Detecção do Papilomavírus Humano por PCR em lavado de

Serviço Público Federal
Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia – Mestrado
Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular
O PAPEL DO PAPILOMA VÍRUS HUMANO NA
CARCINOGÊNESE DOS TUMORES DE PÊNIS: UMA
ABORDAGEM EPIDEMIOLÓGICA E MOLECULAR
Angela Adamski da Silva Reis
Goiânia, 2005.
ii
Serviço Público Federal
Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia – Mestrado
Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular
O PAPEL DO PAPILOMA VÍRUS HUMANO NA
CARCINOGÊNESE DOS TUMORES DE PÊNIS: UMA
ABORDAGEM EPIDEMIOLÓGICA E MOLECULAR
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Biologia – Área de
Concentração:
Biologia
Celular
e
Molecular, do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Goiás – UFG, como requisito para obtenção
do título de Mestre.
Orientanda: Angela Adamski da Silva Reis, B.Sc.
Orientador: Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D.
Co-orientadora:Katia Karina Verolli de Oliveira Moura, Drª.
Goiânia, 2005.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
iii
Aos pacientes que anseiam por descobertas científicas
para o desenvolvimento de novas terapias para o
controle do câncer.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
iv
O desenvolvimento das atividades experimentais do presente estudo contou com a
colaboração das seguintes instituições: Universidade Federal de Goiás (UFG) – Programa de
Pós-Graduação Mestrado em Biologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB); Núcleo
de Pesquisas Replicon do Departamento de Biologia da Universidade Católica de Goiás
(UCG); Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia (RBCP) da Associação de
Combate ao Câncer em Goiás (ACCG), Serviço de Urologia e Serviço de Patologia –
Hospital Araújo Jorge e da International Agency for Research on Cancer (IARC).
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
v
Francis Harry Compton Crick (1916 – 2004)
Ao cientista britânico Francis Crick uma homenagem pela descoberta da estrutura da
molécula de DNA. A descoberta que lhe rendeu o Nobel completou 50 anos em 2003. Quando
trabalhava no Laboratório Cavendish, em Cambridge, Reino Unido, Crick em parceria com
James
Watson
decifraram
juntos
a
forma
estrutural
da
molécula
do
ácido
desoxirribonucléico. A descoberta representou não só uma revolução científica, marcando o
verdadeiro nascimento da biologia molecular, mas marcou para sempre a história das ciências.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
vi
Agradecimentos
Foram inúmeras as pessoas que indiretamente fizeram parte desta etapa em minha
vida. O amor adquire mais força quando oferecido ao próximo. Agradeço a Deus por renovar
as esperanças e a cada etapa a ser vencida. Sem a presença dele minha luz se apaga.
Agradeço a meu pai, José Arlei da Silva, pelo pai maravilhoso que sempre esteve
presente em todos os momentos, que se dedicou à formação da nossa família e me incentivou
aos estudos; a minha querida mãe, Leonélia Maria Adamski da Silva pela preocupação com
o meu bem estar, pelos conselhos, pelo incentivo para eu alcançar meus sonhos e pelo amor
incondicional. Amo vocês!!!. A minha irmã querida Fernanda Adamski da Silva pelo
carinho, amor e pelo eterno incentivo. Amo você!!!.
Ao meu amor, Luciano de Souza Vaz dos Reis, pelo amor, paciência, incentivo,
preocupação, companheirismo de todas as horas e pelos incontáveis conselhos. A ele que
agora entende além de Tecnologia da Informação e Redes, Virologia, Biologia Molecular e
Oncologia, dando sua opinião sobre o contexto da dissertação. Meu eterno amor, Te amo
muito!!!.
Aos familiares do meu marido pelo incentivo, em especial ao Frederico de Souza
Vaz dos Reis pelo auxílio quanto à parte técnica de Urologia. Obrigada!!!
Agradeço a Professora Drª Katia Karina Verolli de Oliveira Moura, por me
ingressar no mundo maravilhoso da Pesquisa Científica como minha orientadora no Programa
de Iniciação Científica – CNPq Agradeço pelo auxílio em me indicar como estagiária do
Professor Peixoto, que permitiu meu ingresso na família do Núcleo de Pesquisas Replicon,
sem a sua ajuda eu não conseguiria chegar a esta etapa, Minha eterna gratidão, amizade,
admiração e respeito. Obrigada!!!!
Ao meu querido orientador (My Dear), Profª Drº. Aparecido Divino da Cruz,
carinhosamente chamado de Peixoto, que me aceitou como aluna e acreditou na minha
capacidade. Agradeço pela oportunidade e pelo auxílio na realização de um sonho. Agradeço
pelo incentivo e conselhos, sem me esquecer dos elogios, quando me chama carinhosamente
de Julia ou Angel Girl, Minha eterna gratidão, amizade, respeito e admiração. Obrigada por
tudo!!!!!!
Aos meus queridos Amigos José Baldin Pinheiro (ESALQ-USP) e Maria
Imaculada Zuchi (UNICAMP), que sempre me apoiaram, me ajudando nos estudos para o
processo seletivo do Mestrado, pela sugestão de alternativas (Agronomia – UFG) para que
meu sonho fosse realizado e até nos momentos difíceis pelos quais passei, me encorajando e
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
vii
me tirando da depressão com os passeios e sessões de cinema, transformando-me até em
decoradora e arquiteta. Minha amizade sincera. Adoro vocês!
Ao Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov que me auxiliou nos estudos para o processo
seletivo e por ser meu avaliador na defesa do projeto desta dissertação. Agradeço o incentivo
e a preocupação, Minha admiração!
A Profª Drª Vera A. Saddi, que se dispôs a ajudar em todos os momentos de
dificuldades, minha admiração, respeito e gratidão!!!
Aos amigos de todas as horas, Eugênio Silva e Luciana Raizer Silva pelo carinho e
amizade, que torciam durante o processo seletivo e que vibraram com o resultado positivo.
Pela constante preocupação com o meu bem estar, meu eterno carinho.
À equipe do Núcleo de Pesquisas Replicon por seu constante auxílio em qualquer
momento. E que fez a parte difícil tornar-se mais agradável e alegre. À pessoa que me acolheu
na chegada ao Replicon e que foi o meu estatístico nesta dissertação e, acima de tudo meu
amigo, Antonio Márcio Teodoro Cordeiro Silva, meu respeito e admiração eterna. Não
posso jamais me esquecer de Jack, esposa do meu amigo Márcio que também torce pelo meu
sucesso, obrigada. Ao Marcus Vinícius Paiva de Oliveira, companheiro de todas as horas. A
única pessoa que entende a "Febre Madonna". Agradeço pelo incentivo durante os estudos
para o processo seletivo, pelo companheirismo durante a execução dos créditos no ICB-UFG
e pela companhia, auxílio e preocupação; o meu carinho e eterna admiração. À Alessandra
de Santana Braga B. Ribeiro, amiga de todas as horas, muito obrigada pelos conselhos,
preocupação e admiração, meu eterno carinho e amizade. Ao Raimundo da Silva Júnior,
meu Bebê querido pelo valioso auxílio técnico. Ao Eduardo Rocha Pedrosa agradeço pela
compreensão, paciência e pelo auxílio indispensável na parte técnica. À Kelly Caçula Castro
pelo auxílio e por me fazer descontrair nos momentos difíceis. À Daniela de Melo e Silva
pelo auxílio valioso e indispensável. E ainda à Damiana Míriam da Cruz e Cunha, Daniela
Cruvinel, Bruno de Oliveira Jayme, Fabiano Ribeiro Borges, Luciana Pinheiro, Sheila
Freires Oliveira Mendes, Núbia Tomaz Maia, Priscila Barros, Rafael Souto, Raquel
Loren Reis e Rodrigo Ignácio de Carvalho, a todos vocês o meu carinho!!!
Ao Marcus Vinícius Texeira Amaral por ter confeccionado todas as figuras desta
dissertação, deixando fluir seu potencial criativo.
Aos pacientes que anônima e voluntariamente fizeram parte deste estudo e
possibilitaram a conclusão da pesquisa.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
viii
Aos professores que ministraram as disciplinas do Programa de Pôs-Graduação /
Mestrado, agradeço, expressando minha admiração ao Prof. Dr. Alexandre Coelho Guedes
Siqueira.
Agradeço também aos meus alunos da Universidade Estadual de Goiás (Gestão
Sanitária e Ambiental e do Corpo de Bombeiros) e da Universidade Católica de Goiás –
CEAD (Biologia) pelo apoio. A eles meu eterno carinho.
Agradeço em especial ao Drº José Eluf Neto da Universidade de São Paulo,
Faculdade de Medicina, Departamento de Medicina Preventiva; à Drª Luisa Lina Villa do
Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer e à Drª Susie B Baldwin, Departament of
Obstetrics and Gynecology / Arizona Cancer Center, pela disponibilização de seus artigos
para meu aprendizado, Obrigada!!!
Aos funcionários da Universidade Católica de Goiás (Departamento de Biologia); do
Hospital Araújo Jorge (Serviço de Patologia - Drª Rita de Cássia Alencar, Serviço de
Urologia - Drº Adriano Augusto Peclat de Paula e Registro de Câncer de Base Populacional
de Goiânia /GO - Drª Maria Paula Curado), muito obrigada!!!
Sean Quail pela correção dos abstracts, muito obrigada!
Sem estas pessoas esta dissertação não teria sido concluída e a minha satisfação não
seria a mesma, obrigada a todos vocês !!!
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
ix
Sumário
Dedicatória ...................................................................................................................
iii
Apoio .............................................................................................................................
iv
Frontispiece .................................................................................................................
v
Agradecimentos ............................................................................................................
vi
Lista de Figuras .............................................................................................................
xii
Lista de Tabelas.............................................................................................................
xiv
Lista de Anexos ............................................................................................................
xvi
Lista de Siglas e Abreviaturas........................................................................................
xviI
Resumo ..........................................................................................................................
xix
Abstract .........................................................................................................................
xx
Objetivos ......................................................................................................................
21
Objetivos Geral ........................................................................................................
21
Objetivos Específicos ...............................................................................................
21
Capítulo 1. Aspectos Gerais dos Carcinomas Penianos ..........................................
22
Resumo ..........................................................................................................................
22
Abstract .........................................................................................................................
22
1. Introdução..................................................................................................................
23
2. Patologia ...................................................................................................................
25
2.1. O Câncer de Pênis..............................................................................................
25
2.2. Estadiamento .....................................................................................................
26
2.3. Apresentação Clínica .........................................................................................
27
2.4. Tratamento .........................................................................................................
28
3. Conclusão ..................................................................................................................
29
Capítulo 2. História Natural da Infecção por Papilomavírus Humano .................
31
Resumo
31
......................................................................................................................................
31
Abstract .........................................................................................................................
32
1. Introdução .................................................................................................................
33
2. História Natural da Doença........................................................................................
33
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Angela Adamski da Silva Reis
x
3. O Agente etiológico..................................................................................................
33
4. Transmissão...............................................................................................................
35
5. Infecção e Persistência ..............................................................................................
36
6. Imunidade ..................................................................................................................
38
7. Transformação Celular ..............................................................................................
39
8. Conclusão ..................................................................................................................
40
Capítulo 3. O Papilomavírus Humano e Saúde Pública: importância da
distribuição de uma cartilha informativa à população ............................................
42
Resumo ..........................................................................................................................
42
Abstract .........................................................................................................................
42
1.Introdução ..................................................................................................................
43
2. Materiais e Métodos ..................................................................................................
44
3.Resultados ..................................................................................................................
46
4.Discussão ...................................................................................................................
47
Capítulo 4. Estudo epidemiológico do câncer de pênis na população Goiânia no
período de 1988 a 1999 ................................................................................................
49
Resumo ..........................................................................................................................
49
Abstract .........................................................................................................................
49
1. Introdução .................................................................................................................
50
2. Materiais e Métodos ..................................................................................................
51
3. Resultados .................................................................................................................
52
4. Discussão ..................................................................................................................
55
Capítulo 5. Detecção do papilomavírus humano por PCR multiplex em lavado
de glande.......................................................................................................................
58
Resumo ..........................................................................................................................
58
Abstract .........................................................................................................................
58
1. Introdução .................................................................................................................
59
2. Materiais e Métodos ..................................................................................................
60
2.1. Grupo amostral ..................................................................................................
60
2.2. Obtenção das Amostras .....................................................................................
61
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
xi
2.3 Extração de DNA ...............................................................................................
61
2.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..........................................................
61
2.5.Análise dos Fragmentos de PCR ........................................................................
62
3. Resultados .................................................................................................................
62
4. Discussão ..................................................................................................................
65
Capítulo 6. Estudo molecular da carcinogênese dos tumores penianos .................
67
Resumo ..........................................................................................................................
67
Abstract .........................................................................................................................
67
1. Introdução .................................................................................................................
68
2. Materiais e Métodos .................................................................................................
69
2.1. Grupo amostral ..................................................................................................
69
2.2. Obtenção das Amostras .....................................................................................
69
2.3. Extração de DNA ..............................................................................................
69
2.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..........................................................
69
2.5. Análise dos Fragmentos de PCR .......................................................................
70
3. Resultados .................................................................................................................
71
4. Discussão ..................................................................................................................
72
Considerações Finais ...................................................................................................
120
Referências Bibliográficas ..........................................................................................
122
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
xii
Lista de Figuras
Capítulo 1. Aspectos Gerais dos Carcinomas Penianos ...........................................
22
Figura 1. Esquema anatômico do sistema reprodutor e urinário masculino.................
23
Figura 2. Esquema da estrutura de corte transversal do pênis .....................................
24
Capítulo 2. História Natural da Infecção por Papilomavírus Humano .................
31
Figura 1. Mapa genético do papilomavírus humano 16 (HPV 16). Esquema do
genoma de HPV linearizado, mostrando organização e localização dos quadros abertos de
leitura das regiões tardias (Late: L) e regiões precoces (Early: E). LCR: Longa Região de
Controle...........................................................................................................................
34
Figura 2. Organização de DNA circular do HPV e sua integração no DNA da célula
hospedeira .....................................................................................................................
35
Figura 3. Ciclo de vida HPV: as células infectadas ao se dividirem, distribuem
eqüitativamente o DNA viral entre as células filhas. Uma das células filha migra da camada
basal inicia o processo de diferenciação. A outra célula filha continua indiferenciada,
sofrendo divisões para fornecer células para a diferenciação e células para a manutenção da
camada basal. A célula infectada corresponde a um reservatório de DNA viral ......................
37
Capítulo 3. O Papilomavírus Humano e Saúde Pública: Importância da
Distribuição de uma Cartilha Informativa à População .........................................
42
Figura 1. Cartilha: HPV e sua relação com o câncer, páginas iniciais na qual foram
discutidos o Papilomavírus Humano, os tipos virais e as regiões de infecção..............
44
Figura 2. Cartilha: HPV e sua relação com o câncer, páginas que demonstram as
formas de transmissão e a relação entre infecção viral e o desenvolvimento de câncer
45
Capitulo 4. Estudo epidemiológico do câncer de pênis na população de Goiânia
no período de 1988 a 1999 ..........................................................................................
49
Figura 1. Sobrevida relativa geral para o câncer de pênis na população de Goiânia
no período de 1988 a 1999............................................................................................
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
55
Angela Adamski da Silva Reis
xiii
Capítulo 5. Detecção de papilomavírus Humano em Células Esfoliadas da
Mucosa de glande por PCR ........................................................................................
