Bactérias I - Laboratório de Biologia

06/09/2016
MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA DE
BACTÉRIAS
Biologia IV
Profa. Dra. Ilana Camargo
A célula procariótica
o Parede celular
*Estrutura da célula
eucariótica: membrana,
citoplasma e núcleo.
o Membrana plasmática
o Citoplasma (80% água, proteínas, carboidratos, lipídeos, íons
orgânicos, compostos de baixo peso molecular) – não possui
citoesqueleto.
o Área Nuclear ou nucleóide
o DNA circular grande de dupla fita (=cromossomo
bacteriano), fixado à membrana plasmática.
o Plasmídeo: DNA circular pequeno de dupla fita,
replicação independente, 5 a 100 genes, transportam
genes relacionados à resistência a antibióticos, tolerância a
metais tóxicos, produção de toxinas e síntese de enzimas.
1 a várias cópias, 1 ou mais tipos por célula.
o Ribossomos – milhares, conferindo aspecto granular ao
citoplasma; 70S (30s+50S); sensível à ação de antibióticos.
o Inclusões
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06/09/2016
A célula procariótica típica
Corte transversal de uma bactéria. a) Esquema. b)
Micrografia. (Fonte: Tortora et al., 2005)
A célula procariótica x célula eucariótica
 DNA (material genético) não está envolvido por uma
membrana e ele é um cromossomo circular.
 DNA não está associado a proteínas histonas.
 Não possuem organelas revestidas por membranas.
 Parede celular contendo quase sempre peptídeoglicano.
 Geralmente divisão celular por fissão binária (envolve
menos estruturas e processos que a divisão de eucariotos).
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Procariotos - bactéria
Cromossomo da Escherichia coli: tem cerca de 4,6 milhões de
pares de bases (~4.300 genes)
a)DNA emergindo da célula rompida.
b)Mapa genético.
(Fonte: Tortora et al., 2005)
Procariotos - bactéria
1 Cromossomo
DNA de dupla fita, circular, grande
E. coli – 1,3 m de comprimento
- 4,2 x 103 kb
Mycoplasma – 750 kb
Exceção:
Brucella abortus – 2 cromossomos
diferentes
http://www.sciencebuddies.org/mentoring/plugin_bac_diversity_bacteria_and_dna.jpg
Replicação de DNA
bacteriano
3
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Procariotos - bactéria
E. coli
- 4,2 x 103 kb
- ~4300 genes
Célula humana:
Quantidade de DNA: mais de
1000 vezes superior;
Número de genes: 7 vezes
maior
http://drugline.org/img/term/e-coli-4798_3.jpg
http://mercedesmoreira.blogspot.com.br/2012/08/actividad-n12-celulas.html
Plasmídeos
 DNA circular pequeno, de dupla fita, além do cromossomo bacteriano;
 São elementos genéticos extra-cromossômicos: não estão conectados ao
cromossomo bacteriano principal e replicam-se independentemente do DNA
cromossômico;
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RecombinantDNA.html
4
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Plasmídeos
 Contém de 5 a 100 genes não cruciais para a sobrevivência da bactéria em
condições ambientais normais;
 Podem ser ganhos ou perdidos sem lesar as células;
 Alguns conferem a vantagem da transferência de genes de resistência aos
antibióticos, tolerância aos metais tóxicos, produção de toxinas e síntese de
enzimas.
 Podem ser utilizados para a manipulação genética.
http://www.asbmb.org/asbmbtoday/asbmbtoday_article.aspx?id=15152
Procariotos - bactéria
Plasmídeos – elementos de DNA móveis que não são essenciais
para a vida do microrganismo, mas que traz vantagens
Plasmídeos de 150 Kb – grandes
70 kb - médios
3.5 kb - pequenos
enovelado
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Plasmídeos
- Origem de replicação para produzir
Conjugação
cópias
que
passam
para
células
filhas na divisão celular ou para
outra célula através da conjugação,
- Integrativos que se inserem no
cromossomo bacteriano ou não.
Resistência aos antimicrobianos devido à
aquisição de plasmídeos
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06/09/2016
Tamanho das células
Fonte: Madigan et al., 2004
Tamanho das células - gigantes
Epulopiscium sp, bactéria endossimbionte de peixes herbívoros marinhos.
Células podem atingir o tamanho de 600 µm por 80 µm.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=107617
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06/09/2016
Morfologia celular: Forma e arranjo
Coco
Bacilo
ovaladas
cilíndricas
Morfologia celular: Forma e arranjo
Células de várias espécies permanecem unidas em grupos ou conjuntos
após a divisão celular
Arranjos
Streptococcus sp.
