCs intersticiais. Apesar de localizadas na pele,
essas populações se encontram em camadas diversas: as LCs têm localização na epiderme e as
DCs intersticiais, nos interstícios do tecido. Além da pele, podemos encontrar as DCs
intersticiais e as DCs dermais – população de células dendríticas que se estabelece na derme,
em vários outros órgãos (Lipscomb e Masten, 2002). Quando ativadas pelo processamento de
antígenos, as LCs migram para a área T dos órgãos linfóides, apresentando os antígenos para
células T. Já as DCs intersticiais migram para os folículos linfóides onde se tornam DCs dos
centros germinais e estimulam a transformação de células B em células secretoras de
anticorpos (Gluckman, Canque et al., 2002).
LCs e DCs intersticiais expressam vários marcadores em comum como CD11c, CD13 e
CD33; e não apresentam CD123. Entretanto, LCs são diferenciadas pela presença de
marcadores específicos como CD1a, molécula apresentadora de antígenos de origem
glicolipídica; langerina, lectina do tipo C envolvida na endocitose mediada por receptor; os
grânulos de Birbeck, relacionados com maturação e migração; e a molécula de adesão Ecaderina, que permite a localização epidermal das células. Já as DCs intersticiais podem ser
diferenciadas pela expressão do fator de coagulação XIIIa (Lipscomb e Masten, 2002;
Steinman, 2003). LCs e DCs intersticiais são capazes de ativar células CD4 e CD8 e induzir a
produção de IL-12 (Dubois, Bridon et al., 1999).
DCs plasmacitóides são caracterizadas pela ausência do marcador CD11c e algumas
evidências, como a ausência de marcadores mielóides CD33 e CD13, sugerem origem
linfóide. O precursor sanguíneo dessas células expressa além de CD123, o CD62L que é um
característico marcador de migração. As pDCs continuadamente recirculam entre a corrente
sanguínea e os órgãos linfóides através das veias de endotélio alto, podendo assim podem ser
encontradas nas zonas T dos órgãos linfóides, no timo e no sangue (Lipscomb e Masten,
2002). Essas células têm capacidade de produzir enormes quantidades de IFN-α quando
estimuladas por uma infecção viral através da ativação das vias dos receptores do tipo Toll
(do inglês toll-like receptor - TLR). Ao contrário das DCs convencionais, que ativam a via do
IFN-α através do TLR3 e do RIG-I (do inglês retinoic-acid inducible gene-I), as pDCs
utilizam os receptores TLR7 e TLR9 (Kato, Sato et al., 2005). Mesmo que as pDCs sejam
fracas na captura de antígenos solúveis e particulados, encontramos a expressão de BDCA-2,
uma molécula capaz de mediar a endocitose e apresentar antígenos. Assim como as cDCs,
20
pDCs são capazes de ativar células CD4 e CD8 e induzir a produção de IL-12 (Lipscomb e
Masten, 2002).
1.3.2.2 – Captura de antígenos pelas células dendríticas
As DCs estão presentes na maioria dos tecidos em fase de diferenciação chamada
“imatura”. As DCs imaturas (do inglês immature DCs – imDCs) são caracterizadas por
intensa atividade endocítica e podem capturar vários tipos de antígenos como: patógenos,
células infectadas, células mortas e seus produtos. As imDCs poderiam ter uma função na
indução de tolerância periférica de células CD4+ e CD8+, induzindo a deleção, a anergia ou a
regulação de determinados clones (Tassaneetrithep, Burgess et al., 2003). As imDCs também
capturam antígenos continuadamente e migram para os linfonodos participando na
apresentação aos linfócitos T, apesar das imDCs expressarem baixos níveis de moléculas do
complexo de histocompatibilidade principal (do inglês major histocompatibility complex MHC) e de moléculas co-estimulatórias (Steinman e Nussenzweig, 2002).
Uma vez endocitados, antígenos se ligam às moléculas de MHC, levando ao início do
processo de maturação das DCs, transformando-as assim em células próprias para
apresentação dos antígenos fagocitados às células T (Quah e O'neill, 2005). Essas
características associadas à sua localização em todo organismo e em tecidos periféricos fazem
das DCs as células sentinelas que monitoram o ambiente na procura por patógenos invasores
(Cella, Sallusto et al., 1997).
A captura de antígenos pelas DCs ocorre por diferentes vias: fagocitose,
macropinocitose e endocitose via receptores de superfície. As DCs seqüestram em geral
partículas e microorganismos, porém os últimos também podem ser capturados por endocitose
via receptores (Banchereau e Steinman, 1998). A macropinocitose permite que grandes
volumes de fluidos sejam endocitados, contribuindo para o monitoramento dos líquidos
extracelulares. Essa via de endocitose permite que concentrações nanomolares e picomolares
de antígenos sejam eficientemente apresentadas às células do sistema imunológico (Norbury,
2006).
As células dendríticas podem diferenciar patógenos através do reconhecimento de seus
padrões moleculares. Dentre os vários receptores de reconhecimento (do inglês pattern
recognition receptors – PRRs) destacam-se os TLRs. Esses receptores possuem função
primordial de reconhecer os padrões moleculares e quando ativados, desencadeiam as vias de
sinalização intracelular que auxiliam na resposta a ser seguida mediante o microorganismo
21
reconhecido. Uma dessas respostas é o aumento da capacidade macropinocítica das DCs
(Norbury, 2006). Foram descritas as expressões de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7
e TLR9 em DCs (Van Kooyk e Geijtenbeek, 2003). Dentre outras moléculas, esses receptores
reconhecem lipoproteínas de procariotos, glicolipídeos, flagelina, CpG DNA e lipossacarídeos
(Janeway e Medzhitov, 2002).
Existe uma grande variedade de receptores endocíticos em DCs. Os imunocomplexos
são capturados com auxílio de receptores para porção Fc das imunoglobulinas, expressos em
DCs: FcαR (CD89), FcγRII, FcγRIII e FcεRI (Cella, Sallusto et al., 1997). DCs imaturas
também expressam integrinas αvβ3 e αvβ5 e CD36 que estão envolvidas na captura contínua de
material apoptótico (Quah e O'neill, 2005).
As lecitinas do tipo C são encontradas nas DCs como a langerina (CD207), o receptor
de manose (CD206), o receptor de manose para macrófago DEC-205 (CD205) e o receptor
DC-SIGN. Esses receptores reconhecem carboidratos na superfície dos patógenos e também
medeiam a endocitose (Engering, Geijtenbeek et al., 2002). O receptor DC-SIGN está
envolvido no acoplamento de vários vírus como o HIV (do inglês human immunodeficiency
virus), o Ebola e o DENV (Geijtenbeek, Kwon et al., 2000; Alvarez, Lasala et al., 2002;
Tassaneetrithep, Burgess et al., 2003).
Os antígenos capturados devem entrar nas vias exógenas ou endógenas de
processamento e apresentação através de moléculas de MHC. A apresentação pela via
exógena é realizada pelas moléculas MHC tipo II. O produto da endocitose é alojado em
endossomos e é parcialmente hidrolisado até a fusão com vesículas ricas em moléculas de
MHC tipo II chamadas MIIC. Esses endossomos especiais possuem além das moléculas de
MHC tipo II, uma série de proteases de cisteína e hidrolases que fragmentam os antígenos
para apresentação. O pH levemente ácido do endossomo auxilia no desacoplamento das
moléculas antigênicas de seus receptores endocíticos, sendo estes reciclados posteriormente
para a membrana plasmática. Fragmentados, os antígenos se ligam às moléculas MHC, são
exocitados e expressos na membrana plasmática para reconhecimento pelas células T CD4+
(Lipscomb e Masten, 2002; Quah e O'neill, 2005).
A via endocítica permite que sejam apresentados antígenos presentes no citosol das
DCs. Entretanto, as DCs possuem a capacidade de fazer apresentação cruzada, ou seja,
antígenos de produtos fagocitados podem ser apresentados por MHC tipo I e tipo II. Na via
MHC tipo I, peptídeos derivados do citosol são degradados pelo transportador associado a
apresentação de antígeno (do inglês transporter associated with antigen processing – TAP) e
no retículo endoplasmático se unem às moléculas de MHC tipo I. Através de vesículas
22
exocíticas, os antígenos são expressos na membrana (Lipscomb e Masten, 2002). O
mecanismo exato da apresentação cruzada ainda não foi totalmente elucidado, porém supõese a existência de mecanismos de transporte dos peptídeos presentes no MIIC para o citosol
(Quah e O'neill, 2005).
1.3.2.3 – Maturação e migração das células dendríticas
Sendo realizada a função de captura e patrulhamento dos tecidos do corpo, ou seja, uma
vez reconhecido o “perigo”, as DCs devem apresentar os antígenos para as células T e B
objetivando iniciar as respostas celulares e humorais. Primeiramente, é necessário que ocorra
um fenômeno identificado por maturação. Este processo é caracterizado pelas mudanças que
acompanham as imDCs na transição para um determinado estado “efetor” em resposta aos
sinais de origem exógena (como microorganismos) ou endógena (como citocinas, hormônios
e células mortas). A qualidade desses sinais é um fator determinante na escolha do tipo de DC
“efetora”, apesar da ontogenia também ter seu papel, visto que alguns subtipos de DCs estão
pré-dispostos a alguns estados “efetores” ou têm o repertório restrito (Reis, 2006).
Vários fatores induzem a maturação das DCs como por exemplo componentes
bacterianos, virais e de parasitas. Eles são reconhecidos, como já citado, pelo TLRs que ao
interagir com patógeno, ativam as vias intracelulares, aumentando a expressão da família do
controle transcripcional do fator de transcrição nuclear κB (do inglês nuclear factor-κB – NFκB), que por sua vez regula a expressão de proteínas inflamatórias e moléculas coestimulatórias. A distribuição dos receptores TLR varia de acordo com a população de DCs
ativada permitindo respostas especializadas de acordo com o patógeno, por exemplo, as DCs
plasmacitóides expressam TLR7 e TLR9 e a ativação dessas vias por produtos virais induz
altos níveis de IFN-α/IFN-β pelas células. Entretanto, pDCs não expressam TLR4, o que
limita a sua resposta ao LPS (Wallet, Sen et al., 2005).
Além da sinalização pelos receptores TLR, o balanço entre as citocinas próinflamatórias e anti-inflamatórias presentes no ambiente como TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10 e
fator de crescimento transformante -beta (do inglês transforming grownth factor-beta – TGFβ) induz à maturação das DCs (Banchereau, Briere et al., 2000). Durante o processo, a
atividade fagocítica tem um pico de atividade, mas logo diminui, favorecendo a apresentação
de antígenos pela ausência de reciclagem das moléculas de MHC tipo II ligadas presentes nos
exossomas. As DCs passam a expressar moléculas co-estimulatórias que irão auxiliar na
ativação de células T durante o contato, ou sinapse imunológica, sendo aumentadas a
23
expressão de CD40, CD83 e CD86. Moléculas de adesão também são expressas como CD2,
CD11a, CD54 e CD58, além das integrinas β1e β2 (Quah e O'neill, 2005; Wallet, Sen et al.,
2005). Apesar do papel endocítico, o DC-SIGN ainda é expresso nas DCs maduras, pois é
fundamental no primeiro contato e na ligação entre as DCs e células T, durante a sinapse
imunológica, ou seja, na estimulação antígeno específica (Steinman, 2000).
As DCs imaturas expressam receptores de quimiocinas que as atraem para os tecidos
periféricos, como o CCR6, CCR1, CCR2 e CCR5. No processo de maturação, as células
passam a expressar o CCR7 e adquirem capacidade de responder ao CCL21 e ao CCL19
(MIP-3β), entre outros receptores de quimiocinas linfóides (Lipscomb e Masten, 2002). Essas
quimiocinas são produzidas pelas células T dos órgãos linfóides e também pelas DCs
residentes destes. Sendo assim, as DCs ativadas passam a migrar através da corrente linfática
para os linfonodos proximais e entram na área paracortical, onde efetuam contato com as
células T (Wallet, Sen et al., 2005).
1.3.2.4 – Células dendríticas e citocinas
A interação das DCs com células T ocorre principalmente nos linfonodos regionais e
desencadeia a resposta imunológica adaptativa. O primeiro contato é exercido pela molécula
DC-SIGN que permite à DC procurar pelo receptor da célula T (do inglês T cell receptor –
TCR). Em seguida ocorre a formação da sinapse imunológica que é composta de três sinais:
1) ligação do MHC – peptídeo com o TCR; 2) ligação entre as moléculas co-estimulatórias
expressas nas células; e 3) reconhecimento das citocinas presentes no ambiente. A interação
desses três sinais definirá a diferenciação, e consequentemente o fenótipo das células T
(Steinman, 2000).
O tempo de interação entre as DCs e as células T também pode ser um dos fatores na
definição da função das células T, ou seja, se serão células anérgicas, efetoras ou células de
memória. De acordo com Lanzavecchia e Sallusto, o contato prolongado com alta expressão
de antígenos e moléculas co-estimulatórias pelas DCs, na presença de citocinas, geraria
células T efetoras; o contato de curta duração com expressão de antígenos e moléculas coestimulatórias geraria células de memória; e o contato de curta duração de DCs expressando
baixas quantidades de antígenos e moléculas co-estimulatórias geraria células tolerantes
(Lanzavecchia e Sallusto, 2004).
Entretanto, conforme citado acima, para compreender a natureza da resposta
imunológica, é necessário considerar os sinais recebidos durante a transformação das imDC
24
em DCs “efetoras” como exemplifica a figura IV. O perfil de citocinas encontrada no local do
estímulo, além do reconhecimento de patógeno pelos PRRs, determina a resposta de citocinas
a ser tomada pelas DCs presentes no local (Reis, 2006).
Fonte: Modificado de Reis, 2006
Figura IV: Função efetora das células dendríticas. Dependendo do microambiente em que se
encontram, as DCs podem permanecer imaturas, o que poderia estar relacionado à tolerância
periférica; ou ainda maturar e estimular diversas funções e respostas nas células T.
Em geral, o reconhecimento de patógenos intracelulares, ativa as vias de produção de
citocinas pró-inflamatórias pelas DCs. Essas citocinas atuam de maneira autócrina e parácrina
25
(na própria célula ou em células vizinhas, respectivamente), induzindo sua produção pelas
DCs. Dentre algumas citocinas produzidas pelas DCs, podemos citar:
TNF-α – É considerado uma citocina multifuncional e o mais importante mediador
inflamatório. O TNF-α exerce funções diversas como indução da produção de outras citocinas
e quimiocinas pelas células do sistema imunológico, além de induzir a expressão de
moléculas de adesão e o aumento da permeabilidade no endotélio, o que propicia o aumento
do número de células mononucleadas no local da inflamação (Vassalli, 1992; Cerami, 1993).
A sinalização do TNF-α é realizada principalmente através de receptores de superfície que
ativam os fatores de transcrição nucleares NF-κB e AP-1, que são promotores de inúmeros
genes pró-inflamatórios (Wallach, Varfolomeev et al., 1999). Além de induzir as vias de
produção dos reativos do oxigênio, a ligação do TNF-α aos seus receptores pode ativar a via
das caspases e desencadear o processo de apoptose celular (Hehlgans e Pfeffer, 2005) A sua
potente ação biológica propicia um intenso dano tecidual, quando liberado em altas
concentrações sistemicamente, podendo ser o responsável pelos quadros de hipotensão,
supressão do miocárdio, extravasamento plasmático e estimulação de cascatas de coagulação
em condições patológicas como na sepsis bacteriana e na Febre do Dengue (Pinto, Oliveira et
al., 1999; Pfeffer, 2003).
IL-1β – Também conhecida como pirógeno endógeno, a IL-1β induz uma grande
quantidade de genes não normalmente expressos na homeostase, como a indução de
ciclooxigenase-2 e expressão de iNOS. Além disso, em conjunto com o TNF-α, estimula a
produção de IL-6, quimiocinas e moléculas de adesão. A secreção de IL-1β é finamente
regulada e agonistas dos TLR, como LPS, podem iniciar a síntese do precursor de IL-1β.
