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Projeto TG1 Gustavo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO
FILOGEOGRAFIA COMPARADA DE DUAS ESPÉCIES CRÍPTICAS DE
ZYGOTHRICA WIEDEMANN 1830 (DIPTERA: DROSOPHILIDAE)
Gustavo César de Albuquerque Zanetti
Matricula: 85655
E-mail: [email protected]
Telefone: (53) 99143-4000
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Gava;
E-mail: [email protected]
Área do Conhecimento: Zoologia
Rio Grande – RS
2018
RESUMO
Zygothrica vittimaculosa é uma espécie de mosca neotropical que apresenta
comportamento generalista, podendo ser encontrada associada a frutos, flores e fungos
enquanto Zygothrica loretoi sua espécie-irmã é mais especialista, sendo apenas
encontrada associada a flores. Essas espécies são encontradas em sintopia e simpatria,
além de crípticas. Esse projeto visa realizar um estudo de filogeografia comparada com
as duas espécies através de marcadores moléculas mitocondriais e nucleares com o
propósito de esclarecer a história evolutiva lançar luz sobre seu mecanismo de especiação.
PALAVRAS-CHAVE: Diversidade Neotropical, Especiação, COI, COII, DNA Barcode
1.INTRODUÇÃO
1.1 Biodiversidade e Ferramentas Moleculares - Barcode e Filogeografia
A região Neotropical, por apresentar ambientes diversos e complexos, é
considerada como uma das regiões com maior diversidade do planeta (Rull, 2011). Há
diversas hipóteses para explicar essa grande diversidade, dentre as quais a mais aceita é
a hipótese dos Refúgios (Haffer, 1969; Rull, 2015). Segundo esta hipótese, durante o
Quaternário, a região Neotropical apresentou ciclos de alternância entre climas secos e
úmidos, onde no período de secas os seres se concentravam em pequenas áreas úmidas,
assim facilitando a especiação das espécies e o aumento da diversidade. Entre os países
que compõem a região Neotropical está o Brasil, que constitui um hotspot de
biodiversidade, tendo a estimativa de 210.000 espécies compondo a sua biota (Giam et
al., 2012).
Em todo o mundo existem diversas espécies com diferenças morfológicas sutis
quando comparadas a grupos irmãos, e essas espécies crípticas representam um grande
empecilho à compreensão da biodiversidade do planeta (Goodman, 2009). Com o avanço
da ciência, vieram meios de solucionar tais empecilhos, e dentre estes destaca-se a técnica
conhecida como DNA Barcode, que propõe o uso de pequenas regiões padronizadas do
DNA para discriminação das espécies. Para o reino animal, é utilizado uma parte do gene
mitocondrial da subunidade I da citocromo c oxidase (COI) como Barcode (e.g. Machado
et al., 2017, Wangensteen et al., 2018).
Muitas vezes associada a técnica do DNA Barcode, devido principalmente ao uso
de marcadores comuns, a filogeografia é a área responsável pelo estudo dos processos
que levaram a distribuição geográfica atual das linhagens genealógicas (Avise et al.,
1987). De forma geral a filogeografia trabalha com a distribuição espacial de alelos ou
haplótipos, tentando inferir relações filogenéticas associadas a processos históricos ou
recorrentes (Avise, 2000). Dentro deste escopo, a filogeografia comparada busca explicar
os processos das relações filogenéticas e a distribuição espacial de diferentes espécies,
frequentemente com o intuito de esclarecer os eventos históricos que afetaram a
biodiversidade de uma determinada região (e.g. Guillemin et al., 2018, Ruiz-García et al.,
2018).
Desde o surgimento do termo filogeografia, em 1987 (Avise et al., 1987), o
número de estudos relacionados a esta área vem crescendo bastante com o passar dos
anos, devido ao interesse científico e às evoluções tecnológicas (Avise, 2009). Contudo,
o número de artigos na região Neotropical ainda é pouco expressivo (Martins &
Domingues, 2011), a despeito de sua grande diversidade.
