Profa. Dra. Luciana Leomil Histórico 1857: Virologia teve origem na Idade Ouro da Microbologia. 1883: Adolf Mayer: descrever uma doença q poderia ser transferida entre plantas, como bactérias 1892: Dimitri Ivanovski: descrição do vírus do mosaico do fumo 1898: Martinus Beijerinck: denominou o agente do mosaico de fluído vivo contagioso ou vírus Histórico 1915/1917: Frederick Twort (Ing.) e Félix D’Herelle (Fr) observaram a ação de vírus bacteriófagos em culturas bacterianas 1935: Wendell Stanley: cristalização dos vírus pela Microscopia Eletrônica 1980: advento da Biologia Molecular Vírus Emergentes: HIV (1983) EHF (Ebola Haemorrhagic Feber - 1989) Hantavírus nos EUA (1993) EHF Zaire (1995) Definição e Propriedades Agentes filtráveis São parasitas intracelulares obrigatórios Não podem produzir energia ou proteínas independentemente da célula hospedeira Genomas virais podem ser DNA ou RNA, mas nunca os dois Morfologia de capsídeo descoberto ou de envelope Componentes virais são montados, e não se replicam por divisão Conseqüências Propriedades Não são vivos Devem ser infecciosos p/ perdurarem na natureza Devem ser capazes de usar os processos da célula do hospedeiro p/ produzirem seus componentes (RNA mensageiro viral, prot. e cópias idênticas do genoma) Devem codificar qq processo necessário não provido pela célula Definição e Propriedades Hospedeiros: animais, vegetais, fungos e bactérias Dimensões: variam de 18 nm a 300 nm Formas: arredondada ou icosaédrica. ex.: vírus da poliomielite, rotavírus, adenovírus paralelepípedo. ex.: vírus da vaccínia, vírus da varíola projétil. ex.: vírus da raiva helicoidal. ex.: vírus do sarampo, vírus da gripe Inativação Vírus Inativação por agentes físicos e químicos Calor Radiação Detergentes Compostos clorados Fenólicos Drogas anti-virais Cultura Celular Culturas primárias Derivadas diretamente dos tecidos Cultura de célula diplóides (as céls c/ mm nº cromossomas) Vantagens: Geral/e + sensível q as d+ p/ cultivo vírus Pode ser utilizada p/ produção de vacinas Desvantagens: Maior dificuldade de obtenção; alto custo; possibilidade de contaminação por vírus latente; qdo subcultivadas, degeneram e morrem após a 2º e 3º passagem Cultura Celular Linhagens celulares Subcultivos Seleção de clones Multiplicar ∞ (+ 50) Utilização das culturas celulares: Visualização do efeito citopático e Reação de Neutralização. Animais de laboratório Ovo embrionado de galinha (7 a 13 dias) Efeitos Citopáticos São efeitos celulares morfológicos característicos, decorrentes da proliferação viral na cél hosp: Corpos de inclusão; Céls gigantes virais, c/ diversos mecanismos de formação; Desdiferenciação ou alterações de modulação celular. Efeitos Citopáticos Efeito citopático numa cultura de células Vero, causada pelo vírus corona associado à SRA, 24 horas após inoculação (Fonte: Institute for Medical Virology; Director: H.W. Doerr) Efeitos Citopáticos Efeito citopático numa cultura de células MDCK, causada pelo vírus H5N1, 72 horas após inoculação. A) controle; B) cél infectada; C) cél protegida pelo anti-H5N1 Lu et al. Respiratory Research 2006 7:43 Efeitos Citopáticos Efeito citopático numa cultura de células, causada pelo vírus HIV após inoculação. Formação de céls gigantes Princen et al. Retrovirology 2004 1:2 Efeitos Citopáticos Efeito citopático numa cultura de células de rins de macaco Rhesus, causada pelo vírus