Grande parte das funções do IL-1β também são exercidas pelo TNF-α, sendo que o primeiro
não destrói as células e atua na medula óssea, estimulando um aumento dos precursores
mielóides (Dinarello, 2005).
IL-6 – Considerada uma citocina pleiotrópica, auxilia na regulação da reatividade
imunológica, na resposta de fase aguda, na inflamação, na oncogênese e na hematopoiese. Ao
se ligar ao seu receptor, a IL-6 ativa o complexo JAK-STAT (do inglês Janus Kinase – Signal
transducer and Activator of Transcription) que promove transcrição de proteínas de fase
aguda e citocinas pró-inflamatórias. A produção de IL-6 é estimulada por TNF-α e IL-1β e
persiste por mais tempo no plasma do que estas citocinas pró-inflamatórias. Níveis
plasmáticos de IL-6 foram correlacionados com mortalidade no choque séptico (Song e
Kellum, 2005).
26
IL-8 – A quimiocina IL-8 também pode ser chamada de CXCL8 (as quimiocinas são
responsáveis pela quimiotaxia de leucócitos ao local da inflamação e virtualmente todas as
células nucleadas do corpo podem produzi-la). As fontes típicas de IL-8 são monócitos e
macrófagos, que a secretam após múltiplos estímulos como LPS, bactérias vivas e outras
citocinas pró-inflamatórias (e.g. TNF-α e IL-1β). A IL-8 é produzida precocemente durante as
infecções, mas pode persistir por longos dias na circulação. Sua função é dada pela atração e
manutenção no foco inflamatório de neutrófilos, através de um gradiente quimiotático
(Remick, 2005).
IL-15 – Esta citocina exerce um papel importante na interação entre DCs e células NK
(Walzer, Dalod et al., 2005). A IL-15 pode induzir in vivo e in vitro mudanças fenotípicas e
funcionais de citotoxicidade das NK, transformando-as em células produtoras de IFN-γ
(Ohteki, 2002).
IFN-α. – É uma citocina anti-viral produzida em grandes quantidades principalmente
pelas DCs plasmacitóides mediante a infecção viral. Através da ligação com seu receptor na
célula, ativa as vias do JAK-STAT, que induzem a expressão dos genes estimulados pelo
interferon (do inglês Intereron-Stimulated Genes – ISGs). Dentre as funções dos ISGs, podese destacar a interferência na tradução e edição do RNA mensageiro viral e, ainda, a ação
enzimática direta sobre este RNA
(Katze, He et al., 2002). O IFN-α é um potente
diferenciador do desenvolvimento das repostas do tipo Th1 (do inglês T helper) e da
imunidade celular, principalmente da ativação de células NK (Marshall, Heeke et al., 2006).
IL-12 – Esta citocina é o fator dominante que direciona células T virgens a se tornarem
células Th1 produtoras de IFN-γ. A IL-12 possui duas subunidades p35 e p40, que juntas
formam a proteína ativa p70. As APCs são fonte principal de IL-12 e em DCs a produção
varia de acordo com o estado das células. As DCs imaturas produzem IL-12 que é capaz de
atrair células NK, macrófagos e células T de memória para o local da inflamação, já as DCs
maduras produzem baixas quantidades e por curto espaço de tempo durante a sinapse
imunológica. Provavelmente, esta particularidade da produção de IL-12 pelas mDCs objetiva
o desvio para Th1 somente das células T antígeno específicas. A produção de IL-12 varia de
acordo com a subpopulação de DCs, sendo as DCs mielóides maiores produtoras que as pDCs
(Moser e Murphy, 2000; Lutz, Schnare et al., 2002).
IL-10 - Objetivando a regulação da resposta imunológica, apesar da presença do
antígeno, o microambiente apresenta concentrações de IL-10 que possui função nessa
modulação imunológica. A IL-10 diminui a expressão dos marcadores de maturação das DCs,
diminuindo a secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, TNF-α e IL-12; e a
27
expressão de moléculas co-estimulatórias (Wallet, Sen et al., 2005). Além disso, DCs
produtoras de IL-10 podem induzir a diferenciação de linfócitos T virgens em células T
regulatórias 1. Essas células participam na imunomodulação da resposta imunológica Th1 e
Th2, inibindo as células T ativadas através da secreção de IL-10 ou através de mecanismos de
contato célula a célula (Wakkach, Fournier et al., 2003; O'garra e Trinchieri, 2004). A
produção de IL-10 é induzida durante respostas inflamatórias por TNF-α e IL-1β, o que
sugere a existência de uma retroalimentação negativa entre essas citocinas. Nos quadros de
sepsis, as altas concentrações das citocinas pró-inflamatórias no início da doença são seguidas
por um perfil de citocinas imunossupressor no desenvolvimento da doença. Não se sabe ao
certo se, no caso, a IL-10 produzida seria um mecanismo compensatório ou imunopatológico,
apesar da função modulatória na produção de TNF-α, que é citocina fundamental na
patogênese do choque séptico (Scumpia e Moldawer, 2005).
1.3.2.5 - Células dendríticas nas infecções virais
A disposição das DCs nos tecidos determina que sejam, na maioria das vezes, as
primeiras células do sistema imunológico encontradas pelos patógenos. Sendo assim, as DCs
são objeto dos inúmeros mecanismos usados pelos vírus para inibir, bloquear ou evadir as
defesas do organismo (Kaiserlian e Dubois, 2001).
Raftery e colaboradores descreveram que DCs derivadas de monócitos são infectadas
por Hantavírus. As DCs infectadas exibiram aumento na expressão de MHC do tipo I, na
expressão de moléculas co-estimulatórias e de moléculas de adesão, ou seja, o Hantavírus não
inibiu a maturação e a apoptose celular. Além disso, o vírus foi capaz de induzir níveis
significativos de TNF-α e de IFN-α (Raftery, Kraus et al., 2002). Níveis significantes de
citocinas pró-inflamatórias foram encontrados em pacientes com a síndrome renal por
Hantavírus (Krakauer, Leduc et al., 1995; Linderholm, Ahlm et al., 1996; Mori, Rothman et
al., 1999), corroborando a hipótese de que, assim como o Dengue, a imunopatologia tem
papel fundamental na febre hemorrágica por Hantavírus, sendo as células produtoras de
citocinas pró-inflamatórias de fundamental importância para o estabelecimento do quadro
(Raftery, Kraus et al., 2002).
O vírus Ebola pode inibir a produção e a resposta a IFN-α/β exógeno em macrófagos.
DCs infectadas secretam algumas quimiocinas, falham na expressão de moléculas coestimulatórias e de MHC, e não são capazes de induzir diferenciação de linfócitos alogênicos
(Bray e Geisbert, 2005). Os vírus Marburg são capazes de infectar MDDCs, porém não
28
induzem produção de citocinas, principalmente do IFN-α, e induzem maturação anômala
(Bosio, Aman et al., 2003).
O receptor DC-SIGN é freqüentemente utilizado por vírus para escapar da vigilância
imunológica exercida pelas DCs, sendo que certos vírus como o Ebola, o vírus da
imunodeficiência dos símios (SIV), o citomegalovírus (CMV), o HIV e o vírus da hepatite C
(HCV) são exemplos desses patógenos (Geijtenbeek e Van Kooyk, 2003). Os vírus HIV e
HCV subvertem a função do DC-SIGN de reconhecimento e endocitose mediada por receptor,
através da fuga da degradação pelo pH ácido típico dos lisossomos, facilitando a
disseminação viral e transmissão às células alvo, hepatócitos, no caso do HCV (Ludwig,
Lekkerkerker et al., 2004), e linfócitos T CD4, no caso do HIV (Van Kooyk, Appelmelk et
al., 2003).
Como dito anteriormente, as DCs são alvos para o vírus DENV. Wu e colaboradores
demonstraram que imDCs são permissivas à replicação viral pelo DENV (Wu, GrouardVogel et al., 2000). Ho e colaboradores relataram que a infecção pelos quatro sorotipos induz
maturação das DCs (Ho, Wang et al., 2001) e vários grupos detectaram a produção de TNF-α
e IFN-α pelas DCs infectadas (Ho, Wang et al., 2001; Libraty, Pichyangkul et al., 2001;
Palmer, Sun et al., 2005).
1.4 – Vacinas
O uso de vacinas de forma mais ampla foi introduzido a partir do início do século
passado, como revisto por Arvin e Greenberg (2006) e contribuiu de forma inequívoca para a
redução de doenças infecciosas. A vacinação é a intervenção médica mais efetiva contra
doenças causadas por patógenos virais humanos (Arvin e Greenberg, 2006).
Através da geração de uma ampla combinação de respostas imunológicas de tipo
humoral, celular e de mucosa, as vacinas virais previnem ou modificam a gravidade da
doença nos indivíduos e interrompem ou reduzem a transmissão dos patógenos a outros
indivíduos suscetíveis (Ada, 2003). Conforme revisado por Schatzmayr (2003), dentre os
exemplos clássicos de doenças limitadas pela aplicação de vacinas na população brasileira,
podemos destacar o sarampo, a rubéola, a caxumba, a febre amarela e a hepatite B, sendo que
a varíola e a poliomielite foram, por este mecanismo, erradicadas no Brasil (Schatzmayr,
2003).
As vacinas empregadas na imunização da população podem ser produzidas de diferentes
maneiras, conforme revisado por Ada (2005). Uma forma eficiente de produção vacinal é a
29
formulação de vacinas virais vivas atenuadas. Apesar dos riscos em relação aos efeitos
adversos e mutações virais, essas vacinas geram imunidade duradoura por causarem uma
resposta imunológica completa. São formas de atenuação viral: a deleção molecular
manipulada dos genes de virulência e passagem em culturas de células animais. Células de
rim de macaco Rhesus ou, simplesmente, células Vero e também ovos embrionados de
galinha são utilizados para passagens de vírus, objetivando atenuação (Ada, 2005). Avanços
nas técnicas moleculares permitiram o desenvolvimento de quimeras virais, em que são
introduzidos fragmentos antigênicos de vírus patogênicos no genoma de outros vírus, que
funcionam como vetores de clonagem (Galler, Freire et al., 1997).
Dentre as vacinas existentes comercializadas, as únicas disponíveis contra flavivírus são
as vacinas contra a encefalite japonesa, a encefalite do carrapato e contra a febre amarela. As
duas primeiras estão disponíveis como vírus inativados por formalina e a última como vírus
atenuado (Tsai, 2000).
Por muitos anos, a febre amarela foi considerada a mais importante arbovirose humana.
Clinicamente, a febre amarela é, assim como a FD, uma febre hemorrágica caracterizada por
febre alta abrupta, cefaléia, dores musculares, náuseas, vômitos e em quadros severos pode
ocorrer incapacidade funcional do fígado, originando o quadro ictérico. A diminuição da
incidência da doença foi atingida pelo intenso controle de vetores e pelo desenvolvimento de
uma vacina atenuada eficaz (Vasconcelos, 2003).
Conforme revisado por Post e colaboradores, a atual vacina contra febre amarela
produzida no Brasil por Biomanguinhos/FIOCRUZ é originada da cepa 17D. A atenuação do
vírus foi obtida utilizando o vírus patogênico isolado do africano Asibi e realizando várias
passagens em culturas de tecidos celulares (Lloyd, Theiler et al., 1936). Em 1937, o vírus
17D foi trazido para o Brasil e várias subcepas foram obtidas ao se submeter o vírus a mais
passagens em culturas. A subcepa escolhida para produção vacinal por Biomanguinhos foi a
cepa 17DD devido a baixa indução de efeitos adversos e altas taxas de soroconversão (Post,
De Carvalho et al., 2001).
1.4.1 – Vacinas para o dengue
Rothman (2003) revisou as dificuldades encontradas na produção de uma vacina efetiva
contra o DENV. Tendo como princípio que a infecção natural por um determinado sorotipo
induz imunidade duradoura e protetora somente para o sorotipo infectante, a vacina deverá
prevenir a infecção pelos quatro sorotipos do vírus (Rothman, 2003). Além disso, a resposta
30
aos epítopos dos quatro sorotipos deverá ser completa e balanceada, sendo que até a queda de
produção de anticorpos deverá ser semelhante entre os sorotipos, objetivando prevenir
excesso de anticorpos facilitadores sobre os neutralizantes (Stephenson, 2005).
As tentativas atuais para produção das vacinas giram em torno da obtenção de vacinas
vivas, ou seja, com vírus atenuados ou quimeras virais, de acordo com revisão por Halstead
(2002). Duas vacinas atenuadas feitas por passagens sucessivas em culturas de tecidos nãohumanas estão em fases de testes. Apesar das altas taxas de soroconversão (Halstead, 2002),
essas vacinas estão sujeitas as rápidas mutações e recombinações, existindo uma arriscada
probabilidade de reversão para fenótipos virulentos (Stephenson, 2005).
Quatro vacinas quiméricas estão em fases finais de desenvolvimento. Em geral, são
utilizados vírus atenuados como carreadores dos epítopos antigênicos. A estabilidade e
segurança da vacina contra febre amarela 17D propiciaram a sua utilização como vetor de
clonagem (Bonaldo, Caufour et al., 2000). Sendo assim, uma vacina quimérica tetravalente
foi desenvolvida inserindo os genes pré-membrana (prM) e envelope (E) na porção nãoestrutural do 17D e concentrações de anticorpos neutralizantes foram encontrados em todos os
macacos vacinados (Guirakhoo, Arroyo et al., 2001). Também foram utilizados o DENV 2 e
4 atenuados, onde foram inseridos na porção não-estrutural os genes prM e E dos DENV
patogênicos (Huang, Butrapet et al., 2000; Durbin, Karron et al., 2001). Essas vacinas
também apresentaram altos níveis de soroconversão dos macacos imunizados e estão em fase
final dos testes de triagem I em seres humanos (Monath, Myers et al., 2005; Pugachev,
Guirakhoo et al., 2005).
No Brasil, as vacinas contra o Dengue estão em fase de desenvolvimento. Foram
construídos vírus quimérico por Caufour e colaboradores que utilizam o vírus 17D como
vetor de expressão das quimeras, sendo que os genes prM e E do vírus vacinal são
substituídos pelos mesmos genes de duas cepas dos vírus DENV-2. A cepa NGC pertence ao
genótipo asiático e a cepa 44/2 foi isolada de um paciente que foi ao óbito causado por FHD,
pelo laboratório da Dra. Rita Nogueira (Virologia/FIOCRUZ). A quimera FAVac/DENV-2
44/3 utiliza os genes pr-M e E da cepa NGC, sendo que o final carboxílico da proteína E
(aminoácidos E261-E495) pertencem a cepa brasileira 44/2. Foram obtidos bons resultados de
imunização: 85% de camundongos vacinados sobreviveram desafio ao DENV-2 NGC
(Caufour, Motta et al., 2001) e 6 de 7 macacos Rhesus imunizados desenvolveram anticorpos
neutralizantes contra DENV-2, sobrevivendo ao desafio com DENV-2 44/2 (Galler,
Marchevsky et al., 2005).
31
Embora bons resultados estejam sendo obtidos em estudos com primatas não-humanos,
a seleção dos melhores candidatos à vacina deverá necessariamente se basear na comparação
entre as respostas imunológicas obtidas dos vacinados com um determinado perfil protetor no
desenvolvimento das respostas naturais ao DENV (Rothman, 2003).
