UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO FILOGEOGRAFIA COMPARADA DE DUAS ESPÉCIES CRÍPTICAS DE ZYGOTHRICA WIEDEMANN 1830 (DIPTERA: DROSOPHILIDAE) Gustavo César de Albuquerque Zanetti Matricula: 85655 E-mail: [email protected] Telefone: (53) 99143-4000 Orientadora: Profa. Dra. Adriana Gava; E-mail: [email protected] Área do Conhecimento: Zoologia Rio Grande – RS 2018 RESUMO Zygothrica vittimaculosa é uma espécie de mosca neotropical que apresenta comportamento generalista, podendo ser encontrada associada a frutos, flores e fungos enquanto Zygothrica loretoi sua espécie-irmã é mais especialista, sendo apenas encontrada associada a flores. Essas espécies são encontradas em sintopia e simpatria, além de crípticas. Esse projeto visa realizar um estudo de filogeografia comparada com as duas espécies através de marcadores moléculas mitocondriais e nucleares com o propósito de esclarecer a história evolutiva lançar luz sobre seu mecanismo de especiação. PALAVRAS-CHAVE: Diversidade Neotropical, Especiação, COI, COII, DNA Barcode 1.INTRODUÇÃO 1.1 Biodiversidade e Ferramentas Moleculares - Barcode e Filogeografia A região Neotropical, por apresentar ambientes diversos e complexos, é considerada como uma das regiões com maior diversidade do planeta (Rull, 2011). Há diversas hipóteses para explicar essa grande diversidade, dentre as quais a mais aceita é a hipótese dos Refúgios (Haffer, 1969; Rull, 2015). Segundo esta hipótese, durante o Quaternário, a região Neotropical apresentou ciclos de alternância entre climas secos e úmidos, onde no período de secas os seres se concentravam em pequenas áreas úmidas, assim facilitando a especiação das espécies e o aumento da diversidade. Entre os países que compõem a região Neotropical está o Brasil, que constitui um hotspot de biodiversidade, tendo a estimativa de 210.000 espécies compondo a sua biota (Giam et al., 2012). Em todo o mundo existem diversas espécies com diferenças morfológicas sutis quando comparadas a grupos irmãos, e essas espécies crípticas representam um grande empecilho à compreensão da biodiversidade do planeta (Goodman, 2009). Com o avanço da ciência, vieram meios de solucionar tais empecilhos, e dentre estes destaca-se a técnica conhecida como DNA Barcode, que propõe o uso de pequenas regiões padronizadas do DNA para discriminação das espécies. Para o reino animal, é utilizado uma parte do gene mitocondrial da subunidade I da citocromo c oxidase (COI) como Barcode (e.g. Machado et al., 2017, Wangensteen et al., 2018). Muitas vezes associada a técnica do DNA Barcode, devido principalmente ao uso de marcadores comuns, a filogeografia é a área responsável pelo estudo dos processos que levaram a distribuição geográfica atual das linhagens genealógicas (Avise et al., 1987). De forma geral a filogeografia trabalha com a distribuição espacial de alelos ou haplótipos, tentando inferir relações filogenéticas associadas a processos históricos ou recorrentes (Avise, 2000). Dentro deste escopo, a filogeografia comparada busca explicar os processos das relações filogenéticas e a distribuição espacial de diferentes espécies, frequentemente com o intuito de esclarecer os eventos históricos que afetaram a biodiversidade de uma determinada região (e.g. Guillemin et al., 2018, Ruiz-García et al., 2018). Desde o surgimento do termo filogeografia, em 1987 (Avise et al., 1987), o número de estudos relacionados a esta área vem crescendo bastante com o passar dos anos, devido ao interesse científico e às evoluções tecnológicas (Avise, 2009). Contudo, o número de artigos na região Neotropical ainda é pouco expressivo (Martins & Domingues, 2011), a despeito de sua grande diversidade. 