Catálise enzimática na produção de etanol de segunda
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Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 Universidade Federal de São João del-Rei Coordenadoria do Curso de Química Catálise enzimática na produção de etanol de segunda geração Jéssica Alexandra da Silva São João del-Rei – 2016 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 CATÁLISE ENZIMÁTICA NA PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado no segundo semestre do ano de 2016 ao Curso de Química, Grau Acadêmico Bacharelado, da Universidade Federal de São João del-Rei, como requisito parcial para obtenção do título Bacharel em Química. Autor: Jéssica Alexandra da Silva Docente Orientador: Prof.a Dr.a Maíra Nicolau de Almeida Modalidade do Trabalho: Revisão bibliográfica São João del-Rei – 2016 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 RESUMO O etanol começou a ser utilizado como combustível no Brasil a partir do século XX com o objetivo de estabilizar o preço do açúcar no mercado interno e reduzir a dependência do petróleo importado, sendo considerado um dos melhores combustíveis renováveis derivados de biomassa vegetal para a substituição dos combustíveis derivados de fósseis. A produção de etanol ocorre a partir de diferentes tipos de matéria prima renováveis (cana-deaçúcar e milho) por meio da aplicação de diferentes tecnologias de conversão. O etanol de segunda geração é produzido por meio da utilização de resíduos agroindustriais e que possuem inúmeras vantagens, como fácil disponibilidade, baixo custo e produção em grande quantidade. É obtido a partir de três processos diferentes: pré-tratamento, sacarificação (ou hidrólise) e fermentação. Os materiais lignocelulósicos são compostos por três principais constituintes: celulose, hemicelulose e lignina, que são frações poliméricas unidas por ligações covalentes. O processo de pré-tratamento é utilizado para o rompimento da estrutura cristalina da biomassa lignocelulósica e também para a remoção da lignina. A sacarificação enzimática consiste na hidrólise da celulose e hemicelulose, que posteriormente têm seus produtos fermentados para a produção de etanol. Isso acontece pela atuação de celulases e hemicelulases, que têm a função de hidrolisar os polímeros de hidratos de carbono da planta produzindo açúcares como glicose e xilose. A hidrólise completa da celulose é realizada pela ação sinérgica de três tipos principais de enzimas: as endoglucanases (EC 3.2.1.4), as exoglucanases (celobiohidrolases (EC 3.2.1.176) e exoglicohidrolases (EC 3.2.1.91)) e as celobiases ou β-glicosidases (EC 3.2.1.21). Os tipos de hemicelulases que atuam no processo de despolimerização da hemicelulose são as xilanases (E.C. 3.2.1.8), mananases (E.C. 3.2.1.78), β-xilosidases (E.C. 3.2.1.37), βmannosidases (E.C. 3.2.1.25), α-arabinofuranosidases (E.C. 3.2.1.55), α-galactosidases (E.C. 3.2.1.22), acetil xilano esterase (E.C. 3.2.1.72), feruloil esterases (E.C. 3.1.1.73), pcumaril-esterases (E.C. 3.2.1.73) e α-glicuronidases (E.C. 3.2.1.139). Os processos de sacarificação e fermentação podem ser realizados individualmente (SHF) ou simultaneamente (SSF). Ambos possuem inúmeras vantagens e desvantagens, sendo a escolha do procedimento determinada pelo equilíbrio associado à enzima e levedura utilizadas nos processos de hidrólise e fermentação que dependem diretamente da natureza do substrato. A etapa de fermentação ocorre pela utilização de leveduras, fungos ou bactérias que convertam facilmente hexoses (glicose, galactose e manose) em etanol. Porém, as pentoses (xilose e arabinose) não são efetivamente fermentadas com métodos tradicionais. Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 SUMÁRIO 1. Introdução 1.1 - Contexto Histórico 1 1.2 - Etanol de segunda geração 2 2 Composição da biomassa lignocelulósica 4 3 Pré-tratamento 8 4 Enzimas hidrolíticas para degradação de lignocelulose 11 5 Sacarificação enzimática da biomassa lignocelulósica 15 6 Fermentação 17 7 Considerações finais 18 8 Referências Bibliográficas 18 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 1. Introdução 1.1 Contexto Histórico O etanol pode ser produzido a partir de diferentes tipos de matéria prima renováveis, por diferentes tecnologias de conversão, que podem ser de primeira ou de segunda geração. As tecnologias de primeira geração baseiam-se na fermentação alcoólica dos carboidratos simples presentes na biomassa ou em hidrolisados enzimáticos. O etanol de primeira geração é produzido principalmente de culturas alimentares que contenham sacarose, como o melaço, a cana de açúcar, a beterraba, além de várias frutas, e de materiais ricos em amido, como milho, trigo, mandioca, centeio, cevada, inhame e batatadoce. Enquanto que o etanol de segunda geração é obtido por matérias primas não alimentares, como a biomassa lignocelulósica obtida a partir de resíduos industriais e agroindustriais, ou de culturas lenhosas. No Brasil, o etanol é obtido a partir da sacarose da cana de açúcar e nos EUA é obtido a partir de hidrolisado de milho (glicose, maltose e dextrinas) (PITARELO et al., 2012; VERARDI et al., 2016). O álcool produzido de cana de açúcar começou a ser utilizado como combustível no Brasil em meados do século XX com o objetivo de estabilizar o preço do açúcar no mercado interno e reduzir a dependência do petróleo importado. Em 1973, ocorreu a primeira grande crise mundial do petróleo onde o país importava mais de 80 % de sua necessidade de consumo. Essa crise induziu, dois anos depois, a criação do Programa Nacional do Álcool (Proálcool) onde o governo buscava regulamentar o uso do álcool anidro misturado à gasolina em todo o país prevenindo, dessa forma, uma crise no balanço de pagamentos. Com o Proálcool, o governo investiu no aumento das áreas plantadas com cana-de-açúcar e também no maquinário das usinas (PEREIRA et al., 2006; VIEIRA; LIMA; BRAGA, 2007). A partir de 1987 já eram notáveis as vantagens que Proálcool trouxera para o país com a produção dessa nova fonte energética. Em 1989, 60 % da gasolina havia sido substituída pelo