32
2 – OBJETIVOS
Vacinas contra o Dengue ainda estão em fases de testes, existindo assim a necessidade
de ensaios in vitro com intuito de comprovar o grau de atenuação e a interação entre o sistema
imunológico humano e os vírus quiméricos candidatos a vacina. Além disso, esta interação
também é pouco estudada para os vírus vacinais. Portanto, o objetivo geral do presente
trabalho é:
Caracterizar a infecção e a produção de citocinas por células dendríticas induzidas por
um vírus quimérico Febre Amarela Vacinal/Dengue (FAVac/DENV) candidato à vacina e de
cepas padrões de Dengue-2 e Febre Amarela Vacinal, comparando as respostas entre os
diferentes vírus.
Para isso objetivamos especificamente:
1 . Caracterizar a produção de citocinas do vírus DENV-2 cepa padrão em monócitos
humanos, determinando as taxas e tempo de infecção;
2 . Padronizar a infecção de 3 flavivírus em culturas de células dendríticas derivadas de
monócitos humanos: DENV-2 cepa do tipo 2, vírus vacinal da febre amarela e vírus
quimérico FAVac/DENV candidato à vacina;
2.1 . Determinar as taxas de infecção de células dendríticas infectadas por esses vírus;
2.2 . Determinar a produção de citocinas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias e antivirais
induzidas em células dendríticas infectadas por esses vírus;
2.3 . Comparar as taxas de infecção e a produção de citocinas obtidas pela infecção pelos
diferentes vírus.
33
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - Cepas virais
Para a padronização dos ensaios das cinéticas virais em monócitos, foi utilizada uma
cepa asiática padrão internacional – 16681, do vírus DENV-2 crescida em células C6/36 de
mosquito. Esse vírus foi cedido originalmente pelo Dr. Halstead do Instituto Militar de
Pesquisa Walter Reed, Maryland/EUA (Halstead e Marchette, 2003) e sua massa viral foi
crescida no Laboratório de Imunologia Viral.
Nas infecções em DCs, foram utilizados vírus crescidos em células Vero. Esses vírus
foram produzidos no Laboratório de Tecnologia Virológica – LATEV, em Biomanguinhos,
com a colaboração de Marcos Freire (LATEV/Biomanguinhos) e Denise Irene Soeiro
Cerqueira. Duas cepas do vírus DENV-2 foram testadas, a cepa 16681 e a cepa 44/2 isolada
de um paciente brasileiro que apresentou Dengue hemorrágico (Caufour, Motta et al., 2001).
Os outros vírus testados foram o febre amarela vacinal (FAVac) 17DD, a atual vacina de
Biomanguinhos/FIOCRUZ, disponível no Brasil contra a febre amarela (Post, De Carvalho et
al., 2001) e o quimera FAVac/DENV-2 44/3. Criado pela equipe do Dr. Ricardo Galler do
Instituto Oswaldo Cruz – IOC da FIOCRUZ, o vírus quimérico foi construído usando o
esqueleto do FAVac 17D (Lloyd, Theiler et al., 1936) e trocando as regiões genômicas de
interesse do vírus original pelas do DENV. Foram utilizados os genes prM/E (prémembrana/envelope) do vírus DENV-2 New-Guinea C com a terminação carboxílica do gene
E derivado da cepa DENV-2 44/2 brasileira (Caufour, Motta et al., 2001).
3.2 - Produção das massas virais
3.2.1 – Meio de cultura e cultivo de células C6/36
Células de mosquito Aedes albopictus, clone C6/36, foram cultivadas em garrafas de
cultura de 150 cm² com 50 mL de meio Leibovitz (L-15) suplementado com 2 mL de
bicarbonato de sódio (7,5% p/v); L-glutamina 1%; fungizona 0,4%; penicilina-estreptomicina
1%; aminoácidos não-essenciais 0,5%; triptose fosfato 10%; e soro fetal bovino (SFB) 10%.
34
As culturas foram incubadas em estufa 28°C até a formação da monocamada completa. Em
seguida foram utilizadas para produção de massa viral e titulação viral.
3.2.2 - Produção do estoque viral em células C6/36
Garrafas de 150 cm² de cultura de células C6/36 foram lavadas com 5 mL de meio L-15
suplementado sem SFB. Foram adicionados 3 mL de inóculo do vírus diluído 1/10 em meio
L-15. Após 90 min de adsorção em estufa 28°C, o inóculo viral foi retirado e foram
adicionados 50 mL de meio L-15 suplementado com 2% de SFB. As culturas foram mantidas
em estufa 28°C de 7 a 10 dias até a detecção do efeito citopático (CPE). O sobrenadante foi
centrifugado a 1200 RPM por 10 min (Beckman GS-15R), aliquotado e armazenado a -70°C
para posterior titulação.
A massa viral de DENV-2 16681 utilizada nos experimentos com monócitos foi obtida
na sexta passagem celular em células C6/36 e recuperada no nono dia após infecção.
3.2.3 - Titulação viral por ensaios de diluição seriada
A titulação dos vírus crescidos em células C6/36 foi realizada através de
imunofluorescência indireta, utilizando-se os cálculos de Reed & Müench (Reed e Müench,
1938). Em placas de 96 poços fundo chato, foram adicionados 0,1 mL de suspensão contendo
2 x 105 células/mL em meio L-15 com 10% de SFB. A placa foi incubada em estufa 28°C até
o fechamento da monocamada. O sobrenadante foi retirado e adicionado 0,1 mL de inóculo
viral com diferentes diluições (10-1 a 10-11). Para cada diluição foi feita uma quadruplicata de
poços, além de quatro poços controle. A adsorção viral foi feita por 120 min em estufa 28°C e
após incubação, o sobrenadante foi retirado e 0,2 mL de meio L-15 com 2% de SFB foi
adicionado. A cultura foi mantida por um período de 7 a 10 dias em estufa 28°C, com
observação diária para visualização do efeito citopático. Após verificação deste, são retirados
0,1 mL de sobrenadante, sendo a cultura celular ressuspendida no meio restante com auxílio
de uma ponteira plástica.
A suspensão celular (0,025 mL) é colocada em lâminas de imunofluorescência
previamente lavadas. Após secagem em temperatura ambiente, as lâminas foram rinsadas com
tampão fosfato (do inglês Phosphate Buffered Saline – PBS) e fixadas com acetona P.A. por
20 min a 4°C. Foram adicionados em cada orifício das lâminas 0,02 mL de anticorpo primário
anti-DENV diluído 1/100 em solução de lavagem I, seguindo de incubação por 60 min em
35
câmara úmida e estufa 37°C. Foram feitas duas lavagens com PBS 1x por 10 min. Após
secagem a temperatura ambiente, foram adicionados em cada orifício 0,02 mL de anticorpo
secundário anti-IgG de camundongo FITC diluído 1/50 em solução de lavagem I, seguindo de
incubação por 30 min em câmara úmida e estufa 37°C. As lâminas foram lavadas duas vezes
em PBS 1x por 10 min e rinsadas com água destilada. Após secagem em temperatura
ambiente, as lâminas foram montadas com glicerol contendo anti-fading. A leitura foi
realizada em microscópio óptico de fluorescência no filtro azul para fluoresceína. Através da
fórmula de Reed & Müench, o título foi obtido em TCID50 (do inglês 50% tissue culture
infectious dose).
# poços
# poços
Total
Total
positivos
negativos
positivo
negativo
10-1
4
0
36
0
36/36 100
10-2
4
0
32
0
32/32 100
10-3
4
0
28
0
28/28 100
10-4
4
0
24
0
24/24 100
10-5
4
0
20
0
20/20 100
10-6
4
0
16
0
16/16 100
10-7
4
0
12
0
12/12 100
10-8
4
0
8
0
8/8
100
10
-9
4
0
4
0
4/4
100
10-10
0
4
0
4
0/4
0
10-11
0
4
0
8
0/8
0
Diluição
Razão
%
Fórmula de Reed & Müench:
(nº % imediatamente acima de 50%) – (% abaixo 50%)____________ =
dose imediatamente acima de 50% – dose imediatamente abaixo 50%
50 – (% imediatamente abaixo 50%)
X – dose imediatamente abaixo 50%
O título viral do DENV-2 16681 utilizado nos experimentos com monócitos foi 5,5x1010
TCID50/mL.
3.2.4 - Meio de cultura e cultivo de células vero
Células Vero (ATCC CCL81) foram mantidas pela equipe do Dr. Marcos Freire
(LATEV). O protocolo que se segue foi utilizado para o cultivo. As células Vero foram
36
cultivadas em garrafas de cultura de 175 cm² com 80 mL de meio 199 Earle’s suplementadas
com 1% gentamicina; 5% bicarbonato de sódio (7,5% p/v); e 5% de SFB. As garrafas foram
incubadas em estufa 37°C/5% CO2 até a formação de monocamada confluente. Em seguida
foram utilizadas para titulação e produção das massas virais.
3.2.5 - Produção do estoque viral em células vero
Garrafas de 175 cm² de cultura de células Vero contendo 5 x 105 células/mL foram
inoculadas com as cepas virais. O sobrenadante foi retirado e foram adicionados 2 mL do
inóculo viral com multiplicidade de infecção (MOI), que determina o número de partículas
virais por célula; de 0,02 PFU/mL. Após 60 min de adsorção viral, o inóculo foi retirado e
foram adicionados 80 mL de meio 199 suplementado com 5% de SFB. As garrafas foram
incubadas em estufa 37°C/5% CO2 por 7 dias, quando foi detectada a presença do CPE. O
sobrenadante foi centrifugado a 2000 RPM por 10 min (Beckman J6C), aliquotado e
armazenado a -70°C para posterior titulação.
3.2.6 -Titulação por unidades formadoras de placa
Os vírus foram titulados em microplacas de 24 poços contendo uma camada confluente
de 2 x 105 células/mL de células Vero mantidas em 3 mL de meio 199 suplementado com 5%
de SFB. Após a formação das monocamadas, o meio foi retirado e 0,1 mL de inóculo viral
diluído em meio 199 (10-1 a 10-6) foi adicionado às culturas. Cada diluição foi semeada em
quadruplicatas, assim como os poços controles. A placa foi incubada em estufa 37°C/5% CO2
por 60 min para adsorção viral. Após esse período, o inóculo viral foi aspirado e substituído
por meio 199 contendo 1,57% p/v de carboximetil celulose (CMC). As placas foram
incubadas por 7 dias e, após este período, a monocamada foi fixada com 1 mL de formol 10%
por poço. Depois de 60 min, as placas foram lavadas em água corrente e as células foram
coradas com cristal violeta a 0,2% p/v em água destilada. Os orifícios na monocamada
formados pela ruptura de células infectadas foram contados em projetor sob amplificação de
12,5x para calcular o título viral. A fórmula utilizada foi log número de placas formadas +
log diluição do vírus + log da fração de 1 mL do inóculo = log título viral. O título foi obtido
em PFU (do inglês plaque forming unit) por mL.
37
Os títulos dos vírus utilizados em experimentos com células dendríticas foram, em log
de PFU/mL: 6,60 para DENV-2 16681; 7,49 para DENV-2 44/2; 6,76 para FAVac/DENV-2
44/3; 7,78 para FAVac 17DD.
3.3 - Leucócitos mononucleares do sangue periférico
As células mononucleares do sangue periférico foram obtidas de doadores saudáveis que
se dirigiam ao setor de Banco de Sangue - HEMOCENTRO do Hospital Universitário
Clementino Fraga. As bolsas de fase leucocitária Buffy Coat contendo aproximadamente 50
mL de volume celular foram doadas após realização de testes sorológicos para VDRL, Chagas
– Hemaglutinação – ELISA, Hepatites – HBsAg – anti-HCV, ALT-anti-HIV-1 e 2 – ELISA,
anti-HTLV-1 e 2- ELISA confirmando sorologia negativa.
3.3.1 – Monócitos
3.3.1.1 – Obtenção de monócitos
As células do sangue de doadores humanos, obtidas a partir de bolsas de fase
leucocitária Buffy Coat, foram obtidas através da técnica de gradiente de densidade. Foi
utilizado meio de cultura RPMI 1640 suplementado com L-glutamina 1%; penicilinaestreptomicina 1%; HEPES 20mM. O sangue foi diluído 1/2 em meio RPMI totalizando um
volume final de 100 mL. Cada volume de 25 mL de sangue diluído foi lentamente adicionado
sobre 15 mL de Ficoll-Hypaque, em tubos Falcon estéreis de 50 mL. Em seguida, o gradiente
foi centrifugado a 1500 RPM por 30 min (Renavan Cientec 5500D), à temperatura ambiente.
Após centrifugação, o anel de leucócitos, que se forma na interface do meio de cultura com o
Ficoll, foi recuperado e submetido a três lavagens por centrifugação com meio RMPI
completo a 1500 RPM por 10 min (Beckman GS-15R) a 18°C. Cada tubo, no total de quatro,
teve o “pellet” ressuspendido em 5 mL de meio RPMI, distribuído em 5 garrafas de cultura
celular de 175 cm2 e completado para um volume final de 50 mL. Após 90 min de incubação
em estufa 37ºC/5% CO2, o sobrenadante com células não-aderentes foi desprezado e as
garrafas foram lavadas duas vezes com meio RPMI. As células foram recuperadas em meio
RMPI frio com auxílio de um raspador e centrifugadas a 1500 RPM por 10 min (Beckman
GS-15R) a 18ºC. Uma suspensão celular de 10 mL foi feita, uma alíquota tirada e diluída 1/10
em 0,2% azul de Trypan para contagem em microscópio óptico com auxílio da câmara de
38
Newbauer. As células foram plaqueadas a 1,0 x 106 células por poço com 1,0 mL/poço em
meio RPMI com 10% de SFB. As culturas de monócitos foram mantidas em estufa 37ºC/5%
CO2 por 1 dia até o momento da infecção.
3.3.1.2 - Infecção dos monócitos
O sobrenadante da cultura de monócitos foi retirado e adicionado 0,3 mL do inóculo
viral diluído em meio RPMI sem SFB. As culturas também foram inoculadas com vírus
inativado a 56ºC por 20 min e com meio de cultura RPMI ou MOCK (sobrenadante de cultura
celular). Após a adsorção do vírus por 120 min em estufa 37ºC/5% CO2, o inóculo foi
retirado e 1,0mL de meio RPMI suplementado com 2% de SFB foi adicionado. A placa foi
incubada em estufa 37ºC/5%CO2. De acordo com a cinética, as células infectadas com vírus
DENV-2 16681 e seus controles negativos foram coletadas para marcação intracelular do
antígeno viral e os sobrenadantes foram armazenados a -20°C para posterior dosagem de
citocinas.
3.3.2 – Células dendríticas
3.3.2.1 - Cultura de células dendríticas
Os monócitos se diferenciam em células dendríticas imaturas através da adição na
cultura das citocinas IL-4 e granulócito macrófago-fator estimulador de colônia (do inglês
granulocyte macrophage-colony stimulating factor – GM-CSF). Após a contagem dos
monócitos, a suspensão celular foi ajustada para 2 x 106 células por mL, com 10% de SFB,
500 U/mL de GM-CSF e 500 U/mL de IL-4 em meio RPMI 1640 completo. As células foram
plaqueadas com 0,5 mL por poço e incubadas em estufa 37°C/5% CO2. As citocinas foram
repostas a cada 2 dias durante 6 dias, sendo que o procedimento de troca de meio foi feito
retirando metade do volume total do poço cuidadosamente e adicionando-se às culturas meio
com citocinas 2x e 20% de SFB.
3.3.2.2 - Infecção das células dendríticas
As células dendríticas obtidas pela técnica descrita acima, foram infectadas retirando-se
0,3 mL do sobrenadante e sendo adicionados 0,5 mL de vírus diluído e dos respectivos vírus
39
inativados e de MOCK. Após a adsorção do inóculo viral por 180 min em estufa 37ºC/5%
CO2, 0,5 mL do sobrenadante foi retirado, sendo reposta a mesma quantidade de meio RPMI
com concentração final nos poços de 500 U/mL de GM-CSF, 500 U/mL de IL-4 e 10% de
SFB. De acordo com a cinética, as células infectadas com as cepas virais e seus controles
negativos foram coletadas para marcação intracelular do antígeno viral e os sobrenadantes
foram armazenados a -20°C para posterior dosagem de citocinas.