58
Figura 1. Esquema mostrando as regiões flanqueadas pelo primers MY09 e MY11,
dentro do gene L1, no genoma do HPV16 (Silva et al., 2003). ....................................
60
Figura 2. Porcentagem de indivíduos quanto ao número de parceiras sexuais ............
63
Figura 3. Porcentagem de casos positivos e negativos para HPV ...............................
63
Figura 4. Porcentagem de casos genotipados de acordo com os casos detectados
com HPV .......................................................................................................................
64
Figura 5. Gel em poliacrilamida a 8% contendo produtos de amplificação corados
por Nitrato de Prata: Detecção de HPV utilizando os primers genéricos My9/11 e
D8S135) para confirmação da presença de DNA humano na amostra .........................
64
Figura 6. Genotipagem dos HPVs 6, 11, 16 e 18; na canaleta C+, utilizando-se
como controle positivo células HeLa (amplificação para HPV 18). O ladder (Ld)
utilizado foi o de 100pb ................................................................................................
64
Capítulo 6. Análise Molecular do Papilomavírus Humano em Carcinomas
Penianos .......................................................................................................................
67
Figura 1. Gel em poliacrilamida a 8% com produtos de amplificações: Detecção de
HPV utilizando os primers genéricos GP5+/6+. Ladder (Ld): o marcador de peso
molecular de tamanho de100pb; A1-A7 (pacientes analisados); Controle negativo
(C-) e Controle positivo (C+) utilizando-se células HeLa para do genoma de HPV
18 ..................................................................................................................................
71
Figura 2. Gel em poliacrilamida a 8%: Genotipagem utilizando primers tipo
especifico HPV6 (195pb), HPV 11 (90pb), HPV 16 (119pb), HPV 18 (172pb), HPV
33 (211pb), HPV 35 (230pb), HPV 45 (236 pb) e HPV 58 (314pb). Controle
positivo (C+: 172pb) utilizando-se células Hela para a amplificação do HPV 18 .......
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
72
Angela Adamski da Silva Reis
xiv
Lista de Tabelas
Capítulo 1. Aspectos Gerais dos Carcinomas Penianos ...........................................
22
Tabela I. Classificação de Jackson para o estadiamento do câncer de pênis ...............
27
Tabela II. Sistema TNM – proposto pela UICC/AJCC para estadiamento do câncer
de pênis..........................................................................................................................
27
Capítulo 2. História Natural da Infecção por Papilomavírus Humano .................
31
Tabela I. Classificação dos HPVs quanto a categoria de risco oncogênico .................
33
Tabela II. Funções das proteínas expressas a partir de genes das regiões precoces E
e tardia L contidos no genoma do HPV .......................................................................
34
Capítulo 3. O Papilomavírus Humano e Saúde Pública: importância da
distribuição de uma cartilha informativa a população............................................
42
Tabela I. Distribuição percentual relacionada ao sexo dos voluntários que
responderam ao questionário, após a leitura da cartilha ..............................................
46
Tabela II. Freqüência percentual de pessoas para o conhecimento do Papiloma
Vírus Humano (HPV) e sua relação com o câncer ............................................................
46
Tabela III. Distribuição dos percentuais relacionados às questões sobre a
transmissão do Papiloma Vírus Humano (HPV), região acometida pela infecção,
diagnóstico da patologia, prevenção e sobre a relação do Câncer de colo de útero
com o HPV.....................................................................................................................
47
Capítulo 4. Avaliação Epidemiológica do Câncer de Pênis Na População de
Goiânia no Período de 19988 a 2000 .........................................................................
49
Tabela I. Freqüência percentual de casos de câncer de pênis por faixa etária e sexo,
em Goiânia no período de 1988 a 1999.........................................................................
53
Tabela II. Freqüência percentual de casos de câncer de pênis por estadiamento, em
Goiânia no período de 1988 a 1999............................................................................... 53
Tabela III. Tábua de vida atuarial para o cálculo da sobrevida geral do câncer de
pênis, em Goiânia no período de 1988 a 1999 .............................................................. 54
Capítulo 5. Detecção do Papilomavírus Humano por PCR multiplex em lavado
de glande ........................................................................................................................ 58
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
xv
Tabela I. Seqüências dos primers usados no presente estudo, indicando o tamanho
esperado do fragmento amplificado, segundo Karlsen e colaboradores (1996) ...........
62
Capítulo 6. Estudo molecular da carcinogênese dos tumores penianos .................
67
Tabela I. Seqüências dos primers utilizados, mostrando o tamanho do fragmento
amplificado, segundo Karlsen e colaboradores (1996) .................................................. 70
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
xvi
Lista de Anexos
Anexo 1. Cartilha: HPV e sua Relação com o Câncer.. ..................................................
74
Anexo 2. Questionário aplicado aos participantes do estudo piloto da cartilha: HPV e
sua Relação com o Câncer ...............................................................................................
77
Anexo 3. Dados brutos da análise das respostas dos questionários aplicados aos
indivíduos que leram a cartilha informativa: HPV e sua relação com o câncer ..............
79
Anexo 4. Fluxograma de notificação do Registro de Câncer de Base Populacional de
Goiânia da ACCG ...........................................................................................................
87
Anexo 5. Cálculo da sobrevida relativa pelo método da tábua de vida atuarial .............
88
Anexo 6. Dados brutos de identificação, sócio demográficos e clínicos dos 38
pacientes que fizeram parte do estudo epidemiológico em Goiânia, no período de
1988 a 1999 ....................................................................................................................
91
Anexo 7. Termo de consentimento dos indivíduos de células esfoliadas da glande .......
94
Anexo 8. Questionário aplicado aos indivíduos que fizeram parte do estudo de células
esfoliadas da glande ........................................................................................................
96
Anexo 9. Protocolo de extração e purificação de DNA células da glande ...................
97
Anexo 10. Dados brutos das respostas dos questionários aplicados aos indivíduos que
fizeram parte do estudo molecular de células esfoliadas da glande ................................
99
Anexo 11. Dados da análise molecular de DNA genômico dos indivíduos de células
esfoliadas da glande ........................................................................................................
103
Anexo 12. Protocolo de extração e purificação de DNA em material biológico
parafinado de câncer de pênis .........................................................................................
104
Anexo 13. Dados da análise molecular de DNA em material biológico parafinado de
câncer de pênis ................................................................................................................
106
Anexo 14. Informações sobre os primers utilizados .......................................................
107
Anexo 15. Amplificação de DNA por PCR ...................................................................
115
Anexo 16. Eletroforese em gel de poliacrilamida ...........................................................
118
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
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xvii
Lista de Siglas e Abreviaturas
A: Adenina,base nitrogenada
HAJ: Hospital Araújo Jorge
ACCG: Associação de Combate ao Câncer em Goiás
HeLa:Linhagens de células tumorais infectadas com
HPV 18
AJCC: American Joint Committee on Câncer
HND: História Natural da Doença
APS: persulfato de amônia
HPV: Papiloma Vírus Humano, do inglês
(Human Papillomavirus)
C: Citosina, base nitrogenada
H2Odd: Água bidestilada
CCE: carcinoma de células escamosas do pênis
IARC: Agência Internacional para Pesquisa em
Câncer, do inglês (International Agency for Research
on Cancer)
CD4+: Linfócito T Auxiliar
IgA: Imunoglobulina A
CD8+: Linfócito T citotóxico
IgG: Imunoglobulina G
CID-O: Classificação Internacional de Doenças para INCa-MS: Instituto Nacional do Câncer – Ministério
Oncologia
da Saúde
C+: Controle Positivo
kb: Kilo base (1 kb=1000 pb)
C -: Controle Negativo
L: litro
CID-O: Classificação Internacional de Doenças para a LCR: Longa Região de Controle, do inglês (Long
Oncologia
Control Region)
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
Ld: Marcador de tamanho ou escada alelica (Ladder)
dNTP: desoxirribonucleosídeos trifosfados
M: Molar
DST: doença sexualmente transmitida
mg: Miligramas
D8S135: Primer utilizado como controle interno da reação
Mg+2: Íon Magnésio
et al. Abreviatura de et alli que significa e outros
mL: Militros
E2F: Fator de Transcrição
mM: Milimolar
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
My 9/11: Primers genéricos para amplificação de
HPV
F: primer de amplificação direta
NaOH: Hidróxido de Sódio
f (%): Freqüência percentual
nmol: Nanomol
G: Guanina, base nitrogenada
pb: pares de base
GO: Goiás
PCR: Reação em cadeia da Polimerase, do inglês
(Polimerase Chain Reatcion)
GP 5 + / 6 +: primers genéricos para amplificação de HPV
pH: Potencial Hidrogênio
pRb: Proteína supressora de tumor expressa pelo gene Rb T N M: Sistema de classifciaçao por estadiamento:
(Retinoblastoma)
Tumor, Nódulos linfáticos e Metástases a distância
p53: Proteína supressora de tumor expressa pelo gene p53
q.s.p: Quantidade uficiente para
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xviii
RCBP: Registro de Câncer de Base Populacional de UFG: Universidade Federal de Goiás
Goiânia/GO
rpm: Rotação por minuto
UICC: União Internacional Contra o Câncer, do inglês
(International Union Against Cancer)
RT-PCR: PCR em tempo real, do inglês (Real Time PCR)
VDS: Sistema de Vídeo Documentação
T: Timina, base nitrogenada
μg: Micrograma
TA: Temperatura Ambiente
μL: Microlitro
TBE: Tampão de Borato e EDTA
μM: Micrometro
UCG: Universidade Católica de Goiás
%CG: Porcentagem de bases citosina e guanina
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xix
Resumo
O pênis faz parte do sistema urinário e reprodutor do sexo masculino, envolvendo as funções na formação
do sêmen e o desempenho do ato sexual. O câncer de Pênis é um tipo raro de neoplasia, que atinge
aproximadamente 1% dos homens nos países desenvolvidos. É uma doença que acomete indivíduos de
baixo nível social com precários hábitos de higiene. Geralmente incide em pacientes não circuncizados,
associado à fimose. A patologia pode comprometer as funções desempenhadas pelo órgão causando um
agravante psicológico no paciente. A associação entre infecção por HPV leva à investigação deste fator na
etiologia do câncer de pênis. Esta evidência sugere que pacientes infectados com os tipos virais do HPV 16,
18, 31 e 33 possam ter uma predisposição para desenvolver o carcinoma escamoso de pênis. As
oncoproteínas E6 e E7 dos HPVs de alto risco oncogênico são responsáveis pela degradação e inativação
das proteínas celulares, supressoras de tumor p53 e pRb, respectivamente. Vários estudos epidemiológicos e
moleculares são realizados na tentativa de determinar associação entre os fatores de risco e o aparecimento
da patologia. Objetivando ampliar o conhecimento acerca da infecção pelo HPV e do comportamento do
câncer anogenital em Goiânia, desenvolvemos uma cartilha educativa com o propósito de informar sobre a
prevenção da transmissão do HPV e sua relação com o processo neoplásico, sobretudo quando se sabe que a
infecção por HPV é uma DST e, particularmente, que o vírus é um fator potencial na iniciação e progressão
dos carcinomas. Foram investigados 38 pacientes do RCBP da ACCG no período de 1988 a 1999. Assim, o
câncer de pênis se mostrou em Goiânia, com sobrevida geral de 3,3% com censura de 42%, sugerindo que o
seguimento deve ser melhorado. Adicionalmente, sugere-se que o homem atue como disseminador do vírus,
sendo portador e não apresentando sintomatologia clínica característica da infecção genital ocasionada pelo
HPV. Na investigação para avaliar a presença de HPV em lavado de glande de 100 indivíduos sem história
clínica pregressa de infecção por HPV, visando a detecção de seqüências específicas do genoma do HPV,
utilizou-se primers genéricos MY09/MY11 e específicos para os subtipos virais de HPV 6, 11, 16 e 18. Os
resultados incluem 23% de positividade para o genoma viral. Foram genotipados 11% de HPV 16, 6% de
HPV 18, 5% HPV 11 e 1% de HPV 6. Finalmente, realizou-se uma avaliação molecular para a detecção de
HPV em 23 pacientes com carcinoma peniano. Para a identificação de seqüências especificas do genoma
viral, foram usados os primers MY9/11 e GP5+/6+. Apenas um, dos 23 casos estudados apresentou
amplificação de genoma de HPV. Primers específicos para os subtipos virais 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 e 58
foram usados na PCR para genotipagem do vírus. Produtos de PCR não foram obtidos, sugerindo uns tipos
diferentes, que será definido por sequenciamento do amplicon gerado pela amplificação gênica. A presença
de HPV como microbiota das mucosas genitais masculinas caracteriza os homens como reservatório do
vírus, sobretudo nas condições em que lesões epiteliais não se desenvolvem. Embora a associação entre
HPV e carcinogênese peniana ainda requer elucidação
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
xx
Abstract
The penis is part of the urinary and reproductive system of the male sex, involving the formation of semen
and used in the sexual act. Penile cancer is an uncommon malignancy in developed countries. It is a
disease that accounts individuals of low-level social and economic conditions and with precarious hygiene
habits. Generally it occurs in uncircumcised patients, associated to phimosis. The pathology can
compromise the penis functions causing a psychological results for the patient. The association between
HPV infection and cancer get to the investigation of this factor in the etiology of the penile cancer. This
evidence suggests that patients infected with HPV 16, 18, 31 and 33 can have a predisposition to develop
the penile squamous cell carcinoma. The oncoproteins E6 and E7 of the HPVs of high oncogenic risk are
responsible for the degradation and inactivation of cellular components, such as p53 and pRb tumor
suppressor proteins, respectively. Epidemiologic and molecular studies were conducted in the attempt to
determine the association between the risk factors and the pathology. Our objective was to increase the
knowledge concerning the HPV infection and the behavior of anogenital cancer in Goiânia. We developed
one educational booklet to inform the general population on the prevention of the HPV infection, and its
relation to the neoplastic process, since it is well known that the infection for HPV is a STD, particularly,
that the virus is a potential factor in the initiation and progression of the carcinomas. The Population
Based Cancer Registry of Goiânia detected 38 patients with penile carcinoma, in the period from 1988 to
1999. According to the data, the penile cancer patients in Goiânia showed a general survival of 3,3% with
a 42% censorship of data, suggesting that the follow-up must be improved. Additionally, it is demonstrated
that the man acts as a disseminator of the virus, spreading it, without presenting clinical symptoms of the
genital HPV infection, suggesting that the penis is a potential reservoirs for HPV carriage. In order to
evaluate the presence of HPV in washed of glands, 100 individuals without former clinical evidence of
genital HPV infection, were investigated. MY09/MY11generic primers were used for the detection of HPV
genome sequences. Specific primers for HPV 6, 11, 16 and 18 were used for genotyping. The results
demonstrated HPV–DNA in 23% of the samples. Genotyping results demonstrated HPV-16 genome in 11%
of the samples, HPV-18 in 6% of the samples, HPV-11 in 5% of the samples, and HPV-6 in 1% of the
samples. Finally, a molecular evaluation for HPV genome was performed in 23 patients with penile
carcinoma. For the detection of HPV genome sequences, two different sets of generic primers, MY9/11 and
GP5+/6+, were employed. One, out of 23 tumor samples, presented amplification for the HPV genome.
Specific primers for the genotypes 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 and 58 were used for the PCR assays. PCR
amplifications were all negative, suggesting a different genotype, which will be defined by future
sequencing experiments. The significance of masculine genital as vehicle in the transmission of genital
HPV infection characterizes the men as reservoir of the virus. Although, the association between penile
carcinogenesis and HPV still requires more research.