1.3 Família Drosophilidae A família Drosophilidae pertence a ordem Díptera e constituiu um grupo amplamente distribuído, que pode ser encontrado por quase todo globo nos mais diversos ecossistemas (Throckmorton, 1975). Esta família apresenta, atualmente, mais de 4.000 espécies distribuídas em 78 gêneros (Bächli, 2018), que podem ser encontradas associados aos mais diversos substratos, como frutos, flores e fungos (Toda, 2006). Em geral, apresentam grande importância ecológica em diferentes cadeias saprofíticas já que dependem de organismos fermentadores ou decompositores para sua alimentação (Throckmorton, 1975). 1.4 Gênero Zygothrica O gênero Zygothrica possui 124 espécies descritas (Bächli, 2018), 54 das quais já foram descritas para o Brasil (Gottschalk 2008). No entanto, esse número deve aumentar com o uso de métodos de coletas mais específicos para o gênero (Fonseca et al. 2017). As moscas desse grupo são predominantemente neotropicais, sendo encontradas principalmente em associação com flores e fungos (Grimaldi 1990). Zygothrica vittimaculosa foi descrita por Burla (1956), possuindo como traço característico manchas escuras nas pontas das asas e noto com manchas amareladas, sem um dimorfismo sexual claro (Burla, 1956). Esta espécie, junto com Z. vitticlara, Z. vittinubila, Z. vittipunctata, Z. sectipoeyi e Z. zygopoeyi,faz parte do grupo vittimaculosa (Grimaldi, 1987), caracteristicamente Neotropical. Zygothrica loretoi foi o nome dado à espécie irmã críptica de Z. vittimaculosa (Fonseca, 2015), que foi descoberta apenas recentemente, com o auxílio de técnicas associadas ao DNA Barcode (Fonseca et al., 2017). Estas duas espécies são, muitas vezes, encontradas em simpatria e sintopia. No entanto, elas parecem utilizar os recursos de forma diferente: enquanto Z. vittimaculosa é generalista, podendo ser encontradas em diferentes substratos como nos corpos de frutificação de fungos (Burla, 1956), iscas de banana (Gottschalk et al., 2008) e nas florações do gênero Cestrum L. (Santos & Vilela, 2005), Z. loretoi aparenta ser mais especializada sendo normalmente encontrada apenas em flores de Cestrum L (Fonseca, 2015). Em face a essas semelhanças e diferenças, os fatores geográficos e/ou ecológicos que permitiram a diversificação destas espécies ainda são totalmente desconhecidos. Este par de espécies pode, pois, constituir um excelente modelo para o estudo dos diferentes processos associados a especiação no Neotrópico. 2.OBJETIVOS Esse trabalho tem como objetivo auxiliar na compreensão dos fatores ecológicos e/ou geográficos associados a diversificação de Z. vittimaculosa e Z. loretoi através de um estudo de filogeografia comparativa. Para tanto, o mesmo busca atingir os seguintes objetivos específicos: a) Comparar os padrões de diversidade genética apresentados por Z. vittimaculosa e Z. loretoi para marcadores mitocondriais e nucleares; b) Comparar os padrões de estruturação populacional apresentados por Z. vittimaculosa e Z. loretoi para marcadores mitocondriais e nucleares; c) Comparar os padrões demográficos e os fatores históricos ou recorrentes potencialmente associados a evolução de Z. vittimaculosa e Z. loretoi; d) Inferir acerca do modo de especiação deste par de espécies crípticas. 3.MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Coletas e identificação Neste trabalho será utilizado material previamente coletado, de 22 pontos distribuídos pelos estados do Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Além disso, novas amostragens serão realizadas mediante coleta de flores em antese e acondicionamento em laboratório até a eclosão de novos indivíduos. Todas amostras serão identificadas pelo edeago, no caso dos machos (Fonseca, 2015), pela técnica de DNA Barcode (Fonseca et al., 2017), no caso das fêmeas. 