álcool. Esse programa apresentou inúmeras características vantajosas em relação ao uso de derivados de petróleo, contribuindo para a redução da dependência do petróleo estrangeiro, aumentando vagas de emprego e diminuindo os déficits comerciais. Sua composição mais limpa provocou uma redução da poluição ambiental por dióxido de carbono, contribuindo para a preservação do meio ambiente. E quando misturado ao diesel, provoca uma diminuição da fumaça visível, responsável pela poluição atmosférica. Pouco tempo depois o Proálcool foi inativado, pois o governo já havia atingido suas metas para o programa (BANERJEE et al., 2016; VIEIRA; LIMA; BRAGA, 2007). O investimento na produção de etanol proveniente de materiais celulósicos iniciou em 2000, quando o USDOE (United States Department of Energy) junto com parcerias 1 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 investiram USD 17,1 milhões no desenvolvimento tecnológico para produção de etanol a partir de resíduos do milho. Após o Departamento assinar um acordo com o Laboratório de Energias Renováveis (National Renewable Energy Laboratory – NREL) e as duas empresas líderes mundiais na produção de enzimas, Novozymes e Genencor, em quatro anos ocorreu uma diminuição de 12 vezes no custo das celulases, enzimas responsáveis pela hidrólise da celulose. A empresa canadense, IOGEN, recebeu financiamentos para a produção de etanol a partir de outras biomassas como aveia, cevada, palhas de trigo e talo de milho (CASTRO; PEREIRA, 2010). O Proálcool serviu de referência para a criação de outros projetos importantes como o Projeto Bioetanol, criado em 2006, financiado pela FINEP (Financiadora de Estudos e Projetos) que tem como meta desenvolver tecnologias viáveis para a conversão da celulose presente na biomassa da cana-de-açúcar em etanol combustível. Outro programa de incentivo a produtividade do etanol de segunda geração (2G) é o BIOEN, projeto da FABESP (Fundação de Amparo e Desenvolvimento da Pesquisa) gerou vários trabalhos destacáveis, incluindo parâmetros ambientais que aperfeiçoariam o crescimento e rendimento da cana (OGEDA; PETRI, 2010). 1.2 Etanol de segunda geração Segundo VERARDI et al., 2016 o etanol é considerado um dos melhores combustíveis renováveis derivados de biomassa vegetal para substituir os combustíveis derivados de fósseis, pois: Pode ser utilizado em motores de combustão interna como substituto para a gasolina, ou misturado à gasolina em qualquer proporção; É facilmente transportado e armazenado; A sua utilização como composto oxigenado para a combustão limpa da gasolina melhora a qualidade do ar e reduz os riscos de poluições subterrâneas; Contribui para a redução das emissões de CO2 e impactos ambientais. Atualmente, os resíduos agroindustriais têm sido identificados como matéria-prima futura para a produção de etanol devido a fácil disponibilidade, baixo custo e produção em grande quantidade, além de seu elevado conteúdo de celulose e hemicelulose. O modelo sustentável para a produção de combustíveis renováveis, produzidos a partir de biomassa lignocelulósica, tem gerado diferentes tecnologias de pré-tratamento, sacarificação (ou hidrólise) e fermentação, em todo mundo, para demonstrar a viabilidade comercial deste processo. A maior dificuldade para esse modelo é o alto custo das enzimas utilizadas e dessa forma, a maior parte destes estudos está orientada ao aumento da acessibilidade 2 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 química da celulose, com o objetivo de reduzir a quantidade de enzima necessária para a conversão dos polissacarídeos em açúcares fermentescíveis (PITARELO et al., 2012; ZHOU et al., 2016). A biomassa lignocelulósica é o recurso reprodutível mais abundante na crosta terrestre e sua conversão em etanol 2G, por meio do bagaço de cana, tem alto valor agregado devido ao considerável teor de celulose (40-45%) e hemiceluloses (30-35%) presentes na planta. Em média, o Brasil produz 85 toneladas por hectare de cana-de-açúcar. E são geradas aproximadamente 24 toneladas de biomassa lignocelulósica (palha e bagaço) por hectare. O aproveitamento integral de cana-de-açúcar (colmo, palha e bagaço) dobraria a produção de etanol sem a necessidade de expansão da área cultivada e reduziria os custos de produção. Grande quantidade do bagaço de cana é mantida como resíduo em períodos de entressafra e também é usada para a produção de papel, geração de eletricidade ou como matériaprima para alimentação animal (SANTOS et al., 2012; VERARDI et al., 2016; ZHOU et al., 2016). A produção de biocombustíveis não exige pesquisas apenas sobre o tipo da biomassa e sua posterior conversão, mas também de sua sustentabilidade econômica, quando operado em larga escala. A utilização de enzimas em aplicações industriais tem gerado várias técnicas que possibilitam a modificação de suas propriedades biocatalíticas, tornando-as mais específicas, enantioseletivas e estáveis de forma a catalisar transformações de diferentes tipos de substratos. Biotransformações geram uma quantidade menor de resíduos, além de reduzir o custo de produção e o consumo de energia, conceitos importantes da Química Verde (BANERJEE et al., 2016; GONÇALVES; MARSAIOLI, 2013). A empresa IOGEN desenvolve tecnologia para a fabricação de biocombustível celulósico renovável, abordando a transformação de resíduo lignocelulósico em etanol. E para a inserção da hidrólise ao setor sucroalcooleiro propôs um modelo previsto entre 2015 e 2025, considerando os seguintes aspectos (CGEE, 2009): Disponibilidade tecnológica; Quantidade suficiente de bagaço para a hidrólise e produção de energia; A compatibilidade dos processos de destilação para a conversão dos licores de hidrólise e açúcares extraídos da cana em do bioetanol; Sustentabilidade, com geração mínima de efluentes, a fim prevenir impactos ambientais negativos e gasto elevado de água. A primeira usina de tamanho comercial que converte resíduo de cana-de-açúcar em etanol de segunda geração foi lançada em 2013, na Itália. No Brasil, a empresa Raízen possui uma unidade localizada em Piracicaba (SP) e, em parceria com a Iogen Corporation, 3 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 desenvolveu a tecnologia de processamento da biomassa para a produção do etanol celulósico. A Bioflex 1, unidade industrial da empresa GranBio, entrou em operação em setembro de 2014 e é a primeira fábrica de etanol celulósico em escala comercial do Hemisfério Sul e se localiza no município alagoano de São Miguel dos Campos. Estes exemplos demonstram que o etanol celulósico já é uma realidade e, futuramente, espera-se que sua produção possua um custo competitivo e um rendimento favorável em relação ao etanol de primeira geração (VARDANEGA; PRADO; MEIRELES, 2015; YEAR, 2013). 