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Angela Adamski da Silva Reis
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Objetivos
Objetivo Geral
Investigar a participação do HPV na iniciação e promoção dos tumores epiteliais do
pênis e determinar as tendências epidemiológicas dessa neoplasia na população de Goiânia.
Objetivos Específicos
9 Detectar a prevalência do HPV em 100 indivíduos da população masculina na faixa etária
de 25 a 60 anos e sexualmente ativa de Goiânia, sem história pregressa de infecção por
HPV.
9 Determinar a possível associação dos subtipos virais de HPV 6, 11, 16, 18,33, 35, 45 e 48
com carcinomas primários de pênis em 23 pacientes diagnosticados no Hospital Araújo
Jorge, no período de 2000, 2001 e 2002.
9 Investigar o papel masculino na disseminação do HPV;
9 Determinar as possíveis associações existentes entre a presença dos subtipos virais e os
aspectos clinicopatológicos descritos para os tumores;
9 Determinar os coeficientes de incidência, mortalidade e sobrevida do tumor de pênis na
população de Goiânia;
9 Associar os resultados das análises encontradas com a sobrevida dos pacientes;
9 Elaborar e sugerir um possível critério prognóstico baseado nos marcadores moleculares
estudados;
Contribuir para a geração de conhecimentos e formação de pessoal qualificado,
visando o desenvolvimento científico e tecnológico do país e, sobretudo, da região.
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22
Capítulo 1. Aspectos Gerais dos Carcinomas penianos
Resumo
O câncer de pênis é uma doença rara e a alta incidência é observada em países em desenvolvimento. Os
carcinomas penianos geralmente acometem homens na 6ª década de vida. Geralmente, incidem em pacientes não
circuncizados, associado à fimose e aos maus hábitos de higiene. Nos países onde a circuncisão infantil é
comum, como Israel e os Estados Unidos, a incidência do carcinoma escamoso de pênis é baixa. O
comportamento biológico desses tumores tende a ser uniforme, com disseminação para linfonodos inguinais e
linfonodos pélvicos. Os pacientes não tratados ou cujos tratamentos foram ineficazes, em geral morrem por
complicações secundárias às metástases inguinais, ou seja, hemorragias por lesões tumorais de grandes vasos ou
processos sépticos. Estudos sobre o câncer de pênis têm demonstrado a associação do papilomavírus humano
(HPV) com lesões benignas e malignas. A associação entre infecção por HPV leva à investigação deste fator na
etiologia do câncer de pênis.
Palavras-Chave: câncer de pênis, circuncisão e HPV
Abstract
Penile cancer is an uncommon disease with a high incidence in developing countries. Penile carcinoma is
typically a disease of the 6th decade of life. Generally, it occurs in uncircumcised patients, associated to phimosis
and bad hygiene habits. In countries where infantile circumcision is common, such as Israel and the United
States, the incidence of the squamous penile carcinoma is low. The biological behavior of these tumors tends to
be uniform, with dissemination for inguinal and pelvic lymph nodes. Treated or untreated patients, in general,
die for secondary complications of inguinal metastasis and hemorrhages caused by tumors injuries. Studies
about penile cancer have demonstrated the association of human papillomavirus (HPV) with benign and
malignant injuries. The association between HPV infection leads to the investigation of this factor in the etiology
of penile cancer.
Key Word: penile cancer, circumcision and HPV
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1. Introdução
Sítio Anatômico, Fisiologia e Histologia
O pênis faz parte do sistema reprodutor e urinário do sexo masculino (Figura 1). As
funções reprodutivas do homem podem ser divididas em três grupos principais: primeiro, a
espermatogênese, que se refere simplesmente à formação do sêmen; segundo, o desempenho
do ato sexual; e terceiro a regulação das funções reprodutivas masculinas pelos vários
hormônios (Guyton,1998).
Figura 1 – Esquema anatômico do sistema reprodutor e urinário masculino.
Os testículos secretam diversos hormônios sexuais masculinos denominados de
androgênios, incluindo androstenediona, diidrotestosterona e testosterona (Guyton, 1998). Em
geral, a testosterona é responsável pelas características peculiares do corpo masculino. Mesmo
durante a vida fetal, os testículos são estimulados pela gonadotrofina coriônica proveniente da
placenta, produzindo quantidades moderadas de testosterona (Moore & Persaud, 1994).
A uretra no homem é um longo duto estendendo-se da bexiga para uma abertura na ponta
do pênis. A porção da uretra do pênis é envolta por tecidos eréteis, musculares e fibrosos. A
uretra entra no pênis pela borda posterior da cintura pélvica, e a partir do bulbous
diverticulum estende-se posteriormente e lateralmente. A partir desse ponto o pênis estende-se
anteriormente ao longo da parede ventral por dentro do tecido subcutâneo para terminar na
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papila genital elevada ventral. O orifício externo da uretra localiza-se na ponta da glande, o
final do pênis em forma de clava, que geralmente é recoberta por uma camada refletida de
pele, o prepúcio.
Histologicamente, o pênis é composto por três massas cilíndricas de tecido erétil
organizado mais a uretra, envolta externamente por pele (Figura 2). Estas encontram
interligadas quando o órgão está flácido, mas se preenchem de sangue durante a ereção, tais
estruturas irrigadas pelas artérias dorsais e profundas, são controladas pela estimulação do
nervo parassimpático, o qual permite o preenchimento dos cilindros através de desvios
atriovenosos, caracterizando a ereção do órgão. O tecido que envolve a uretra peniana em
todo o seu trajeto; na sua porção terminal, dilata-se formando a glande (Junqueira & Carneiro,
2004).
Os corpos cavernosos do pênis e da uretra são formados por um emaranhado de vasos
sanguíneos dilatados, revestidos por endotélio O prepúcio é uma prega retrátil da pele do
pênis contendo tecido conjuntivo, com músculo liso no seu interior. Observam-se, na sua
dobra interna e na pele que recobre a glande, pequenas glândulas sebáceas (Junqueira &
Carneiro, 2004).
Figura 2 – Esquema de estrutura de corte transversal do pênis.
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25
2. Patologia
2.1.O Câncer de Pênis
O câncer de pênis é um tipo raro de neoplasia, que atinge aproximadamente 1/100.000
homens nos países desenvolvidos (Frisch & Goodman, 2000; Griffiths & Mellon, 1999). A
alta incidência é observada em países em desenvolvimento, incluindo Brasil, Índia e China, os
quais apresentam taxas de incidência consideravelmente elevadas para este tipo de neoplasia
(Pow-Sang et al., 2002; Levi et al., 1998), acometendo principalmente homens na terceira
idade, independentemente de sua origem étnica. Os homens são mais comumente afetados
entre 50 a 70 anos. No entanto, indivíduos jovens também podem ser afetados, e de fato,
aproximadamente 22% dos casos são pacientes com idade inferior a 40 anos. (Pow-Sang et
al., 2002; Griffits & Mellon, 1999).
A doença acomete indivíduos de baixo nível social e com precários hábitos de higiene.
Geralmente incide em pacientes não circuncizados, associado à fimose e à má higiene genital.
Nos países onde a circuncisão infantil é comum, como Israel e Estados Unidos, a incidência
do carcinoma escamoso de pênis é baixa (Fernandes, 2002; Graham et al., 1979). A higiene
adequada e a circuncisão precoce previnem a ocorrência da neoplasia na idade adulta. A
história de fimose é encontrada em aproximadamente 25% dos pacientes com câncer de pênis.
A fimose está associada ao carcinoma invasivo de pênis e as lesões pré – cancerígenas, sendo
encontrada em 15% a 20% dos pacientes (Pow-Sang et al., 2002). Desta forma, é importante
esclarecer a população no sentido da prevenção do câncer de pênis. O conhecimento de que os
maus hábitos de higiene da genitália local associados ao efeito carcinogênico da fimose estão
envolvidos no processo neoplásico, assim, proporcionaria a redução da incidência e a da
severidade da doença (Gilliland & Key, 1995).
Os tipos histológicos mais comuns são o carcinoma epidermóide invasivo e uma
variante deste, o carcinoma verrucoso. A eritroplasia de Queyrat e a doença de Bowen são
dois tipos descritos de patologias do pênis, que se apresentam na forma de modificações
celulares epiteliais não invasivas (Ornellas & Bown, 2004). O carcinoma de células
escamosas do pênis (CCE) é o tipo histológico mais comum e o seu prognóstico relaciona-se
com o estádio de expansão do tumor (Cotran et al., 1991). As metástases em linfonodos
inguinais e ilíacos caracterizam a disseminação generalizada (Soria et al., 1998).
Estudos em câncer de pênis tem demonstrado a associação do papilomavírus humano
(HPV) com lesões benignas e malignas (Pow-Sang et al., 2002; Gil et al., 2001). A associação
entre infecção por HPV e tumor peniano levanta considerações sobre o papel do HPV na
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etiologia do câncer de pênis. Evidências sugerem que pacientes infectados com os tipos virais
do HPV 16, 18, 31 e 33 possam ter uma predisposição para o desenvolvimento do carcinoma
escamoso de pênis (Holland-Frei, 2003; WHO, 2002; Gil et al., 2001). O HPV causa o
condiloma acuminado. Embora alguns homens possam ser portadores totalmente
assintomáticos do vírus outros podem abrigar lesões intrauretral desconhecidas ao paciente,
tornando-se uma fonte potencial de transmissão para parceiros sexuais (Teixeira et al., 2002;
McCance et al., 1986).
O pênis é formado por tecidos que incluem pele, nervos, musculatura e vasos
sanguíneos. A apresentação clínica do carcinoma de pênis invasivo se deve às diferenças
histológicas presentes no órgão. Assim, diferentes tipos de neoplasias podem ser
desenvolvidas de acordo com a célula afetada. A diferença celular em nível histológico
determina o tipo de câncer, como também o tratamento (Cubilla et al., 1998; Cubilla, 1995).
A fimose pode obscurecer o tumor, mascarando o diagnóstico. Em geral a
sintomatologia inclui o sangramento e mau cheiro da genitália. Todas as lesões penianas,
particularmente aquelas em que o paciente apresenta o prepúcio não retrátil, requerem uma
atenção especial e devem ser investigadas com a suspeita de neoplasia. A biópsia nestes casos
é uma importante forma de diagnóstico. Em lesões grandes, o diagnóstico é obtido por biópsia
incisional (Pow-sang et al., 2002; Cubilla, 1995).
As neoplasias do pênis são divididas segundo a malignidades, em primárias (aquelas
que originam dos tecidos macios, uretral ou epitelial) e secundárias (aquelas que representam
a doença metastática e que afetam freqüentemente o corpo cavernoso). A primeira etapa no
diagnóstico histológico da malignidade é a confirmação do diagnóstico e da avaliação da
profundidade da invasão por microscopia de biópsia (Pow-sang et al., 2002).
As lesões metastáticas que envolvem o corpo cavernoso são ocasionadas
freqüentemente por nódulos múltiplos, palpáveis, que podem se assemelhar ao cancro
sifilítico (Pompeo & Billis, 2003; Griffiths & Mellon, 1999).
2.2. Estadiamento
O sistema de classificação e estadiamento dos cânceres foi proposto devido à
necessidade de se uniformizar a terminologia utilizada. Assim, foram realizados vários
encontros com comitês internacionais em busca dessa padronização. É de suma importância
alcançar a concordância no registro da informação precisa sobre a extensão da doença para
cada localização anatômica. A correta descrição clínica e a classificação histopatológica das
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27
neoplasias malignas, auxiliam os profissionais no planejamento do tratamento, oferecem
indicação do prognóstico, auxiliam na avaliação dos resultados do tratamento, e, finalmente,
contribuem para a pesquisa contínua sobre o câncer (UICC, 1998).
O sistema de estadiamento TNM oferece informações relacionadas ao Tumor, o seu
tamanho e a extensão para órgãos vizinhos; Nódulos linfáticos regionais, a quantidade e
tamanho dos linfonodos regionais acometidos; e, finalmente, Metástase à distância, a
extensão do tumor para órgãos distantes. As informações combinadas sobre tumor, nódulos
linfáticos e metástase determinam o estadiamento que é descrito em números romanos e
variam de I a IV (UICC, 1998).
Dois sistemas são usados em câncer de pênis: classificação de Jackson (Jackson, 1966)
(Tabela I) e Sistema TNM proposto pela UICC / AJCC (International Union Against Cancer /
American Joint Committee on Câncer - Greene, 2002) (Tabela II).
Tabela I –Classificação de Jackson para o estadiamento do câncer de pênis
Estágio I
Encontra-se circunscrito à glande e ao prepúcio, sem envolvimento do corpo do pênis ou do corpo cavernoso.
Estágio II
Apresenta invasão do corpo cavernoso do pênis, mas sem disseminação para os linfonodos, conforme exame
clínico.
Estágio III Apresenta disseminação clínica nos linfonodos regionais da virilha. A possibilidade de cura depende do número
e da extensão dos nodos envolvidos.
Estágio IV É de natureza invasiva apresentando extenso envolvimento dos linfonodos, sem possibilidade de intervenção
cirúrgica, na virilha e/ou metástases distantes.
Tabela II – Sistema TNM – proposto pela UICC/AJCC para estadiamento do câncer de pênis
Estágio
Descrição
Tumor (T)
Tx
Tumor primário não é passível de avaliação
T0
Sem evidência de tumor primário
Tis
Carcinoma in situ
Ta
Tumor verrucoso não-invasivo
T1
Tumor invade tecido conectivo subepitelial
T2
Tumor invade corpo cavernoso
T3
Tumor invade a uretra ou a próstata
T4
Tumor invade outras estruturas adjacentes
Linfonodos regionais (N)
NX
Linfonodos regionais não são passíveis de avaliação
N0
Sem evidências de infiltração
N1
Metástase únical
N2
Metástase múltiplas ou bilaterais superficiais
N3
Metástase em linfonodos profundos pélvicos ou inguinais
Metástase distante (M)
MX
Presença de metástases distantes não é passível de avaliação
M0
Nenhuma metástase distante
M1
Metástase à distância
2.3. Apresentação clínica
A queixa do paciente comumente é a presença de lesão vegetante ou áreas de
ulceração peniana. Estas lesões variam quanto às dimensões e freqüentemente o paciente
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28
procura o atendimento médico tardiamente, por falta de recursos locais ou mesmo por temer o
tratamento cirúrgico (Pompeo & Billis, 2003).
Os tumores penianos tendem a evoluir de maneira lenta, inicialmente superficial,
invadindo a seguir o córion, o tecido esponjoso da glande e os corpos cavernosos. A
infiltração da uretra é rara e em geral ocorre apenas nas fases avançadas da evolução dos
tumores dos corpos cavernosos, por via hematogênica. O comportamento biológico desses
tumores tende a ser uniforme, com disseminação para linfonodos inguinais, linfonodos
pélvicos, periaórticos e raramente apresentam comprometimento visceral. Os pacientes não
tratados ou cujo tratamento foi ineficaz em geral morrem por complicações secundárias às
metástases inguinais, ou seja, hemorragias por lesões tumorais de grandes vasos ou processos
sépticos (Pompeo & Billis, 2003; Pizzocaro et al., 1997; Jones et al., 1993).