3.2 Manejo do DNA Todos os indivíduos serão macerados e a extração do DNA será de acordo com o método descrito por (Jowett, 1986). Serão amplificados três genes, dois mitocondriais [COI e COII (citocromo c oxidase subunidade I e II, respectivamente)] e um nuclear ainda não determinado. Os genes mitocondriais serão amplificados com o uso dos primers TYJI460 e C1N2329 (COI) (Simon et al., 1994) e TL2J3037 e TKN3785 (COII) (Simon et al., 1994) que já apresentaram resultados positivos na amplificação dos genes nas duas espécies (Fonseca et al., 2017). Os amplicons resultantes serão purificados com acetato de amônio e sequenciados através de um sequenciador automático MegaBACE 500, utilizando os mesmos primers usados para gerar os amplicons. 3.3 Analises Filogeograficas Os eletroferogramas gerados serão checados e montados através do programa Gap4, presente no pacote Staden (Staden, 1996), e os alinhamentos serão realizados através do algoritmo ClustalW no programa Mega 7 (Kumar et al., 2016). Os índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, e as estimativas do número de haplótipos ou alelos e do número de sítios polimórficos serão obtidas no programa DNAsp (Librado & Rozas, 2009). Os testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu serão realizados no programa Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010), que também será utilizado para avaliar a estruturação entre as populações de cada espécie através de Fst e AMOVA. As inferências das relações entre os indivíduos de cada espécie e entre suas populações serão analisadas pelo método de Neighbor-Joining no programa Mega 7 e pela construção de uma rede de haplótipos no programa Network 5.0.0.3 (Woolley, 2008). As alterações no tamanho efetivo populacional de cada espécie, bem como suas datações, serão obtidas através de um Bayesian Skyline no programa Beast2 v2.5 (Bouckaert et al, 2014) 4.ORÇAMENTO Custeio Discriminação Agarose Taq DNA Polimerase dNTP Tampão TAE Unidade Frasco (100g) Kit Kit Vidro (500ml) Quantidade Valor Unitário (R$) Valor Total (R$) 1 2 2 290,00 125 368 290,00 250 736 4 150 600 Água para PCR Azul de Bromofenol Parafilm Eppendorf 1,5 ml Eppendorf 0,6ml Eppendorf 0,2 ml Ponteira 10uL Ponteira 10uL com Filtro Ponteira 200uL Ponteira 1000uL Primers Luvas de Silicone Vidro (500ml) Frasco (10g) Rolo Pacote Pacote Pacote Pacote (1000u) Pacote (1000u) Pacote (1000u) Pacote (1000u) Frasco Caixa 1 1 1 1 1 1 115 115 170 72 148 239 115 115 170 72 148 239 1 69 69 1 303 303 1 34 34 1 6 2 95 71,15 27 Subtotal 95 426,9 54 3.716,90 Capital Discriminação Termociclador Cuba de Eletroforese Fonte da eletroforese Fluxo Unidirecional Freezer Micropipeta 1000ul Micropipeta 200ul Micropipeta 20ul Micropipeta 10uL Transluminador Uv Vortex Microcentrífuga Cuba de Banho Maria Digital Estufa 13L Minicentrífuga Balança de Precisão 5.CRONOGRAMA Unidade / / / / / / / / / / / / Quantidade 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 / / / / 1 1 1 1 Valor Unitário (R$) 31.327,00 2.211,00 3.038,00 37.120,00 1.499,00 1.100,39 1.100,39 1.100,39 1.280,45 6.024,00 634 5.221,00 1.699,00 1.789,90 1.599,00 496,00 Subtotal TOTAL Valor Total (R$) 31.327,00 2.211,00 3.038,00 37.120,00 1.499,00 1.100,39 1.100,39 1.100,39 1.280,45 6.024,00 634 5.221,00 1.699,00 1.789,90 1.599,00 496,00 97.239,52 100.956,42 Mês Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Tarefas Extração de DNA Amplificação, purificação e sequenciamento Análise e entendimento dos resultados obtidos Redação do TCC Defesa do TCC Entrega da versão corrigida do TCC Revisão bibliográfica 6.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA AVISE, JC, J ARNOLD, RM BALL, E BERMINGHAM, T LAMB, JE NEIGEL, CA REEB & NC SAUNDERS. 1987. 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