2. Composição química da biomassa lignocelulósica Os materiais lignocelulósicos são compostos por três principais constituintes: celulose, hemicelulose e lignina, que são frações poliméricas unidas por ligações covalentes (Figura 1). A celulose é um polissacarídeo formado por moléculas de glicose unidas através de ligações β-1,4-glicosídicas por ligações de hidrogênio, sendo sua forma estrutural em espiral que se mantém envolvida pela lignina, rede polimérica tridimensional formada por unidades fenilpropano interligadas. Atuando como um elo químico entre as outras duas frações está a hemicelulose, polissacarídeo ramificado formado principalmente por D-xilose com pequenas quantidades de L-arabinose, D-glicose, D-manose, D-galactose, ácido glicurônico e ácido manurônico (OGEDA; PETRI, 2010). Figura 1:Arranjo típico da parede celular vegetal. Fonte: (MURPHY; MCCARTHY, 2005) 4 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 Estruturalmente, a celulose pode ser classificada em três níveis organizacionais, podendo ser observado na figura 2 que o primeiro está definido pela sequência de resíduos β-D-glicopiranosídicos unidos por ligações covalentes, formando o homopolímero de anidroglicose com ligações β-D (1→4) glicosídicas, de fórmula geral (C6H10O5)n. Já o segundo nível tem como característica as distâncias das ligações e as variações angulares decorrentes das forças intermoleculares provenientes das ligações de hidrogênio. O terceiro nível é responsável pela característica insolubilidade em água e em outros solventes da celulose, corresponde a sua estrutura cristalina formada pela associação de moléculas (SANTOS et al., 2012). Figura 2. Representação esquemática da estrutura molecular da celulose. Fonte: (SANTOS et al., 2012) A celulose é um polímero de unidades de glicose unidas por ligação β1-4. A glicose é o substrato perfeito para a fermentação na produção de etanol ou butanol (álcool de cadeia longa). A rigidez e sustentabilidade estrutural das paredes celulares dos vegetais é garantida por interações entre os polissacarídeos de celulose, reforçados dentro de uma matriz de hemiceluloses e pectinas. Essa sustentação estrutural é uma importante função da celulose que só se faz possível pela sua extrema insolubilidade em água sob condições normais (BANERJEE et al., 2016; OGEDA; PETRI, 2010). A hemicelulose (Figura 3) possui significativa semelhança estrutural com a celulose e com a lignina, permitindo interações entre elas que promovem flexibilidade para a formação de um agregado altamente estável. Quando comparada com a celulose, a hemicelulose oferece maior acessibilidade aos ácidos utilizados no processo de hidrólise ácida e essa reatividade pode ser atribuída ao caráter amorfo de sua estrutura (SANTOS et al., 2012). Figura 3. Representação esquemática da estrutura molecular da hemicelulose. Fonte: (SANTOS, et al, 2012) 5 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 Hemiceluloses são geralmente classificadas de acordo com o resíduo de açúcar principal em sua estrutura, como, por exemplo, xilanas, mananas e glucanas. A xilose é o principal açúcar solúvel produzido pelo processo de auto-hidrólise das hemiceluloses, pois maior parte de sua estrutura é composta principalmente de cadeias lineares de xilose. Uma pequena quantidade monomérica de outros açúcares, tais como arabinose e manose (VERARDI et al., 2016). A lignina é um heteropolímero amorfo com estruturas globulares constituído de álcool p-cumarílico, álcool coferílico e álcool sinapílico, que são unidades diferentes de fenilpropanos (Figura 4). A organização conformacional e também a composição estrutural variam entre as espécies de acordo com a matriz celulose-hemicelulose. Durante a hidrólise enzimática a lignina tem a capacidade de capturar fortemente as enzimas, influenciando diretamente nas quantidades de enzimas usadas durante a sacarificação e, dessa forma, dificultando a recuperação dessas enzimas após o procedimento (SANTOS et al., 2012). Figura 4. Representação estrutural da lignina. Fonte: (ROSA; GARCIA, 2009) A biomassa da cana-de-açúcar é composta de caldo, fibras e folhas. O colmo e as folhas originam o bagaço e o palhiço é composto pelas folhas verdes e secas, e pelo ponteiro da cana-de-açúcar. Esses resíduos da colheita gerados nas usinas e destilarias são geralmente queimados ou utilizados na cobertura de terrenos e o excesso incinerado no campo (CGEE, 2009; VIEIRA; LIMA; BRAGA, 2007). Quando recém-moído o bagaço de cana de açúcar possui cerca de 50% de umidade, 45% de fibras lignocelulósicas e de 2 a 3% de sólidos solúveis e insolúveis (SANTOS et al., 2011). Essa biomassa não homogênea apresenta variações em sua composição devido aos procedimentos como corte e processamentos industriais que podem causar modificações em sua estrutura morfológica. A matéria mineral encontrada na planta varia entre impurezas e cinzas constitutivas que podem chegar a 5 % do bagaço. Na Tabela 1 são mostrados 6 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 percentuais médios dos componentes de um bagaço padrão, visando a potencial quantificação do aproveitamento na hidrólise (CGEE, 2009). Tabela 1. Composição química da palha de cana-de-açúcar em diferentes regiões do Brasil. Palha de cana Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas Extrativos Total % MG 45,3 31,51 16,7 5,9 16,1 99,41 SP 44,44 30,7 19,8 3,9 16,7 98,84 PR 44,98 30,92 18,9 4,8 16,8 99,6 MT 43,53 