3.4 – Citometria de Fluxo
3.4.1 - Marcação extracelular para marcador de superfície
Os monócitos foram marcados um dia após a realização da obtenção por gradiente de
densidade, sendo armazenados no intervalo de tempo a 4°C em meio de cultura RPMI com
10% de SFB. As DCs foram recuperadas após 7 dias de diferenciação celular e marcadas no
mesmo dia.
Após a centrifugação da suspensão celular a 1200 RPM por 7 min (Beckman GS-15R),
as células foram lavadas com 1 mL de solução de lavagem I. O sobrenadante foi desprezado,
foram adicionados 0,5 mL de solução de bloqueio I, seguido de incubação por 30 min a 4ºC.
Foram adicionados 0,5 mL de solução de lavagem I e as células foram centrifugadas a 1200
RPM por 7 min (Beckman GS-15R). O sobrenadante foi desprezado e às células foram
adicionados 0,02 mL de anticorpo anti-humano CD1a-PE, DC-SIGN-FITC, CD14-FITC,
HLA-DP,DQ,DR-FITC, CD80-FITC e isotipos. Os anticorpos foram diluídos em solução de
lavagem I e incubados por 30 min a 4ºC. Após, foram centrifugadas com 1,0 mL de solução
de lavagem I. O sobrenadante foi descartado e as células fixadas com 0,25 mL de solução de
fixação. As amostras foram guardadas a 4ºC para posterior leitura em FACS. A análise dos
resultados foi feita pelo programa FlowJo.
3.4.2 -Marcação intracelular para antígeno viral
As células foram recuperadas de acordo com as cinéticas e marcadas no mesmo dia. As
suspensões celulares foram centrifugadas com 1,0 mL de solução de lavagem I a 1200 RPM
por 7 min (Beckman GS-15R). O sobrenadante foi desprezado e as células fixadas com 0,5
mL de solução de fixação com incubação por 20 min a 4ºC. Após, foram adicionados 0,5 mL
de solução de permeabilização, seguindo de centrifugação a 1200 RPM por 7 min (Beckman
40
GS-15R). O sobrenadante foi descartado e foi adicionado 1 mL de solução de
permeabilização, seguindo de incubação por 10 min a 4ºC. As células foram centrifugadas a
1200 RPM por 7 min (Beckman GS-15R) e o sobrenadante descartado. Foram adicionados
0,5 mL de solução de bloqueio I e realizada incubação por 30 min a 4ºC. Foram adicionados
0,5 mL de solução de permeabilização e as células foram centrifugadas a 1200 RPM por 7
min (Beckman GS-15R). O sobrenadante foi desprezado e às células foram adicionados 0,02
mL de anticorpo primário anti-Dengue ou anti-febre amarela diluídos em solução de
permeabilização, seguido de incubação por 60 min a 4ºC. Após, foram lavadas com 1,0 mL de
solução de permeabilização. Foram adicionados 0,02mL de anticorpo secundário anti-IgG de
camundongo PE diluído 1/50 com incubação por 30 min a 4ºC. Após, foram lavadas com 1,0
mL de solução de permeabilização. O sobrenadante foi descartado e as células fixadas com
0,25 mL de solução de fixação. As amostras foram guardadas a 4ºC para posterior leitura em
FACS. A análise dos resultados foi feita pelo programa FlowJo.
3.5 - Detecção de citocinas nos sobrenadantes das culturas
Foram utilizados kits de ELISA (do inglês enzyme linked immunesorbent assay) para
detecção de TNF-α e de IFN-α no sobrenadante das culturas. A padronização dos kits foi
realizada, porém os dados não são aqui demonstrados, sendo que apenas dois exemplos de
curvas padrões foram demonstrados no apêndice. Também foi utilizado um kit de tecnologia
de análise múltipla para citocinas (do inglês Multiplex Cytokine Analysis Technology),
Luminex® (Beadlyte®, Upstate) para detecção de TNF-α, IFN-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10,
IL-15 e IL-12.
O TNF-α foi detectado nos sobrenadantes das culturas pela técnica de ELISA utilizando
kits da PeproTech®, que foram padronizados de acordo com a literatura (Kittigul, Temprom et
al., 2000). Placa de 96 poços (Maxi-sorp – Nunc®) foi sensibilizada com 0,1 mL de anticorpo
captura diluído 1/125 em PBS 1x e incubada overnight a temperatura ambiente.
Posteriormente, foram efetuadas quatro lavagens com 0,25 mL de solução de lavagem II para
adição de 0,3 mL de solução de bloqueio II. A placa foi agitada por 90 min a temperatura
ambiente. Após quatro lavagens com solução de lavagem II, as amostras foram diluídas 1/2 e
distribuídas na placa juntamente com a curva padrão. A placa foi incubada overnight a 4ºC.
Após quatro lavagens com solução de lavagem II, o anticorpo detecção diluído 1/200 em
solução diluente foi adicionado e a placa mantida por 60 min a temperatura ambiente, sob
41
agitação. Após seis lavagens com solução de lavagem II, estreptavidina-HRP diluída 1/2000
em solução diluente foi adicionada e mantida por 30 min a temperatura ambiente sob
agitação. Após oito lavagens com solução de lavagem II, 0,1 mL de TMB
(tetrametilbenzidina) foi adicionado e incubado por 5 min a temperatura ambiente sob
agitação. A leitura da placa foi feita a 630 nm e o cálculo das amostras foi feito por regressão
linear, conforme exemplificado no apêndice.
A técnica utilizada para detecção de IFN-α nos sobrenadantes é semelhante ao protocolo
descrito acima e o kit utilizado é da Bender MedSystems®. A placa de 96 poços (Maxi-sorp Nunc®) foi sensibilizada com anticorpo captura diluído 1/10 em PBS 1x e incubada overnight
a 4ºC. Posteriormente, foi efetuada uma lavagem com 0,25 mL de solução de lavagem II para
adição de 0,25 mL de solução de ensaio. A placa foi agitada por 120 min a temperatura
ambiente. Após duas lavagens com solução de lavagem II, as amostras foram diluídas 1/2 em
solução de ensaio e distribuídas na placa juntamente com a curva padrão. O anticorpo
detecção conjugado com HRP diluído 1/1000 em solução de ensaio foi adicionado e a placa
mantida por 120 min a temperatura ambiente, sob agitação. Após três lavagens com solução
de lavagem II, 0,1 mL de TMB foi adicionado e incubado por 20 min a temperatura ambiente
sob agitação. Foram adicionados 0,05mL de ácido sulfúrico 4N. A leitura da placa foi feita a
450 nm e o cálculo das amostras foi feito por regressão linear, conforme exemplificado no
apêndice.
O ensaio de detecção multiplex Luminex® consiste na detecção de várias citocinas em
um mesmo poço utilizando microesferas específicas para cada citocina (mais informações no
http://www.luminexcorp.com). Esta técnica vem sendo utlizada por vários grupos de pesquisa
(Cesbron-Gautier, Simon et al., 2004; Dupont, Wang et al., 2005; Heijmans-Antonissen,
Wesseldijk et al., 2006) e também pela nossa equipe (Kubelka, em manuscrito). Cada
microesfera possui uma mistura de dois fluorocromos que as diferenciam umas das outras. As
microesferas são recobertas com anticorpos que se ligam a uma citocina específica. Um
anticorpo marcado com ficoeritrina (PE) se liga ao complexo citocina-microesfera,
determinando a quantidade de ligante no complexo. Esse sistema será lido no aparelho por
dois lasers: o primeiro identifica a bead analisada e o segundo determina a concentração da
citocina ligada à bead. Comparando com uma curva padrão, é obtida a concentração de cada
citocina calculada estatisticamente. O protocolo utilizado na dosagem dos sobrenadantes de
cultura foi realizado de acordo com o fabricante do kit Beadlyte®, Upstate (catálogo #48-508).
Suscintamente, as amostras foram plaqueadas em placas de 96 poços com filtro no fundo,
diluidas em tampão fornecido pelo kit. O padrão de citocinas fornecido foi diluido e
42
plaqueado. Um pool de beads de cada citocina analisada foi plaqueado, seguindo de
incubação. A placa foi lavada à vácuo e foi adicionado um pool de anticorpos biotinilados
para as citocinas. Após incubação, foi adicionada estreptavidina-PE prosseguindo de
incubação. Uma solução STOP fornecida foi adicionada e a placa foi lavada à vácuo. Após
ressuspensão das beads com tampão, foi realizada a leitura da placa no aparelho Luminex®
Instrumentation System. O cálculo das amostras foi processado pelo programa fornecido pelo
aparelho.
3.6 – Material e reagentes
3.6.1 – Meios de Cultura
Meio L15 (Leibovitz) #41300-070 – Gibco
Meio 199 Earle’s #M5017 – Sigma
Meio RPMI 1640 #11876-093 – Gibco
3.6.2 – Reagentes
Bicarbonato de Sódio P.A. #302 - ISOFAR
L-Glutamina #21051-024 - GibcoBRL
Fungizona #15290-018 – Gibco
Penicilina-Estreptomicina #15140-122 – Gibco
Aminoácidos não essenciais #11140-050 – Gibco
Triptose Fosfato #T8782 – Sigma
Soro Fetal Bovino #10270-106 – Gibco
HEPES #15630-080 – Gibco
Ficoll-Paque™ Plus #17-1440-03 – Amercham Biosciences AB
Citocina humana recombinante Interleucina-4 humana #200-04 – PeproTech
Citocina humana recombinante GM-CSF #300-03 – PeproTech
Albumina Bovina (BSA) #A-8022 – Sigma
Saponina #S-7900 – Sigma
Paraformaldeído #P6148-500G – Sigma
Azul de Trypan – Sigma
Tween 20™ (Polyoxythylene Sorbitan Monolaurate) #P-1379 – Sigma
43
Human TNF-α ELISA Development Kit (Padrão, Anticorpos Captura e Detecção) #900-K25EDK – PeproTech
Human IFN-α Module Set (Padrão, Anticorpo Captura e Conjugado com peroxidase)
#BMS216MST – BenderMed Systems
Estreptavidina-HRP #43-4323 – Zymed
TMB (tetrametilbenzidina) #T-0440 – Sigma
Kit de detecção multiplex Luminex® Beadlyte® #48-508 – Upstate
3.6.3 Soluções
PBS (Tampão fosfato) pH 7.4 (10x)
Cloreto de sódio......................................................... 80 g
Cloreto de potássio..................................................... 2 g
Fosfato dibásico de sódio........................................... 28,98 g
Fosfato monobásico de potássio................................ 2 g
Água destilada q.s.p. ................................................. 1000 mL
Bicarbonato de sódio
Bicarbonato de Sódio ............................................... 7,5 g
Água destilada q.s.p. ................................................ 100 mL
Solução de azul de trypan 2%
Azul de trypan .......................................................... 2 g
PBS q.s.p. ................................................................. 100 mL
Soluções para Citometria de Fluxo
Solução de Lavagem I – BSA 1% Azida 0,1% PBS 1x
Azida Sódica........................................................... 0,1 g
BSA ........................................................................ 1 g
PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL
44
Solução de bloqueio I – BSA 1% Azida 0,1% Plasma autólogo 5% PBS 1x
Azida sódica............................................................. 0,1 g
BSA ......................................................................... 1 g
Plasma autólogo ...................................................... 5 mL
PBS q.s.p. ................................................................ 100 mL
O plasma autólogo deve ser inativado a 56°C por 30 min.
Solução de permeabilização – BSA 1% Azida 0,1% Saponina 0,15% PBS 1x
Azida sódica ........................................................... 0,1 g
BSA ........................................................................ 1 g
Saponina ................................................................. 0,15 g
PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL
Solução de fixação – Paraformaldeído 2% PBS 1x
Paraformaldeído ..................................................... 2 g
PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL
Soluções para ELISA
Solução de lavagem II – Tween 20 0,05% PBS 1x
Tween 20 ............................................................... 0,5 mL
PBS q.s.p. .............................................................. 1000 mL
Solução de bloqueio II – BSA 1% PBS 1x
BSA ........................................................................ 1 g
PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL
Solução diluente – BSA 0,1% Tween 20 0,05% PBS 1x
BSA ........................................................................ 0,1 g
Tween 20 ................................................................ 0,05 mL
PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL
45
Solução de ensaio – BSA 0,5% Tween 20 0,05% PBS 1x
BSA ........................................................................ 0,5 g
Tween 20 ................................................................ 0,05 mL
PBS q.s.p. ............................................................... 100 mL
3.6.4 – Anticorpos
Anticorpo de camundongo anti-Dengue complexo #MAB8705 – Chemicon International
(1/100)
Anticorpo anti-febre amarela MIAF (fluído ascítico hiperimune) – ATCC (1/100)
Anticorpo anti-IgG de camundongo (F (ab’)2) – RPE #R0480 – DakoCytomation (1/50)
Anticorpo anti-IgG de camundongo (F (ab’)2) – FITC #F0313 – DakoCytomation (1/50)
Anticorpo de camundongo anti-DC-SIGN humano – FITC #FAB161F – R&D Systems (1/5)
Anticorpo de camundongo anti-CD1a humano – RPE #LMHCD1a04 – Caltag Laboratories
(1/20)
Anticorpo de camundongo anti-CD14 humano – FITC clone TÜK4 #F0844 –
DakoCytomation (1/50)
Anticorpo de camundongo anti-CD80 humano – FITC #PNIM1853 – IOTest Immunotech
(1/20)
Anticorpo de camundongo anti-antígeno HLA-DP,DQ,DR humano – FITC clone CR3/43
#F0817 – DakoCytomation (1/50)
Anticorpo de camundongo IgG1 – RPE #X0928 – DakoCytomation
Anticorpo de camundongo IgG1 – FITC #X0927 – DakoCytomation
Anticorpo de camundongo IgG2a – FITC #X0933 - DakoCytomation
Anticorpo de camundongo IgG2b – FITC #RMG2b01 – Caltag Laboratories
46
4 – RESULTADOS
4.1 – Padronização da infecção in vitro de DENV-2 em monócitos
4.1.1 – Titulação da diluição do inóculo viral do DENV-2 (cepa 16681)
Como foi descrito acima, monócitos, macrófagos e células dendríticas são alvos para o
DENV. Objetivando padronizar a produção de citocinas nas infecções virais nos fagócitos
mononucleares, a padronização dos experimentos de cinéticas virais foi desenvolvida em
nosso laboratório em monócitos pelo seu menor custo de obtenção.
Uma população de células aderentes ricas em monócitos foi obtida pela técnica de
gradiente de densidade e em seguida pela aderência em garrafas de plástico. Estas células
foram infectadas um dia após o plaqueamento em placas de 24 poços, com diferentes
diluições do vírus DEN-2 cepa padrão 16681 com título 5,5x10-10 TCID50/mL crescido em
células C6/36. Foram utilizadas as diluições do inóculo de 1/10, 1/25, 1/50, 1/75 e 1/100 nas
infecções, que correspondem ao título final de 5,5x10-9, 1,37x10-8, 2,75 x10-8, 4,28 x10-8 e 5,5
x10-8 em TCID50/mL, respectivamente. As células foram recuperadas dois dias após a
infecção e foram feitas marcações para o antígeno viral em duplicatas. Culturas inoculadas
com vírus inativado e meio de cultura foram utilizadas como controles da infecção. De acordo
com a figura 1, não foi detectada expressão de antígeno viral nas culturas controles, indicando
que os vírus infecciosos estão se multiplicando para manter a expressão do antígeno. Para
todas as diluições usadas, foram detectadas células positivas para o antígeno do DENV, sendo
a porcentagem de células positivas proporcional à carga viral inoculada. A maior porcentagem
de células positivas para o antígeno viral foi detectada para título final do inóculo de 0,55 x108
TCID50/mL com 72,3%. No entanto, foi escolhida a diluição final do vírus de 1,37 x10-8
TCID50/mL para ser utilizada nas cinéticas dos monócitos infectados com os vírus DENV-2
16681 crescido em C636, uma vez que esta diluição demonstrou percentual de infecção
superior a 50%, taxa essa capaz de provocar alterações detectáveis em monócitos (NevesSouza, 2005).