A disseminação tumoral tem relação com as características histopatológicas da lesão
primária. É fato reconhecido que lesões de grandes dimensões e com histologia desfavorável
têm tendência a maior disseminação. O conhecimento desses aspectos histopatológicos tem
importância fundamental no planejamento terapêutico, assim como no prognóstico dos
pacientes. A padronização do exame anatomopatológico, assim como sua interpretação é
indispensável para os médicos oncologistas (Pompeo & Billis, 2003; Schellhammer &
Gabastald, 1986).
2.4. Tratamento
O tratamento do câncer pênis é baseado na extensão do tumor primária e de sua
classificação, estabelecidos pela biópsia de lesão. A terapia antibiótica inicia-se antes da
biópsia e continua com a terapia cirúrgica, extendendo-se por 4 a 6 semanas adiconais. Uma
vez que o diagnóstico do tecido é confirmado, os tumores superficiais pequenos podem com
sucesso ser tratados com excisão cirúrgica local, quimioterapia, cirurgia do laser ou terapia
de radiação superficial (Holland-Frei et al., 2003; Blastein & Finklestein, 1990).
Os tumores com extensão maior e com invasão são controlados com cirurgia ou
radioterapia. Porém tumores profundamente invasivos, particularmente aqueles com lesões
que envolvem o eixo distal ou que deformam a glande, são controlados geralmente por
penectomia parcial. Lesões mais avançadas ou tumores que envolvam a base do pênis podem
ser controlados por penectomia total, (Pompeu & Billis, 2003). Lesões mais extensivas ou
aquelas que envolvem a base e a parte uretral bulbar do pênis requer cistoprostatectomia ou
ocasionalmente esvaziamento pélvico anterior ou total, com diversificação urinária. Os
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pacientes que apresentam metástase inguinal devem ser submetidos à linfadenectomia pélvica
na região afetada (Lynch et al., 1998; Srinivas et al., 1987).
É fato conhecido que aproximadamente 20% dos tumores estadiados clinicamente
como localizados no pênis têm metástases linfonodais. Em contrapartida, 50% dos linfonodos
clinicamente comprometidos, não têm tumor e sim reação inflamatória (Pompeu & Billis,
2003). É recomendável que sejam feitos cortes de congelação durante as linfadenectomias, o
que poderia implicar no aumento da extensão da dissecção (McDougal et al., 1986). Nas
linfadenectomias inguinais parciais (linfonodos sentinelas ou superficiais), quando presentes,
indicam a necessidade de um estudo histopatológico com objetivos avaliar o estadiamento e
assim sugerir o tratamento terapêutico adequado (Burgers et al., 1992; Schellhammer &
Gabastald, 1986). Os cortes de congelação devem informar sobre eventual presença de células
neoplásicas. O laudo definitivo do material (parafina) deve ser elaborado posteriormente
(Pompeu & Billis, 2003; Burgers et al., 1992; McDougal et al., 1986).
Estudos recentes confirmam a importância da classificação do tumor e do
estadiamento que auxiliam no prognóstico e na terapêutica. Os pacientes com tumores da
classe I, que são limitados à pele e aos tecidos superficiais do pênis, são improváveis de se
espalhar à região inguinal. Os pacientes com as lesões da classe II ou da classe III com
qualquer grau de invasão na estrutura peniana possuem um risco significativo do
aparecimento de metástases (Ornellas & Brown, 2004; Theodorescu et al., 1996; Fraley et al.,
1989).
3. Conclusão
O carcinoma de células escamosas é uma doença que em grande parte pode ser
prevenida. O fato da incidência ser maior em países em desenvolvimento do que em países
desenvolvidos se deve às circunstâncias sócio-econômicas, aos maus hábitos de higiene e a
promiscuidade, além das dificuldades ao acesso à saúde. Considera-se fator de risco, para uma
determinada doença, todo e qualquer fator que contribui para o surgimento desta enfermidade.
No entanto, a ocorrência de um ou mais fatores de risco não implica, necessariamente, na
presença da doença. Para o câncer de pênis, epidemiologicamente, a não realização de
circuncisão, a presença de fimose, higiene inadequada, as infecções virais e o comportamento
sexual de risco são os principais fatores para o desenvolvimento da neoplasia (Holland-Frei,
2003).
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De todos os tumores urológicos, o carcinoma peniano constitui a analogia mais próxima
do câncer de colo uterino. Estudos epidemiológicos demonstram estreita correlação entre os
dois tipos de câncer. Embora as incidências relativas variem, as regiões do mundo com as
taxas mais elevadas de incidência de câncer de colo uterino apresentam também a incidência
mais alta de câncer de pênis. Mulheres de homens com câncer peniano correm risco de 2,8 a
3,2 vezes mais elevado de desenvolvimento de câncer de colo uterino (Schiffman & Castle,
2003; Teixeira et al., 2002). Esses achados em combinação com a associação do HPV ao
câncer de colo uterino tornam provável a associação entre o HPV e o câncer de pênis.
A compreensão melhor da histologia do tumor confere uma avaliação mais precisa para
o prognóstico e terapêutica. O tratamento da neoplasia é sempre cirúrgico, com retirada da
lesão e, em alguns casos, com a amputação parcial do membro e a retirada dos gânglios da
região inguinal (primeiro sítio de metástase desta doença). O diagnóstico precoce é
fundamental para evitar o desenvolvimento da doença e a amputação com conseqüências
físicas, sexuais e psicológicas ao paciente.
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Capítulo 2. História Natural da Infecção por Papilomavírus Humano
Resumo
Os HPVs são capazes de transformar e imortalizar uma célula. Portanto, o vírus pode agir
como um fator de iniciação do processo neoplásico. Atualmente são conhecidos mais de 100
tipos virais, classificados em dois grupos de acordo com a categoria de risco para o
desenvolvimento de neoplasias: HPVs de baixo risco oncogênico, indeterminado ou
desconhecido e de alto risco oncogênico. Os genes virais envolvidos no processo
carcinogênico são E6 e E7, pois suas oncoproteínas são capazes de se ligar a proteínas
sentinelas do ciclo celular, p53 e pRb, fazendo com que as mesmas sejam inativadas ou
degradadas. Conseqüentemente, promove-se a desregulação do ciclo celular, iniciação e
progressão tumoral. A história natural da infecção viral e os estudos moleculares dos
carcinomas associados ao HPV proporcionam a compreensão da patogênese e fornece
embasamento para a prevenção da doença em nível coletivo, com respaldo nas tendências
epidemiológicas observadas para patologia.
Palavras-chave: HPV, p53, pRb (gene supressor de tumor) e carcinogênese.
Abstract
HPVs are capable of transforming and immortalizing a cell and, therefore they can act as
initiation factors for the neoplasic process. At the present time, 100 types have been
described, which are classified in two groups according with the category of risk for the
development of neoplasia, HPVs of low and high oncogenic risks. Genes involved in the
carcinogenic process are E6 and E7, therefore their oncoproteins are capable of binding to
the proteins of the cellular cycle, p53 and pRb, leading them to inactivation or degradation,
and consequently deregulating the cell cycle, and thus initiating the tumoral progression. The
natural history of the viral infection and the molecular knowledge of HPV related carcinomas
provide the understanding of the pathogenesis of the disease and supply the base for
prevention of the disease at the collective level, within the epidemiological trends observed
for pathology.
Key-words: HPV, p53, pRb (tumor suppressor gene) and carcinogenesis
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1. Introdução
O papilomavírus humano (HPV) tem sido associado a um largo espectro de lesões
muco-cutâneas, incluindo verrugas na pele, verrugas genitais, papilomas e câncer (Boccardo
& Villa, 2004; Castellsagué et al., 2002). Dos mais de 100 tipos virais molecularmente
genotipados, cerca de 40 tipos tem sido demonstrados em infecções da mucosa genital, dos
quais 15 tipos são considerados carcinogênicos para o epitélio da cérvice uterina (Muñoz et
al., 2003). Os estudos moleculares têm fornecido evidências de que o HPV causa alterações
no genoma e na fisiologia das células hospedeiras. Tais modificações são a causa subjacente à
iniciação e à promoção dos tumores (zur Hausen, 2002). Em cerca de 99,7% dos casos de
carcinoma cervical, a infecção do epitélio por HPV tem sido observada, sendo os HPVs 16,
18, 31 e 33 os tipos mais freqüentemente encontrados (Burd, 2003; Muñoz et al., 2003;
WHO, 2002, Castellsagué et al., 2002; Pornthanakasem et al., 2001), conferindo a esta
particular neoplasia o segundo tipo de câncer feminino mais prevalente no mundo. Assim, o
HPV é considerado como o agente etiológico do carcinoma de cérvix uterina (Yu et al., 2005;
Boccardo & Villa, 2004; Muñoz et al., 2003; Castellsagué et al., 2003; IARC, 1995).
A infecção genital ocasionada pelo HPV é uma doença sexualmente transmissível
(DST) que acomete homens e mulheres (Burd, 2003; Ho et al., 1998). A disseminação do
HPV tende a ser universal entre os indivíduos sexualmente ativos, sendo o homem um
importante fator propagador deste vírus entre as mulheres (Teixeira et al., 2002; Walboomers
et al., 1999). No entanto, o câncer de pênis constitui uma neoplasia rara, sendo pouco comum
em países desenvolvidos. Em geral a incidência anual dos carcinomas penianos é de 0,29 por
100.000 habitantes. Todavia, nos países da África e da América do Sul, a sua incidência pode
chegar até 4,4 casos por 100.000 habitantes (Rubin et al., 2001; Picconi et al., 2000). No
Brasil, a incidência dos tumores penianos varia conforme a região estudada. Nas regiões
Norte e Nordeste observam-se índices de 5,5% a 16% e para as regiões Sul e Sudeste de 1 a
4%, respectivamente (Gil et al., 2001). Alguns estudos recentes têm descrito a associação de
câncer de pênis com HPV baseados na evidência de que o genoma viral é identificado no
epitélio tumoral com freqüências variando de 30 a 50%. (WHO, 2002; Bezerra et al., 2001;
Picconi et al., 2000).
O avanço contínuo das técnicas de detecção molecular tem possibilitado a identificação
de genoma do HPV em associação com diversos tecidos, incluindo as células neoplásicas
malignas (Villa, 1998). A presença do HPV em carcinomas de pênis foi demonstrada pela
primeira vez no início da década de 80 (Durst et al., 1983). No Brasil, os primeiros relatos são
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33
de 1986, demonstrando a presença de HPV em 44,4% e 50,9% dos pacientes com tumores
penianos (McCance et al.,1986; Villa & Lopes,1986).
2. História Natural da Doença
A História Natural da Doença (HND) compreende todas as inter-relações entre o
hospedeiro, o agente etiológico e o meio ambiente. Em desequilíbrio, os três elementos
interagem, resultando na patologia (Rouquayrol e Goldbaum, 2003). O conhecimento da
HND na carcinogênese dos tumores penianos proporciona a compreensão da patogênese e
fornece embasamento para a prevenção da doença em nível coletivo, com respaldo nas
tendências epidemiológicas observadas para esta patologia.
3. O Agente etiológico
Os HPVs, membros da família Papilomaviridae (Menzo et al., 2001), são vírus
relativamente pequenos, não envelopados e com cerca de 55 nm de diâmetro. Os
papilomavírus possuem genoma circular de DNA de fita dupla, contendo aproximadamente
8.000 pb (Figura 1), são mucoepiteliotrópicos e espécie-específicos (Boccardo & Villa, 2004).
Com o avanço das técnicas moleculares, já foram genotipados mais de uma centena de
tipos de HPVs. Atualmente, os HPVs são classificados em baixo risco, de risco intermediário
ou desconhecido e alto risco oncogênico. A Tabela I, relaciona os tipos de HPVs mais
freqüentemente citados conforme o risco oncogênico associado a sua infecção (De Villiers et
al., 2004; Boccardo & Villa, 2004; Villa, 2003; Burd, 2003; Muñoz, 2003; Silva et al., 2003).
Tabela I. Classificação dos HPVs quanto a categoria de risco oncogênico.
*Tipos virais associados a diferentes graus de lesões escamosas intraepiteliais carcinomas cervicais e pênis
(Boccardo & Villa, 2004; Silva et al., 2003).
Risco Oncogênico
Tipo viral HPV
Inespecífico ou
30, 34, 53, 57, 62, 64, 67 e 69.
indeterminado
Baixo risco
6*, 11*, 26, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 73 e 81.
Alto Risco
16*, 18*, 31*, 33*, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 66 68 e 82.
O genoma do vírus HPV codifica em geral de 9 a 10 genes, sendo de 7 a 8 encontrados
na região precoce E (do inglês, Early) e dois na região tardia L (do inglês, Late). A função
atribuída aos produtos dos genes está descrita na tabela II.
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34
Tabela II. Funções das proteínas expressas a partir de genes das regiões precoce E e tardia L contidos no
genoma do HPV (Silva et al., 2003; zur Hausen, 2002; Villa, 1998).
Genes
Função
Precoce
E1
Replicação do DNA viral
E2
Controle da Transcrição
E4
Maturação do vírus e alteração da matriz intracelular
E5, E6 e Estímulo da proliferação e transformação celular
E7
Tardio
L1
Codificação da proteína principal do capsídeo
L2
Codificação da proteína secundária do capsídeo
Os principais genes dos HPVs envolvidos na oncogênese vírus–induzida dos tumores
epiteliais são E5, E6 e E7. Os produtos protéicos originados mediante a expressão destes
genes são capazes de imortalizar e transformar as células da camada basal dos epitélios
mucosos (Burd, 2003; Silva et al., 2003; Villa, 1998). A expressão contínua das proteínas
virais é essencial para o desenvolvimento e evolução da neoplasia maligna, a exemplo do
carcinoma da cérvix uterina (Burd, 2003; Schiffman & Castle, 2003; Villa, 1998).
A região codificadora do gene E1 leva à produção de uma fosfoproteína de 68 KDa
com alta afinidade pelo DNA. O complexo protéico formado pelas proteínas E1 e E2, as quais
são de extrema importância nos mecanismos de replicação viral. Já a proteína codificada pelo
gene E2, além de controlar a transcrição de outros genes como E6 e E7, parece possuir
atividade estimuladora da função da proteína supressora tumoral p53. Estudos moleculares
indicam que a expressão de E2 pode resultar em apoptose (Brenna & Syjänen, 2003; Silva et
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35
al., 2003; Villa, 2003).Quando ocorre a integração viral, a região dos genes E1/E2, sofre uma
interrupção do controle transcricional, resultando na perda da função controladora de E2,
gerando a expressão descontrolada da região precoce do genoma viral, levando a síntese
continua das proteínas E6 e E7 (Figura 2) (Villa, 1998).
Os
genes
E6
e
E7
desempenham papel importante no
processo
que
culmina
a
transformação celular neoplásica,
tendo
a
expressão
dos
genes
aumentada pela perda do gene E2, o
que proporciona a imortalização
celular (Burd, 2003; Silva et al.,
2003).
4. Transmissão
A infecção por HPV está
associada ao desenvolvimento de
processos neoplásicos da cérvix
uterina, vulva, pênis e ânus e à
formação de verrugas na pele.
Assim, os HPVs anogenitais do tipo
6, 11 e 42 causam lesões benignas, como os condilomas. Os tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45 e 58
causam lesões malignas. Em conseqüência da presença de HPV nas mucosas anogenitais, o
vírus é mais comumente transmitido durante as relações sexuais (Yu et al., 2005; Schiffman
& Castle, 2003; Muñoz et al. 2003), sendo esta via considerada como a principal maneira de
transmissão do HPV entre humanos (Eluf-Neto, 1998; Villa & Schlegel, 1991). As infecções
genitais pelo HPV são transmitidas presumivelmente através da superfície do epitélio genital
durante o ato sexual, tanto em casais heterossexuais quanto em homossexuais (Schiffman &
Castle, 2003, Kjaer et al., 2001, Frisch et al., 1999; Frisch et al., 1997; Wickenden et al.,
1987).