30,53 19,4 5,3 16,7 98,8 AL 43,02 31,85 20,2 4,4 14,1 99,47 Média 44,26 ± 1,35 31,1 ± 0,78 19,01 ± 1,95 4,86 ± 1,1 16,68 ± 2,83 0,56 1,38 0,78 2,01 Desvio padrão 0,95 Fonte: (SANTOS et al., 2014) As partículas presentes na estrutura morfológica do bagaço não apresentam tamanho uniforme, uma parte é esponjosa e a outra fibrosa. Essas frações distinguem-se entre casca, fibra e medula que variam em suas densidades, porém todas são baixas. A fibra e a medula possuem composição química diferentes sendo, respectivamente, rica em celulose e, a outra, em hemicelulose e lignina. Essas composições interferem diretamente no rendimento da hidrólise (CGEE, 2009). O sabugo de milho é um dos resíduos agroindustriais mais ricos em hemicelulose, principalmente composto de xilose, um açúcar muito usado como fonte de carbono na fermentação. A composição média relatada nesta biomassa é 42 % de celulose, 33 % de hemicelulose, 18 % lignina e 1,5 % de cinzas. Devido à sua estrutura complexa, as espigas de milho precisam de um tratamento termoquímico para a hidrólise da hemicelulose e para o aumento da acessibilidade de celulase em coquetéis enzimáticos para a produção de açúcares monoméricos livres, principalmente glicose e xilose (PEDRAZA et al., 2016). Resíduos provenientes da mostarda, utilizada na extração de óleo, também são possíveis fontes de matéria-prima para a produção de etanol 2G. Devido ao seu odor característico não tem outras finalidades além da queima. Porém, sua composição química se assemelha com a de outros resíduos também usados na produção de etanol como a palha de arroz e o farelo de trigo. No entanto, possui teores superiores de celulose (48,5%) e hemicelulose (29,6%) presentes em sua biomassa (BANERJEE et al., 2016). A produção de etanol celulósico requer que a biomassa lignocelulósica seja convertida em açúcares fermentáveis a partir de quatro etapas: (1) Pré-tratamento, onde a estrutura cristalina da celulose será rompida (2) Sacarificação, que é a hidrólise dos polissacarídeos gerando açúcares fermentescíveis (3) Fermentação, que é a conversão dos açúcares em 7 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 etanol e (4) Destilação, que promove a separação dos componentes por volatilização (SANTOS et al., 2014). 3. Pré-tratamento O pré-tratamento é um processo utilizado a fim de quebrar a estrutura cristalina da biomassa lignocelulósica e remover a lignina, reduzindo a cristalinidade da estrutura da celulose e aumentando a porosidade para que as moléculas de celulose e hemicelulose sejam completamente expostas às ações enzimáticas (Figura 5). Esse processo varia de acordo com os produtos químicos envolvidos e as concentrações utilizadas com a combinação da temperatura e tempo de reação. Diferentes métodos de pré-tratamento normalmente resultam em diferentes padrões de libertação de compostos, que podem variar com tipo de biomassa e diferentes formulações de enzima (BEHERA et al., 2014; NAKASU et al., 2016; SANTOS et al., 2014; STUDER et al., 2011). Figura 5. Ilustração do rompimento da estrutura cristalina da biomassa lignocelulósica determinadas pelo pré-tratamento. Fonte: (SANTOS et al., 2012) A etapa de pré-tratamento pode representar até 20% dos custos totais de produção do etanol celulósico. Um pré-tratamento eficaz deve (a) melhorar a digestibilidade de celulose, (b) produzir baixas concentrações de produtos de degradação e (c) ter baixa demanda energética. Existem vários tipos de pré-tratamentos desenvolvidos e muitos outros vêm sendo propostos a fim de minimizar, principalmente, os custos dessa etapa de produção do etanol de segunda geração (2G) (BANERJEE et al., 2016). Fatores como temperatura, tempo de residência e umidade influenciam diretamente no rendimento da recuperação dos principais componentes da parede celular (celulose, hemiceluloses e lignina) e devem ser verificados na etapa de pré-tratamento, pois são precursores na eficiência das etapas de sacarificação da celulose e de fermentação dos 8 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 hidrolisados obtidos. Condições mais drásticas de temperatura e tempo de residência no reator resultam em maiores percentuais de sacarificação da celulose (ALVIRA et al., 2010). Elevados níveis de decomposição dos carboidratos (celulose e hemiceluloses) e de condensação da lignina, podem gerar um acúmulo de inibidores, causando a inibição de reações de sacarificação e de fermentação diminuindo o rendimento (PITARELO et al., 2012). Alguns produtos gerados a partir da xilose, da decomposição da arabinose e da degradação da estrutura lignocelulósica, como o furfural e outros subprodutos devem ser removidos no processo de pré-tratamento mais adequado (VERARDI et al., 2016). Comumente são encontrados compostos inibidores como ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, 2-furaldeído (furfural), 5-hidroximetil-2-furaldeído (HMF), vanilina, siringaldeído, e aldeído coniferílico (PEREIRA et al., 2011; ZHANG; PEI; WANG, 2016). De modo geral, os processos de pré-tratamento podem ser separados em quatro grupos: biológicos, químicos, físicos ou de acordo com suas propriedades físico-químicas. Os pré-tratamentos físicos, como trituração mecânica e ultra-som, apresentam menor desempenho quando comparados aos outros grupos, além de custos mais elevados no procedimento (FITZPATRICK et al., 2010). Em pré-tratamentos biológicos, são utilizados fungos e bactérias (actinomicetes) visando à remoção da maior parte de lignina possível. A escolha do micro-organismo mais adequado para este processo deve seguir três critérios principais: (1) capacidade de utilizar açúcares de cinco carbonos; (2) ser tolerante a concentrações elevadas de inibidores de fermentação produzidos a partir de biomassa pré-tratada; (3) possuir um intermediário ou tolerância a concentração do produto. A escolha do micro-organismo afeta diretamente nos títulos finais de etanol e rendimentos (BEHERA et al., 2014; CHEN et al., 2016). A utilização de ácido diluído no processo de pré-tratamento é um dos métodos mais comumente empregados, pois promove a remoção da maior