47
4.1.2 – Cinética viral do DENV-2
Uma vez padronizada a diluição a ser utilizada, foi realizada uma cinética em nosso
laboratório com monócitos infectados pelo DENV-2 (cepa 16681). As células foram
infectadas e recuperadas de 1 a 5 dias após a infecção para marcação do antígeno viral. O
sobrenadante da cultura celular (MOCK) e o vírus inativado foram utilizados como controles
negativos para a infecção. O antígeno viral foi detectado em todos os pontos analisados
(figura 2), sendo que o pico de replicação viral foi detectado no 2° dia após a infecção
(54,45%). No 3° dia (39,7%), encontramos valores semelhantes ao 1° (40,94%), enquanto nos
4° (35,33%) e 5° dias (28,99%) ocorreu diminuição gradual da expressão do antígeno.
Conforme o esperado, não houve detecção de antígenos nas culturas infectadas com MOCK e
vírus inativado em todos os pontos da cinética (figura 2).
4.1.3 – Cinética de produção de citocinas induzidas pelo DENV-2 em monócitos
As células da linhagem monocítica são intensas produtoras de TNF-α. Para analisar a
produção desta citocina por monócitos, induzida pelo DENV-2 16681, os sobrenadantes da
cinética viral realizada no item anterior foram armazenados a -20°C para dosagem por
ELISA. As concentrações obtidas foram calculadas por regressão linear usando uma curva
padrão. As culturas incubadas com meio de cultura, MOCK e vírus inativado foram utilizadas
como controles negativos e não induziram concentrações significativas de TNF-α em relação
ao vírus infeccioso. A produção de TNF-α foi detectada em todos os pontos da cinética (figura
3), sendo que logo no 1° dia, já foram detectados níveis elevados da citocina (503,65 ± 13,44
pg/mL). No 2° (817,33 ± 106,92 pg/mL) e 3° dias (895,47 ± 288,60 pg/mL), os valores
aumentam, porém o pico de produção foi visto no quarto dia com 1055,48 ± 118,87 pg/mL,
seguida da queda da concentração no 5° dia (440,46 ± 113,40 pg/mL), de acordo com a figura
3.
Em outra cinética realizada também com o DENV-2, em que a taxa de infecção dos
monócitos foi de 30,86% no 2° dia após a infecção, os sobrenadantes foram recuperados de 1
a 7 dias e dosados pela tecnologia de multiplex (Luminex®). Meio de cultura e vírus inativado
foram utilizados como controles negativos e foram dosadas as concentrações de TNF-α, IL1β, IL-6, IFN-α, IL-10, IL-12, IL-8 e IL-15 (figura 4). Não foram encontradas diferenças entre
as concentrações induzidas pelos controles negativos e pelo vírus infeccioso em nenhum
ponto das cinéticas de IL-12 (figura 4 H) e IL-15 (figura 4 F). As concentrações de IL-8
48
induzidas pelo vírus infeccioso não apresentaram diferenças em relação ao vírus inativado
(figura 4 G). Neste experimento, a produção de TNF-α (figura 4 A) foi precoce com pico no
2° dia após a infecção (64,33 pg/mL), tendo queda no 3° (48,05 pg/mL) e 4° dias (41,72
pg/mL). A IL-1β também foi produzida precocemente com pico no 2° dia após a infecção
(10,43 pg/mL) e também foi detectada uma produção da citocina na fase tardia (figura 4 B). A
citocina IL-6 foi secretada tardiamente com picos de produção no 5° (1274,50 pg/mL) e 6°
dias (1479,10 pg/mL) e, assim como o TNF-α e IL-1β, foi detectada produção de IL-6 pelo
vírus inativado na fase tardia da cinética (figura 4 C). Foi determinado um platô de produção
de IFN-α do 3° (143,66 pg/mL) ao 6° (171,70 pg/mL) dias (figura 4 D) e também da IL-10
(figura 4 E) no mesmo período.
4.2 – Caracterização morfológica e fenotípica das culturas de monócitos e de células
dendríticas
As células dendríticas (DCs) foram geradas a partir de monócitos, obtidos de leucócitos
mononucleares do sangue periférico (PBML) de doadores saudáveis e a morfologia e os
aspectos celulares das culturas foram acompanhados por microscopia óptica. Os monócitos
apresentaram morfologia bem esférica e regular, dando aspecto de uniformidade na cultura.
Durante a diferenciação em DCs, conforme eram adicionadas as citocinas recombinantes IL-4
e GM-CSF às culturas, as células foram sofrendo modificações morfológicas, sendo que eram
mais arredondadas e maiores em relação aos monócitos. No último dia de diferenciação, a
cultura não era mais regular e apresentava agrupamentos celulares, formados pelas células
arredondadas. Os grupos celulares ou clusters estavam dispersos em todo poço e eram
encontrados fracamente aderidos no fundo do poço e no sobrenadante da cultura.
Objetivando diferenciar os tipos celulares obtidos antes e depois da diferenciação, foi
realizada a imunofenotipagem das populações de monócitos e células dendríticas obtidas,
utilizando marcações para CD1a, CD14, DC-SIGN, CD80 e HLA-DP,DQ,DR, que
diferenciam os tipos celulares.
Analisando os parâmetros de tamanho (FSC, do inglês Foward Scatter) e granulosidade
(do inglês Side Scatter), os monócitos foram selecionados na região R1 (figura 5 A) típica
dessa população e foram fenotipicamente: CD14 positivo (90,4%) e DC-SIGN negativo
(1,79%). Já as células cultivadas por 6 dias na presença de GM-CSF e IL-4 foram
selecionadas na região R2 (figura 5 B), que apresentou células maiores e mais granulosas que
as células da região R1. A região R2 demonstrou células CD14 negativas (3,32%) e DC-SIGN
49
positivas (96,5%). Em outro experimento, foi feita a marcação de CD1a, marcador
característico de células dendríticas, em que 58,7% das células eram CD1a positivas (figura
6).
As marcações para verificação do fenótipo de maturação das células dendríticas foram
realizadas através da comparação das DCs obtidas pela diferenciação na cultura com adição
das citocinas recombinantes, com culturas de DCs acrescentadas de LPS e IFN-γ. As DCs
foram selecionadas na região R2 e as células obtidas em cultura (figura 7 A) foram 84,6%
(MFI 371) DC-SIGN positivas; 4,17% (MFI 165) CD80 positivas e 89,3% (MFI 400) HLADP,DQ,DR positivas, enquanto as células ativadas com LPS e IFN-γ foram 71,3% (MFI 340)
DC-SIGN positivas; 42,8% (MFI 271) CD80 positivas e 98,5% (MFI 549) HLA-DP,DQ,DR
positivas (figura 7 B). Além do aumento de porcentagem de células positivas foi observado
também um aumento da intensidade de fluorescência para o CD80 e HLA das DCs ativadas.
4.3 – Interações entre as células dendríticas e os vírus DENV-2, FAVac e quimérico
(FAVac/DENV-2)
4.3.1 – Cinéticas de infecção dos vírus DENV-2, FAVac e quimérico (FAVac/DENV-2)
Uma vez padronizada a cinética de infecção em monócitos e produção de citocinas,
além da verificação da obtenção de células dendríticas, procedeu-se às cinéticas em DCs
utilizando os vírus DENV-2 cepas asiática (16681) ou DENV-2 AS, e brasileira (44/2) ou
DENV-2 BR; FAVac (17DD) e o quimera FAVac/DENV-2 (44/3). Para realizar as
comparações, foram utilizados dois doadores de bolsas de sangue nas cinéticas de infecção e
dosagem de citocinas. Foram utilizados como controles negativos culturas inoculadas com
meio de cultura, MOCK e vírus inativados. A mesma multiplicidade de infecção (MOI = 4)
foi utilizada para comparação entre as cepas virais nos dois doadores. A análise da infecção
foi feita determinando-se a porcentagem de células positivas para antígenos virais versus
tamanho das células da região R2 (figura 8).
No doador 1 (figura 9 A), a maior percentagem de antígeno viral, no primeiro dia após a
infecção, foi detectada nas culturas infectadas com o DENV-2 AS (54%), enquanto que nas
culturas infectadas com os outros vírus esses valores foram muito reduzidos (DENV-2 BR,
1,37%; FAVac/DENV-2, 6,91%; FAVac 2,97%). No quarto dia após infecção, ocorreu uma
redução na detecção de antígenos do DENV-2 AS (5,71%), DENV-2 BR (valor menor que
1%), FAVac/DENV-2 (4,43%), enquanto houve um aumento na do FAVac (17,48%). Já no
sétimo dia após infecção, a detecção de antígenos foi muito baixa para todos os vírus, sendo o
50
maior valor do FAVac (5,25%). No doador 2 (figura 9 B), o DENV-2 AS infectou 12,8% das
DCs no segundo dia, enquanto as outras cepas virais tiveram valores menores (DENV-2 BR,
3,18%; FAVac/DENV-2, 1,47%; FAVac, 4,16%). No quarto dia, cairam as taxas de infecção
das culturas inoculadas com o DENV-2 AS (7,02%), DENV-2 BR e FAVac/DENV-2 (valores
menores que 1%) e aumentou a taxa de infecção das DCs infectadas com FAVac (5,0%). No
sétimo dia, as taxas de infecção cairam para o DENV-2 AS (3,0%) e o FAVac/DENV-2
(menos de 0,5%) e aumentaram para o DENV-2 BR (2,4%) e para o FAVac (10,71%). O
doador 1 se mostrou mais sensível à infecção, embora ambos doadores permitissem o
crescimento dos 3 vírus. Em ambos o DENV-2 BR infectou uma taxa muito pequena de
células.
4.3.2 – Produção de citocinas pelas células dendríticas infectadas com os vírus DENV-2,
FAVac e quimérico (FAVac/DENV-2)
Os sobrenadantes das culturas de DCs infectadas foram armazenados e dosados por
ELISA para TNF-α e IFN-α, como descrito anteriormente na metodologia. Foram realizadas
as dosagens para os dois doadores citados no item anterior, utilizando como controles
negativos os sobrenadantes das culturas infectadas com vírus inativado, MOCK ou meio de
cultura.
Conforme demonstrado nas figuras 10 e 11, para o doador 1, o vírus DENV-2 AS induz
a produção de TNF-α nos primeiro dias de infecção com pico no quarto dia (800,18 ± 312,27
pg/mL), enquanto a produção de IFN-α teve início no quarto dia com altos níveis da citocina
detectados no sétimo dia (256,34 ± 77,08 pg/mL). O vírus DENV-2 BR apresentou mais baixa
produção de TNF-α, com pico no primeiro dia (176,04 ±34,00 pg/mL) e níveis abaixo de 6
pg/mL de IFN-α. O FAVac teve uma produção de TNF-α com pico no quarto (290,01 ±
36,52 pg/mL) e uma alta produção de IFN-α também no quarto dia (619,68 ± 51,03 pg/mL).
Já o vírus FAVac/DENV-2 apresentou uma produção menor de TNF-α (150,22 ± 10,07
pg/mL) e um pico de produção de IFN-α no quarto dia com 358,05 ± 3,88 pg/mL. O perfil de
produção de TNF-α e IFN-α foi semelhante para os dois doadores, porém os níveis de TNF-α
foram mais baixos no segundo doador para todos os vírus. Os níveis de IFN-α foram
semelhantes nos dois doadores.
Ao compararmos as cinéticas de infecção, a produção de TNF-α e de IFN-α, pode-se
observar, de acordo com a figura 12, que a concentração de TNF-α foi proporcional às taxas
51
de infecção dos vírus e foi induzida precocemente pelas cepas virais. Já o IFN-α foi
produzido principalmente pelas cepas quimérica e vacinal, sendo a indução pelo vírus vacinal
em fase precoce da sua cinética de infecção.
Uma vez que não foi detectada a produção de citocinas com precisão pelo vírus DENV2 BR, suspeitou-se que o MOI baixo estaria dificultando a infeção das DCs. Foi realizada,
então, uma cinética utilizando um MOI de 15 PFU/mL no intuito de verificar o perfil da
produção de TNF-α e IFN-α por esta cepa. O pico de infecção foi detectado no 1° dia após a
infecção com 29,8 % de células DENV+ (figura 13). Em relação às citocinas testadas, o TNFα foi detectado precocemente com pico no 2° dia (1021,83 pg/mL), enquanto a produção de
IFN-α é tardia com maior produção detectada no 6° dia após a infecção (207,17 pg/mL).
Os sobrenadantes da cinética das cepas virais em DCs do doador 2 também foram
dosados pela técnica do Luminex. A escolha deste doador foi determinada pelo tempo de
armazenamento das amostras, uma vez que o kit de multiplex não se encontrava disponível
quando foi realizada a cinética com o doador 1. De acordo com os ensaios prévio por ELISA,
foram confirmados os dados que apontam a maior produção de TNF-α pela cepa DENV-2 AS
(31,30 pg/mL) em relação as demais (figura 14 A), assim como a maior produção do FAVac
de IFN-α, com 438,70 pg/mL (figura 14 B). Altas concentrações de IL-6 (figura 14 D) foram
produzidas pelas culturas de DCs incubadas com MOCK (6547,67 pg/mL), o que dificulta a
análise da sua produção pelos vírus. Os maiores níveis de produção desta citocina foram do
vírus DENV-2 AS com (6739,41 pg/mL), porém não significativa devido à alta produção pelo
vírus inativado (6172,36 pg/mL). A maior diferença entre vírus infeccioso e inativado foi
detectada no FAVac (3986,38 e 1168,15 pg/mL, respectivamente). O FAVac/DENV-2
induziu baixas concentrações com pouca diferença entre o infeccioso e o inativado (2011,26 e
1803,45 pg/mL, respectivamente). Também foram detectadas altas concentrações de IL-10
(figura 14 E) induzidas pelo MOCK. Uma produção significante desta citocina foi induzida
pelos vírus FAVac (162,22 pg/mL) e FAVac/DENV-2 (187,03 pg/mL), enquanto não foi
encontrada diferença expressiva entre a produção de IL-10 entre o DENV-2 AS infeccioso e
inativado (93,34 e 127,26 pg/mL, respectivamente). A produção de IL-8 (figura 14 F)
demonstrou menor produção para os vírus infecciosos em relação aos seus controles
negativos, sendo maior diferença encontrada para o FAVac/DENV-2 (4817,53 e 2203,42
pg/mL, respectivamente inativado e infeccioso) e a menor para o FAVac (4738,65 e 3950,92
pg/mL, respectivamente inativado e infeccioso). Não foram encontradas diferenças
significantes de produção de IL-1β (figura 14 C), IL-15 (figura 14 G) e IL-12 (figura 14 H)
entre os vírus e seus controles negativos.
52
80
Células DENV+ (%)
70
60
50
40
30
5.0
2.5
5,
5
4,
28
2,
75
1,
37
0,
55
M
O
CK
0.0
T ítulo do final do inóc ulo (x10-8 TC ID 50/mL)
MOC K
Inativado
Infeccioso
Figura 1: Titulação em monócitos infectados com DENV-2. Monócitos humanos
foram infectados por 2 dias com DENV-2 (cepa 16681) com 5,5x10-10 TCID50/mL em
diluições sucessivas em duplicatas. Vírus DENV-2 inativado e MOCK foram utilizados
como controles negativos. Após dois dias de infecção, as células foram recuperadas e
marcadas com anticorpo anti-dengue ou anti IgG de camundongo-PE. As células para
análise foram selecionadas na região dos monócitos na região lógica para CD14+ e as
taxas de infecção obtidas na análise por citometria de fluxo estão representadas no
gráfico de barras. O eixo x representa título final do inóculo no poço e o eixo y
representa porcentagem de células positivas para antígeno viral.