Há poucos estudos relacionados à transmissão do HPV por vias não sexuais, tais como
fômites, provavelmente devido a sua pouca importância quando comparada a transmissão
sexual. No entanto, a transmissão vertical tem merecido destaque na literatura, pois esta via de
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36
transmissão é particularmente importante na infecção do recém nascido por HPV (Silva et al.,
2003). Diversos estudos epidemiológicos demonstram que o número de parceiros sexuais é
um importante fator de risco na infecção e disseminação de HPV, sobretudo para as infecções
anogenitais (Kjaer et al., 2001). A existência de diferentes formas quanto ao comportamento
sexual dos indivíduos seria uma explicação para a acentuada prevalência de infecção por HPV
encontrada nos diferentes países (Villa, 1998; Villa & Schlegel, 1991).
Comumente, o homem é avaliado após sua parceira apresentar lesões genitais causadas por
HPV. No entanto, devido ao alto potencial oncogênico desta DST, é fundamentalmente
necessário pesquisar a presença de HPV nos homens, mesmo na ausência de lesões clínicas
aparentes, tal conduta diminuiria consideravelmente o risco de recidivas da infecção na
mulher (Teixeira et al., 2002), além de possibilitar o diagnóstico precoce de infecção e
conseqüentemente atuar como medida preventiva para os tumores epiteliais anogenitais. Em
seu estudo, Castellsagué e colaboradores (2002) concluíram que a circuncisão em homens está
associada com a redução da infecção genital masculina por HPV e, conseqüentemente a
redução do risco de câncer cervical em suas parceiras sexuais. A circuncisão pode ser
considerada um importante co-fator na história natural da redução das infecções por HPV,
bem como nos carcinomas cervical e peniano, visto que o homem pode ser considerado um
elo importante na cadeia de disseminação do vírus na população (Teixeira et al., 2002; Bosch
et al., 1996).
5. Infecção e Persistência
O HPV infecta células epiteliais do tecido epitelial pavimentoso estratificado da pele e
mucosas, produzindo vírions durante a diferenciação das células. A infecção inicial pelo HPV
provavelmente ocorre em células epiteliais tronco e basais ou células que estão
transitoriamente em divisão, localizadas nas camadas mais baixas do epitélio estratificado.
Após sua entrada na célula, o genoma do HPV é estabilizado na forma de elementos
extracromossômicos nos núcleos e o número de cópias desta unidade replicativa aumenta para
aproximadamente 50 a 100 cópias por célula. Ao se dividirem, as células infectadas
distribuem eqüitativamente o DNA do genoma viral entre as células filhas. As células que
migram da camada basal após sucessivas divisões, iniciam um processo contínuo de
diferenciação, enquanto as células que permanecem na camada basal fazem parte do
contingente de células de manutenção e reposição do epitélio. Assim, as células basais
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37
indiferenciadas constituem o reservatório de DNA viral (Figura 3) (zur Hausen, 2002; Silva et
al., 2003).
Apesar da infecção pelo HPV acontecer nas camadas basais, a produção do vírus é
restrita às células da camada suprabasais, pois as células da camada basal não são lisadas pela
produção dos vírions, mas continuam as proliferações. Conseqüentemente, por apresentar um
ciclo dependente da diferenciação epitelial a infecção ocasionada por HPV promove sua
manutenção e persistência nas camadas basais do epitélio infectado por um período de até
vários anos (Silva et al., 2003; Stubenrauch & Laimins, 1999).
A maioria das infecções por HPV é transitória, sendo que apenas um pequeno número
de indivíduos infectados tende a mantê-la de forma persistente. Além disso, a persistência da
infecção é maior em pacientes infectados com os HPVs de alto risco oncogênico. Estes
achados sugerem que as infecções persistentes são as que efetivamente contribuem para a
tumorigênese peniana. De fato, estudos epidemiológicos recentes indicam que mulheres
persistentemente infectadas com HPVs de alto risco oncogênico tem maior probabilidade de
desenvolver lesões neoplásicas cervicais quando comparadas a mulheres com infecções
transientes (Burd, 2003; Ward, 2002; Stubenrauch & Laimins, 1999).
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38
Não é possível estabelecer o intervalo mínimo entre a infecção por HPV e o
desenvolvimento de lesões epiteliais. O vírus pode permanecer por muitos anos no estado
latente e, assim, a recidiva das lesões pode estar relacionada à ativação de reservatórios
próprios ou a reinfecção pelos parceiros sexuais, sintomáticos ou não. Na infecção latente,
para a qual não existe lesão identificável, a detecção do vírus é possível mediante o uso das
técnicas moleculares e, mesmo assim, é detectável apenas o DNA genômico do HPV (Burd,
2003; MS, 2003).
Os protocolos técnicos de Southern Blotting e Hibridização in situ têm sido descritos
em estudos moleculares para a identificação e genotipagem de HPV. No entanto, os dois
métodos possuem os parâmetros de sensibilidade e de especificidade reduzidos para a
detecção viral. Atualmente, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR do inglês, Polymerase
Chain Reaction), que usa primers específicos para amplificação de DNA viral, é a técnica de
escolha para a detecção e genotipagem do genoma do HPV. A PCR é uma técnica bastante
sensível e específica, que aliada à facilidade de sua metodologia, torna-se ideal para o
diagnóstico e detecção viral (Iftner & Villa, 2003; Franco, 2003; Szuhai et al., 2001).
6. Imunidade
A infecção natural pelo HPV é seguida por uma resposta imune humoral e celular
contra as proteínas virais. Anticorpos contra proteínas do capsídeo de HPV são formados no
decorrer da infecção. No entanto, a detecção de IgG e IgA específicas para L1 de HPV 16 não
se correlaciona com a eliminação viral. De fato, as respostas sistêmicas de IgG são mais
freqüentes em pacientes com detecção persistente do DNA viral. Além disso, anticorpos
contra as proteínas precoces E6 e E7 dos HPVs 16 e 18 ocorrem com mais freqüência e, em
títulos maiores, em pacientes com carcinoma de colo de útero do que em mulheres normais
(Boccardo & Villa, 2004).
A resposta imune celular mediada por linfócitos T CD4+ (auxiliar) e CD8+ (citotóxico)
parece ser a mais importante na eliminação de infecções genitais pelo HPV. Condilomas em
regressão espontânea apresentam um infiltrado celular composto essencialmente de linfócitos
T e macrófagos. Em pacientes com imunodeficiência celular, seja iatrogênica ou adquirida, há
aumento da prevalência de lesões associadas ao HPV, além de maior chance de progressão
para lesões pré-invasivas mais graves (Alcami & Koszinowski, 2000).
Entretanto, os mecanismos que controlam a resposta imune contra o HPV são pouco
conhecidos. Uma resposta ineficiente pode implicar a persistência da infecção, especialmente
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39
por tipos oncogênicos de HPV, que é considerado o principal fator de risco para o
desenvolvimento de lesões neoplásicas do colo uterino (Boccardo & Villa, 2004).
7. Transformação Celular
O HPV é capaz de transformar e imortalizar uma célula, iniciando assim o processo
maligno. Os produtos dos genes E6 e E7 são importantes para a transformação e imortalização
celular. O produto do gene E6, a proteína E6, tem uma grande afinidade pelo DNA e é
encontrada tanto no núcleo como na membrana plasmática. Já o produto do gene E7, a
proteína E7, é uma fosfoproteína encontrada no citoplasma e, provavelmente, no núcleo
(Lewin, 2001;Garcia-Carranca & Gariglio, 1993). Os produtos dos genes supressores de
tumores presentes nas células como as proteínas pRb e p53 são alvo da ação dos produtos dos
genes dos HPVs. Em geral a atividade de pRb é inibida pela proteína viral E7, por outro lado,
a p53 é degradada subseqüentemente à ligação com a proteína E6. A perda da função de
ambas as proteínas responsáveis pela supressão tumoral contribui para a progressão de
tumores (Brenna & Syjänen, 2003; Silva et al., 2003; zur Husen, 2002; Vousden, 1993).
Geralmente, o genoma viral encontra-se em estado epissomal no núcleo das células de
tecido com alterações benignas ou pré-malignas o aumento da expressão dos genes E6 e E7
em lesões malignas pode ser associado pela integração do DNA viral no genoma celular ao
longo do progresso tumoral. A integração acontece ao acaso no DNA celular, mas
invariavelmente interrompe a região E1-E2 do genoma viral. Isto altera o controle negativo
exercido pela proteína E2 na expressão dos genes E6 e E7 (Boccardo & Villa, 2004; Bechtold
et al., 2003; Lukaszuk et al., 2003).
Inúmeras funções têm sido descritas para E6 e E7. Os produtos desses genes
interagem bloqueando os supressores de tumores. Certamente, das funções proeminentes da
proteína E6 é a degradação de p53, resultando na resistência a apoptose e no aumento da
instabilidade cromossomal. Tem sido especulado que a estabilização de formas ativadas de
membros específicos da família SRC poderia contribuir para a transformação do fenótipo
celular – HPV (zur Hausen, 2002).
O gene Rb é um supressor de tumor localizado no cromossomo 13q14, que tem como
produto à proteína celular pRb, de aproximadamente 105 kDa. A pRb tem a função de inibir a
progressão do ciclo celular, pois é capaz de seqüestrar o fator de transcrição E2F e impedi-lo
de promover a transcrição de genes necessários para a replicação do DNA na fase S. Assim, a
pRb exerce uma regulação negativa do ciclo celular através da sua fosforilação específica
ciclo-dependente. A associação da pRb com a proteína viral E7 causa uma perturbação no
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40
controle normal do ciclo celular, resultando em um estímulo excessivo para a proliferação das
células infectadas (Silva et al., 2003; zur Hausen, 2002).
A proteína E7 de HPVs de alto risco está associada a degradação das proteínas da
família Rb, incluindo a p107, a p130 e a própria pRb. A E7 é reconhecidamente eficiente na
formação de complexos com ciclinas A e E. No entanto, estudos recentes sugerem essa
mesma eficiência quando E7 forma complexos estáveis com as proteínas p21 e p27. Com a
degradação da pRb o fator de transcrição E2F não pode ser reprimido, em conseqüência, a
célula perde o controle do ciclo celular (Silva et al., 2003; Stubenrauch & Laimins, 1999).
O gene p53 é um supressor de tumor localizado no cromossomo 17p13, cujo produto é
a proteína p53. Esta proteína é responsável por monitorar os danos ocorridos nas moléculas de
DNA. O ciclo celular é impedido de prosseguir até que o dano no DNA seja restaurado
(Lewin, 2000). A proteína E6 de HPVs de alto risco se associa a proteína p53, que é
responsável pela regulação da passagem da fase G1 para S e da fase G2 para M, no ciclo
celular. A proteína E6 recruta a proteína celular E6AP, que funciona como uma ubiquitinaligase para o complexo contendo p53. Este recrutamento resulta na ubiquitinação de p53
seguido de sua rápida degradação (Brenna & Syjänen, 2003; zur Hausen, 2002; Silva et al.,
2003; Stubenrauch & Laimins, 1999; Brown & Pagano, 1997). Sem a proteína p53 a célula
perde a capacidade de perceber e reparar possíveis danos no DNA, assim a divisão celular
passa a ocorrer sem reparo. Conseqüentemente, aumenta-se a freqüência das mutações, dos
rearranjos cromossômicos e das aneuploidias. O acúmulo de eventos mutacionais é a causa
subjacente ao desenvolvimento de um fenótipo neoplásico e, conseqüentemente do câncer
(Brenna & Syjänen, 2003; Vogel & Motulsky, 2000; Griffiths et al., 1999; Vousden, 1993).
8. Conclusão
A elucidação da história natural da infecção por HPV em pênis possibilitará uma
melhor compreensão da etiologia e da patogênese viral e seu papel na carcinogênese dos
tumores de pênis. Infecções por HPV e sua detecção em homens não seguem a rotina
diagnóstica aplicada às mulheres, em parte porque a mucosa epitelial das mulheres é
abundantes em células, o que facilita a coleta e o diagnóstico. Nos homens, no entanto, a
escassez de células epiteliais da mucosa peniana dificulta o diagnóstico. Diversos estudos
epidemiológicos demonstram a presença do HPV como um elemento obrigatório nos
processos neoplásicos malignos nos carcinomas cervicais (99,7%), tornando o homem um
fator importante associado à disseminação do vírus.
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O homem é um importante agente disseminador do HPV entre as mulheres e a
disseminação do vírus tende a ser universal entre os indivíduos sexualmente ativos (Teixeira
et al., 2002). Castellsangué e colaboradores (2002) demonstraram a alta prevalência de
infecções por HPV e a variabilidade dos tipos virais em homens estão relacionadas ao
comportamento sexual. Os autores sugeriram que a infecção masculina poderia ser a causa
subjacente ao aumento da carcinogênese cervical em suas parceiras sexuais, sendo a
promiscuidade o principal fator de risco. As infecções por HPV em homens não parecem ter
as conseqüências observadas na infecção feminina, nas quais os co-fatores, como os
hormônios femininos e o uso contínuo de contraceptivos hormonais, participam de forma
combinada no processo de múltiplas etapas da oncogênese cervical (Villa, 2003; Moreno et
al., 2002; Villa, 1998).
As proteínas oncogênicas E6 e E7 são capazes de imortalizar e transformar as células,
promovendo o descontrole do ciclo celular na célula hospedeira. A expressão contínua das
proteínas virais desencadeia o processo neoplásico. A progressão tumoral, subseqüente a
infecção em células normais, também está sujeita a fatores ambientais, como carcinógenos
químicos presentes no tabaco, ou restrito ao hospedeiro, tais como resposta imune, herança
genética e hábitos sexuais.
O HPV é capaz de alterar o ciclo celular pela expressão das proteínas virais E6 e E7 na
inativação e eliminação dos produtos de genes supressores de tumor. Em geral a atividade de
Rb é inibida pela proteína viral E7, por outro lado, a p53 é degradada subseqüentemente à
ligação com a proteína E6. A perda das funções de ambas as proteínas responsáveis pela
supressão tumoral contribui para a progressão de tumores (Vousden, 1993). O processo de
interação entre as proteínas virais e as proteínas celulares, altera o controle do ciclo celular,
fazendo da infecção por HPV um potente fator de iniciação e promoção de tumores, que deve
ser avaliado em conjunto com todas as variáveis envolvidas na carcinogênese para estabelecer
os riscos relativos e os prognósticos individuais.
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Capítulo 3. O Papilomavírus Humano e Saúde Pública: importância da distribuição de
uma cartilha educativa à população.
Resumo
O papilomavírus humano (HPV) foi primeiramente associado a tumores benignos, como verrugas e condilomas.