parte de hemiceluloses melhorando a digestibilidade da celulose. Este método já foi empregado no pré-tratamento de vários materiais lignocelulósicos, tais como trigo, polpa de beterraba, caules e folhas de milho. Porém, possui a desvantagem de produção concomitante de furanos, que inibem a fermentação. Dessa forma, é necessário um processo de desintoxicação dos xaropes para a realização da sacarificação e fermentação (ALVIRA et al., 2010; HU et al., 2015; VARGASTAH et al., 2015). Pré-tratamentos catalisados por ácidos são eficientes na hidrólise das hemiceluloses, enquanto a catálise ácida apresenta a vantagem de solubilizar a lignina e liberar hemiceluloses para serem hidrolisadas por hemicelulases com a vantagem de retenção da celulose (OGEDA; PETRI, 2010; VISSER et al., 2013). O pré-tratamento com solventes orgânicos promove uma menor degradação e permite a separação de celulose com alta pureza. Neste caso, a maior parte da lignina e da 9 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 hemicelulose são dissolvidas pelo solvente, aumentando a superfície de contato da celulose e melhorando o desempenho da hidrólise enzimática e o rendimento na fermentação. Estudos recentes relataram um aumento da produção e mais taxas de conversão da sacarificação de materiais tratados com solventes orgânicos em comparação com sacarificação catalisada por ácido. A temperatura e a pressão são relativamente suaves e o pH neutro reduz a degradação de carboidratos em inibidores indesejados como o furfural (ALVIRA et al., 2010; MESA et al., 2016; ZHANG; PEI; WANG, 2016). Outra tecnologia de pré-tratamento é a explosão a vapor, que tem sido aplicada para vários tipos de biomassas lignocelulósicas. Pode ser realizado com ou sem catalisadores químicos, esse processo é feito por meio de altas temperaturas (160-190 °C) e por um curto período de tempo até a liberação explosiva da pressão (OGEDA; PETRI, 2010). Essa técnica é amplamente utilizada para diferentes substratos de biomassa: lascas de madeira, palha de trigo, silagem de milho, etc. Possui a capacidade de remover a hemicelulose e consequentemente aumentar a eficiência e a acessibilidade de celulose, no entanto, o teor de lignina não pode ser significativamente reduzido (VERARDI et al., 2016; ZHOU et al., 2016). O fracionamento por solvente é outra forma de pré-tratamento, que dessa vez se baseia no conceito de solubilização diferencial e quebra das ligações de hidrogênio entre as microfibras provocando a separação de vários componentes, como a celulose. Os solventes concentrados, tais como ácido fosfórico, dissolvem completamente as fibras de celulose e perturbam as ligações de hidrogênio que unem a celulose cristalina e que, por sua vez, aumentam a acessibilidade da celulose às celulases (FITZPATRICK et al., 2010). Líquidos iônicos também podem ser utilizados no processo de pré-tratamento para a dissolução e hidrólise da biomassa. Fatores como a baixíssima pressão de vapor, estabilidade térmica, e outras propriedades como polaridade, hidrofobicidade e miscibilidade com solventes, geram muito interesse nestes compostos principalmente pela preocupação com o meio ambiente e com futuras tecnologias (FITZPATRICK et al., 2010; OGEDA; PETRI, 2010). O pré-tratamento hidrotérmico é à base de água e não requer uso de outros reagentes. Dessa forma, não causa danos ao meio ambiente e é economicamente favorável, pois reduz o consumo de produtos químicos e o risco de corrosão do equipamento. Neste caso, é necessário conhecimento do comportamento térmico e dos parâmetros cinéticos da biomassa para o seu melhor aproveitamento, durante o processo de termoconversão. Apesar das vantagens, este pré-tratamento apresenta baixo rendimento o que inviabiliza sua utilização em escala industrial (NAKASU et al., 2016; SANTOS et al., 2011; STUDER et al., 2011). 10 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 Um processo chamado desacetilação remove a maior parte de grupos acetil ligados à hemicelulose e remove parcialmente a lignina presente, favorecendo assim a hidrólise enzimática. Em seguida, outro processo de refinação mecânica é realizado a fim de aumentar a área de superfície da biomassa por desfibramento mecânico, melhorando consideravelmente o acesso à celulose e hemicelulose pelas enzimas. O processo de refinação mecânica é muito simples e possui menores custos, além de utilizar pouco vapor químico e apresentar rendimentos elevados de açúcar e concentrações em prontidão para comercialização (CHEN et al., 2016; DAVIES et al., 2011). Operações físicas, como o processo de moagem, realizadas no pré-tratamento tem a capacidade de aumentar a superfície de contato da enzima com a celulose, podendo também reduzir a cristalinidade de sua estrutura. Normalmente, hidrólises enzimáticas possuem um rendimento de açúcar menor que 20%, enquanto que, se uma etapa de prétratamento for utilizada, o rendimento pode alcançar até mais de 90% (ALVIRA et al., 2010). 4. Enzimas hidrolíticas para degradação de lignocelulose A estrutura recalcitrante da biomassa dificulta a hidrólise enzimática, no entanto a remoção da lignina e da hemicelulose por meio de um pré-tratamento pode melhorar a eficiência deste processo. Após o pré-tratamento, a hidrólise enzimática é realizada com as celulases e hemicelulases que têm a função de hidrolisar os polímeros de hidratos de carbono da planta. Celulases são enzimas hidrolíticas que degradam a celulose de diferentes tipos de biomassa em glicose. Porém, a grande desvantagem no uso dessa enzima é seu alto custo. Atualmente, existem várias tecnologias para a produção eficaz de celulase que buscam minimizar os custos para sua utilização em alta escala (SHARMA; SHARMA; KUILA, 2016; ZHOU et al., 2016). Celulases são classificadas de acordo com seu local de atuação no substrato celulósico. Esses biocatalisadores atuam sobre diferentes materiais celulósicos liberando açúcares, principalmente na forma de glicose, produto de maior interesse industrial, para posteriormente serem convertidas em etanol (SHARMA; SHARMA; KUILA, 2016). A hidrólise enzimática completa