Frequentemente os arranjos
são característicos de
determinados gêneros
Staphylococcus sp.
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Morfologia celular: Forma e arranjo
Espiral
Forma de estrela: Stella
Forma quadrada e plana: Haloarcula
Forma helicoidal (saca-rolhas)
com corpo rígido,
movimentação com flagelos
Bacilo torcido
Intensamente espiralada
Forma helicoidal (saca-rolhas)
com corpo flexível,
movimentação com filamento
axial (flagelo contido em
bainha externa flexível)
Aula de hoje...
o Parede celular
o Estruturas internas à parede
o Membrana citoplasmática
o Inclusões
o Endósporos
o Estruturas externas à parede
o Glicocálice (ou glicocálix)
o Flagelos
o Fímbrias e Pili
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
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06/09/2016
Parede celular - Função
o Estrutura complexa, semi-rígida e que confere forma à célula.
o Previne a ruptura da célula (Lise celular) – fornece rigidez contra a
pressão de turgor (meio intracelular é geralmente mais concentrado
em solutos que o meio externo).
o Proteção contra choques físicos;
o
Essencial para crescimento e divisão da célula;
o Importância clínica e taxonômica;
o Visualização individualizada somente em microscopia eletrônica.
Parede celular
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06/09/2016
Parede celular – Gram-Positivo e Gram-Negativo
Camada rígida
Parede celular – composição e estrutura
Ácido
N-acetilmurâmico
N-acetilglicosamina
(NAM)
(NAG)
o Peptideoglicano (ou mureína) –
principal componente da camada
rígida da parede (só encontrado em
Bacteria).
o Unidades repetidas de dois derivados
de açúcar unidas por polipeptídeos.
Ligação  1,4  sensível à lisozima!!
Cadeia de glicano (ligações covalentes)
Interligadas através da ligação cruzada
de suas cadeias de tetrapeptídeos para
formar peptídeoglicano
Ponte cruzada de peptídeos (interpeptídica)
Cadeia adjacente de glicano
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Parede celular – composição e estrutura
http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS95/course/10_interactions/NAMNAGb14_t.gif
Ligações peptídicas
Parede celular – composição e estrutura
Ligações glicosídicas
Organização das unidades repetitivas
formando a camada de peptideoglicano.
a) Ligação cruzada em bactérias Gramnegativas. b) Ponte interpeptídica de
glicina em bactérias Gram-positiva
(Staphylococcus aureus). c) Várias fitas de
peptídeoglicano unidas por ligações
cruzadas.
(Madigan et al., 2004).
Obs.: DAP (ácido diaminopimélico) ocorre nas Gramnegativo e poucas Gram-positivo; Lys (lisina), maioria
dos cocos Gram-positivo.
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06/09/2016
Paredes celulares de Bacteria
Diagrama esquemático das paredes celulares de
bactérias Gram-positivo (a) e Gram-negativo (b)
(Fonte: Madigan et al., 2004)
Parede das bactérias Gram-positivo
o
o
o
Muitas camadas (até ~25) de peptideoglicano (corresponde a 90% da parede).
Apresentam ácido teicóico e lipoteicóico (polissacarídeo ácido, com resíduo de glicerol
fosfato ou ribitol fosfato), que confere carga negativa à superfície celular, regulando o
movimento de íons + (Ca2+ e Mg2+) na célula.
Ácidos teicóicos – respondem pela especificidade antigênica da parede, tornando
possível a identificação de bactérias em testes laboratoriais.
Ligação covalente com resíduos do ácido
murâmico
Ligação covalente com lipídeos da membrana
Fonte: Madigan et al, 2004.
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06/09/2016
Parede das bactérias Gram-negativo
o
o
o
Membrana externa composta de lipopolissacarídeo (LPS), lipoproteínas e
fosfolipídeos.
Periplasma – espaço entre a MP e a ME – fluido com alta concentração de
enzimas e proteínas de transporte (consistência de gel).
Uma ou poucas camadas de peptideoglicano (que não contém ácido teicóico).
Fonte: Madigan et al, 2004.
Parede das Gram-negativo
o Membrana externa
o Permeável a pequenas moléculas pela presença de porinas, que permitem a
passagem de moléculas hidrofílicas de baixa massa molecular (alguns
nucleotídeos, dissacarídeos, peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro).
o Propriedade tóxica: associada ao lipídeo A (=endotoxina) do LPS.