Com o avanço das técnicas moleculares de detecção do genoma viral, o DNA do vírus passou a ser identificado
em associação com células neoplásicas malignas do colo e cérvice uterina, da vagina, da vulva, do pênis, do
ânus, e da cavidade oral e da laringe. Devido a relação etiológica do HPV com os carcinomas de colo uterino,
faz-se necessário a elaboração de instrumentos que esclareçam a população. Aqui propomos uma cartilha
educativa com o propósito de informar sobre a prevenção e a transmissão do HPV e sua relação com o processo
neoplásico. Em um estudo piloto, a cartilha informativa foi aplicada a 200 pessoas leigas na faixa etária de 15 a
55 anos de idade de ambos os sexos, com escolaridade variando de Ensino Médio a Superior. Posteriormente, os
participantes responderam a um questionário para a avaliação de alguns aspectos da cartilha e seu conhecimento
geral sobre o tema apresentado. Dos questionários analisados, 64% não tinham o conhecimento sobre o HPV e
sua relação com o câncer. Em relação à transmissão, as regiões de infecção, diagnóstico e prevenção, a
percentagem de compreensão ultrapassou os 90%. Para a questão sobre o câncer de colo uterino, somente 74%
assimilaram que o HPV está associado a esse tipo particular de câncer. A cartilha foi criada com uma linguagem
fácil e com ilustrações que visam chamar a atenção do leitor. A cartilha atingiu o seu objetivo de informação e
prevenção. No entanto, é necessário promover campanhas de conscientização da população em geral sobre o
HPV e sua relação com as neoplasias malignas.
Palavras-chave: Papilomavírus humano, informação e prevenção.
Abstract
Human papilllomavirus (HPV) were first associated to benign skin lesion, such as warts and condilomas. With
the advancement of molecular techniques for detection of the viral genome, the association between the virus
DNA with malignant neoplasic cells of the cervix, vagina, vulva, penis, anus, mouth and larynx was
demonstrated by several studies. Since the etiologic relation between HPV and cervical cancer have been
proved, the elaboration of instruments to inform the general population becomes necessary. Here we consider
one informative booklet with the intention of informing about the transmission of the HPV and its relation to the
neoplasic process. In this pilot study, the booklet was given to 200 people in the aged group from 15 to 55 years,
including both genders, with education levels varying from high school to College. Later, the participants
answered a questionnaire for the evaluation of some aspects described in the booklet. Of the analyzed
questionnaires, 64% did not have the knowledge about HPV and its relation with cancer. In relation to
transmission, the regions of infection, diagnosis and prevention, the percentage of understanding exceeded 90%.
For the question on cervical cancer, 74% had only assimilated that the HPV is associated with this particular
type of cancer. The booklet was created with basic language and illustrations aiming to catch the attention of the
reader. The booklet reached its objective of information and prevention. However, we identified the necessity to
promote campaigns of awareness for the population about the HPV and its relation with the malignant
neoplasias.
Key-words: Human papillomavirus, information and prevention
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43
1. Introdução
O Papilomavírus Humano (HPV) é o agente causal de tumores benignos como
papilomas, verrugas comuns e condilomas (Arbyn et al., 2004; Villa, 1998). As evidências de
associação deste vírus com neoplasias, somadas as evidencias epidemiológicas, permitiram
estabelecer uma relação etiológica entre alguns tipos de HPVs e o carcinoma cervical (Arbyn
et al., 2004; Burd, 2003; Villa, 1998; Schiffman & Brinton, 1995; Schiffman et al., 1993). O
DNA de HPVs de alto risco oncogênico tem sido encontrado em 99,7% dos carcinomas
cervicais, câncer cervical invasivo e lesões pré malignas (Yu et al., 2005; Delucaet al., 2004;
Franco & Schlecht, 2003; Villa, 2003).
Adicionalmente deve-se investigar a associação do câncer cervical com o fator
masculino. As infecções pelo HPV ocorrem em ambos os sexos e a sua alta prevalência
demonstra que a mesma é uma doença sexualmente transmissível (Yu et al., 2005; Villa,
1998; Castellsagué et al., 1997; Schiffman & Brinton, 1995; zur Hausen, 1991). Mais de uma
centena de tipos diferentes de HPV já foram descritos e cerca da metade destes já foram
isolados em amostras de mucosa genital (Picconi et al., 2000). Dados epidemiológicos têm
mostrado que parceiras de homens com câncer de pênis têm uma tendência maior para o
desenvolvimento de neoplasia cervical (Frisch et al., 1997; Graham et al., 1979). Contudo,
estudos da associação entre HPV e carcinoma de pênis são limitados devido à baixa
incidência desta doença comparada aos carcinomas de cérvice uterina. Por outro lado, a
presença de HPV como microbiota normal das mucosas genitais de homens, que não
desenvolvem lesões, pode funcionar como um reservatório do vírus, contribuindo para a sua
disseminação entre as mulheres (Castellsagué et al., 1997).
Assim, a alta prevalência, infectividade e diagnósticos na forma de lesões subclínicas,
assintomáticas, tornam evidente o fato de que a disseminação do HPV tende a ser universal
entre os homens sexualmente ativos. Portanto, o homem é um importante meio propagador
deste vírus entre as mulheres (Bosch et al., 2002). Desta forma é necessária uma maior
preocupação em esclarecer a população sobre a forma de transmissão, diagnóstico, tratamento
e prevenção das infecções ocasionadas pelo HPV.
O objetivo deste estudo foi elaborar uma cartilha contendo informações necessárias à
conscientização e prevenção da população em geral, acerca da carcinogênese da região
anogenital (vagina, vulva, colo do útero, pênis e ânus) (De Villiers et al., 2004; Franco &
Schletcht, 2003; zur Hausen, 2002) e da região de cabeça e pescoço (orofaringe, cavidade
oral, laringe, orofaringe e hipofaringe) (Silva et al., 2003; Aaltonen et al., 2002; Vancurova et
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
44
al., 2002; Badaracco et al., 2000; Smith et al., 2000) O esclarecimento da população pode
contribuir para a redução da incidência das neoplasias em homens e mulheres, sobretudo das
neoplasias ocasionadas pelo HPV.
2. Material e Métodos
Foi elaborada uma cartilha piloto intitulada “HPV e sua relação com o câncer” (Anexo
1), contendo desenhos ilustrativos e uma linguagem de fácil entendimento aos leitores,
contendo informações sobre o HPV, incluindo modos de transmissão, dados da patologia,
diagnóstico e prevenção (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Cartilha: HPV e sua relação com o câncer, páginas iniciais nas quais foram discutidos o
Papilomavírus Humano, os tipos virais e as regiões de infecção.
De forma sucinta, as informações sobre o HPV relataram os tipos virais e as regiões
afetadas (anogenital / cabeça e pescoço) pela infecção viral. A cartilha introduz ainda noções
sobre a capacidade dos HPVs em transformar e imortalizar as células e, assim, agir como um
fator de iniciação do processo neoplásico. Como as infecções pelo HPV são consideradas
doença sexualmente transmissível (DST) (Villa, 2003; Picconi et al., 2000; Villa, 1998; Park
et al., 1995; zur Hausen, 1991), foram citadas diversas formas de transmissão: relação sexual,
fômites e canal do parto, indicando as vias de transmissão com desenhos ilustrativos para reter
a atenção do leitor e facilitar o aprendizado.
A transmissão por via sexual é considerada como a principal maneira de transmissão do
HPV entre os humanos (Eluf-Neto, 1998; Villa & Schlegel, 1991), envolvendo as diversas
formas sexuais, incluindo o sexo oral e anal, e tendo relação direta com o número de parceiros
sexuais. Assim, o HPV pode ser transmitido da região genital para as regiões anatômicas de
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Angela Adamski da Silva Reis
45
cabeça e pescoço, podendo iniciar processos neoplásicos nestas regiões, uma vez que o HPV é
mucosotrópico e pode estabelecer-se como microbiota local (zur Hausen, 2002; Villa, 1998).
A transmissão viral por fômites também é possível e foi considerada. A contaminação
vertical pelo canal do parto também foi inserida, especialmente porque os papilomas laríngeos
recorrentes, de início juvenil estão associados à infecção por HPV, geralmente transmitido
pela mãe com infecção anogenital ativa ou latente à criança durante o parto (Silva et al., 2003;
Vancurova et al., 2002; Conejo et al., 2001).
Os leitores foram informados acerca da necessidade de se buscar auxílio do serviço
médico para diagnóstico de infecção por HPV da região genital e região da cabeça e pescoço
quando na presença dos sintomas ou suspeita de infecção.
No aspecto da prevenção foi dada ênfase na transmissão anogenital com o objetivo de
aumentar o nível de conhecimento dos leitores, enfatizando-se a necessidade da mulher estar
procurando o médico ginecologista pelo menos uma vez ao ano para fazer o exame preventivo
do Papanicolaou. Adicionalmente a cartilha estimula o uso de preservativo durante as
relações sexuais e a redução de parceiros sexuais.
Figura 2. Cartilha: HPV e sua relação com o câncer, páginas que demonstram as formas de
transmissão e a relação entre infecção viral e o desenvolvimento de câncer.
A cartilha foi aplicada a 200 pessoas na cidade de Goiânia (GO) de ambos os sexos,
com nível de escolaridade variando do ensino médio a superior. Os voluntários responderam a
um questionário após a leitura da cartilha. O questionário (Anexo 2) era composto por 12
questões de múltipla escolha, que avaliaram o alcance da cartilha como instrumento de
informação e prevenção. As questões eram de caráter educativo abordando o conhecimento
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
46
sobre o vírus, as formas de transmissão, as regiões afetadas pela infecção e os diagnósticos
clínico e laboratorial.
3. Resultados
A análise dos questionários permitiu avaliar a cartilha como instrumento de
informação e prevenção. A faixa etária foi de 15 a 55 anos de idade de ambos os sexos, sendo
a média da faixa etária de 25 anos. A distribuição percentual por sexo foi de 40,5% e 59,5%
para os sexos masculino e feminino, respectivamente (Tabela I).
Tabela I. Distribuição percentual relacionada ao sexo dos voluntários que responderam ao questionário, após a
leitura da cartilha.
SEXO
f (%)
Masculino
40,5
Feminino
59,5
TOTAL
100
Dos 200 questionários respondidos 64% não tinham o conhecimento sobre o HPV e
sua relação com o câncer (Tabela II). Para as questões relacionadas à transmissão, as regiões
de infecção, ao diagnóstico e à prevenção, a percentagem de compreensão ultrapassou os
90%. A cartilha atendeu as expectativas e o interesse dos leitores em 96% dos questionários.
Para a questão sobre o câncer de colo uterino, verificou-se pouco conhecimento individual
sobre o fato do HPV ser o agente etiológico da neoplasia cervical. Após a leitura, somente
74% dos participantes assimilaram que o HPV é o agente causal deste tipo particular de
câncer (Tabela III).
Tabela II. Freqüência percentual de pessoas para o conhecimento do Papiloma Vírus Humano (HPV) e sua
relação com o câncer.
Conhecimento sobre Papilomavírus Humano (HPV)
f (%)
Sim
35,5
Não
64,5
TOTAL
100
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47
Tabela III. Distribuição dos percentuais relacionados às questões sobre a transmissão do Papiloma Vírus
Humano (HPV), região acometida pela infecção, diagnóstico da patologia, prevenção e sobre a relação do
Câncer de colo de útero com o HPV.
Questões avaliadoras da cartilha
f (%)
Transmissão
99
Região afetada pela infecção
97
Diagnostico
92
Prevenção
99
Relação entre câncer de colo de útero e HPV
74
4. Discussão
A Cartilha: HPV e a sua relação com o câncer atendeu as expectativas, pois 98% dos
entrevistados gostaram da forma de apresentação e suas informações. A maioria dos leitores
sugeriu a publicação da Cartilha para ser usada como instrumento informativo em postos de
saúde na região de Goiânia/GO.
A população feminina predominou entre os leitores (59,5%). Nesse contexto,
considerando o desconhecimento sobre o tema, um contingente feminino foi informado de
que o câncer de colo uterino é hoje uma das neoplasias mais comuns entre as mulheres no
mundo (Franco & Schletcht, 2003; zur Hausen, 2002; Badaracco et al.,2000; IARC, 1995).
Desta forma, a cartilha atingiu o público alvo propagando a informação e contribuindo para a
prevenção das infecções e o processo neoplásico ocasionadO pelo HPV.
Cerca de 64% da população analisada não conhecia o HPV e a sua relação com o
câncer. Os dados sugerem que as campanhas educativas de prevenção sobre o papel do HPV
na carcinogênese epitelial devem ser reforçadas para conseqüentemente, a promoção da
saúde, sobretudo porque a infecção pelo vírus é considerada uma DST, sendo um fator
adicional para a progressão de infecção para a neoplasia do câncer de colo uterino.
Tendo em vista que o instrumento para a divulgação da informação e prevenção
continha informações básicas e ilustrações que visavam deter a atenção do leitor em relação
as infecções e aos processos neoplásicos promovidos pelo vírus HPV, a população analisada
absorveu significativamente o conteúdo da cartilha, nos seguintes tópicos: transmissão
(sexual, fômites e canal do parto), as diversas regiões acometidas pela infecção (região genital
/ cabeça pescoço, diagnóstico, prevenção e sobre ao fator de risco do HPV com câncer de colo
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48
de útero; como também os riscos de infecção viral para o sexo masculino. Desta forma
podemos concluir que a cartilha cumpriu o seu papel como veículo para o conhecimento, pois
as questões elaboradas no questionário eram específicas e procuraram verificar se o leitor
absorveu o conteúdo informativo.
Os dados referentes à aplicação da cartilha piloto a um grupo de indivíduos indicam a
necessidade de informar a população, pois 64,5% dos entrevistados não tinham conhecimento
sobre o vírus e as patologias a ele associadas. Cerca de 92% demonstraram interesse em saber
mais informações sobre as patologias promovidas pela infecção por HPV, formas de
transmissão, diagnóstico e prevenção.
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49
Capítulo 4. Estudo epidemiológico do câncer de pênis na população de Goiânia no
período de 1988 a 1999.
Resumo:
Atualmente, o câncer é considerado como a terceira causa de mortalidade no Brasil, tendo o sexo
masculino com maior participação no volume dos óbitos por neoplasias malignas em quase todas as faixas
etárias. A análise epidemiológica de uma dada patologia leva a obtenção de informações importantes que
apontam as tendências e perspectivas da doença nos últimos anos. O objetivo deste estudo foi a avaliação
epidemiológica da incidência, mortalidade e taxa de sobrevida do câncer de pênis em Goiânia no período de
1988 a 1999. O coeficiente médio de incidência anual para o câncer de pênis foi de 3,5/100.000 habitantes,
enquanto que o coeficiente médio de mortalidade anual para a mesma doença foi 2,6/100.000 habitantes. A
sobrevida geral dos 38 pacientes foi estimada em aproximadamente 3,3%, com censura de 42%. O estádio III foi
o mais freqüentemente encontrado ao diagnóstico de câncer de pênis. O diagnóstico em estágios avançados
compromete a sobrevida do paciente. O tratamento de tumores com extensão maior e com invasão dos nodos
regionais são controlados com cirurgia ou radioterapia. Na maioria dos casos de carcinomas penianos, o paciente
deve ser submetido à penectomia parcial ou total, dependendo da extensão do tumor, o que gera agravo do
quadro psicológico do paciente.