da celulose é realizada pela ação sinérgica de três tipos principais enzimas: as endoglucanases (EC 3.2.1.4), as exoglucanases (celobiohidrolases (EC 3.2.1.176) e exoglicohidrolases (3.2.1.91)) e as celobiases ou βglicosidases (EC 3.2.1.21) (DEN HAAN et al., 2007; FALKOSKI et al., 2012; VISSER et al., 2013). A Endoglucanase (1,4-β-D-glucana-4-glicanohidrolase) é uma enzima celulolítica que tem a função de iniciar a hidrólise, solubilizando rapidamente o polímero celulósico. Ela atua na clivagem das ligações internas da fibra celulósica, atacando aleatoriamente cadeias de 11 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 celulose. Enquanto hidrolisa randomicamente as regiões internas da estrutura amorfa da fibra celulósica, libera diferentes polímeros de oligossacarídeos (celobiose e glicose) e também novos terminais, sendo um redutor (hidroxila heterosídica livre na extremidade da glicose) e um não redutor (hidroxila heterosídica ligada à outra extremidade com a glicose adjacente) (BHALLA et al., 2013; CASTRO; PEREIRA, 2010). O grupo das exoglucanases é pouco citado, porém tem a capacidade de hidrolisar o polímero, a partir das suas extremidades. As celobiohidrolases (CBH) estão entre as enzimas mais eficientes como agentes celulíticos e possuem como nome sistemático 1,4-βD-glicana celobiohidrolase. Elas desempenham um papel essencial nos processos de decomposição, podendo ser dividida em dois tipos: celobiohidrolase do tipo I (EC 3.2.1.176), CBH I, que tem a função de hidrolisar terminais redutores, enquanto que a do tipo II (EC 3.2.1.4 ), CBH II hidrolisa terminais não redutores. O produto da hidrólise dessas enzimas é a celobiose (dímero de glicose) (BOMMARIUS et al., 2008; DEN HAAN et al., 2007; SØRENSEN et al., 2015). No grupo de exoglicosidases também estão incluídas as exoglicohidrolases (EC 3.2.1.74) que possuem como nome sistemático 1,4-β-D-glicana glicobiohidrolase (GH). Apesar de ser pouco reportada, a hidrólise promovida pela GH na degradação da fibra celulósica é de extrema importância, pois libera glicose diretamente do polímero. Assim como as celobiohidrolases, as exoglocohidrolases sofrem inibição pelo seu produto de hidrólise (celobiose ou glicose) (BHALLA et al., 2013; BOMMARIUS et al., 2008). A CBH além de catalisar a hidrólise primária dos terminais não-redutores da fibra celulósica e oligossacarídeos produzindo celobiose, também tem a capacidade de atacar os terminais redutores. Durante sua atuação, a CBH provoca um fenômeno ainda não elucidado completamente conhecido como amorfogênese que envolve a ruptura física do substrato, aumentando assim as regiões intersticiais. Dessa forma ocorre um aumento nas taxas de hidrólise da celulose, deixando o polímero mais exposto às celulases (CASTRO; PEREIRA, 2010). As β-Glicosidases (EC 3.2.1.21) são produzidas a partir de micro-organismos, plantas e animais, e têm sido propostas em vários estudos recentes para a degradação de βglucanos a fim de produzir glicose. Esse último grande grupo de enzimas do complexo celulítico β-glicosidades (BG) tem a função de hidrolisar a celobiose e os oligossacarídeos convertendo-os em glicose. Assim como a CBH sofre inibição pela celobiose, a BG também é inibida pelo seu produto de hidrólise (NAKAJIMA et al., 2012). O rendimento apresentado pelas enzimas do complexo celulolítico em conjunto é superior aos seus rendimentos individuais, sendo esse efeito conhecido como sinergia (Figura 7). Isso ocorre, por exemplo, quando a endoglucanase, atua nas regiões amorfas da 12 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 fibra e disponibiliza terminais redutores e não redutores para a atuação da CBH (CASTRO; PEREIRA, 2010). Figura 6. Ação sinérgica das enzimas do complexo celulítico. Fonte: (CASTRO; PEREIRA, 2010) A hemicelulose, segunda maior fração da biomassa lignocelulósica é hidrolisada pelas enzimas hemicelulases. Os tipos de hemicelulases, tais como as xilanases (E.C. 3.2.1.8), mananases (E.C. 3.2.1.78), β-xilosidases (E.C. 3.2.1.37), β-mannosidases (E.C. 3.2.1.25), α-arabinofuranosidases (E.C. 3.2.1.55), α-galactosidases (E.C. 3.2.1.22), acetil xilano esterase (E.C. 3.2.1.72), feruloil esterases (E.C. 3.1.1.73), p-cumaril-esterases (E.C. 3.2.1.73), e α-glicuronidase (E.C. 3.2.1.139) atuam no processo de despolimerização da hemicelulose. Estas enzimas têm a função de hidrolisar e remover os fragmentos hemicelulose que revestem as fibras de celulose, aumentando assim a acessibilidade à celulose e consequentemente estimulando a ação de celulases (FALKOSKI et al., 2012). As hemicelulases são produzidas a partir de micro-organismos e plantas. Esses microorganismos têm a capacidade de produzir vários tipos padrões de hemicelulases eficientes no processo de degradação da lignocelulose. Comercialmente, são obtidas principalmente por fungos geneticamente modificados como Trichoderma ou Aspergillus (OGEDA; PETRI, 2010). Assim como as celulases, as hemicelulases são hidrolases que possuem alta especificidade pelos seus respectivos substratos. Essa característica limita a ação dessas enzimas que necessitam de contato direto com os polissacarídeos que compõem a parede celular da planta (CARVALHO et al., 2009). Os polissacarídeos presentes no material lignocelulósico são degradados por enzimas produzidas principalmente por fungos pertencentes ao gênero Trichoderma, tais como Trichoderma reesei e Trichoderma viride que possuem a capacidade de secretar grandes 13 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 quantidades de enzimas endoglucanases e celobiohidrolases. Porém, são ineficazes para a produção das β-glicosidases, gerando a acumulação de celobiose e diminuindo dessa forma o rendimento na hidrólise da celulose. Outros fungos produtores de celulase também importantes pertencem aos gêneros Penicillium e Aspergillus e possuem a capacidade de secretar grandes quantidades de β-glicosidase (FALKOSKI et al., 2012). Alguns estudos recentes têm relatado a produção de enzimas para a sacarificação enzimática a partir de isolamento de celulases e hemicelulases, em altas concentrações, de fungos