53
Células DENV+ (%)
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
T empo (dias)
Infeccioso
Inativado
MOC K
Figura 2: Cinética em monócitos infectados com DENV-2. Monócitos humanos foram
infectados com DENV-2 (cepa 16681) 5,5x10-10 TCID50/mL com inóculo final de
1,37x10-8 TCID50/mL. Vírus DENV-2 inativado e MOCK foram utilizados como
controles negativos. As células foram recuperadas de 1 a 5 dias após infecção e
marcadas com anticorpo anti-dengue ou anti IgG de camundongo-PE. As células para
análise foram selecionadas na região dos monócitos no gate lógico para CD14+ e as
taxas de infecção obtidas na análise por citometria de fluxo estão representadas no
gráfico de linhas. O eixo x representa tempo após infecção em dias e o eixo y representa
porcentagem de células positivas para antígeno viral.
Concentração (pg/mL)
1250
1000
750
500
250
0
1
2
3
4
5
Tempo (dias)
MO C K
Me io
I na tiva do
I nfe ccio s o
Figura 3: TNF-α produzido por monócitos infectados com DENV-2 detectados por
ELISA. Monócitos humanos foram infectados com DENV-2 (cepa 16681) 5,5x10-10
TCID50/mL com inóculo de 1,37x10-8 TCID50/mL em duplicatas. Vírus DENV-2
inativado, meio de cultura e MOCK foram utilizados como controles negativos. Os
sobrenadantes foram recuperados de 1 a 5 dias após infecção e dosados por ELISA. As
concentrações foram representadas em pg/mL no gráfico de linhas. O eixo x representa
tempo após infecção e o eixo y representa concentração em pg/mL da citocina analisada.
54
A
TNFTNF-a
B
α
70
12.5
60
10.0
Concentração (pg/mL)
Concentração (pg/mL)
IL-1β
IL-1b
50
40
30
20
10
7.5
5.0
2.5
0
0.0
1
2
3
4
5
6
7
1
2
T e m p o (d ia s )
C
3
4
5
6
7
T e m p o (d ia s )
D
IL-6
IL-6
IFNα
IFN-a
200
1750
Concentração (pg/mL)
Concentração (pg/mL)
1500
1250
1000
750
500
250
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
1
2
T e m p o (d ia s )
F
IL-10
IL-10
50
400
40
300
200
100
0
5
6
7
6
7
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
1
2
T e m p o (d ia s )
G
3
4
5
T e m p o (d ia s )
H
IL-8
IL-8
IL-12
IL-12(p70)
25000
50
20000
40
Concentração (pg/mL)
Concentração (pg/mL)
4
IL-15
IL-15
500
Concentração (pg/mL)
Concentração (pg/mL)
E
3
T e m p o (d ia s )
15000
10000
5000
0
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
1
T e m p o (d ia s )
Meio
2
3
4
5
6
7
T e m p o (d ia s )
Inativado
Infeccioso
Figura 4: Cinética da produção de citocinas em monócitos infectados com DENV-2
detectados por Luminex®. Monócitos humanos foram infectados com DENV-2 (cepa
16681) 5,5x10-10 TCID50/mL com inóculo de 1,37x10-8 TCID50/mL. O vírus DENV-2
inativado e o meio de cultura foram utilizados como controles negativos. Os
sobrenadantes foram recuperados de 1 a 7 dias após infecção e dosados pela técnica
Luminex®. As cinéticas de produção de TNF-α (A), IL-1β (B), IL-6 (C), IFN-α (D), IL10 (E), IL-15 (F), IL-8 (G) e IL-12 (H) estão representadas nos gráficos acima. O eixo x
representa o tempo após infecção e o eixo y representa a concentração em pg/mL.
55
B
Monó
Monócitos ex vivo
Células dendrí
dendríticas
6° dia de diferenciaç
diferenciação
1000
800
800
SSC-H: SSC-Height
1000
SSC-H: SSC-Height
SSC: granulosidade
A
600
39.3
400
R1
200
60.8
600
400
R2
200
0
0
0
200
400
600
800
FSC-H: FSC-Height
1000
0
200
400
600
800
FSC-H: FSC-Height
1000
100
100
80
80
60
60
% of Max
CD14
CD14
% of Max
FSC: tamanho celular
40
3.32
40
90.7
20
20
0
0
10
1
2
10
CD14-FITC
10
3
10
0
4
10
100
100
80
80
60
60
% of Max
DC-SIGN
DC
DC-SIGN
% of Max
10
1.79
40
0
10
1
2
10
CD14-FITC
40
10
3
10
4
3
10
4
96.5
20
20
0
0
10
0
10
1
2
10
DC-SIGN-FITC
10
3
10
4
10
0
10
1
2
10
DC-SIGN-FITC
10
Figura 5: Caracterização fenotípica das populações de monócitos e de células
dendríticas originados de PBML. A: Os monócitos enriquecidos pela aderência. B:
Células aderentes cultivadas por 6 dias com IL-4 e GM-CSF. Cerca de 5.000 células
foram analisadas na região selecionada. As células foram marcadas com anticorpos
monoclonais anti-humano CD14 e DC-SIGN ambos marcados com FITC. A análise por
citometria de fluxo das populações selecionadas nas regiões R1 e R2 está representada
nos dotplots. O eixo x representa tamanho celular, FSC-H e o eixo y representa
granulosidade, SSC-H. A análise dos marcadores celulares CD14/DC-SIGN-FITC está
representada nos histogramas.
56
C
élulas dendrí
íticas
dendr
Células
dendríticas
6
° dia
ção
diferencia
6°
dia de
de diferenciaç
diferenciação
C
élulas Totais
Células
Totais
10
4
0
A
60.8
FL2-H: CD1A-PE
SSC-H: SSC-Height
800
600
400
200
10
3
10
2
10
1
58.7
B
FL2-H:
CD1a
FL2
FL2-H: CD1a
SSC--H: Granulosidade
SSC
SSC-H:
1000
R2
0
10 0
0
0
200
400
600
800
FSC-H: FSC-Height
1000
0
41.3
200
400
600
800
FSC-H: FSC-Height
1000
FSC-H: Tamanho celular
FSC
FSC-H:
celular
Figura 6: Caracterização da população de células dendríticas pela expressão de
CD1a. Monócitos humanos obtidos de bolsa de fase leucocitária foram cultivados por
seis dias com IL-4 e GM-CSF. No sétimo dia de diferenciação, após três reposições de
citocinas, as células foram raspadas e marcadas com anticorpos monoclonais anti
humano CD1a-PE (B). Cerca de 5.000 células foram analisadas na região selecionada. A
análise por citometria de fluxo da população selecionada na região R2 (A) está
representada no dotplot (B). O eixo x representa tamanho celular, FSC-H e o eixo y
representa granulosidade, SSC-H (A) ou FL2-H: CD1a-PE (B) .
57
C
élulas dendrí
íticas
dendr
Células
dendríticas
Com
Com meio
meio
C
élulas dendrí
íticas
dendr
Células
dendríticas
com
-γ
IFN
com LPS
LPS +
+ IFNIFN-γ
B
100
100
80
80
60
60
% of Max
DC-SIGN
DC
DC-SIGN
% of Max
A
84.6
40
40
71.3
20
20
0
0
0
10
1
2
10
DCSIGN-FITC
10
3
10
4
10
100
100
80
80
60
60
% of Max
CD80
CD80
% of Max
10
4.17
40
20
10
0
10
1
2
10
CD80-FITC
10
3
10
1
2
10
DCSIGN-FITC
10
3
10
4
10
3
10
4
10
4
42.8
40
0
4
10
100
0
10
1
2
10
FL1-H: IgG-FITC
100
MFI 400
80
MFI 549
80
60
% of Max
% of Max
10
20
0
HLA-DP,
HLA
HLA-DP,
DQ,DR
DQ,DR
0
89.3
40
20
60
98.5
40
20
0
10
0
10
1
2
10
10
HLA-DRDPDQ-FITC
3
10
4
0
10
0
10
1
2
10
10
HLA-DRDPDQ-FITC
3
Figura 7: Caracterização da população de células dendríticas mediante a adição de
LPS e IFN-γ. Monócitos humanos obtidos de bolsa de fase leucocitária foram
cultivados por seis dias com IL-4 e GM-CSF. Na última troca de meio, adicionou-se às
culturas 10 μg/mL de LPS e 100 U/mL de IFN- γ (B) ou meio (A). As culturas foram
recuperadas no dia seguinte, e marcadas com anticorpos monoclonais anti-humano DCSIGN-FITC, CD80-FITC e HLA-DP,DQ,DR-FITC. Cerca de 5.000 células foram
analisadas na região selecionada. A análise por citometria de fluxo da população
selecionada na região R2 está representada nos histogramas. O eixo x representa FL1-H:
DC-SIGN/CD80/HLA-DP,DQ,DR-FITC e o eixo y representa a porcentagem do
número máximo de células.
58
Meio
Inativado
10 4
0.95
A
0
0
10 3
10 3
10 2
10 2
10 2
10 1
10 1
10 1
0
0
99.1
200
400
600
800
0
10 0
1000
99
0
10 4
FL2-H: DENV-PE
1.02
B
10 3
10 0
200
400
60
800
D
0
0.3
E
0
10 3
1 3
0
10 2
10 2
1 2
0
10 1
10 1
1 1
0
0
99.7
200
400
600
80
0
0
10 0
0
1000
10 4
99.4
200
400
600
800
0
H
10 3
10 2
10 2
10 2
10 1
10 1
10 1
0
99.8
200
400
600
800
0
10 4
99.8
0
10 0
1000
200
400
600
800
10 2
10 1
0
0
98.6
200
400
600
800
1000
400
600
800
1000
3.15
I
0
96.8
200
0
0.9
L
400
600
800
1000
33
M
10 3
10 2
10 1
10 0
91.2
200
0
10 3
FL2-H: FA-PE
10 3
8.78
10 4
0
1.37
J
F
1000
DENVDENV-2
BR
(44/2)
7 d.p.i.
10 0
1000
10 4
0
800
0
0
10 3
0
600
FAV/
DENVDENV-2
(44/3)
4 d.p.i.
0.23
10 3
10 0
40
0
10 4
0.23
G
0
1 0
0
0
1000
10 4
0
200
1 4
0
10 3
0
46
0
0.63
54
C
DENVDENV-2
AS
(16681)
1 d.p.i.
10 0
1000
10 4
0
10 0
FL2-H: DENV-PE
10 4
FL2-H: FA-PE
FL2-H: DENV-PE
0
FL2-H: FA-PE
Infeccioso
10 4
FAVac
(17DD)
4 d.p.i.
10 2
10 1
99.1
0
10 0
0
200
400
600
800
1000
0
10 0
0
67
200
400
600
800
1000
FSC-H: Tamanho celular
Figura 8: Padrões do FACS para antígenos de DENV e FAVac durante infecção in
vitro de células dendríticas por diferentes vias (doador 1). DCs originadas de
monócitos foram inoculadas com meio de cultura (figuras A, D, G e J) e vírus inativados
(B, E, H e L). As células foram recuperadas e marcadas com anticorpo anti-dengue ou
anti-febre amarela-PE. Foram feitas duplicatas para vírus infecciosos, mas somente uma
é mostrada em C para DENV-2 AS (16681), em F para FAVac/DENV-2 (44/3), em I
para DENV-2 BR (44/2) e em M para FAVac (17DD). O eixo x representa o tamanho
celular na região R2 das DCs totais, FSC-H e o eixo y representa a intensidade de
fluorescência dos anticorpos anti-dengue ou anti-febre amarela, ambos marcados com
PE, FL2-H.
59
60
50
A
40
30
30
Doador 1
antíígeno viral (%)
Células positivas para o antígeno
ant
Células
20
10
0
1
4
7
60
50
B
40
30
30
20
Doador 2
10
0
2
4
7
Tempo (dias)
Figura 9: Comparação da infecção de DCs pelas cepas virais DENV-2 AS, DENV-2
BR, FAVac e FAVac/ DENV-2 em dois doadores infectados com MOI 4. DCs foram
infectadas com as cepas virais (pontos conectados por linhas) e seus controles negativos
(pontos) em duplicatas. As células foram recuperadas e marcadas com anticorpos antidengue ou anti-febre amarela no 1°, 4° e 7° dias no doador 1 e no 2°, 4° e 7° no doador
2. Foram feitas duplicatas para vírus infecciosos. As células para análise foram
selecionadas na região das DCs e as taxas de infecção obtidas na análise por citometria
de fluxo. As cinéticas dos vírus estão demonstradas em A para o doador 1 e em B para o
doador 2. O eixo x representa o tempo em dias e o eixo y representa a porcentagem de
células positivas para o antígeno viral .
60
TNF-α
1200
A
1000
800
Doador 1
Concentraç
ção de TNF-α
TNF--α (pg/mL)
pg/mL)
/mL)
Concentra
TNF
(pg
Concentração
600
400
200
0
1
4
7
1200
B
1000
800
Doador 2
600
400
200
0
2
4
7
Tempo (dias)
Figura 10: Produção de TNF- α por DCs infectadas pelas cepas virais DENV-2 AS,
DENV-2 BR, FAVac e FAVac/ DENV-2 com MOI 4. DCs derivadas de monócitos
foram infectadas com as cepas virais (pontos conectados por linhas) e seus controles
negativos (pontos) em duplicatas e em dois doadores. Os sobrenadantes foram utilizados
para dosagem por ELISA. As cinéticas de produção de TNF-α estão representadas em A
para doador 1 e B para doador 2. O eixo x representa tempo após infecção e o eixo y
representa concentração em pg/mL de TNF- α.
61
IFN-α
750
A
500
Concentraç
ção de IFN-α
IFN--α (pg/mL)
pg/mL)
/mL)
Concentra
IFN
(pg
Concentração
Doador 1
250
0
1
4
7
750
B
500
Doador 2
250
0
2
4
7
Tempo (dias)
Figura 11: Produção de IFN- α por DCs infectadas pelas cepas virais DENV-2 AS,
DENV-2 BR, FAVac e FAVac/ DENV-2 com MOI 4. DCs derivadas de monócitos
foram infectadas com as cepas virais (pontos conectados por linhas) e seus controles
negativos (pontos) em duplicatas e em dois doadores. Os sobrenadantes foram utilizados
para dosagem por ELISA. As cinéticas de produção de IFN-α estão representadas em A
para doador 1 e B para doador 2. O eixo x representa tempo após infecção e o eixo y
representa concentração em pg/mL de IFN- α.
62
DENVDENV-2 AS (16681)
A
1000
750
20
500
10
250
0
0
1
4
7
FAVac (17DD)
60
50
40
30
30
B
1000
750
20
500
10
250
0
0
1
4
7
FAV/DENVFAV/DENV-2 (44/3)
60
50
40
30
30
C
1000
750
20
500
10
250
0
Concentração
Concentra
((pg/mL)
Concentraç
ção de citocinas (pg
pg/mL)
/mL)
% de células
cé
élulas positivas para o antígeno
antíígeno viral
c
ant
60
50
40
30
30
0
1
4
7
Tempo (dias)
Figura 12: Infecção e produção de IFN-α e TNF-α em DCs infectadas pelas cepas
virais DENV-2 AS, FAVac e FAVac/DENV-2 com MOI 4 (Doador 1). As cepas
virais [em laranja – A: DENV-2 AS (16681), B: FAVac (17DD) e C: FAVac/DENV-2
(44/3)], TNF-α (em vermelho) e o IFN-α (em azul) são representados pelos pontos
conectados com linhas. O eixo y esquerdo representa a porcentagem de células positivas
para o antígeno viral. O eixo y direito representa a concentração das citocinas em
pg/mL. O eixo x representa o tempo após infecção.