Exemplos de gêneros patogênicos Escherichia, Salmonella e Shigella.
o Polissacarídeos O do LPS atuam como antígenos e são úteis para diferenciar
espécies de bactérias Gram-negativas.
Estrutura do lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas. A composição
química do lipídeo A e dos polissacarídeos é variável nas diferentes espécies.
Fonte: Madigan et al, 2004.
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Características comparativas entre Gram – e +
Característica
Gram-positivo Gram-negativo
Reação de Gram.
Retém o
corante violeta
Aparece o
contracorante
(safranina)
Camada de peptideoglicano.
Espessa –
múltiplas
Camada única –
fina
Ácidos teicóicos.
Presentes em
muitas
Ausentes
Espaço periplasmático.
Ausente
Presente
Membrana externa.
Ausente
Presente
Conteúdo de LPS.
Nenhum
Alto
Conteúdo de lipídeos e lipoproteínas.
Baixo
Alto (devido à
ME)
Toxinas produzidas.
Exotoxinas
Endotoxinas
Resistência à ruptura física.
Alta
Baixa
Ruptura da parede por lisozima.
Alta
Baixa
Sensibilidade à penicilina e às sulfonamidas. Alta
Baixa
Sensibilidade à estreptomicina, cloranfenicol
e tetraciclina.
Alta
Baixa
Adaptado de Tortora et al., 2005.
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Parede celular de Archaea
o Diversidade de tipos de parede neste domínio – porém inexiste
peptideoglicano.
o Tipo mais comum: Camada S – camada superficial paracristalina (também
encontrada em Bacteria)
o formada por um arranjo bidimensional de proteínas, com várias simetrias;
o função pouco esclarecida: atua como barreira de permeabilidade – permite
passagem de pequenas moléculas;
o em bactérias patogênicas poderia proteger a célula contra mecanismo de
defesa da célula hospedeira.
o Paredes compostas por polissacarídeos, glicoproteínas ou proteínas
(Methanosarcina, Halococcus).
o Pseudopeptideoglicano: presente em algumas espécies de Archaea, como
Methanobacterium.
o Possui o N-acetiltalosaminurônico (NAT), em substituição ao Nacetilmurâmico (NAM) de Bacteria.
o Ligações glicosídicas do tipo -1,3 (insensível à lisozima).
Parede celular de Archaea
Pseudopeptideoglicano de Archaea: ligações peptídicas
cruzadas entre os resíduos do NAT (N-acetil talosaminurônico).
Fonte: Madigan et al, 2004.
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06/09/2016
 Parede celular
o Estruturas internas à parede
o Membrana citoplasmática
o Inclusões
o Endósporos
o Estruturas externas à parede
o Glicocálice (ou glicocálix)
o Flagelos
o Fímbrias e Pili
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
Membrana citoplasmática dos procariotos
Bicamada de fosfolipídios (invertidos)
Porção hidrofílica
Porção hidrofóbica
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Membrana citoplasmática dos procariotos
Estrutura de uma bicamada lipídica.
Fonte: Madigan et al., 2004.
o Bacteria possuem hopanol, em substituição ao esterol das
MP dos eucariotos (o que torna a MP menos rígida).
o Algumas bactérias possuem dobras internas da MP onde
localizam-se enzimas e pigmento envolvidos na fotossíntese
(cromatóforos ou tilacóides).
Membrana citoplasmática dos procariotos
Funções:
-Barreira para a maior parte das moléculas
solúveis em água, é muito mais seletiva que a
Parede Celular.
- Sítio de localização de Permeases, proteínas
específicas que transportam pequenas
moléculas para dentro da célula;
-Enzimas produzem energia e auxiliam a
síntese da Parede Celular.
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Membrana citoplasmática dos procariotos
Proton motive force is composed of
∆pH and ∆ (membrane potential)
Redox loop and electron transfer chain
Dehydrogenase + quionone + Proton pump + cytochrome + ATP synthase
Membrana citoplasmática bacteriana
Funções de barreira:
Osmose e Difusão
Permite a osmose - entrada de
água
quando
em
uma
solução
hipotônica (baixa concentração de
soluto) e saída de água de dentro da
célula para fora quando em solução
hipertônica (alta concentração de
soluto).
