Histopathological and Immunohistochemical Aspects of Rabies in

Acta Scientiae Veterinariae, 2014. 42(Suppl 1): 67.
CASE REPORT
Pub. 67
ISSN 1679-9216
Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos
da raiva em raposas Cerdocyon thous
Histopathological and Immunohistochemical Aspects of Rabies in foxes Cerdocyon thous
Jeann Leal de Araújo1, Antônio Flavio Medeiros Dantas1, Glauco José Nogueira de Galiza2,
Pedro Miguel Ocampos Pedroso3, Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva1,
Luciano da Anunciação Pimentel4 & Franklin Riet-Correa1
ABSTRACT
Background: Several wild canids are considered reservoirs of rabies virus in the Northeast of Brazil, two wild canids
have been reported as reservoirs of rabies virus Cerdocyon thous (crab-eating fox) and Pseudalopex vetulus (hoary fox)
(previously called Dusicyon vetulus). The diagnosis of rabies in foxes is usually performed through fluorescent antibody
test (FAT) and mouse inoculation test (MIT). However, until the moment, there are no detailed histopathological and immunohistochemical (IHC) description studies in foxes affected by this disease studies. Therefore, the aim of this work
was the characterization of pathological and IHC findings of foxes with rabies sent to the Laboratory of Animal Pathology
(LPA) of the Federal University of Campina Grande (UFCG) in Patos, semiarid region of Paraiba, Brazil.
Case: Two foxes were sent to the LPA, phenotypic species identification through analysis of morphological aspects was
performed and posteriorly necropsied. Fragments of organs of the thoracic and abdominal cavities, salivary glands, eye and
Gasser ganglia were collected in addition to the central nervous system (CNS) that was collected integer and fixed at 10%
buffered formalin. Later, serial sections of the 16 fragments of the CNS were performed, measuring about 0.5 cm thick
and cleaved. Fragments of cerebrum, cerebellum, brainstem, spinal cord and salivary glands were sent to performing FAT
and MIT. Paraffin blocks with fragments of the hippocampus were selected and submitted to IHC. Macroscopically, the
two foxes had multiple skin lacerations, bone fractures and ruptures of abdominal organs from injuries. The vessels of the
meninges were slightly congested. Histologically, the CNS had diffuse non-suppurative encephalitis, with inflammatory
infiltrate composed primarily by lymphocytes and plasma cells, forming mononuclear perivascular cuffing, and gliosis
associated with mild eosinophilic intracytoplasmic inclusion corpuscles primarily in neurons of the cortex, basal ganglia,
hippocampus, thalamus, colliculi, bridge, obex and cerebellum. Meningitis and mild myelitis non-suppurative were also
observed in both cases with rare viral inclusions in spinal cord neurons. Similar inflammation was also observed in the
Gasser ganglion and in others peripheral nerve ganglia. Adrenal and salivary glands showed multifocal areas of moderate
mononuclear inflammatory infiltrate composed mainly by macrophages and plasma cells. Strong positive IHC labeling
was observed for rabies in the neurons in different brain regions, especially in the cerebral cortex and in Purkinje cells
of the cerebellum. In both cases the diagnosis of rabies was confirmed by immunofluorescence and mouse inoculation.
Discussion: The diagnosis of rabies in foxes was conducted through the characteristic histopathologic findings of the
disease observed in the CNS and confirmed by the FAT, MIT and IHC. Although the histopathological findings in foxes
are similar to what is observed in other species, the severity of inflammatory lesions and the large amount of inclusion
bodies in the nervous tissue is an outstanding feature, regardless of the inflammatory response. The diagnosis of rabies
in foxes can be achieved by characteristic histopathologic findings of the CNS, supported by evaluating peripheral nerve
ganglia, salivary glands and adrenal which may also present similar microscopic lesions. Auxiliary Laboratory tests must
be performed, such as FAT, MIT and IHC for confirmation of the disease.
Keywords: wild animals, canids, Lyssavirus.