Palavras Chaves: Câncer de pênis, epidemiologia e sobrevida
Abstract
Currently, cancer is considered as the third cause of mortality in Brazil, with males having the greater
percentage of deaths for malignant neoplasias in almost all ages. The epidemiological analysis of a given
pathology provides the trends and perspectives of the disease over the time. The objective of this study was to
evaluate the epidemiological aspects, including the incidence, mortality and survival of penile cancer, in the
male population of Goiânia, during the period of 1988 to 1999. The average coefficient of annual incidence for
penile cancer was 3,5/100.000 inhabitants, while the average coefficient of annual mortality was 2.6/100,000
inhabitants. The general survival analysis of the 38 patients was approximately 3.3%, with 42% censorship of
the data. Stage III was the more frequent stage found in the diagnosis of penile cancer. The diagnosis in
advanced stages compromises the survival of the patient. The treatment of tumors with larger extension and
invasion for the regional lymph nodes is performed with surgery or radiotherapy. In the majority of cases of
penile cancer, the patient must be submitted to partial or total penectomy, depending on the extension of the
tumor, which generates the psychological trauma of the patient.
Key words: penile cancer, epidemiology and survival
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50
1. Introdução
As tendências de risco de morte por doenças não transmissíveis nas cinco regiões do
Brasil tem sofrido modificações ao longo das últimas décadas. As doenças do aparelho
circulatório eram a principal causa de morte até o ano de 2000. Em 1980, as neoplasias eram
responsáveis por 10% dos óbitos do país, em 2000 passaram para 15%. Atualmente, o câncer
é considerado como a terceira causa de mortalidade no Brasil, tendo o sexo masculino com
maior participação no volume dos óbitos por neoplasia malignas em quase todas as faixas
etárias (MS, 2004).
A mortalidade por câncer para o sexo masculino é maior que para o feminino, devido
aos comportamentos de saúde-risco (INCA, 2002). Os órgãos masculinos afetados por
neoplasias envolvem especificamente, pulmão, a próstata, estômago, os testículos e o pênis
(MS, 2004). As neoplasias são resultantes da interação entre fatores genéticos e ambientais. A
freqüência percentual da contribuição genética para o desenvolvimento dos cânceres é de
apenas 5%, o restante é atribuída a fatores ambientais que atuam em conjunto com a
suscetibilidade genética (Rossit & Froes, 2002; Davies, 2001).
O aparecimento de um tumor está associado com a ocorrência de alterações genéticas
que se acumulam progressivamente no genoma de uma célula normal. Dessa forma, o câncer
pode ser considerado uma doença genética e a identificação e caracterização dos genes
alterados são fundamentais para a compreensão das bases moleculares da doença. A perda do
controle da proliferação e a aquisição de características associadas com a progressão tumoral
são conseqüências de alterações que ocorrem no conteúdo genético das células normais.
Assim sendo, o câncer pode ser considerado uma doença genética complexa que resulta de
alterações simultâneas em genes geralmente relacionados à proliferação e diferenciação
celular (Parmigiani & Camargo, 2004).
Estudos epidemiológicos sobre neoplasias objetivam a investigação dos efeitos diretos
e indiretos de agentes carcinógenos endógenos e exógenos na iniciação e promoção dos
cânceres em geral. Refletindo uma preocupação política, social e científica, visto que as
doenças oncológicas são consideradas um problema de saúde pública (Silva,1999). A análise
de sobrevida, na área de saúde, geralmente está associada a ensaios clínicos, objetivando
avaliar a eficácia do diagnóstico e do tratamento. Adicionalmente, a análise de sobrevida com
base em populações geograficamente definidas, desempenha um importante papel na
descrição do comportamento de uma doença e de seus fatores prognósticos, permitindo,
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
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51
assim, a obtenção de informações necessárias para a determinação de prioridades na área da
saúde (Louzada-Neto & Pereira, 2003; Bustamante-Teixeira et al., 2002).
Há dois tipos estudos em oncologia que utilizam análise de sobrevida que podem ter o
tempo como variável de interesse. Um deles é o estudo experimental (ensaios clínicos
controlados aleatorizados), indicado para avaliar formas de tratamento. O outro tipo é os de
estudos de coorte observacionais, cujos dados podem ser obtidos pela coleta direta em
prontuários médicos ou em bases de dados já existentes (dados secundários). Essas fontes de
dados secundários podem ser de base hospitalar (registros hospitalares de câncer) ou
populacional (registros de câncer de base populacional). Registros de base hospitalar são
aqueles que se referem a todos os casos tratados e acompanhados em uma instituição.
Fornecem informações tanto para a administração do hospital quanto para pesquisadores
interessados em informações sobre os resultados do tratamento nos diferentes grupos e fatores
de risco ou fatores prognósticos. Contribuem ainda na atenção ao paciente individualmente,
uma vez que asseguram o seguimento destes pacientes (Young, 1991).
Nas análises de sobrevida de base populacional o período de tempo analisado é, via de
regra, aquele decorrido entre o diagnóstico da doença e o óbito. Nesses casos, a sobrevida
exprime a probabilidade de que um paciente esteja vivo após um período determinado
(Micheli et al., 1992) e refletem, além da história natural da doença, as atividades de controle
do câncer, incluindo rastreamento (screening) e organização e qualidade dos serviços de
saúde (Black & Bashir, 1998).
A análise epidemiológica de uma dada patologia leva a obtenção de informações
importantes que apontam as tendências e perspectivas da doença nos últimos anos. O objetivo
deste estudo foi realizar uma avaliação epidemiológica da incidência, mortalidade e taxa de
sobrevida do câncer de pênis em Goiânia no período de 1988 a 1999.
2. Materiais e Métodos
A presente análise epidemiológica corresponde a um estudo retrospectivo de pacientes
diagnosticados com carcinoma de pênis do registro de câncer de Base Populacional de
Goiânia (RCBP) da Associação de Combate ao Câncer em Goiás (ACCG), no período de
1988 a 1999. Para a notificação de novos casos o RCBP segue um fluxograma próprio (Anexo
4) e utiliza uma ficha padronizada para a coleta de dados.
Foram analisados 38 prontuários, referentes às variáveis: idade, data do diagnostico,
data de óbito e hábitos de vida. Os dados referentes ao tumor de cada caso foram
caracterizados segundo CID (Classificação Internacional das Doenças para a Oncologia),
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52
Morfologia, Topologia, Estadiamento TNM e o tipo de tratamento, obtido diretamente dos
prontuários (Anexo 6)
Para a estimativa dos Coeficientes de Incidência, razão entre o número de novos casos
de câncer de pênis em um período de tempo específico e o número de pessoas expostas ao
risco de desenvolver a doença, por 100.000 habitantes, foram consideradas as datas do
diagnóstico individual. Por outro lado, a determinação dos Coeficientes de Mortalidade,
definida pela razão entre o número de mortes por câncer de pênis em um período de tempo
específico e o número de pessoas expostas ao risco de morrer pela doença, por 100.000
habitantes, foram usadas as datas dos óbitos coletadas diretamente dos prontuários.
Os dados dos respectivos pacientes foram tabulados em planilhas, visando a obtenção
da curva de sobrevida. Para o cálculo da sobrevida foi utilizado o método da tábua de vida
atuarial, que contempla o uso de dados incompletos dos prontuários, incluindo data do
diagnóstico, intervalo livre de doença, avaliado através da presença ou ausência de recidivas e
condições de saúde do paciente em sua última visita de acompanhamento clínico (Silva,
1999).
Para os cálculos estatísticos dos coeficientes de incidência e mortalidade e das
sobrevidas, foi utilizado o software Excel® - Microsoft, USA e para a confecção dos gráficos
de sobrevida o software SPSS®.
3. Resultados
No período estudado, o coeficiente médio de incidência anual para o câncer de pênis
foi de 3,5/100.000 habitantes, enquanto que o coeficiente médio de mortalidade anual para a
mesma doença foi 2,6/100.000 habitantes.
Em relação às freqüências percentuais dos casos de câncer de pênis, discriminadas por
faixa etária, 23,7% (9/38) dos pacientes encontravam-se na faixa etária de 51 a 60 anos (6a
década de vida) (Tabela I.).
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53
Tabela I. Freqüência percentual de casos de câncer de pênis por faixa etária e sexo, em
Goiânia no período de 1988 a 1999.
Idade (Anos)
Número
%
21- 30
1
2,7
31- 40
4
10,5
41- 50
3
7,9
51- 60
9
23,7
61 – 70
8
21,1
71- 80
7
18,4
81 – 90
5
13,2
> 90
1
2,7
Total
38
100
Média
4,75
12,3
Em relação ao Estadiamento (TNM), ou seja, o estágio em que o câncer de pênis foi
diagnosticado, dos 38 pacientes com a patologia, 2 (5,26%) se encontravam no estádio I da
doença, 4 (10,52%) no estádio II, 5 (13,15%) no estádio III e, finalmente 3 (7,89%) se
encontravam no estádio IV. Em 24 (63,15%) dos prontuários não foi possível obter
informações sobre o estadiamento, em conseqüência do não preenchimento dos prontuários
ou de classificação dos casos com indefinição (Tabela II e Figura 1).
Tabela II. Freqüência percentual de casos de câncer de pênis por estadiamento, em Goiânia
no período de 1988 a 1999.
Estadiamento TNM
n Pacientes
f (%)
Estádio I
2
5,26
Estádio II
4
10,52
Estádio III
5
13,15
Estádio IV
3
7,89
Indefinido
24
63,15
Total
38
100
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54
A sobrevida geral dos 38 pacientes pode ser observada na Tabela III e Figura 2, sendo
estimada em aproximadamente 3,3%, num período de 5 anos, no intervalo de 1988 a 1999,
com censura de 42%.
Tabela III. Tábua de vida atuarial para o cálculo da sobrevida geral do câncer de pênis, em Goiânia
no período de 1988 a 1999.
Intervalo
Tempo
(anos)
Lx
Dx
Ux
Wx
Lx`
qx`
px`
S(x)
0—1
38
9
11
1
13
0,692
0,308
0,308
1—2
17
0
3
3
5,5
0,000
1,000
0,308
2—3
11
1
1
2
4
0,250
0,750
0,231
3—4
7
2
0
0
3,5
0,571
0,429
0,099
4—5
>5
5
2
1
0
0
1
2
1
1,5
0
0,667
0,000
0,333
0,000
0,033
0,000
13
16 (42%)
9
TOTAL
Onde:
x: representa o intervalo de tempo considerado para o cálculo da variável
Lx: número de pessoas expostas ao risco de morrer
Dx: número de óbitos
Ux: número de censuras
Wx: número de pessoas vivas
Lx’: número de indivíduos expostos ao risco de morrer corrigido pela censura,
Lx’ = Lx – (Wx + Ux)/2
qx’: probabilidade de óbito em decorrência da doença considerada
qx’ = Dx/Lx’
px’: probabilidade de sobreviver a doença considerada
px’ = 1 – qx’
S(x): probabilidade de sobrevida acumulada é obtida a partir da multiplicação das
probabilidades de sobrevida (px’) de cada período consecutivo, considerado na
análise.
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Angela Adamski da Silva Reis
55
1,000
0,900
0,800
0,700
Sx
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
0--1
1--2
2--3
3--4
4--5
5
Intervalo
Figura 1. Sobrevida relativa geral para o câncer de pênis na população de Goiânia no período
de 1988 a 1999.
4. Discussão
No presente estudo, verificou-se que a incidência de 3,5/100.000 habitantes é
relativamente baixa quando comparada com as regiões Norte e Nordeste, que apresentaram
índices de 5,5/100.000 habitantes a 16/100.000 habitantes (Gil et al., 2001). Assim, o câncer
de pênis se mostrou na região Centro – Oeste, especificamente na cidade de Goiânia/GO,
como uma neoplasia rara.
Os resultados do presente estudo indicam que 13,15% dos pacientes eram indivíduos
jovens, com idade inferior a 40 anos. No entanto 60,52% dos casos incluíram homens na faixa
etária da 6ª década de vida. A distribuição dos casos de câncer de pênis na população goiana
está em conformidade com os dados descritos na literatura (Ornellas & Bown, 2004; PowSang et al., 2002; Griffits & Mellon, 1999).
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56
Os dados de um Registro Hospitalar de Câncer devem demonstrar qualidade no
prontuário médico, uma vez que este registro geralmente é considerado a única fonte de dados
sobre o paciente. Assim, como ocorre com os atestados de óbito, o preenchimento correto de
prontuários é uma obrigação legal. Um prontuário médico deve consistir de anotações
sistemáticas sobre os quadros clínicos e cirúrgicos dos pacientes, que incorpora os resultados
dos exames complementares. A manutenção de um prontuário organizado depende do
médico, sendo ele o principal agente determinante da qualidade dos dados levantados e
publicados (MS, 1997). No presente estudo, observa-se uma deficiência na manutenção dos
prontuários médicos, comprometendo principalmente a definição do estadiamento dos casos
em 63,15% (24/38). A sobrevida com base populacional não foi possível ser avaliada, visto
que quase sempre, a avaliação de variáveis como o estadiamento de tumores e o tratamento
são dados incompletos em prontuários, mesmo sendo dados importantes para os estudos de
sobrevida (Bustamante-Teixeira et al., 2002).
Segundo o Art. 69 do Código de Ética Médica, o clínico tem o dever de elaborar o
prontuário para cada paciente a que assiste. O prontuário é um documento valioso para o
paciente, para o médico que o assiste para as instituições, de ensino e pesquisa e para os
serviços públicos de saúde, além de ser instrumento de defesa legal (DOU, 2002). Neste
contexto, é importante que os médicos e os outros profissionais de saúde, que tenham acesso
aos prontuários, se conscientizem da necessidade de realizar um preenchimento eficiente do
documento com intuito de fornecer dados completos para estudos epidemiológicos e,
conseqüentemente, transformá-lo em um poderoso instrumento de pesquisa capaz de ampliar
o conhecimento e otimizar o tratamento das patologias.
No presente estudo, o estádio III foi o mais freqüentemente encontrado ao diagnóstico
de câncer de pênis. O diagnóstico em estágios avançados compromete a sobrevida do
paciente. O tratamento de tumores com extensão maior e com invasão dos nodos regionais são
controlados com cirurgia ou radioterapia. Na maioria dos casos de carcinomas penianos, o
paciente deve ser submetido à penectomia parcial ou total, dependendo da extensão do tumor,
o que gera agravo do quadro psicológico do paciente. Adicionalmente, devem-se intensificar
as campanhas de prevenção, na tentativa de diminuir a incidência e diagnosticar o câncer nos
estágios iniciais da doença, oferecendo maior chance de cura individual e aumenta a
sobrevida (Curado & Latorre, 2000).
A sobrevida relativa geral do presente estudo foi de 3,3%, contendo uma censura de
42%. A censura dos dados estava compreendida devido a este tipo particular de câncer ter
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57
portadores que vivenciam um processo de fragilização psicológica, tendo o paciente a visão
do binômio câncer de pênis e mutilação. O processo de terapia do paciente geralmente resulta
em abandono do tratamento, sobretudo porque no curso da doença é comum a disseminação
para linfonodos inguinais, linfonodos pélvicos e periaórticos, e o tratamento de escolha clínica
é a penectomia. Os pacientes não tratados morrem por complicações secundárias às
metástases inguinais, geralmente devido a presença de hemorragias ocasionadas por lesões
tumorais de grandes vasos. O paciente penectomizado no âmbito psicológico perde a sua
referência de masculinidade e, comumente não retorna ao serviço de saúde para dar
seguimento ao tratamento e controle da doença.