63
DENV-2 44/2 MOI 15
DENV+ (%)
(%)
Células DENV+
Células
35
30
A
25
Antí
Antígeno
20
viral
15
10
5
0
1200
1000
1
2
3
6
B
Concentraç
ção de
de citocinas
citocinas (pg/mL)
(pg
pg/mL)
/mL)
Concentra
(
Concentração
800
TNFTNF-α
600
400
200
0
1
2
3
6
250
200
C
150
IFNIFN-α
100
50
0
1
2
3
6
Tempo
Tempo (dias)
(dias)
Figura 13: Cinética de infecção e produção de TNF-α e IFN-α por DCs infectadas
pela cepa viral DENV-2 BR com MOI 15. DCs derivadas de monócitos foram
infectadas com a cepa viral (linha vermelha) e seus controles negativos (MOCK, linha
azul; vírus inativado, linha verde). As células foram recuperadas e marcadas com
anticorpo anti-dengue no 1°, 2°, 3° e 6° dias e lidas no FACS. A cinética de infecção
está representada em A. O eixo y representa porcentagem de células positivas para o
DENV. Os sobrenadantes foram usados para dosagem por ELISA. As cinéticas de
produção de TNF-α e IFN-α estão representadas em B e C respectivamente O eixo y
representa a concentração em pg/mL das citocinas estudadas.. O eixo x representa o
tempo após infecção.
64
A
B
TNFα
TNF-a
40
30
20
10
0
MOCK
inat
infec
inat
infec
inat
200
100
0
infec
inat
infec
44/3
D
Concentração (pg/mL)
7 .5
5 .0
2 .5
0 .0
MOCK
inat
infec
16681
inat
infec
17DD
ILIL-66
inat
infec
4 4 /3
inat
7500
5000
2500
0
infec
17D D
MOCK
inat
infec
inat
F
250
infec
44/3
16681
IL10
IL-10
E
inat
infec
17DD
IL-8
IL8
Concentração (pg/mL)
10000
200
150
100
50
MOCK
inat
infec
16681
G
inat
infec
44/3
inat
7500
5000
2500
0
infec
17DD
MOCK
inat
infec
IL-15
IL15
inat
infec
44/3
16681
inat
infec
17DD
IL-12(p70)
IL- 12(p70)
H
20
10
Concentração (pg/mL)
Concentração (pg/mL)
inat
10000
1 0 .0
15
10
5
0
MOCK
16681
IL - 11β
b
IL-
C
Concentração (pg/mL)
300
infec
1 2 .5
Concentração (pg/mL)
400
17DD
44/3
16681
0
IFNIFN-aα
500
Concentração (pg/mL)
Concentração (pg/mL)
50
MOCK
inat
infec
16681
inat
infec
44/3
inat
infec
17DD
8
6
4
2
0
MOCK
inat
infec
16681
inat
infec
44/3
inat
infec
17DD
Figura 14: Produção de citocinas em DCs infectadas com DENV-2 AS (16681),
FAVac/DENV-2 (44/3) e FAVac (17DD) detectados por Luminex® (doador 2). DCs
derivadas de monócitos humanos foram infectadas com as cepas virais com MOI igual a
4. Os vírus inativado e MOCK foram utilizados como controles negativos. Os
sobrenadantes foram recuperados no 4° dia a após infecção e dosados pela técnica
multiplex. A produção de TNF-α (A), IFN-α (B), IL-1β (C), IL-6(D), IL-10 (E), IL-8
(F), IL-15(G) e IL-12 (H) está representada nos gráficos acima. O eixo x representa cada
cepa viral e seus controles e o eixo y representa a concentração em pg/mL da citocina
analisada.
65
5 – DISCUSSÃO
O Dengue é uma doença que vêm aumentando sua incidência a cada ano, uma vez que
não existem terápicos ou vacinas disponíveis e o mosquito transmissor ainda não foi
erradicado. Considerando estas perspectivas, apontamos a necessidade de mais estudos nos
mecanismos de patogenicidade e proteção relacionados com a doença. A falta de um modelo
animal que reproduza a imunopatologia dos seres humanos propiciou a utilização dos
modelos in vitro como forma de investigação. A infecção de fagócitos mononucleares
primários in vitro possibilita o entendimento das interações dos vírus com suas células alvo,
em nível da produção de mediadores imunológicos, da ativação das vias intracelulares de
sinalização e de outros efeitos do DENV. Sendo assim, este trabalho visou estabelecer a
infecção do vírus Febre Amarela Vacinal e do vírus quimérico candidato a vacina
FAVac/DENV-2 no modelo de células dendríticas humanas, e compará-los com as cepas de
DENV-2. Este modelo in vitro também poderá ser utilizado para aprofundar o conhecimento
sobre as interações entre o sistema imunológico e os vírus candidatos à vacina contra o
Dengue.
Os principais alvos para o DENV são as células do sistema mononuclear fagocítico,
assim, na primeira parte desse estudo buscou-se determinar a cinética de produção de
citocinas por este vírus em monócitos. Para isso, foram realizados em nosso laboratório
titulação e cinéticas de infecção em monócitos humanos infectados com DENV-2 cepa
asiática, utilizando o modelo in vitro descrito em Neves-Souza e colaboradores (2005). A
cepa em questão já vem sido utilizada largamente por vários grupos de pesquisa como
DENV-2 padrão em ensaios diversos (Butrapet, Huang et al., 2000; Diamond, Edgil et al.,
2000; Chen e Wang, 2002). Os resultados da titulação do DENV-2 16681 em monócitos
humanos usando FACS confirmaram dados encontrados na literatura de que a infecção é
proporcional à carga viral inoculada como descrito por outros autores para monócitos (Sydow,
Santiago et al., 2000), DCs (Brandler, Brown et al., 2005) e outras linhagens celulares
(Diamond, Edgil et al., 2000). A citometria de fluxo é uma metodologia adequada para
detecção da replicação viral nas células alvo e recentemente também foi utilizada como um
método rápido de titulação de massas virais, além dos tradicionais e demorados métodos de
unidade formadoras de placas (PFU/mL) e ensaios de diluição seriada (TCID50) (Lambeth,
White et al., 2005). A cinética do vírus 16881 demonstrou um pico de replicação precoce de
48 horas após a infecção, assim como relatado por Chen e colaboradores (2002) para a mesma
66
cepa e por Pryor e colaboradores (2001) para outras cepas de DENV-2 (Pryor, Carr et al.,
2001; Chen e Wang, 2002). Sabe-se porém que esta cinética pode variar de acordo com a
concentração do inóculo, ou seja, menores cargas virais podem causar picos de replicação
mais tardios (Cologna e Rico-Hesse, 2003).
Mediadores imunológicos solúveis estão envolvidos na imunopatologia do Dengue,
assim foi investigada a presença destes nos sobrenadantes das culturas infectadas com o
DENV. Como descrito por Braga (2001), o TNF-α é frequentemente encontrado no soro de
pacientes com manifestações hemorrágicas do Dengue, sugerindo um papel no choque
hipovolêmico (Vitarana, De Silva et al., 1991; Braga, Moura et al., 2001). O modelo in vitro
utilizado foi capaz de induzir concentrações de TNF-α em monócitos infectados, sendo sua
produção detectada em altas concentrações entre o segundo e quarto dias após a infecção,
confirmando as altas taxas de infecção e a detecção dos antígenos virais até pontos tardios da
cinética, reproduzidas neste doador.
Ainda objetivando observar as cinéticas de produção de citocinas, um painel foi obtido
através da tecnologia de análise múltipla para citocinas (Luminex®). No presente trabalho
foram detectadas as cinéticas de produção de IL-1β, TNF-α e IL-6, citocinas próinflamatórias; de IL-10 e IFN-α, respectivamente, anti-inflamatória, e antiviral. As citocinas
TNF-α e IL-1β foram encontradas precocemente, decaindo gradativamente e a IL-6 é
detectada mais tardia. In vivo, o TNF-α pode estar atuando nas células endoteliais, induzindo
a liberação de outras citocinas pró-inflamatórias, como a IL-1β, a IL-6, de quimocinas e de
óxido nítrico (Cines, Pollak et al., 1998; Braga, Moura et al., 2001). Sinergicamente, as
citocinas produzidas teriam papel fundamental na indução da febre e na alteração da
permeabilidade vascular que caracteriza o extravasamento plasmático. Verificou-se produção
de algumas das citocinas pró-inflamatórias pelos vírus inativados nos pontos tardios da
cinética, o que provavelmente se deve às proteínas virais que estariam estimulando as células
mesmo sem haver infecção viral. A IL-10 é produzida logo após os picos de TNF-α e IL-1β
iniciarem sua queda, sugerindo que esta citocina poderia estar balanceando e modulando a
reação inflamatória encontrada no Dengue. Porém, Azeredo e colaboradores relataram uma
correlação entre a redução no nível de plaquetas e o aumento da concentração de IL-10
encontrada em pacientes, o que indicaria um papel patológico desta citocina (Azeredo, Zagne
et al., 2001). O IFN-α foi produzido pelo vírus, mas seu pico se dá em fase mais tardia. Foi
observado que o efeito antiviral do IFN-α sofre interferência de proteínas do DENV, a NS4B
inibe a STAT-2 (Jones, Davidson et al., 2005) e o promotor ISRE (Munoz-Jordan, Laurent-
67
Rolle et al., 2005). Esta inibição pode retardar o processo de clearance viral, sendo coerente
com o quadro característico do Dengue de doença aguda com rápida resolução. As citocinas
IL-15, IL-8 e IL-12 não foram induzidas por esta cepa em monócitos. Entretanto, não se pode
afirmar que estas citocinas não sejam produzidas pelos monócitos. Chen e colaboradores
detectaram níveis de TNF-α, IFN-α, IL-1β e IL-12, porém não detectaram IL-6 e nem IL-15.
A IL-8 foi encontrada por este grupo e também por Moreno-Altamirano e colaboradores
(2004) que detectaram expressão do gene da citocina aumentada em relação ao controle (Chen
e Wang, 2002; Moreno-Altamirano, Romano et al., 2004). As variações nos perfis de
citocinas encontrados podem ser explicadas pelas diferenças dos protocolos de infecção ou
pela variabilidade genética tanto dos vírus quanto dos cohorts de doadores testados. Assim,
pode-se afirmar que a infecção da cepa DENV-2 em monócitos foi bem sucedida,
reproduzindo in vitro as características encontradas in vivo, uma vez que foram visualizadas a
infecção produtiva e a produção de citocinas pelos monócitos.
As células dendríticas estão entre os principais alvos do DENV por serem mais
permissivas à infecção que os monócitos (Wu, Grouard-Vogel et al., 2000). Estas células
possuem papel crucial de iniciação da resposta imunológica, pois através da apresentação de
antígenos e da produção de citocinas, definem o tipo de resposta a ser tomada pelo organismo
mediante infecções (Lipscomb e Masten, 2002). Dentre as células fagocitárias, a primeira
população a entrar em contato com os vírus após a picada do mosquito é a de células de
Langerhans (subpopulação de DCs) por sua localização nos tecidos da pele (Wu, GrouardVogel et al., 2000). Assim, as DCs foram selecionadas para os ensaios com os vírus
quimérico, vacinal e DENV-2.
Já foram descritos vários protocolos de geração de DCs in vitro. De acordo com os
precursores e as citocinas utilizadas na diferenciação são obtidas diferentes populações de
DCs. O precursor mais utilizado é o monócito CD14+ do sangue periférico (Lipscomb e
Masten, 2002). Vários coquetéis de citocinas foram descritos, sendo que o protocolo mais
difundido de obtenção de DCs utiliza GM-CSF e IL-4 para diferenciação e foi usado neste
estudo (Seager Danciger, Lutz et al., 2004). As DCs geradas por este protocolo são
designadas MDDCs (do inglês monocyte-derived dendritic cells) e fenotipicamente se
assemelham às DCs dermais (Grassi, Dezutter-Dambuyant et al., 1998). Neste trabalho
observamos conforme o esperado, que as MMDCs perderam o marcador CD14, característico
de monócitos e passaram a expressar DC-SIGN e CD1a. O GM-CSF é responsável pela
indução da expressão de CD1a nos monócitos (Kasinrerk, Baumruker et al., 1993); a IL-4
induz expressão de DC-SIGN (Granelli-Piperno, Pritsker et al., 2005) e apresenta um efeito
68
inibidor sobre a diferenciação de macrófagos (Romani, Gruner et al., 1994). Nem todos os
monócitos das nossas culturas se diferenciaram completamente como mostra a marcação de
CD1a e este fato se repete ainda que adicionemos o dobro da concentração de GM-CSF e IL-4
(dados não apresentados). Entretanto, a população obtida foi suficiente para verificar as
diferenças entre as taxas de infecção dos vírus estudados. As DCs geradas também
demonstraram capacidade de apresentação de antígenos, pois quando ativadas com LPS e
IFN-γ, passam a expressar marcadores fenotípicos de maturação, expressando altos níveis de
HLA-DQ,DP,DR e níveis mais moderados de CD80, conforme verificado por outros autores
(Steinman, Inaba et al., 1999).
As cepas virais estudadas foram capazes de infectar as DCs, porém verificou-se que a
infecção varia entre as cepas virais e também de entre doadores. O vírus DENV-2 AS (cepa
16681) demonstrou as mais altas taxas de infecção em DCs, além da mais alta produção de
TNF-α e uma baixa produção de IFN-α, podendo assim ser considerada a mais virulenta entre
as cepas estudadas aqui. Duas massas virais desta cepa foram utilizadas nos experimentos,
sendo o DENV-2 crescido em células C6/36 usado nos ensaios com monócitos e o crescido
em Vero, nos ensaios com DCs. Mostramos que tanto o vírus crescido em linhagem de células
C6/36 quanto em Vero são capazes de infectar os monócitos e as DCs. Porém, a diferença
entre as células utilizadas no crescimento do DENV-2 poderia induzir eventualmente
alterações na infectividade das massas virais. Além disso, os diferentes métodos utilizados
para titular as massas virais não permitem a comparação quantitativa da carga viral inoculada
nos experimentos, ou seja, não se pode comparar com precisão os resultados obtidos nos
ensaios com monócitos e com os obtidos em DCs.
Pela primeira vez foi demonstrado, em nosso trabalho, que uma cepa de FAVac produziu
infecção em DCs humanas. O vírus vacinal FAVac (17DD) demonstrou taxas de infecção
moderadas com picos mais tardios na cinética. A produção de TNF-α foi considerada baixa
em relação ao DENV-2 AS e à produção de IFN-α e é interessante notar que o FAVac foi o
maior indutor de IFN-α entre os vírus estudados. O vírus quimérico FAVac/DENV-2 (44/3)
mesmo em baixas taxas de infecção também induziu concentrações de IFN-α maiores do que
o DENV-2 AS e a produção de TNF-α foi menor. Podemos especular que as proteínas
semelhantes presentes tanto na estrutura do vírus vacinal quanto na do vírus quimérico seriam
responsáveis pela semelhança entre as curvas de produção de IFN-α. A resposta imunológica
gerada pelas vacinas, no caso, pela da febre amarela é pouco conhecida. Estudos
aprofundados da imunidade vacinal podem indicar algumas características que auxiliam na
69
formação da memória imunológica, o que propiciará novos parâmetros para construção de
novas vacinas.
O papel protetor do IFN-α pode ser especulado em razão de sua produção em altas
concentrações pelo vírus vacinal e mais baixas pelo DENV-2 AS, a cepa mais virulenta.