1.3 Família Drosophilidae
A família Drosophilidae pertence a ordem Díptera e constituiu um grupo
amplamente distribuído, que pode ser encontrado por quase todo globo nos mais diversos
ecossistemas (Throckmorton, 1975). Esta família apresenta, atualmente, mais de 4.000
espécies distribuídas em 78 gêneros (Bächli, 2018), que podem ser encontradas
associados aos mais diversos substratos, como frutos, flores e fungos (Toda, 2006). Em
geral, apresentam grande importância ecológica em diferentes cadeias saprofíticas já que
dependem de organismos fermentadores ou decompositores para sua alimentação
(Throckmorton, 1975).
1.4 Gênero Zygothrica
O gênero Zygothrica possui 124 espécies descritas (Bächli, 2018), 54 das quais já
foram descritas para o Brasil (Gottschalk 2008). No entanto, esse número deve aumentar
com o uso de métodos de coletas mais específicos para o gênero (Fonseca et al. 2017).
As moscas desse grupo são predominantemente neotropicais, sendo encontradas
principalmente em associação com flores e fungos (Grimaldi 1990).
Zygothrica vittimaculosa foi descrita por Burla (1956), possuindo como traço
característico manchas escuras nas pontas das asas e noto com manchas amareladas, sem
um dimorfismo sexual claro (Burla, 1956). Esta espécie, junto com Z. vitticlara, Z.
vittinubila, Z. vittipunctata, Z. sectipoeyi e Z. zygopoeyi,faz parte do grupo vittimaculosa
(Grimaldi, 1987), caracteristicamente Neotropical.
Zygothrica loretoi foi o nome dado à espécie irmã críptica de Z. vittimaculosa
(Fonseca, 2015), que foi descoberta apenas recentemente, com o auxílio de técnicas
associadas ao DNA Barcode (Fonseca et al., 2017). Estas duas espécies são, muitas vezes,
encontradas em simpatria e sintopia. No entanto, elas parecem utilizar os recursos de
forma diferente: enquanto Z. vittimaculosa é generalista, podendo ser encontradas em
diferentes substratos como nos corpos de frutificação de fungos (Burla, 1956), iscas de
banana (Gottschalk et al., 2008) e nas florações do gênero Cestrum L. (Santos & Vilela,
2005), Z. loretoi aparenta ser mais especializada sendo normalmente encontrada apenas
em flores de Cestrum L (Fonseca, 2015).
Em face a essas semelhanças e diferenças, os fatores geográficos e/ou ecológicos
que permitiram a diversificação destas espécies ainda são totalmente desconhecidos. Este
par de espécies pode, pois, constituir um excelente modelo para o estudo dos diferentes
processos associados a especiação no Neotrópico.
2.OBJETIVOS
Esse trabalho tem como objetivo auxiliar na compreensão dos fatores ecológicos
e/ou geográficos associados a diversificação de Z. vittimaculosa e Z. loretoi através de
um estudo de filogeografia comparativa. Para tanto, o mesmo busca atingir os seguintes
objetivos específicos:
a) Comparar os padrões de diversidade genética apresentados por Z.
vittimaculosa e Z. loretoi para marcadores mitocondriais e nucleares;
b) Comparar os padrões de estruturação populacional apresentados por Z.
vittimaculosa e Z. loretoi para marcadores mitocondriais e nucleares;
c) Comparar os padrões demográficos e os fatores históricos ou recorrentes
potencialmente associados a evolução de Z. vittimaculosa e Z. loretoi;
d) Inferir acerca do modo de especiação deste par de espécies crípticas.
3.MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Coletas e identificação
Neste trabalho será utilizado material previamente coletado, de 22 pontos
distribuídos pelos estados do Paraná, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul e Santa Catarina.
Além disso, novas amostragens serão realizadas mediante coleta de flores em antese e
acondicionamento em laboratório até a eclosão de novos indivíduos. Todas amostras
serão identificadas pelo edeago, no caso dos machos (Fonseca, 2015), pela técnica de
DNA Barcode (Fonseca et al., 2017), no caso das fêmeas.