monkeypox (mesmo Grupo da varíola) Classificação Sistema de classificação dos vírus e uma taxonomia uniforme, Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV). O sistema usa as seguintes denominações: Ordem (com sufixo -virales); Família (sufixo -viridae); Subfamília (sufixo -virinae) Gênero (sufixo -virus) Espécie (tobacco mosaic virus) Classificação Estrutura: tamanho, morfologia e ácido nucléico picornavírus, togavírus, retrovírus Características bioquímicas: estrutura e modo de replicação Doença: vírus da encefalite ou hepatite Meios de transmissão: arbovírus (insetos) Cél. Hospedeira: animal, planta ou bactéria Tecido ou órgão (tropismo): adenovírus e enterovírus Tipos de Vírus: Tamanho / Forma Fig. 1 Estrutura Básica Vírion = partícula viral completa e infecciosa (fora da célula hospedeira) Envelope Capsídeo Nucleocapsídeo Ácido Nucléico Matriz Protéica Fig. 2 Estrutura Básica Fig. 3 Vírus Icosaédricos Fig. 4 Vírus Helicoidais Fig. 5 Vírus Complexos Bainha *Cauda Pino Fibras da Cauda Placa Basal Estrutura Básica Capsídeo Proteínas codificadas pelo genoma viral (protômeros); Proteção e rigidez; Simetria: Fig. 7 Icosaédrica Helicoidal Complexa Estrutura Básica Capsídeo Simetria – Microscopia Eletrônica Fig. 8 Icosaédrica Helicoidal Complexa Estrutura Básica Fig. 9 Estrutura Básica Envelope Derivado das membranas celulares; Glicoproteínas codificadas pelos vírus. Ácido Nucléico DNA ou RNA DNA dsDNA ssDNA RNA dsRNA ssRNA ssRNA (+) ssRNA (- ) Fig. 10 Fig. 11 Etapas da infecção viral 1) Adsorção: interação vírus-receptor da cél hosp. 2) Penetração: direta (injeção do material genético); Fusão com a membrana; Endocitose. 3) Desnudamento: remoção do capsídeo viral. 4) Síntese: replicação do genoma e síntese protéica. 5) Maturação: montagem das partículas virais. 6) Liberação: envelopados (brotamento) e nu (lise da célula). Etapas da infecção viral Penetração vírus nu Fig. 12 Fig. 13 Vírus nu a qual está adsorvido na cél hospedeira. Para ocorrer a adsorção, as prots da superfície viral (ligantes) se ligam a receptores da superfície da cél hospedeira. Em vírus nu, não há membranas envolvendo o capsídeo. A membrana da cél engolfa a partícula viral. Essa é envolvida pela vesícula da membrana da célula para dentro citoplasma. Após penetração, a membrana que envolve o capsídeo será removida e para continuar a replicação viral. Etapas da infecção viral Penetração vírus envelopado Fig. 14 Fig. 15 Vírus envelopado infectando uma cél. hospedeira (adsorção e penetração). O vírus envelopado tem ligantes no envelope (bicamada lipídica). Os ligantes são específicos ao receptor da cél. hospedeira (glicoproteína). Etapas da infecção viral Penetração vírus envelopado: Endocitose Fig. 16 Fig. 17 Adsorção do vírus nu a cél hospedeira, bem como, uma cél sem a propriedade receptora q evita a infecção. Os ligantes são específicos p/ receptores às cels hospedeiras, e a interação ligante-receptor é extremamente responsável pelo tipo de hospedeiro (ex. homem x cão) e tipo de célula (ex. fígado x epitelio). Brotamento Fig. 18 Liberação de um vírus envelopado por brotamento Fig. 19 Ciclo de vida de vírus envelopado Fase 1: adsorção Ciclo de vida de vírus envelopado Fusão e desnudação na membrana plasmática Endocitose e desnudação na membrana da vesícula endocítica Fase 2 e 3: penetração e desnudação Ciclo de vida de vírus envelopado Fase 4 e 5: replicação