Apesar de ter sido demonstrado que a proteína NS4B do DENV e do YFV cepa patogênica
esteja inibindo a sinalização do IFN-α (Munoz-Jordan, Laurent-Rolle et al., 2005), não se
pode afirmar que o FAVac também interfira na sinalização; provavelmente não teria este
efeito. Podemos notar que a produção de IFN-α do FAVac é precoce em relação à infecção,
ao contrário do DENV-2 AS em que o pico da citocina antiviral é tardio em relação ao pico de
replicação. Em geral, a indução da síntese do IFN-α/β ocorre por dois caminhos: o vírus e
seus produtos são reconhecidos pela célula através dos PRRs que induzem uma pequena, mas
necessária produção dessas citocinas. Esta concentração induz uma segunda produção dos
IFN tipo I através da sinalização via receptores extracelulares, ativando o IRF-7 (do inglês
interferon regulatory factor-7) que é responsável pela maior transcrição dos genes de IFNs
pelas células, através de retroalimentação positiva (Taniguchi e Takaoka, 2002; Tailor,
Tamura et al., 2006). Conforme esquematizado na Figura 15 A , o atraso da síntese de IFN-α
pelo vírus DENV-2 AS pode decorrer da inibição da via dependente de IRF-7 exercida pelo
vírus, o que diminuiria a produção de IFN-α e evitaria o rápido controle da infecção.
Alternativamente, este atraso poderia ser exacerbado durante as infecções secundárias de
Dengue, em que o ADE ativaria os FcγR, induzindo a produção de IL-10, que ativa a
transcrição do supressor de sinalização de citocinas (do inglês supressor of cytokine signalling
– SOCS). Este supressor interfere na via JAK/STAT, bloqueando a ação do IFN-α, ou seja,
apesar de ser produzido, IFN-α não estaria sendo efetivo no controle da infecção do DENV
(Suhrbier e La Linn, 2003). Hipoteticamente, como apresentado na Figura 15 B, o FAVac não
teria a interferência na via de retroalimentação da síntese dos IFNs, explicando a sua produção
em maiores quantidades que o DENV-2 AS. Suportando o papel protetor do IFN-α produzido
pelas DCs em resposta à estimulação viral das via do TLR, esta citocina induz as células NK a
produzirem IFN-γ e a aumentar a expressão de CD69 (marcador de ativação), estimulando a
função citotóxica destas células que é fundamental para a resposta antiviral (Marshall, Heeke
et al., 2006). Foi relatado que as maiores taxas de células NK (Azeredo, De Oliveira-Pinto et
al., 2006) e de DCs plasmacitóides (principal produtora de IFN-α) (Pichyangkul, Endy et al.,
2003) foram correlacionadas com o Dengue brando e com um bom prognóstico da doença.
Sendo assim, nossos resultados podem suportar o conceito que o IFN-α tenha papel
70
importante na construção da imunidade vacinal e a alta produção desta citocina pelo vírus
quimérico, assim como sua baixa indução de TNF-α indicam boas características vacinais.
O DENV-2 BR (44/2) não infectou as DCs em taxas detectáveis nos experimentos com
MOI baixo (4), ficando assim também prejudicada a avaliação da produção de citocinas por
esse vírus. Não foi possível realizar experimentos de comparação das cepas virais com MOI
maior, pois os títulos dos vírus 16681 e 44/3 estão 1 log abaixo das outras cepas. Porém,
quando inoculadas com maior carga viral (MOI=15) do vírus DENV-2 BR, as DCs se
mostraram permissivas à replicação do vírus que também induziu a produção de citocinas. Foi
determinado que ocorre uma queda na detecção dos antígenos no segundo dia da cinética, que
pode ser explicado pela intensa liberação da progênie viral no sobrenadante, o que reinfectaria
as DCs. Uma análise quantitativa da carga viral no sobrenadante poderia confirmar esta
hipótese. Também foi demonstrado que este vírus é capaz de induzir a produção de TNF-α e
IFN-α pelas DCs. Assim como o DENV-2 AS, o pico de TNF-α é detectado logo após o pico
de replicação viral e o IFN-α também é detectado tardiamente durante o período de infecção.
Assim, podemos concluir que a cepa asiática é mais virulenta que a brasileira, pois esta última
necessitou de maior carga viral para causar uma infecção produtiva com indução de citocinas.
Com intuito de se estudar outras citocinas induzidas pelos vírus DENV-2 asiático,
vacinal e quimérico foi analisado o perfil de 8 citocinas produzidas por estes vírus. Este
estudo é pioneiro para os vírus FAVac 17DD e quimérico. As citocinas induzidas pelo DENV
são extensamente estudadas na literatura, porém divergências são encontradas quanto ao perfil
induzido. Chaturvedi e colaboradores encontraram, em culturas de leucócitos de sangue
periférico infectadas com o vírus DENV, TNF-α, IL-2, IL-6 e IFN-γ precoce; e de IL-10, IL-5
e IL-4 em fase tardia, sugerindo que inicialmente a resposta ao vírus seria do tipo Th1,
mudando para Th2 na fase tardia (Chaturvedi, Elbishbishi et al., 1999) e essa mudança estaria
correlacionada com a FHD (Chaturvedi, Agarwal et al., 2000). Libraty e colaboradores
demonstraram que DCs infectadas com vírus DENV produzem níveis significantes de TNF-α
e IFN-α, baixos níveis de IL-10 e IL-12p70. A produção de IL-12 pode ser induzida com
adição de IFN-γ. Foi sugerido que a gravidade resultaria da desregulação e exacerbação da
resposta Th1 induzida por células T de memória fontes de IFN-γ (Libraty, Pichyangkul et al.,
2001; Libraty, Endy et al., 2002). Já Ho e colaboradores descreveram a detecção de IL-2 e
IFN-γ e de IL-4 e IL-10 em ensaios de co-culturas de linfócitos T e DCs infectadas, sugerindo
que o DENV induza a produção de um perfil Th0 (Ho, Shaio et al., 2004).
71
O perfil de citocinas obtido neste presente estudo permite apenas a formulação de
hipóteses sobre o real perfil induzido pelas cepas estudadas, uma vez que o experimento
preliminar foi feito apenas para um doador e somente com duplicata para o vírus infeccioso da
cepa quimérica. Além disso, somente foram analisados os sobrenadantes do quarto dia da
cinética, ponto em que nos ensaios de ELISA, podemos visualizar as diferenças de produção
do TNF-α e do IFN-α. A detecção destas citocinas foi semelhante à obtida por ELISA,
enfatizando a reprodutibilidade do ensaio do multiplex em esferas. Assim, foram confirmadas
as produções de TNF-α e IFN-α pelas cepas virais.
A IL-6 teve altos níveis de produção pelo MOCK e pelos antígenos do DENV-2 AS,
mas esses níveis caem para os vírus quimérico e vacinal. Podemos suspeitar que os antígenos
desses vírus estejam inibindo a produção de IL-6, o que seria interessante visto a atuação
desta citocina na permeabilidade vascular e na reação inflamatória. Dados obtidos de uma
cinética do DENV-2 AS em outras condições experimentais indicaram uma produção em
grandes quantidades de IL-6 no quarto dia da cinética e IL-1β precoce decaindo no quarto dia
(Bonaldo e colaboradores, dados não publicados). Esses resultados apontam que a IL-6
poderia estar relacionada, assim como o TNF-α e a IL-1β aos quadros de extravasamento
plasmático. Em nosso trabalho, a citocina IL-1β não foi detectada, no entanto, de acordo com
os dados de Bonaldo e colaboradores, podemos suspeitar que a IL-1β seja bem precoce na
cinética do DENV-2 AS.
Ao contrário do esperado, a IL-10 não foi intensamente produzida pelo DENV-2 AS.
Observou-se uma ligeira queda de sua produção pelo vírus infeccioso, o que poderia indicar
inibição da síntese de IL-10 em DCs. Porém, Bonaldo e colaboradores apontaram uma
pequena produção de IL-10 no primeiro dia após a infecção, supondo que a cinética de
produção desta citocina seria precoce. A IL-10 poderia colaborar com uma inativação precoce
das DCs propiciando menor ativação celular e menor controle da replicação viral. Entretanto,
o papel da IL-10 na imunopatologia do Dengue não está bem elucidado. Por outro lado, o
FAVac e o FAVac/DENV-2 produziram mais IL-10 que o DENV-2 infeccioso, o que poderia
estar relacionado com a modulação mais eficiente da resposta inflamatória para estas cepas na
fase tardia da cinética de infecção.
A quimiocina IL-8 é encontrada em altas concentrações nos pacientes com Dengue
(Huang, Lei et al., 2000) e alternativamente em pacientes brasileiros, a IL-8 não foi marcante
(Kubelka et al., dados não publicados). Esta citocina possui funções de aumentar a
permeabilidade trans-endotelial. Porém, os resultados demonstram uma queda acentuada da
72
produção de IL-8 pelos vírus infecciosos DENV-2 AS e FAVac/DENV-2, o que não acontece
tão intensamente para FAVac. Podemos especular que antígenos presentes no DENV-2 e no
quimera sejam responsáveis por esta queda ou que os vírus infecciosos induzam a síntese de
IL-8 em pontos mais precoces ou tardios da cinética. As citocinas IL-12 e IL-15 não tiveram
diferenças significativas de produção nesta dosagem. A baixa carga viral inoculada pode ter
sido a razão de não terem sido encontradas concentrações significantes destas citocinas em
DCs ou a produção seria maior em outros pontos da cinética.
Em geral, os vírus FAVac/DENV-2 e FAVac não tiveram aumentadas as
concentrações das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 e exibiram altas concentrações de
IFN-α. Um perfil Th2 seria interessante para estes vírus, pois induziria uma boa resposta de
anticorpos. Isto provavelmente está acontecendo para o FAVac, devido à excelente resposta
de anticorpos e raríssimas notificações de efeitos adversos demonstradas para esta vacina.
73
DENV-2
A
TLRs
IFNAR
RIG-I
Ptns virais
TLRs
Jak/STAT
Reconhecimento
pelos PRRs
do DENV
IRF-7
TNFTNF-α
IFNIFN-α
IRFIRF-7
NF-κB
Genes pró-inflamatórios
IFNIFN-α
ISRE
Célula NK
DCs
IFN-γ
Extravasamento
Plasmá
Plasmático
Alta carga viral
× citotoxicidade
Imunidade
Viral
Endoté
Endotélio vascular
FAVac
B
TLRs
IFNAR
RIG-I
Ptns virais
TLRs
Reconhecimento
pelos PRRs
do DENV
Jak/STAT
?
IRF-7
TNF-α
NF-κB
IFNIFN-α
IRF-7
Genes pró-inflamatórios
IFNIFN-α
ISRE
Célula NK
DCs
IFN-γ
Baixa carga viral
× citotoxicidade
Endoté
Endotélio vascular
Imunidade
Viral
Figura 15: Esquema de hipótese para a interação vírus-células dendríticas. Em A,
vírus DENV-2 AS (16681) e em B, FAVac (17DD). Setas de cor rosa representam vias
mais ativadas. Linhas brancas com barras representam vias inibidas. A. O vírus DENV-2
AS (16681) poderá estimular preferencialmente as vias indutoras de genes próinflamatórios e inibir a via do interferon tipo I, propiciando uma alta carga viral e
extravasamento do endotélio. B. Por outro lado, o vírus FAVac (17DD) estaria
estimulando fortemente a via do interferon tipo I, o que resultaria no clearance viral e
em uma ativação de células NK e da imunidade viral.
74
6 – CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
O vírus DENV-2 AS é capaz de infectar monócitos humanos e induziu a produção de
citocinas, reproduzindo o perfil encontrado em pacientes. Foi verificada a boa
reprodutibilidade do modelo in vitro utilizado.
Foi demonstrado que o DENV-2 padrão asiático é a cepa mais virulenta dentre as
estudadas, devida a sua alta capacidade de infecção e produção de TNF-α. A cepa brasileira
de DENV-2 utilizada é menos virulenta que a cepa asiática, mas também foi capaz de induzir
a produção de citocinas quando inoculada com MOI maior.
O vírus da Febre Amarela vacinal exibiu altas concentrações de IFN-α e baixas de
TNF-α, sugerindo que estas condições possam estar envolvidas na geração ótima da
imunidade vacinal. O vírus quimera FAVac/DENV-2 apresentou perfil dessas citocinas
parecido com o FAVac, o que indica um bom prognóstico vacinal desta cepa quimérica.
As dosagens pela técnica de análise múltipla para citocinas (Luminex®) dos
sobrenadantes das culturas infectadas com as cepas virais não forneceram dados conclusivos,
assim novos experimentos deverão ser realizados fazendo-se dosagens das cinéticas das
citocinas com mais doadores. Além disso, outros vírus serão testados nesse sistema de
infecção, dentre eles o DENV-1 e DENV-3 brasileiros e padrões internacionais.
As células dendríticas diferenciadas de monócitos humanos exibiram marcadores
fenotípicos característicos de DCs imaturas e quando ativadas foram capazes de aumentar a
expressão de seus marcadores de ativação. Na continuidade deste trabalho, pretende-se
analisar se existe alterações na expressão de marcadores de ativação das MDDCs induzidas
pelos vírus DENV e também por FAVac e FAVac/DENV-2.
As vias ativadas pelos receptores Toll-like (TLR) deverão ser estudadas em células
dendríticas infectadas com estas cepas. Esses receptores são fundamentais para a escolha da
resposta imune durante as infecções. Através das vias de sinalização intracelular, os
receptores ativam fatores de transcrição que determinam o perfil de citocinas que será
produzido (Janeway e Medzhitov, 2002). Já foi demonstrado que o vírus dengue é capaz de
aumentar a expressão de receptores TLR2, mas não de TLR4 em monócitos (Neves-Souza,
2005). Os TLRs que reconhecem partículas virais ainda serão testados (TLR3, TLR7, TLR8 e
TLR9) em células dendríticas além dos TLR2 e TLR4. Investigar a sinalização intracelular
será uma abordagem adicional para verificar se o perfil de citocinas induzida pelo vírus
quimérico dará origem à uma resposta protetora ou patológica ao ser humano.
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ANEXO
90
Curvas Padrões
IFN-α
IFN
IFN-α
A
TNF-α
TNF
TNF-α
B
1,6
1,0
Densidade Óptica
1,4
0,8
1,2
1,0
0,6
0,8
0,4
0,6
0,4
0,2
0,2
0,0
0
100
200
300
400
0,0
500
0
200
400
600
800
1000
Concentração em pg/mL
C
álculos da Regressão Linear
Cálculos
C
Concentraçõ
es (C)
C/C
inicial
(F)
Log2
F
(x)
Curva
1
Curva
2
Média da DO
(D)
Log10 D
(y)
0
-
-
0,245
0,250
0,248
-
15,625
1
0
0,296
0,288
0,292
-0,53462
31,25
2
1
0,329
0,331
0,330
-0,48149
62,5
4
2
0,387
0,350
0,369
-0,43356
125
8
3
0,450
0,453
0,452
-0,34534
250
16
4
0,577
0,588
0,583
-0,23470
1000
64
6
1,409
1,367
1,388
0,14239
D
E
Nº
1
Interseção
(I)
Variável X 1
(A)
A+I
(B)
-0,60812846
0,110450207
-0,497678252
Amostra
Meio 1D
Média da
DO
(D)
0,339
Log10 D
(Y)
-0,469800302
X = (Y-B)/A
0,252402881
2^X * C
inicial
18,612
Diluição
1
18,61
Anexo 1: Curvas Padrões e cálculos do ELISA. Em A e B são demonstradas exemplos
de curvas padrões de IFN-α (A) e TNF-α (B) obtidas. X representa concentração em
pg/mL e y representa densidade óptica. Em C, D e E, é demonstrado um exemplo de
cálculo de amostra para TNF-α. Primeiro em C, são obtidos os valores x e y,
respectivamente na terceira e última coluna da esquerda para direita. Esses valores são
utilizados pelo programa Excel (Microsoft®) no cálculo da regressão (D). O cálculo da
amostra é realizado de acordo com a primeira linha de cima para baixo representada em
E, sendo o valor final exemplificado: 18,61 pg/mL.