Descritores: animais selvagens, canídeos, Lyssavirus.
Received: 3 June 2014
Accepted: 16 August 2014
Published: 28 December 2014
Hospital Veterinário, Laboratório de Patologia Animal, CSTR, UFCG, Campus de Patos, PB, Brazil. 2Laboratório de Patologia Veterinária, Departamento
de Patologia, CCS, UFSM, Santa Maria, RS, Brazil. 3Laboratório de Patologia Veterinária, CCA, UFRB, Cruz das Almas, BA, Brazil. 4Universidade de
Cuiabá, Cuiabá, MT, Brazil. CORRESPONDENCE: A.F.M. Dantas [[email protected] - Tel.: +55 (83) 9929-8064]. Hospital Veterinário, Laboratório
de Patologia Animal, CSTR, UFCG, Campus de Patos. Avenida Universitária S/N, Santa Cecilia. CEP 58708-110 Patos, PB, Brazil.
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J.L. Araújo, A.F.M. Dantas, G.J.N. Galiza, et al. 2014. Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos da raiva em raposas
Cerdocyon thous.
Acta Scientiae Veterinariae. 42(Suppl 1): 67.
INTRODUÇÃO
0,5 cm de espessura e clivados 16 fragmentos do SNC
identificados: 1) córtex frontal, 2) córtex parietal, 3)
córtex temporal, 4) córtex occipital, 5) núcleos da base,
6) hipocampo, 7) tálamo, 8) colículo rostral, 9) colículo caudal, 10) pedúnculos cerebelar, 11) ponte, 12)
óbex, 13) cerebelo, 14) medula cervical, 15) medula
torácica e 16) medula lombar. Para a confecção das
lâminas histológicas, os fragmentos clivados foram
processados rotineiramente e coradas pela técnica de
hematoxilina e eosina (HE).
Seguindo protocolos estabelecidos previamente [5,8] foram realizadas as técnicas de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em
camundongos (ICC), respectivamente, em fragmentos
do cérebro, cerebelo, tronco encefálico, medula espinhal e glândulas salivares das raposas foram enviados
para a execução dessas técnicas.
Blocos de parafina com fragmentos do hipocampo foram selecionados e submetidos à técnica de
imuno-histoquímica para a detecção do vírus da raiva.
Após desparafinizanação e reidratação dos tecidos,
foi realizada recuperação antigênica com solução de
citrato (pH 6,0) em forno micro-ondas, em potência
máxima, por dez min. O anticorpo primário utilizado
era policlonal para raiva produzido em cabras marcado
com FITC (anticorpo conjugado de isotiocianato de
fluorescência - Chemicon #5199)1, diluído 1:1000 em
solução tamponada fosfato salina (PBST) com Tween®
20 (Sigma P2287)2, e incubado por 60 min a 37Cº.
O anticorpo secundário biotilinilado e o complexo
estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB+System
HRP)3 foram utilizados consecutivamente, incubados
à temperatura ambiente por 30 min e marcados através
da adição do DAB + Substrate - Choromogen System3
e contra corados com hematoxilina de Harris. Como
controle positivo foi utilizado secções histológicas de
casos confirmados de raiva em bovinos. Como controle
negativo, as mesmas secções foram utilizadas, com
substituição do anticorpo primário por PBST.
Esses casos ocorreram em anos distintos, sendo
o primeiro em maio de 2010 e o segundo em abril de
2013. As duas raposas enviadas foram identificadas
como pertencentes à espécie Cerdocyon thous. Segundo informações obtidas dos moradores da zona rural
do Município de São José de Espinharas - PB, local
onde os animais foram encontrados, as raposas foram
atropeladas após terem sido vistas com sinais nervosos
caracterizados por incoordenação, perda de equilíbrio,
Vários canídeos silvestres são considerados
reservatórios do vírus rábico, a exemplo da raposa
vermelha (Vulpes vulpes), distribuída mundialmente
na Europa, América do Norte, norte da África e na
Austrália [4].