fitopatogênicos. Estes micro-organismos produzem hidrolases e tem a capacidade de invasão rápida para a degradação da parede celular vegetal (MAITAN-ALFENAS; VISSER; GUIMARÃES, 2015). A produção de enzimas no local da hidrólise também tende a diminuir os custos deste procedimento, além da possibilidade de produção de um material mais completo, em comparação com um extrato comercial purificado. Dessa forma, a alteração genética da enzima produzida pode tornar-se necessária para aumento da eficiência de produção. Técnicas que incluem a mistura de extratos de enzima são alternativas que produzem enzimas mais completas, capazes de degradar a hemicelulose facilitando a hidrólise da celulose (VISSER et al., 2013). Técnicas como fermentação em estado sólido (FES) têm sido consideradas um promissor e econômico processo para a obtenção de enzimas a serem utilizadas na produção de etanol celulósico. Porém, apesar de apresentarem várias vantagens para maior produção de celulase, possuem a necessidade de grande espaço para a produção e após a fermentação, menores quantidades de enzima são extraídas, tornando sua purificação mais difícil. Industrialmente, a fermentação submersa (SMF) tem sido a técnica mais eficaz para a produção de importantes enzimas como a celulase. Essa técnica possui várias vantagens, como maior controle de fatores importantes (temperatura, pH), exige menor espaço, produz maior quantidade de enzima extraída após a fermentação, tornando sua purificação mais fácil (LEE et al., 2013; SHARMA; SHARMA; KUILA, 2016). 5. Sacarificação enzimática da biomassa lignocelulósica O processo de sacarificação enzimática consiste na hidrólise da celulose e hemicelulose, que posteriormente tem seus produtos fermentados para a produção de etanol. O método de sacarificação possui rendimento teórico mais elevado em relação a outros métodos, como por exemplo, a hidrólise promovida por ácidos concentrados. Porém, o alto custo das enzimas tem sido uma barreira para a produção de etanol celulósico em grande escala (TANEDA et al., 2012). 14 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 Os processos de hidrólise enzimática e a fermentação podem ocorrer em separado (SHF) ou simultaneamente (SSF), dependendo da técnica a ser utilizada. A escolha do procedimento é determinada pelo equilíbrio das vantagens e desvantagens associado à enzima e à levedura utilizada nos processos de hidrólise e fermentação que dependem diretamente da natureza do substrato (WANG et al., 2013). Em SHF as condições de sacarificação e fermentação podem ser otimizadas independentemente umas das outras, bem como suas temperaturas, que podem variar de acordo com a temperatura ótima das enzimas e das leveduras. Porém, é um processo limitado devido aos produtos inibitórios gerados durante a hidrólise de açúcar provenientes da atuação de algumas enzimas (SANTOS et al., 2012; TREEBUPACHATSAKUL et al., 2015). Quando realizadas simultaneamente, sacarificação e fermentação, a glicose formada é rapidamente consumida pela levedura para a produção de etanol, evitando assim a inibição enzimática e convertendo maior quantidade de celulose. Este processo requer uma condição intermediária de temperatura para as enzimas e para a levedura adicionada. A temperatura ótima para sacarificação varia de acordo com a natureza das enzimas que, geralmente, é acima de 40 °C e, para a fermentação, em torno de 30 °C, mantendo-se o sistema sob agitação (SANTOS et al., 2012; TREEBUPACHATSAKUL et al., 2015; WANG et al., 2013). A figura 7 demonstra a ação sinérgica de celulases e hemicelulases promovendo a hidrólise de celuloses e xiloses respectivamente, pelo processo de sacarificação realizado juntamente com a fermentação, utilizando uma estirpe de S. cerevisiae geneticamente modificada para a conversão das pentoses e hexoses em etanol (HASUNUMA; KONDO, 2012). 15 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 Figura 7. Mecanismo de produção do etanol a partir de celulose e xilana utilizando uma estirpe de S. cerevisiae recombinante apresentando enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas tais como endoglucanase (EG), celobiohidrolase (CBH), β-glucosidase (BGL), xilanase e xilosidase na superfície celular e expressando enzimas assimilantes de xilose tais como xilose redutase (XR), xilitol Desidrogenase (XDH) e xilulocinase (XK) na célula. Xilulose-5P, xilulose-5-fosfato (HASUNUMA; KONDO, 2012). Apesar da dificuldade no processo de agitação aplicado em sólidos, em SSF isso se torna menos pronunciado devido à hidrólise gradual de fibras adicionadas. A fermentação em lotes é uma vantagem adicional desse método, uma vez que o nível de glicose minimizado durante a co-fermentação de xilose e glicose, o que pode promover a absorção de xilose (SAHA et al., 2011). Naturalmente, várias enzimas hidrolíticas produzidas por micro-organismos atuam em sinergia no processo de degradação da biomassa lignocelulósica. Os fungos e as bactérias possuem a capacidade de degradar celulose, hemicelulose e lignina por meio de complexo enzimático contendo enzimas hidrolíticas e oxidativas. Enzimas bacterianas são mais estáveis que as produzidas por fungos e são conhecidas por atuar sob condições alcalinas (ADSUL et al., 2011). Como as enzimas agem em sinergia para a hidrólise de seu substrato, a mistura de extratos enzimáticos de diferentes fontes tem sido aplicada com grande sucesso. Para uma combinação de extratos enzimáticos uma série de fatores diferentes deve ser estudada, pois a utilização sinérgica de enzimas é extremamente complexa e exige micro-organismos com diversidade no seu arsenal de enzimas e com alta produtividade. Geralmente, a mistura do coquetel enzimático é baseada na combinação de extratos ricos em celulases e em hemicelulases, além do potencial de deslignificação levando em consideração a possível formação de inibidores (VISSER et al., 2013). Em processos industriais é imprescindível determinar as propriedades físico-químicas das celulases e seus fatores cinéticos, para utilizá-las em suas condições de melhor atuação. Análises mais atuais demonstraram maior eficiência das atividades das celulases para as temperaturas entre 40-50 °C em pH 4-5, condições semelhantes para a atuação de xilanases (MAITAN-ALFENAS; VISSER; GUIMARÃES, 2015). O uso de surfactantes em processos de hidrólise enzimática proporciona o aumento da conversão de vários substratos lignocelulósicos. Os aditivos não iônicos são mais eficazes, por se tratarem de substâncias anfifílicas, a parte hidrofóbica em sua estrutura interage diretamente com as ligninas, resultando no aumento de rendimento da hidrólise enzimática, reduzindo assim uma adsorção improdutiva ou dessorção crescente de celulases nas fibras do substrato, o que permite que as enzimas realizem outra catálise em outro ciclo de reações (MESQUITA; FERRAZ; AGUIAR, 2016). 