Também permite a difusão simples, a entrada de moléculas pequenas como
oxigênio e dióxido de carbono, dissolvidos por meio da membrana citoplasmática
sem gasto de energia (um processo passivo);
Entretanto, a maior parte dos nutrientes é transportada por permeases e
requer gasto de energia (processo ativo)
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Membrana citoplasmática bacteriana
A maioria das Membranas Citoplasmáticas procarióticas não
contém esteróis (colesterol), por isso são menos rígidas que as
células eucarióticas.
Exceção são os micoplasmas, a única eubactéria que não
possui parede celular.
Possuem esteróis junto à membrana citoplasmática ajudando a
manter sua integridade.
Moléculas planas e
rígidas
Mycoplasma – as menores bactérias
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06/09/2016
Membrana citoplasmática de Archaea
•
Diferença dos domínios Bacteria e Eucarya está na
composição do lipídeo.
– Ligação do tipo éter entre glicerol e a cadeia lateral hidrofóbica.
– Cadeia lateral não é um ácido graxo e sim unidades repetitivas
de isopreno (hidrocarboneto de 5 C).
(a) Ligação éster (liga o glicerol ao ácido graxo em Eucarya e Bacteria).
(b) Ligação éter (liga o glicerol à cadeia lateral, em Archaea).
(c) Isopreno, estrutura da cadeia lateral hidrofóbica dos lipídeos de
Archaea.
Madigan et al., 2004.
Membrana citoplasmática de Archaea
•
Tipos de cadeia lateral definem a alta resistência a rupturas que
alguns grupos apresentam, inclusive as ocasionadas por altas
temperaturas (caso das arquéias hipertermófilas).
Principais lipídeos de Archaea
e a estrutura de suas
membranas.
Madigan et al., 2004.
Na monocamada lipídica
as cadeias laterais de
fitanil de cada molécula
de glicerol estão
covalentemente ligadas,
o que confere a
resistência a rupturas.
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06/09/2016
 Parede
o Estruturas internas à parede
 Membrana citoplasmática
o Citoplasma
o Inclusões
o Endósporos
o Estruturas externas à parede
o Glicocálice (ou glicocálix)
o Flagelos
o Fímbrias e Pili
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
Citoplasma
Substância da célula dentro da membrana plasmática
Espesso, aquoso, semitransparente, elástico
80% - àgua
Proteínas (enzimas)
Carboidratos
Lipídeos
Íons inorgânicos
Compostos de peso molecular muito baixo
Principais estruturas:
DNA
Ribossomos
Inclusões
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Inclusões da célula bacteriana
•
Função de armazenamento de energia ou como reservatório de
constituintes estruturais.
•
Geralmente envolvidas por uma fina camada de lipídeos.
•
Polímeros de armazenamento de carbono
– PHB (ácido poli-b-hidroxibutírico): natureza lipídica
– PHA (poli-b-hidroxialcanoato): nome coletivo para os grânulos
acumulados, cujos polímeros podem variar de tamanho (C4 até
C18).
– Glicogênio (polímero de glicose)
Estrutura química do PHB.
Micrografia eletrônica de uma seção da
célula de Rhodovibrio sodomensis.
(Madigan et al., 2004)
Inclusões da célula bacteriana
•
Grânulos de polifosfato (volutina): reserva de fosfato inorgânico para
ser usado na síntese de ATP (também encontrados em algas, fungos e
protozoários).
•
Grânulos de enxofre: Thiobacillus (bactéria do enxofre)- glóbulos de
enxofre no periplasma!.
•
Magnetossomos: inclusões de óxidos de ferro - Fe3O4 – em algumas
bactérias Gram-negativo. Função provável relacionada ao movimento –
atração magnética a sedimentos onde [ ] de O2 é menor.
•
Vesículas de gás: em procariotos aquáticos (cianobactérias,
fotossintéticas anoxigênicas), com função de aumentar a flutuabilidade.
Magnetossomos: fotomicrografia
de Aquaspirillum
magnetotacticum com uma
cadeia de magnetossomos.
Fonte: Tortora et al., 2005.
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06/09/2016
 Parede celular
o Estruturas internas à parede
 Membrana citoplasmática
 Inclusões
o Endósporos
o Estruturas externas à parede
o Glicocálice (ou glicocálix)
o Flagelos
o Fímbrias e Pili
o Locomoção da célula bacteriana
o Flagelar
o Deslizamento
o Taxias (fototaxia, quimiotaxia)
Endósporos
•
Estruturas de resistência (ao calor, à agentes químicos, à
dessecação, radiação), desidratadas e duráveis.
•
São formados em condições de exaustão de nutrientes no meio.
•
Geralmente em bactérias do solo, Gram-positivo (descritos em
cerca de 20 gêneros de Bacteria). Não se observou em Archaea.