No Brasil, o ciclo silvestre terrestre da raiva
é representado principalmente por saguis (Callithrix
jacchus) ou raposas (Cerdocyon thous). Na região Nordeste, dois canídeos silvestres já foram relatados como
reservatórios do vírus rábico: C. thous (crab-eating fox,
cachorro-do-mato) e Pseudalopex vetulus (hoary fox,
raposa cinzenta) (previamente denominada Dusicyon
vetulus) [3,6]. Existem relatos de casos de raposas com
raiva e transmissão para humanos nos estados do Ceará,
Paraíba, Pernambuco, Bahia e Minas Gerais [1,2] e dos
329 casos de raiva notificados no período de 2002 a
2009, cerca de 88% eram de canídeos silvestres, todos
ocorridos na região Nordeste, onde muitos desses eram
mantidos como animais de estimação. Segundo dados
da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS/MS) [13],
no Brasil, os canídeos silvestres foram responsáveis por
7,9% dos 165 óbitos de humanos com raiva, no período
de 1986-2006. No Estado da Paraíba entre os anos de
2007 e 2010, foram notificados sete casos de raiva em
cães e gatos, e cinco casos em canídeos silvestres [13].
Até o momento, não existem estudos detalhados de descrição histopatológica e imuno-histoquímica
em raposas acometidas por essa doença, portanto, o
objetivo do presente trabalho é a caracterização dos
achados patológicos e imuno-histoquímicos de raposas
com raiva encaminhadas ao Laboratório de Patologia
Animal (LPA) da Universidade Federal de Campina
Grande (UFCG) em Patos, semiárido da Paraíba,
Brasil.
CASOS
As raposas utilizadas foram encaminhas mortas
para o LPA da UFCG, realizada a identificação fenotípica da espécie através da análise de aspectos morfológicos do animal com base no Guia de Identificação de
Canídeos Brasileiros [10] e posteriormente necropsiadas. Foram coletados fragmentos de órgãos das cavidades torácica e abdominal, glândulas salivares, globo
ocular e gânglio de Gasser, além do sistema nervoso
central (SNC) que foi coletado e fixado em formol
tamponado a 10%. Posteriormente foram realizados
cortes seriados do encéfalo, medindo aproximadamente
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acentuado balançar compulsivo da cabeça e aparente
debilidade muscular.
Macroscopicamente as duas raposas apresentavam múltiplas lacerações cutâneas, fraturas ósseas
e rupturas de órgãos abdominais provenientes de
traumatismos. Os vasos das leptomeninges estavam
levemente congestos.
Histologicamente verificou-se reação inflamatória mononuclear, principalmente no SNC, variando
no grau de intensidade e sua localização (Tabela 1).
Havia encefalite não supurativa, caracterizada pela
presença de infiltrado inflamatório constituído principalmente por linfócitos e plasmócitos, formando
manguitos perivasculares (Figura 1A), associada a
discreta gliose e corpúsculos de inclusões eosinofílicos
intracitoplasmáticos principalmente em neurônios dos
córtices, núcleos da base, hipocampo (Figura 1B), tálamo, colículos, ponte, óbex e cerebelo. Meningomielite
linfoplasmocitária discreta com raras inclusões virais
em neurônios da medula espinhal também foram observadas nos dois casos.
Inflamação semelhante também foi observada
nos gânglios nervosos periféricos, glândulas salivares
e adrenais dos dois casos. Havia infiltrado inflamatório
principalmente de linfócitos e plasmócitos entre os
feixes nervosos do gânglio de Gasser, caracterizando
ganglioneurite não supurativa (Figura 1C), associada
a raras inclusões virais intracitoplasmáticas em neurônios. Ganglioneurite não supurativa também foi
observada no gânglio ciliar do primeiro caso. Infiltrado
linfoplasmocitário também foi encontrado nas glândulas salivares (Figura 1D) e nas adrenais dos dois casos,
característicos de adenite e adrenalite não supurativa.