e maturação Ciclo de vida de vírus envelopado Fase 6: Liberação por brotamento ou exocitose Ciclo de vida de vírus envelopado resumo Vírus Complexos Replicação - ciclo lítico Fig. 19 Fig. 20 Bacteriófago T-even (T2, T4 e T6) liberando seu material genético na cél. hospedeira (attaching e penetração - entrada). Os ligantes são específicos às membranas externas das céls hospedeiras. Bacterial cell wall Bacterial chromosome Capsid DNA Capsid Sheath Tail fiber 1 Attachment: Phage attaches to host cell. Base plate Pin Tail Cell wall Plasma membrane 2 Penetration: Phage pnetrates host cell and injects its DNA. Sheath contracted Tail core 3 Merozoites released into bloodsteam from liver may infect new red blood cells Tail DNA 4 Maturation: Viral components are assembled into virions. Capsid 5 Release: Host cell lyses and new virions are released. Fig. 21 Tail fibers Ciclo Lítico X Ciclo Lisogênico Fig. 22 Genomas Virais Pode ser fita simples ou dupla Ácido nucléico pode estar segmentado Genoma pequeno Fig. 11 Genomas Virais Enzimas RNA polimerases (replicases): sintetizam RNA a partir de RNA Lisozimas: perfuram a parede celular bacteriana Proteínas da capa Proteínas do envelope Transcriptase reversa: no caso de retrovírus Alta taxa de mutação é devido a incapacidade da enzima da RNA polimerase corrigir erros de leitura durante a replicação Genomas Virais Viróides Viróides são pequenos ssRNA circulares: 200 400 pb (menores q vírus) Sem capa protéica, capazes de causar doenças em plantas. Acredita-se que replicam através da interação com uma RNA pol celular e causam seus efeitos patogênicos pela interferência com o metabolismo de DNA/RNA e/ou transcrição Príons Várias evidências sugerem que o príon é uma forma modificada de uma proteína celular conhecida como PrPc. Essa proteína é encontrada na superfície dos neurônios ligada por uma âncora do fosfolipídio glicoinositol. Acredita-se que possa funcionar na sinapse; A forma modificada da PrPc é conhecida como PrPsc (sc de scrapie), que é relativamente resistente a proteases e acumula em vesículas no citoplasma de indivíduos doentes. Acredita-se que quando a PrPsc é introduzida em uma célula normal, ocorre a conversão do PrPc em PrPsc. Príons Agentes infecciosos que não possuem um ácido nucléico. Acredita-se que uma proteína é o agente infeccioso. O príon é definido como uma partícula infecciosa pequena, de natureza protéica, que resiste à inativação por procedimentos que inativam ou modificam ácidos nucléicos. Príons Doenças: muitas vezes, denominadas de encefalites espongiformes, devido à aparência do cérebro após a morte, com vários vacúolos (buracos). Scrapie: Ovelhas TME (transmissible mink encephalopathy): mink CWD (chronic wasting disease): muledeer, Alce BSE (vaca louca) encephalopathy): Bovinos (bovine spongiform Príons Sintomas: perda da coordenação motora, demência, paralisia e morte 2º parte Classificação: por Baltimore Vírus são classificados em sete grupos arbitrários: Grupo I: vírus DNA fita dupla Grupo II: vírus DNA fita simples sentido positivo Grupo III: vírus RNA fita dupla Grupo IV: vírus RNA fita simples sentido positivo Grupo V: vírus RNA fita simples sentido negativo Grupo VI: vírus RNA fita simples sentido (+) com uma molécula de DNA intermediária no ciclo de vida Grupo VII: vírus DNA fita dupla como um RNA intermediário Síntese do ácido nucléico viral e das proteínas