•
Bem estudados nos gêneros Clostridium e Bacillus.
•
Podem permanecer dormentes por longos períodos de tempo:
– Clostridium aceticum: 34 anos, frasco perdido em depósito da
Universidade da Califórnia.
– Thermoactinomyces: 2.000 anos. Fragmentos de ruínas de sítio
arqueológico romano no Reino Unido.
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06/09/2016
Formação do endósporo
•
Condição de limitação de um ou mais nutrientes essenciais.
•
Em B. subtilis, ~ 200 genes envolvidos no processo de
esporulação. Processo completo pode levar 8 horas.
•
Interrupção da síntese de proteínas envolvidas nas funções da
célula vegetativa e ativação da síntese das proteínas específicas
do esporo, em resposta a um sinal ambiental.
Célula com
metabolismo ativo e
úmida
Endósporo seco,
metabolicamente inerte
e extremamente
resistente
Estágios da formação de um endósporo
(fonte Tortora et al., 2005)
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06/09/2016
Composição da estrutura do endósporo
Exósporo – Camada externa consiste de membrana lipoprotéica que
contém aminoaçúcares.
Capa do esporo – rígida composta de proteína rica em ligações de
dissulfeto intramoleculares que confere a resistência aos agentes
químicos
Parede do esporo – peptideoglicano que dará origem a parede
celular da célula vegetativa;
Córtex – camada espessa (peptideoglicano diferente com menos
ligações cruzadas);
Cerne do esporo – Região interna
Estrutura do endósporo
•
Camadas adicionais e externas à parede
celular que protegem o DNA, formadas
basicamente por proteínas.
•
Núcleo: parcialmente desidratado (contém
de 10 a 30% de água da célula vegetativa) inativa as enzimas, aumenta a
termoresistência.
– Apresenta altas [ ] de PPASs (pequenas
proteínas de ácido solúveis de esporo): liga-se
ao DNA, protegendo-o de possíveis danos
causados pela radiação, calor seco e
dessecamento; pode ser utilizado como fonte de
energia e carbono na germinação do esporo.
– Ácido dipicolínico: exclusivo dos esporos,
corresponde a 10% do peso seco do esporo.
Endósporo bacteriano. (a) MET
de esporo maduro de Bacillus
megaterium. (b) Fotomicrografia
de fluorescência de célula de B.
subtilis em esporulação. O corante
liga-se a uma proteína da capa do
esporo.
Fonte: Madigan et al., 2004.
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06/09/2016
Germinação do endósporo
•
Ativada por lesão física
(aquecimento) ou química no
revestimento do esporo.
•
Enzimas do endósporo rompem
as camadas extras.
•
Intumescimento devido à
entrada de água; síntese de
novas moléculas de RNA,
proteínas e DNA (se condições
nutricionais foram favoráveis).
Germinação de um
endósporo em
Bacillus. (a) esporo
maduro. (b) ativação –
perda de refringência.
(c) e (d) extrusão –
nova célula emergindo.
Fonte: Madigan et al.,
2004.
Endósporos
•
Endósporos - Se formam dentro da célula, são exclusivos das
bactérias.
•
•
•
Possuem parede celular espessa;
São altamente refratáveis;
Altamente resistentes às mudanças do ambiente, à exposição
a compostos químicos tóxicos (desinfetantes).
•
Em M. O. - Coloração específica após o aquecimento do
material para que os mesmos absorvam o corante.
•
Variam em forma e localização dentro da célula!
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06/09/2016
Coloração de Schaeffer-Fulton
Bacillus anthracis – Endósporos e células vegetativas
Localização, tamanho e forma dos endósporos
Esporos ovais:
localização central
(Bacillus cereus)
Esporos esféricos:
localização terminal
(Clostridium tetani)
Esporos ovais:
localização subterminal
(Clostridium subterminale)
São mais freqüentes nos gêneros Clostridium e Bacillus.
Geralmente em culturas que se aproximam do final de um crescimento
ativo.
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06/09/2016
Localização, tamanho e forma dos endósporos
Endósporos bacterianos.
Fotomicrografia de contraste
de fase ilustrando localizações
intracelulares de endóporos
em diferentes espécies. (a)
Terminais (b) Subterminais
(c) Centrais.
Fonte:Madigan et al., 2004.
Atrapalhou a tentativa de contrariar a
Teoria da Geração Espontânea
Condições de experimentos não eliminavam as formas latentes
de bactérias e fungos;
No combate ao carbúnculo, os microbiologistas compreenderam
que as formas latentes do bacilo do carbúnculo poderiam
sobreviver no solo por anos!!