Corpúsculos de inclusões raramente foram verificados
em agregados de neurônios distribuídos perifericamente a essas estruturas glandulares.
No exame de IFD e na ICC o resultado foi positivo em todos os fragmentos testados para o vírus da raiva.
Pela imuno-histoquímica os dois casos marcaram fortemente com anticorpos para o vírus rábico,
demonstrando múltiplos agregados de grânulos distribuídos no pericário, como também na forma de corpúsculos grandes, únicos ou múltiplos no citoplasma de
neurônios do córtex (Figura 2A) e ponte (Figura 2B).
No controle negativo não foram observadas nenhum
tipo de imunomarcação (Figura 2C).
Tabela 1. Distribuição das lesões no SNC de raposas (Cerdocyon thous) com raiva de acordo com a intensidade da resposta inflamatória e presença
de corpúsculos de Negri.
CORTE
REGIÃO DO SNC
MENINGITE
A1*/A2**
MANGUITOS
A1*/A2**
INCLUSÕES
A1*/A2**
1
Córtex Frontal
+/+
+/+
+++/++
2
Córtex Parietal
+/+
+/-
++/+
3
Córtex Temporal
+/+
++/+
+++/+++
4
Córtex Occipital
+/+
+/-
+/+
5
Núcleos da base
+/-
+/-
+++/++
6
Hipocampo
+/-
++/-
+++/+++
7
Tálamo
+/+
++/+
+++/+
8
Colículo rostral
+/-
++/+
+/+
9
Colículo caudal
+/-
+/+
+/+++
10
Ponte
+/-
++/+
+/+
11
Quarto Ventrículo
-/-
+/+
++/+
12
Óbex
+/-
+/+
+/+
13
Cerebelo
++/-
+/-
++/-
14
Medula cervical
-/-
+/-
-/-
15
Medula torácica
-/-
+/-
-/+
16
Medula lombar
-/-
++/-
+/+
*Animal 1. **Animal 2. -: Sem lesão. +: Lesão discreta. ++: Lesão moderada. +++: acentuada.
3
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Figura 1. Lesões histológicas de raposas (Cerdocyon thous) com raiva. (A) Córtex occipital mostrando manguitos
mononucleares perivasculares e corpúsculos de Negri (seta) [HE, 10x]. (B) Hipocampo com múltiplos corpúsculos de
Negri (setas) [HE, 20x]. (C) Gânglio trigêmeo com infiltrado inflamatório mononuclear [HE, 20x]. (D) Glândula salivar
com inflamação não supurativa [HE, 20x].
Figura 2. Seções do encéfalo de raposas (Cerdocyon thous) com raiva, submetidas à técnica de imuno-histoquímica. (A)
Córtex e (B) Tronco encefálico (ponte) mostrando múltiplos agregados de grânulos amarronzados distribuídos no pericário
e prolongamentos citoplasmáticos de neurônios, caracterizando imunomarcação positiva para raiva. (C) Córtex. Controle
negativo (sem anticorpo). Técnica de imuno-histoquímica método da estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB+System
HRP) contracorados com Hematoxilina de Harris [Barra = 20 µm].
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Propõe-se que a ocorrência de raiva em herbívoros nos Estados da Paraíba e Pernambuco é causada
principalmente por uma variante do vírus chamada de
RABV, relacionada a morcegos hematófagos e que
ela está circulante nessa área do Nordeste por pelo
menos sete anos, isolada por barreiras geográficas [9].