virais MUITAS ESTRATÉGIAS O ÁCIDO NUCLEICO PODE SER SINTETIZADO NO NÚCLEO OU NO CITOPLASMA DA CÉLULA INFECTADA A SÍNTESE PROTEICA VIRAL É SEMPRE NO CITOPLASMA DA CÉLULA INFECTADA Definições: Proteínas Virais PROTEÍNAS ESTRUTURAIS – TODAS AS PROTEÍNAS DO VÍRUS MADURO PROTEÍNAS NÃO-ESTRUTURAIS – CODIFICADAS PELO VÍRUS E QUE NÃO SÃO EMPACOTADAS NA PARTÍCULA VIRAL MADURA (SÃO REGULATÓRIAS) Virus carregam informação genética para: • ASSEGURAR A REPLICAÇÃO DE SEU PRÓPRIO GENOMA • ASSEGURAR O EMPACOTAMENTO DE SEU GENOMA NO NUCLEOCAPSÍDEO • ALTERAR A ESTRUTURA OU FUNÇÃO DA CÉLULA HOSPEDEIRA I: DNA fita dupla (Adenovirus; Herpesvirus; Poxvirus, etc) • Alguns vírus replicam no núcleo (ex. Adenovirus) usando proteínas celulares. • Os Poxvirus replicam no citoplasma e produzem as suas próprias enzimas para a replicação do ácido nucléico. Estratégias dos vírus DNA de replicação nuclear • mRNAs são necessários para a síntese de proteínas – Utiliza a RNA polimerase dependente de DNA, mais proteínas adicionais da célula hospedeira para a síntese do mRNA viral. • Precisam replicar o seu próprio DNA – Utiliza a DNA polimerase, mais proteínas adicionais do hospedeiro para replicar o DNA viral • ESTA MAQUINARIA ESTÁ NO NÚCLEO CELULAR!! Ciclo lítico dos vírus DNA nucleares • FASE PRECOCE (EARLY) – SÍNTESE DE PROTEÍNAS NECESSÁRIAS PARA A REPLICAÇÃO DO DNA VIRAL – SÍNTESE DE PROTEÍNAS REGULATÓRIAS (EX: DNA E RNA POLIMERASES) – A SÍNTESE DESTAS PROTEÍNAS ALTERA A CÉLULA HOSPEDEIRA • FASE TARDIA (LATE) REPLICAÇÃO DO DNA NOVAS PROTEÍNAS ESTRUTURAIS Proteínas precoces incluem as: • Que são necessárias para a transcrição dos mRNA precoces • São necessárias para a síntese do DNA • Alteram a expressão dos genes do hospedeiro • Interferem com as defesas anti-virais do hospedeiro • Interferem com o ciclo de regulação celular Estratégias dos vírus DNA de replicação citoplasmática • Precisam ter genes para codificar DNA e RNA polimerases citoplasmáticas. • Precisam ter genes para codificar proteínas acessórias para a síntese do RNA e DNA. • Precisam de genomas maiores!!!!! • Ex: família dos poxvírus (100x mais DNA do que os vírus de DNA nucleares como os parvovírus) Transcrição precoce dos vírus DNA de replicação citoplasmática • Citoplasma da célula hospedeira • RNA polimerase viral empacotada no interior do virion • Enzimas para capping, metilação, poliadenilação no virion • (DNA viral nu não é infeccioso) Produtos gênicos muito precoces • Papel no desnudamento viral quando no citoplasma • Uma vez desnudado, os genes precoces estão prontos para a transcrição Produtos gênicos precoces • • • • Desnudamento completo Replicação do DNA Transcrição e modificação do RNA Síntese de pequena parte das proteínas estruturais Replicação do vírus DNA fita dupla (dsDNA) em cél hospedeira. Quando vírus infectam uma cél, eles usam muito a maquinaria da cél hospedeira p/ replicação. Devido a isso, é difícil tratar uma doença viral sem provocar danos ao hospedeiro. Estratégias dos vírus de genoma RNA RNA -> RNA RNA polimerase dependente de RNA RNA -> DNA DNA polimerase dependente de RNA - transcriptase reversa Célula hospedeira DNA -> RNA RNA polimerase dependente de DNA II: DNA fita-simples sentido (+) (Parvovirus) • A replicação ocorre no núcleo, envolvendo a formação de uma fita sentido (-), que por sua vez, serve como molde para a síntese de DNA e RNA sentido (+). Replicação do