6. Fermentação 16 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 A produção de etanol a partir de açúcares fermentescíveis provenientes da biomassa lignocelulósica é um processo tão complexo quanto a natureza química da biomassa. A grande diversidade de açúcares exige um micro-organismo fermentador com capacidade de fermentar açúcares distintos como hexoses e pentoses. A capacidade de fermentar ambos açúcares, em geral, é atingida após a modificação genética das leveduras. Como características primordiais, esses micro-organismos devem ser tolerantes a inibidores, variações de temperaturas e pH’s (HU; WANG; YU, 2004). As hexoses (glicose, galactose e manose) são facilmente fermentadas para a produção de etanol, enquanto que as pentoses (xilose e arabinose) necessitam de algumas estirpes nativas para a fermentação e ainda assim baixos rendimentos são obtidos. Microorganismos de fermentação de xilose possuem produção comercial limitada devido a sua sensibilidade aos inibidores e baixa tolerância ao etanol. No entanto, a conversão de pentoses presentes na biomassa lignocelulósica é economicamente viável na produção de etanol, logo para a fermentação destes e também de hexoses, estirpes gênicas de bactérias e leveduras tem sido combinadas para melhor rendimento (LIISA et al., 2013; MAITANALFENAS; VISSER; GUIMARÃES, 2015). Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado em condições de anaerobiose para a conversão de glicose em etanol e CO2, se destacando pela sua resistência inerente ao baixo pH em temperaturas próximas de 30-35 °C e quando modificada, a vários inibidores como ácido acético, ácido furfurílico e ácido fórmico (CARDONA; QUINTERO; PAZ, 2010; MAITAN-ALFENAS; VISSER; GUIMARÃES, 2015). Também são utilizados no processo de fermentação os micro-organismos Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Kluyveromyces marxianus, Pichia stipitis, Candida brassicae entre outros. Porém, esses micro-organismos, incluindo S. cerevisiae não são eficientes na fermentação de pentoses. (SANTOS et al. 2010; LYND et al., 2005). Para a redução de custos são testados diferentes métodos a fim de tornar a produção de etanol economicamente favorável. A integração de processos como produção de enzimas, sacarificação enzimática e fermentação, tem sido uma recorrente alternativa que concilia a redução de gastos com o aumento dos rendimentos. No entanto, os microorganismos utilizados nesses processos possuem condições ótimas de operação tipicamente diferentes, o que torna essa alternativa atraente, mas também bastante complexa. (MAITAN-ALFENAS; VISSER; GUIMARÃES, 2015). 7. Considerações Finais A produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica é uma estratégia que tem como principal objetivo a redução dos impactos ambientais por meio do aproveitamento de 17 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ - 2016 resíduos industriais. A eficiência na conversão de biomassa lignocelulósica para a produção de etanol depende da capacidade do micro-organismo utilizado nos processos de sacarificação e fermentação e da quantidade de celulose e hemicelulose presentes na biomassa. O custo da produção de etanol de segunda geração ainda é relativamente alto com base nas tecnologias atuais. Para o avanço deste processo, cientistas de vários países têm buscado tecnologias eficazes a fim de torná-lo uma realidade sustentável e mais rentável para aplicações industriais. Devido à complexidade estrutural da biomassa lignocelulósica o processo de hidrólise enzimática requer diferentes tipos de enzimas para promover sua degradação. Após a atuação sinérgica das enzimas endoglucases e exoglucanases, são geradas as celobioses, que posteriormente serão hidrolisadas pelas β-glicosidases para a formação de glicose. Porém, o rendimento de glicose nesse processo é reduzido, pois conforme a celobiose é gerada, a mesma inibe a atuação das enzimas no coquetel enzimático. Os métodos SHF e SSF, são utilizados a fim de aumentar o rendimento de glicose e de reduzir a ação de inibidores, possuindo inúmeras vantagens e desvantagens quando comparados. O método SSF é proposto para minimizar a inibição causada pela celobiose, pois a fermentação ocorre simultaneamente com a sacarificação. Uma das maiores dificuldades de produção do etanol de segunda geração tem sido o elevado custo das enzimas utilizadas nos processos de sacarificação e a complexidade do processo de hidrólise. Dessa forma, a busca por enzimas mais eficientes e com menor custo de produção é um caminho que tem sido seguido por acadêmicos e por empresas de forma a tornar o etanol 2G um produto completamente viável e estabelecido no mercado a preços competitivos. 8. Referências Bibliográficas ADSUL, M. G. et al. Development of biocatalysts for production of commodity chemicals from lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, v. 102, n. 6, p. 4304–4312, 2011. ALVIRA, P. et al. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, v. 101, n. 13, p. 4851– 4861, 2010. BANERJEE, D. et al. Enhanced saccharification efficiency of lignocellulosic biomass of mustard stalk and straw by salt pretreatment. Industrial Crops and Products, v. 80, p. 42– 49, 2016. BEHERA, S. et al. Importance of chemical pretreatment for bioconversion of lignocellulosic biomass. 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