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06/09/2016
Clostridium botulinum
Causam a intoxicação alimentar - Botulismo.
Possui endósporos: resistem a fervura durante horas;
As células vegetativas são mortas por temperaturas acima de 70°C,
mas a maioria dos endósporos pode resistir a 80°C por até 10
minutos.
 Perda de água durante a esporulação;
Resistência
ao calor
 Presença em grande quantidade de ácido
dipicolínico (DPA) combinado com grande
quantidade de cálcio.
Clostridium sp.
30
06/09/2016
Microrganismos em meio de cultura
Fatores orgânicos de crescimento
61
Nutrientes
Macronutrientes
Micronutrientes
62
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06/09/2016
Macronutrientes  necessários em grandes quantidades
• Carbono – elemento principal de todas as macromoléculas biológicas:
• corresponde a 50% do peso seco da célula bacteriana típica.
• fontes orgânicas de C – proteínas, carboidratos e lipídeos
• fonte inorgânica de C – CO2
• Nitrogênio – importante constituinte de proteínas, ácidos nucléicos:
• corresponde a 12-14% do peso seco da célula bacteriana típica.
• encontrado na natureza principalmente na forma de compostos inorgânicos:
amônia (NH3), nitrato (NO3-) ou N2.
• fontes orgânicas: aminoácidos, bases nitrogenadas.
• Fósforo e Enxofre – juntos, correspondem a 4% do peso seco da célula bacteriana
típica:
• Fósforo necessário para a síntese de ácidos nucléicos e fosfolipídeos. Forma
usual encontrada na natureza – íon fosfato PO43- .
• Enxofre – constituinte dos aa cisteína e metionina e também de vitaminas
(tiamina, biotina). Maior parte do enxofre utilizado nos processos celulares vem
de fontes inorgânicas: íon sulfato (SO42-) e sulfeto (HS-).
63
Macronutrientes
Madigan et al., 2004.
64
32
06/09/2016
Micronutrientes (elementos-traço)
Madigan et al., 2004.
65
Fatores orgânicos de crescimento
Algumas bactérias
necessitam de fontes
extracelulares de vitaminas,
que atuam como coenzimas.
Ex. bactérias lácticas
(Streptococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc)
66
Madigan et al., 2004.
33
06/09/2016
Microrganismos em meio de cultura
Crescimento e multiplicação
Meio de cultura satisfatório
Deverá conter:
Síntese de seus próprios monômeros
Fonte de carbono
Nitrogênio
Sais inorgânicos
Em certos casos:
Vitaminas (tiamina, biotina, cobalamina...)
Outros fatores de crescimento
(Aminoácidos, purinas, pirimidinas)
67
Microrganismos em meio de cultura
Exigente
Nutricionalmente
Meio específico/
Ricos
Não Exigente
Meio mínimo
Pseudomonas
Soluções aquosas de glicose, amônia, fosfato, sulfato e outros minerais
Parasitas intracelulares obrigatórios
68
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06/09/2016
Meios de Cultura
• Soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos
em laboratório.
• Inóculo: microrganismos que são colocados em um meio de cultura para iniciar o
crescimento.
• Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura.
Quimicamente definidos:
Quantidades precisas de compostos
químicos inorgânicos ou orgânicos
altamente purificados, adicionados a
água destilada.
Meios
Complexos (ou indefinidos):
Não se conhece a composição precisa
de alguns componentes. Empregam
produtos de digestão da caseína
(proteína do leite), de carne, de soja, de
leveduras, extratos de plantas, entre
outros.
69
Meios de cultura
Utilizados para o cultivo dos microrganismos;
Quimicamente definidos – Definição exata
Retirando ou adicionando um constituinte ao meio definido, pode-se
saber se aquele constituinte é essencial para o crescimento do
microrganismo.
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Meios comerciais
Já contém todos os componentes desejados;
Adiciona-se água
Esteriliza-se 121ºC durante 20 minutos.
Distribui-se em placas de Petri também esterilizadas.
Armazena-se em geladeira embaladas em sacos plásticos para diminuir
a desidratação.
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Microrganismos em meio de cultura
Composição:
Peptona (Fonte de nitrogênio)
Triptose (reações de fermentações)
Extrato de carne (carboidratos, constituintes minerais, vitaminas)
Extrato de leveduras (Fonte de vitaminas)
Água (destilada / deionizada)
Sangue (Fator de crescimento, rico em nitrogênio, carboidratos e
vitaminas)
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Ágar:
polissacarídeo complexo solidificante obtido de algas marinhas.