3.2 Manejo do DNA
Todos os indivíduos serão macerados e a extração do DNA será de acordo com o
método descrito por (Jowett, 1986). Serão amplificados três genes, dois mitocondriais
[COI e COII (citocromo c oxidase subunidade I e II, respectivamente)] e um nuclear ainda
não determinado. Os genes mitocondriais serão amplificados com o uso dos primers
TYJI460 e C1N2329 (COI) (Simon et al., 1994) e TL2J3037 e TKN3785 (COII) (Simon
et al., 1994) que já apresentaram resultados positivos na amplificação dos genes nas duas
espécies (Fonseca et al., 2017). Os amplicons resultantes serão purificados com acetato
de amônio e sequenciados através de um sequenciador automático MegaBACE 500,
utilizando os mesmos primers usados para gerar os amplicons.
3.3 Analises Filogeograficas
Os eletroferogramas gerados serão checados e montados através do programa
Gap4, presente no pacote Staden (Staden, 1996), e os alinhamentos serão realizados
através do algoritmo ClustalW no programa Mega 7 (Kumar et al., 2016).
Os índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, e as estimativas do número
de haplótipos ou alelos e do número de sítios polimórficos serão obtidas no programa
DNAsp (Librado & Rozas, 2009). Os testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu serão
realizados no programa Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010), que também será
utilizado para avaliar a estruturação entre as populações de cada espécie através de Fst e
AMOVA. As inferências das relações entre os indivíduos de cada espécie e entre suas
populações serão analisadas pelo método de Neighbor-Joining no programa Mega 7 e
pela construção de uma rede de haplótipos no programa Network 5.0.0.3 (Woolley,
2008). As alterações no tamanho efetivo populacional de cada espécie, bem como suas
datações, serão obtidas através de um Bayesian Skyline no programa Beast2 v2.5
(Bouckaert et al, 2014)
4.ORÇAMENTO
Custeio
Discriminação
Agarose
Taq DNA Polimerase
dNTP
Tampão TAE
Unidade
Frasco
(100g)
Kit
Kit
Vidro
(500ml)
Quantidade
Valor Unitário
(R$)
Valor Total
(R$)
1
2
2
290,00
125
368
290,00
250
736
4
150
600
Água para PCR
Azul de Bromofenol
Parafilm
Eppendorf 1,5 ml
Eppendorf 0,6ml
Eppendorf 0,2 ml
Ponteira 10uL
Ponteira 10uL com Filtro
Ponteira 200uL
Ponteira 1000uL
Primers
Luvas de Silicone
Vidro
(500ml)
Frasco (10g)
Rolo
Pacote
Pacote
Pacote
Pacote
(1000u)
Pacote
(1000u)
Pacote
(1000u)
Pacote
(1000u)
Frasco
Caixa
1
1
1
1
1
1
115
115
170
72
148
239
115
115
170
72
148
239
1
69
69
1
303
303
1
34
34
1
6
2
95
71,15
27
Subtotal
95
426,9
54
3.716,90
Capital
Discriminação
Termociclador
Cuba de Eletroforese
Fonte da eletroforese
Fluxo Unidirecional
Freezer
Micropipeta 1000ul
Micropipeta 200ul
Micropipeta 20ul
Micropipeta 10uL
Transluminador Uv
Vortex
Microcentrífuga
Cuba de Banho Maria
Digital
Estufa 13L
Minicentrífuga
Balança de Precisão
5.CRONOGRAMA
Unidade
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
/
Quantidade
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
/
/
/
/
1
1
1
1
Valor Unitário
(R$)
31.327,00
2.211,00
3.038,00
37.120,00
1.499,00
1.100,39
1.100,39
1.100,39
1.280,45
6.024,00
634
5.221,00
1.699,00
1.789,90
1.599,00
496,00
Subtotal
TOTAL
Valor Total
(R$)
31.327,00
2.211,00
3.038,00
37.120,00
1.499,00
1.100,39
1.100,39
1.100,39
1.280,45
6.024,00
634
5.221,00
1.699,00
1.789,90
1.599,00
496,00
97.239,52
100.956,42
Mês
Jan
Fev
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Ago
Set
Out
Nov
Dez
Tarefas
Extração de DNA
Amplificação,
purificação e
sequenciamento
Análise e
entendimento dos
resultados obtidos
Redação do TCC
Defesa do TCC
Entrega da versão
corrigida do TCC
Revisão
bibliográfica
6.REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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