Sugere-se ainda, a presença de duas ramificações de
Lyssavirus na região da Paraíba, sendo uma associada
com quirópteros e outra com carnívoros. Entretanto,
existe uma variabilidade genética nessas ramificações,
subdividindo o grupo de quirópteros em “morcegos
insetívoros” e “morcegos hematófagos”, e o grupo
dos carnívoros em “cão”, “raposa 1” e “raposa 2” (está
mais próxima do grupo “cão”) [7]. Essa existência de
variabilidade entre as ramificações das variantes do
vírus rábico sugere que pelo menos dois grupos de
vírus coexistem na mesma região e apesar de somente a
variante de morcegos hematófagos ter sido incriminada
como causadora da raiva em herbívoros, a criação de
animais silvestres como animais de estimação no Nordeste favorece o risco de transmissão da doença para os
animais de produção, sugerindo um papel importante
das raposas nesse cenário. A presença da variabilidade genética das variantes de raposas, sugerem que
estes animais tem um papel muito mais importante na
manutenção e disseminação da raiva no Brasil do que
antes se pensava, tendo uma implicação de saúde pública significante já que nessa região o monitoramento
desses animais é muitas vezes ineficiente ou ausente,
e a prática da vacinação de animais silvestres não tem
sido empregada no país [2].
O diagnóstico da raiva em raposas pode ser
realizado pelos achados histopatológicos característicos do SNC, auxiliado pela avaliação dos gânglios
nervosos periféricos, glândulas salivares e adrenais
que também podem apresentar lesões microscópicas
semelhantes. Em adição os exames laboratoriais auxiliares devem ser realizados, como IFD, ICC e IHQ
para a confirmação da doença.
DISCUSSÃO
O diagnóstico da raiva em raposas foi realizado
através dos achados histopatológicos característicos da
doença, observados no SNC e confirmados pela IFD,
ICC e IHQ.
Apesar dos achados histopatológicos encontrados nas raposas serem semelhantes ao que são observados em outras espécies [14], a severidade das lesões
inflamatórias e a grande quantidade de corpúsculos
de inclusão no tecido nervoso é uma característica
marcante, independente da resposta inflamatória. A
inflamação não supurativa e a presença de inclusões
observadas nos gânglios nervosos periféricos encontrados ao redor ou dentro do tecido das glândulas salivares
e das adrenais, semelhantemente a reação inflamatória
observada no SNC, podem auxiliar no diagnóstico
dessa patologia, principalmente nos casos em que
não são observadas inclusões no SNC. As glândulas
salivares também tem sido um importante órgão para a
realização do isolamento viral do Lyssavirus, já tendo
sido encontrada positividade para raiva em glândulas
salivares avaliadas por outros autores [11].
Diferentemente dos herbívoros, onde geralmente as principais lesões são cerebelares, os carnívoros tendem a apresentar lesões mais intensas na
região de hipocampo, entretanto, de forma semelhante
aos bovinos, pode haver áreas com pouca ou ausente
reação inflamatória [14]. Um aspecto importante da
análise histopatológica é a realização de cortes seriados
do sistema nervoso central, uma vez que a localização
e intensidade das lesões podem variar entre as regiões
do SNC, não havendo uma uniformidade.
A forte marcação nos neurônios do hipocampo
no presente trabalho através da imuno-histoquímica,
difere dos achados de Stein et al. [12] que encontraram
uma marcação moderada no hipocampo de raposas da
espécie Urocyon cinereoargenteus e Vulpes vulpes.
Apesar das implicações legais, muitas pessoas
tem o hábito de criar raposas e outros animais silvestres
no Nordeste brasileiro. Essa tradição aumenta significativamente o risco de transmissão da raiva para humanos e outros animais. No ano de 2012, duas pessoas
morreram no Nordeste vítimas de raiva transmitidas
por animais silvestres [13]. No Estado da Paraíba, a
raposa tem sido o animal silvestre com maior número
de agressões contra humanos, havendo no período
de 2000 a 2003, cerca de 24 casos de agressões em
humanos por raposas [7].
MANUFACTURERS
Chemicon International Inc. Temecula, CA, USA.
1
Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA.
2
Dako Cytomation. Carpinteria, CA, USA.
3
Declaration of interest. The authors report no conflicts of
interest. The authors alone are responsible for the content and
writing of the paper.
5
J.L. Araújo, A.F.M. Dantas, G.J.N. Galiza, et al. 2014. Aspectos histopatológicos e imuno-histoquímicos da raiva em raposas
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