Poucos microrganismos degradam o ágar.
Temperatura de fusão inferior à temperatura da água.
Permanece líquido até 40ºC.
Na técnica de Pour plate o ágar é mantido a 50ºC e é adicionado sobre o
inóculo sem afetar, ou causar danos a bactéria.
Dependendo de sua concentração os meios podem ser classificados
quanto a consistência:
- Líquido – menos de 1g de ágar por litro de água
- Semi-sólido – 4 g/L
- Sólido – 15 a 18 g/L
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Classificação quanto à função:
-Seletivo
-Diferencial
-Enriquecedor
-Transporte
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Meios Seletivos
Favorece o crescimento da bactéria de interesse impedindo o
crescimento de outras bactérias.
Inibidores: substâncias capazes de inibir algumas bactérias que não são
de interesse.
1) Corantes: verde brilhante, eosina, cristal violeta...
2) Metais pesados: Bismuto;
3) Substâncias químicas: azida, citrato, desoxicolato, selenito e álcool
feniletílico...
4) Agentes antimicrobianos: vancomicina, cloranfenicol
5) Meio hipertônico: alta concentração de sal (7,5%)
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Meio Diferencial
Utilizado para fácil detecção da colônia da bactéria de interesse quando
existem outras bactérias crescendo na mesma placa do meio
Substâncias utilizadas como indicadores de atividade enzimáticas que
auxiliam na identificação
-Indicadores de pH: fucsina, azul de metileno, vermelho neutro, vermelho de
fenol e púrpura de bromocresol. Medem as variações de pH que resultam do
metabolismo bacteriano de certos substratos.
- Indicadores diversos: detectam produtos bacterianos específicos. Ex.: íons
ferro e ferroso para a detecção de sulfato de hidrogênio
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06/09/2016
CLED
(Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes)
Com indicador azul de bromotimol
Lactose +
(Amarelo)
Meio diferencial
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CLED
(Cistina Lactose- Eletrólitos-Deficientes)
Com indicador de Andrade!!
Lactose +
(Rosa)
Meio diferencial
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06/09/2016
Ágar MacConkey
Peptona de carne...................................................3
Peptona de caseína..............................................17
Nitrogênio e
carbono
NaCl.........................................................................5
Lactose..................................................................10
Sais biliares.........................................................1,5
Vermelho neutro................................................0,03
Cristal violeta...................................................0,001
Açúcar
Inibidor de
Gram+
Indicador de pH
Inibidor de
Gram+
Ágar....................................................................13,5
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Meio Seletivo e Diferencial
Muito utilizado na rotina laboratorial
Ágar MacConkey – Seletivo e Diferencial
Seletivo: Cristal violeta e sais biliares – inibem bactérias Gram-positivo;
Diferencial: Este meio possui indicador de pH, por exemplo vermelho neutro:
quando o meio fica ácido a cor fica rosa.
Possui lactose que a bactéria pode degradar (fermentar) produzindo ácido
que diminui o pH do meio.
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06/09/2016
Lactose Lactose +
MacConkey
Cultura mista!!!!!!
Seletivo para enterobactérias
(Gram-negativo) a partir de
fezes, urina, alimentos,
água...
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MacConkey
Cultura mista!!!!!!
1. Lactose –
2. Lactose +
Sais biliares e cristal violeta
inibem Gram-positivas
Meio seletivo e diferencial
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06/09/2016
Ágar Manitol Hipertônico
Peptona...............................................................10
Nitrogênio e
carbono
Extrato de carne..................................................1
Inibidor de algumas
NaCl.....................................................................75 Gram+
e das Gram -
Manitol................................................................10
Vermelho de fenol .......................................0,025
carboidrato
Indicador de pH
Ágar....................................................................12
Meio Seletivo e Diferencial
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Ágar Manitol Hipertônico
Manitol -
Indicador Vermelho de fenol!!!
Manitol +
A degradação do manitol está relacionada com a patogenicidade, indicativo
da presença de Staphylococcus aureus.
Crescem apenas bactérias que suportam grande concentração de sal!
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06/09/2016
E.M.B.
(Eosina Azul de metileno)
Para isolamento de
Enterobactérias
(Gram–negativo)
Corantes inibem
Gram-positivo
Brilho verde metálico
Escherichia coli???