RNA • RNA polimerase viral (replicase) • Fatores proteicos do hospedeiro envolvidos como acessórios de replicação; • Novas fitas de RNA positivas servem para: – Empacotamento viral – Moldes para replicação – Moldes para mais tradução III: RNA fita-dupla (Reovirus; Birnavirus) • Esses vírus possuem genomas segmentados. Cada parte do genoma é transcrito separadamente para produzir mRNA monocistrônicos (contém informação genética para traduzir somente uma única proteína). IV: RNA fita-simples, sentido (+)(Picornavirus; Togavirus, etc) • mRNA policistrônicos (e.g. Picornavirus; Hepatite A.) O genoma viral é equivalente ao mRNA, ou seja, o RNA viral é infectivo. Não existe polimerase associada com a partícula. A tradução resulta na formação de uma poliproteína, que é subsequentemente clivada para formar proteínas maduras. • Transcrição complexa (e.g. Togavirus). Dois ou mais ciclos de tradução são necessários para produzir RNA genômico Genomas Virais V: RNA fita-simples sentido (-) (Orthomyxovirus, Rhabdovirus, etc) • Necessitam sintetizar o mRNA • Possui RNA polimerase dependente de RNA na partícula viral. • Segmentados (e.g. Orthomyxovirus). O primeiro passo na replicação é a transcrição do RNA - pela RNA polimerase viral produzindo um mRNAs policistrônico, que também serve como molde para a replicação do genoma. • Não-segmentados (e.g. Rhabdovirus). Replicação ocorre como descrito acima e um mRNAs monocistrônico é produzido. VI: RNA fita-simples sentido (+) com uma molécula de DNA intermediária no ciclo de vida (Retrovirus) • O genoma é sentido (+) mas não serve como molde para formação de mRNA e sim para a transcrição reversa. Life Cycle of the Human Immundeficiency Virus VII: DNA fita-dupla como um RNA intermediário (Hepadnavirus) • Esse grupo de vírus também utiliza da transcrição reversa, mas, diferentemente dos retrovírus, isso ocorre dentro da partícula viral durante a maturação. • Não-segmentados (e.g. Rhabdovirus). Replicação ocorre como descrito acima e um mRNA monocistrônico é produzido. Vírus DNA Família Gênero Virion- nu/ envelopado Simetria do capsídeo Ác. nucléico Adenoviridae Adenovirus Nu Icosaédrico Fita dupla Papovaviridae Papillomavirus Nu Icosaédrico Fita dupla circular Parvoviridae Vírus B 19 Nu Icosaédrico Fita simples Herpesviridae Herpes Simplex, Varicella zoster, Cytomegalovirus, Epstein Barr virus Envelopado Icosaédrico Fita dupla Poxviridae Smallpox virus, Vaccinia virus Capa Complexa Complexo Fita dupla Hepadnaviridae Hepatitis B virus Envelopado Icosaédrico Fita dupla circular Polyomaviridae Polyoma virus (progressive multifocal leucoencephalopathy) ? ? Fita dupla Vírus RNA Família Gênero Reoviridae Reovirus e Rotavirus Poliovirus, Rhinovirus, Hepatite A Rubéola HIV Dengue, febre amarela, Hepatite C Influenza Picornaviridae Togaviridae Retroviridae Flaviviridae Orthomyxoviri dae Bunyaviridae Rhabdoviridae Filoviridae Hantavirus Raiva Ebola Virion- nu/ envelopado Nu Simetria do capsídeo Icosaédrico Ác. nucléico Nu Icosaédrico Fita simples Envelopado Envelopado Envelopado Icosaédrico Complexo Complexo Fita simples Fita simples Fita simples Envelopado Helicoidal Fita simples Envelopado Envelopado Envelopado Helicoidal Helicoidal Helicoidal Fita simples Fita simples Fita simples Fita dupla ELISA Western blot Análises moleculares PCR Geometric Amplification 20 st cycle 1 21 2nd cycle 22 nth cycle 2n Obrigada