Bactérias produtoras de ácidos fortes formam
brilho verde metálico causado pela
precipitação do corante nas colônias:
SUGESTIVO de E. coli!!!
Meio seletivo e diferencial
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E.M.B.
(Eosina Azul de metileno)
Para isolamento de
Enterobactérias
(Gram–negativo)
Corantes inibem
Gram-positivo
Colônias pardo rósea
Produtora de ácido fraco
Ex: Enterobacter sp
Meio seletivo e diferencial
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06/09/2016
Meio Mueller Hinton
Pseudomonas aeruginosa
Pigmento verde natural
Escherichia coli
Brilho verde metálico
somente no meio
EMB!
Meio EMB
Serratia marcescens
Pigmento vermelho natural!!
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Momento I
“Aprendendo Microbiologia com Poema e Poesia”
By Ilana Camargo
http://www.icej.org.br/?p=372
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06/09/2016
Encontro com uma Drag queen verde!
Será que vai me notar?
Se isso não ocorrer, não vou chorar,
nem tampouco esporular!
Sou mesófilo e sempre estou com você.
No seu calor me sinto bem.
Vou crescer, você vai ver!!
Pode até me cortar o oxigênio,
como sou anaeróbio facultativo,
vou continuar a crescer, Oh! Gênio!
Porém, se no meu meio jogar sal,
me inibirá e te deixarei...
Não sou halófilo, afinal!
Se você quiser me ver,
me semeie em EMB e vou aparecer.
Fermento lactose e ácido forte pode ser observado.
Assim, como uma Drag queen verde,
por todos posso ser notado.
Sou bacilo Gram Negativo.
Meu nome é Escherichia coli,
e nosso encontro pode ser divertido!
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De volta à aula...
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06/09/2016
Rico X Enriquecimento
Rico:
é o meio que é suplementado com sangue, soro, suplementos
vitamínicos e extrato de levedura para isolar microrganismos exigentes.
Ex: ágar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e
ágar chocolate
Meio de enriquecimento:
Incrementa o crescimento de certas
espécies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de
microrganismos que não sejam de interesse.
Ex.: Caldo GN e Caldo selenito.
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Ágar Mueller Hinton
suplementado com sangue de
carneiro a 5%.
Meio rico
Permite o crescimento da
maioria das bactérias
Colônia
Hemólise
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06/09/2016
Meios de Cultura
Seletivo:
Favorece o crescimento do microrganismo de
interesse e impede o crescimento de outros.
Ex.: Ágar sulfeto de bismuto para isolamento
de Salmonella typhi a partir das fezes.
Meios
Diferencial:
Permite a fácil identificação da colônia da
bactéria de interesse, dentre as colônias de
outras bactérias crescidas no meio.
Ex.: Meio ágar sangue para detectar a presença
de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo
claro em torno da colônia pela lise das
hemáceas)
de Enriquecimento:
Semelhante ao seletivo, mas
suplementado por nutrientes especiais,
com a característica de aumentar o número
da bactéria de interesse tornando-a
detectável.
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Técnicas de
semeadura
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Isolamento de colônias para posteriormente obter cultura pura
Objetivo dos métodos:
Diminuir a população microbiana, assim as células individuais estarão localizadas a
uma certa distância umas das outras.
Para obter uma cultura pura, uma colônia individual é transferida do meio para outro
em placa ou tubo.
O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança
Zona Asséptica
Bico de Bunssen
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Manobras assépticas
Manobras assépticas
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Manobras assépticas
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Swab de algodão esterilizado
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Métodos de isolamento de microrganismos
em cultura pura
Métodos de isolamento de microrganismos:
- Espalhamento em placa;
- Pour-plate;
- Esgotamento por estrias;
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Método
Espalhamento
em placa
Método
Pour Plate
Espátula de Drigalski
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Método de espalhamento em placa
Método de esgotamento em placa
Por estrias
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Por estrias
Método de esgotamento em placa
Por estrias
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Cultura Pura
Onde todas as células na população são idênticas e todas
se originaram de uma mesma célula parenteral.
Natureza - Culturas mistas: muitas espécies diferentes no
mesmo ambiente
Primeiro passo: Isolar as diferentes espécies contidas em um espécime (amostra).
Cultura
mista
Cultura
pura
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Bibliografia
- Madigan et al., Microbiologia de Brock. São
Paulo:Prentice-Hall, 10ª ed., 2004. Capítulo 4.
- Tortora et al., Microbiologia. Porto Alegre;
ArtMed, 8ª ed., 2005. Capítulo 4.
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