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Capítulo 5. Detecção do Papilomavírus Humano por PCR multiplex em lavado de
glande
Resumo:
Dados epidemiológicos têm mostrado que parceiras de homens com câncer de pênis apresentam um risco maior
para o desenvolvimento de neoplasia cervical. O presente estudo teve como objetivo detectar a prevalência do
HPV em 100 indivíduos do sexo masculino sem história de lesão subclínica ou história pregressa de infecção por
HPV. Os participantes foram voluntários atendidos no Serviço de Urologia do Hospital Araújo Jorge, em
Goiânia-GO. Foram coletadas amostras das células esfoliadas do epitélio da glande em solução álcool-ácido, que
foram armazenadas entre 2-8°C até a extração de DNA e posterior amplificação do genoma viral por PCR.
Visando a detecção de seqüências específicas do genoma do HPV, utilizou-se primers genéricos MY09/MY11 e
específicos para genotipagem dos subtipos virais de HPV 6, 11, 16 e 18. Para todas as amplificações foram
utilizados controles internos, mediante a amplificação de uma região de D8S135 para confirmação da presença
de DNA humano na amostra. Como controle positivo da reação foi utilizado DNA de células HeLa, que contém
genoma de HPV 18 integrado. Os resultados incluem 23% de positividade para o genoma viral. Foram
genotipados 11% de HPV 16, 6% de HPV 18, 5% de HPV 11 e 1% para o HPV 6. Assim, a presença de HPV
como microbiota das mucosas genitais masculinas, sobretudo nas condições em que as lesões epiteliais não se
desenvolvem, caracteriza os homens como reservatórios do vírus, e confirma a importância do papel masculino
na disseminação do vírus entre as mulheres.
Palavras chaves: PCR, HPV e fator masculino
Abstract
Epidemiological data have shown that partners of men with penile cancer present a greater risk for
the development of cervical cancer. The present study aimed to detect the prevalence of the HPV
genome in 100 men, without former clinical evidence of genital HPV infection. The participants
voluntarily took part in the Urology Department of the Hospital Araújo Jorge, in Goiânia-GO.
Samples collected from the surface of the penile glands cells were preserved in alcohol-acid solution
and stored between 2-8°C until the extraction of DNA. Detection of HPV DNA was often determined
by PCR based approach with standard universal consensus primers MY09/11. For HPV 6, 11, 16 and
18 genotyping, specific primers were employed. All the amplifications were carried out by using
internal controls, and the amplification of a region of D8S135 sequence was performed in order to
confirm the presence of human DNA in the sample. We used HeLa DNA cells as a positive control,
which contain integrated genome of HPV 18. The results demonstrated HPV-DNA in 23% of the
samples. HPV-16 was demonstrated in 11%, HPV-18 in 6%, HPV-11 in 5% , and HPV-11 in 1% of
the samples. HPV DNA was present in the male genital tract of a reasonable number of samples,
overall under conditions where no epithelial disease could be detected, characterizing men as the
vector of the virus, and confirming the importance of the masculine role in the dissemination of the
virus to women.
Key words: PCR, HPV and men factor.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
59
1. Introdução
O câncer de colo uterino é o segundo tipo de câncer mais comum em mulheres e cerca
de 500.000 novos casos são detectados anualmente na população feminina mundial, sendo
uma neoplasia de alta incidência nos países subdesenvolvidos (IARC, 1995). Estudos
epidemiológicos e moleculares evidenciam etiologicamente o papilomavírus humano (HPV)
como principal causa do câncer cervical invasivo e neoplasia intraepitelial cervical (NIC) em
99,7% dos casos (Yu et al., 2005; Munõz et al., 2003; Franco et al., 2001; Bosch et al., 2001;
Franco et al.,1999; Walboomers et al., 1999;. Schiffman et al., 1993). Mais de 100 tipos virais
do HPV já foram identificados, sendo que 40 tipos estão associados com infecções
anogenitais e são classificados como tipos virais de alto risco oncogênico (de Villiers et al.,
2004; Munõz et al., 2003; zur Hausen, 2002).
O HPV pode ser classificado de acordo com o risco oncogênico em tipos virais de alto
risco que incluem, os HPVs 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 55, 56, 58, 59 e 68, e tipos
virais de baixo risco incluem os números, 6, 11, 26, 42, 44, 54, 70 e 73 (Boccardo & Villa,
2004; de Villiers et al., 2004; zur Hausen, 2002; Villa, 1998). O HPV 16 (Figura 1) é o tipo
viral mais freqüentemente encontrado em carcinoma de cérvice uterina, sendo encontrado em
58,9% dos casos seguidos dos tipos virais 18 e 33 (Castellsangué & Munõz, 2003; Munõz et
al., 2002; Dell et al., 2000).
O primeiro fator de risco para infecção por HPV envolve história de múltiplos
parceiros sexuais, infecção por outras doenças sexualmente transmissível (DSTs), fumo
associado ao etilismo e imunossupressão (Castellsangué & Munõz, 2003; Dell et al., 2000).
Para as mulheres existem ainda fatores de risco putativos como o uso de contraceptivos orais,
dieta pobre e parceiro sexual promíscuo (Castellsangué & Munõz, 2003; Moore et al., 2001;
Giuliano et al., 1999). A detecção de HPV no sêmen e na urina sugere que estes elementos
sejam um reservatório em potencial e um veículo carreador que contribui para a contaminação
da mulher (Kadze et al., 2000; Lai et al., 1997; Green et al., 1991).
Adicionalmente, sugere-se que o homem atue como disseminador do vírus, sendo
portador e não apresentando sintomatologia clínica característica da infecção genital pelo
HPV (Bosch et al., 1996). O significado do homem atuar como um veículo na transmissão
dos HPVs genitais necessita de elucidação. Existe uma associação de que homens
circuncizados diminuem o risco de transmissão do vírus para suas parceiras sexuais (Schoen
et al., 2000). Adicionalmente, o nosso estudo teve como objetivo avaliar a presença de HPV
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
60
em lavado de glande de homens sem história clínica pregressa de infecção por HPV utilizando
a técnica molecular da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Figura 1. Esquema mostrando as
regiões flanqueadas pelo primers
MY09 e MY11, dentro do gene L1,
no genoma do HPV16 (Silva et al.,
2003).
2. Materiais e Métodos
2.1. Grupo amostral
Foi realizado um estudo randômico que inclui 100 indivíduos que acompanhavam
pacientes atendidos no Serviço de Urologia no Hospital Araújo Jorge (SU-HAJ) sem história
de infecção prévia por papilomavírus humano (HPV) na faixa etária de 25 a 60 anos,
sexualmente ativos e sem lesão peniana. Os participantes assinaram um termo de
consentimento (anexo 7) para participarem do referido estudo e responderam voluntariamente
a um questionário (anexo 8), sobre os hábitos sexuais, número de parceiras e ocorrência de
DSTs.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
61
2.2. Obtenção das amostras
O SU-HAJ realizou a coleta com o auxílio de um swab de cerdas, após o esfregaço na
região da glande, o swab foi lavado em uma solução álcool-ácida 3% (metanol-ácido acético)
para soltar as células aderidas às cerdas do swab e para a preservação das células coletadas.
As amostras foram armazenadas a 2 - 8°C até a realização da extração de DNA.
2.3.Extração de DNA
Para a extração, as amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 30 minutos para
separar as células da solução álcool-ácida. Posteriormente as amostras foram submetidas à
extração de DNA com o kit de purificação de DNA genômico Wizard – Promega (Promega
Corporation, EUA)®, seguindo as instruções do fabricante (anexo 9).
2.4. Reação em Cadeia da Polimerase
As reações de PCR foram realizadas de acordo com o protocolo proposto por Levi et
al., 1998, utilizando-se volume final 25 μl, contendo aproximadamente 100 ng de DNA
genômico, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 uM de cada dNTP,
0.5 U de Taq DNA polimerase. Para a detecção do genoma de HPV utilizou-se primers
genéricos MY9/11 para L1 (Figura 1), que amplifica um fragmentto de 450pbdo DNA viral.
Para as amostras positivas para o genoma do HPV foi realizada uma PCR com intuito de
genotipar o vírus, utilizando-se primers tipo-específicos para os HPVs 6, 11, 16 e 18, visto
estes tipos virais serem os mais prevalentes em infecções genitais (zur Hausen, 2002).
Para cada amostra foi amplificado um fragmento de aproximadamente 100pb da região
D8S135 do 8p,11, como controle interno da reação para a presença de DNA humano. A
seqüências dos primers encontra-se na Tabela I e o protocolo da PCR encontra-se no anexo
15.
2.5. Análise dos fragmentos de PCR
Para a análise dos produtos de PCR, o DNA foi submetido a eletroforese em campo
elétrico constante de 10V/cm em gel de poliacrilamida 8% em TBE 1X. Para a visualização
do DNA amplificado, o gel foi corado em solução de brometo de etídio (5µg/mL) e as
imagens foram capturadas e analisadas pelo sistema de vídeo documentação Image Master VDS (Amersham Pharmacia Biotech, EUA) ®.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
62
Tabela I. Seqüências dos primers usados no presente estudo, indicando o tamanho esperado
do fragmento amplificado, segundo Karlsen e colaboradores (1996).
Fragmento
(pb)
Seqüências 5’ Æ 3’
Tipos
S*
HPV 6
D8S135
F
R
F
R
F
R
F
R
R
F
R
CAC
CCA
CGC
AGT
TCA
CGT
CCG
TCG
TTT
GGG
CTG
MY 09
R
CGT CCA AGA GGA TAC TGA TC
MY 11
F
GCC CAG GGT CAT AAC AAT GG
HPV 11
HPV 16
HPV 18
GTC
TGA
AGA
TCT
AAG
GTT
AGC
TTT
CTT
AGG
GGC
TGC
AAT
GAT
AAG
CCA
CTT
ACG
TCT
GTG
CTT
AAC
AAC
TCT
ATA
CAA
CTG
GAT
ACA
TCC
GAC
TAT
AGA
GAC
AGG
TGC
CAG
TGT
GAT
GGA
TCT
ACA
AAT
GTG
CAT
CAG
ATA
GCA
CCT
CTG
ACG
GAG
ATG
TAT
GGA
AG
CA
TGC
CAC
GA
CAA
ACT
TCG CTT
GT
TTA GC
C
195
90
119
172
100
450
*S: Sentido - F: Forward (Senso) e R: Reverse (Anti-senso).
Sentido (S*): D / R F (Senso) e R (Anti-senso)
3. Resultados
O grupo amostral apresentou como média de idade 54 anos. 86% dos indivíduos
responderam ao questionário, destes 69% eram casados ou tinham relacionamento com
parceira fixa, 33% já tiveram de 2 a 5 de parcerias (Figura 2). Dos indivíduos casados 21% já
tiveram relação sexual com prostitutas e 25% apresentaram algum tipo de DST, sendo
gonorréia a mais incidente. Nenhuns dos indivíduos relatou qualquer tipo de lesão ou verrugas
na região genital, sendo esta informação confirmada clinicamente.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
63
35
33%
30
25
20
%
15
13%
9%
10
6%
4%
5
1%
0
2-5
parceiras
6-10
parceiras
11-20
parceiras
21-50
pareciras
51-100
parceiras
mais de
100
Figura 2. Porcentagem de indivíduos quanto ao número de parceiras sexuais.
Os resultados incluem 23% de positividade para o genoma viral (Figura 3 e Figura 5).
Foram genotipados 11% de HPV 16, 6% de HPV 18, 5% de HPV 11 e 1% HPV 6 (Figura 4 e
Figura 6). Um dos indivíduos analisados apresentou co-infeção para os HPVs 11 e 18,
%
respectivamente.
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
77%
23%
Positivos
Negativos
Figura 3. Porcentagem de casos positivos e negativos para HPV.
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Angela Adamski da Silva Reis
64
12
11%
10
8
%
6%
6
5%
4
2
1%
0
HPV 16
HPV 18
HPV 11
HPV 6
Figura 4. Porcentagem de casos genotipados de acordo com os casos detectados com HPV.
Ld 100 pb
My9/11
450 pb
D8S135
100 pb
Figura 5. Gel em poliacrilamida a 8% contendo produtos de amplificação corados por Nitrato de Prata:
Detecção de HPV utilizando os primers genéricos My9/11 e D8S135) para confirmação da presença de DNA
humano na amostra.
Ld
6
11
195pb
90pb
16
18
C+
C-
200 pb
100 pb
119pb 172pb 172pb
Figura 6. Genotipagem dos HPVs 6, 11, 16 e 18; na canaleta C+, utilizando-se como controle positivo células
HeLa (amplificação para HPV 18). O ladder (Ld) utilizado foi o de 100pb.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
65
Dos indivíduos detectados e genotipados quanto a infecção subclínica por HPV, 16%
não apresentaram relato de nenhuma DST, 5 % relataram ter tido DST do tipo gonorréia e 3%
não responderam ao questionário, 29,16% dos indivíduos apresentaram relato de relação
sexual com prostitutas e a média de idade dos indivíduos com infecção subclínica por HPV
foi de 51anos.
4. Discussão
Em se tratando de um estudo prospectivo com a participação de voluntários, muitos se
sentiram constrangidos ao responderem ao questionário. O genoma de HPV foi amplificado
em 23% (23/100) das amostras, a genotipagem do vírus demonstrou o predomínio do HPV 16
e 18, sendo estes os tipos virais responsáveis por mais de 70% de todos os casos de câncer
cervical, como também do câncer anal, o qual apresenta epitélio com características
semelhantes à da mucosa da cérvice uterina (Jansen & Shaw, 2004; Holly et al., 2001; Frisch
et al., 1999; Vernon et al., 1998; Frisch et al., 1997; Wickenden et al., 1988). Os tipos virais 6
e 11, não são considerados de alto risco oncogênico, mas são responsáveis por mais de 90%
de todas as verrugas e lesões genitais em homens e mulheres e estão envolvidos com
papilomatoses respiratória e laríngea recorrente (Boccardo & Villa, 2004; zur Hausen, 2003;
Silva et al., 2003).
Grussendorf - Coen e colaboradores (1987) demonstraram a presença de DNA de HPV
em 5,8% (31/550) na glande de indivíduos sem infecção aparente, sendo o tipos virais 6 e 11
os mais prevalentes (8/31) do que os tipos 16 e 18 (5/31). Os resultados do presente estudo
sugerem que a técnica de PCR é uma técnica molecular sensível para a detecção e
genotipagem de HPV (23/100). Um estudo espanhol utilizando os primers genéricos MY9/11
por PCR encontrou prevalência de apenas 3,5% de HPV em parceiros de mulheres
aleatoriamente selecionadas na população geral sem câncer e 17,5% com câncer cervical.
Neste contexto a associação entre HPV em swab de pênis e câncer cervical foi evidenciada
(Bosch et al., 1996). Muitos estudos têm apontado que a promiscuidade sexual é o principal
fator de risco para a infecção genital pelo HPV (Hippelainen et al., 1994).
A presença de HPV integrante da microbiota da glande sugere que a disseminação do
HPV tende a ser universal, sendo o homem um importante meio propagador do vírus entre
seus parceiros sexuais. Assim, o homem atua como vetor, podendo desenvolver as lesões e
verrugas condilomatosas no pênis. Adicionalmente, há relatos de casos de câncer de pênis
associados ao HPV (Pow- Sang et al., 2002; Bezerra et al., 2001; Chan et al., 1994). Em geral
os tipos virais de HPV 16 e 18 são mais freqüentemente implicados no carcinoma de pênis. O
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
66
carcinoma peniano é uma doença rara, portanto não há elucidação da carcinogênese neste tipo
particular de neoplasia e estudos que investigam estes fatores devem ser estimulados.
Muitos fatores estão associados a infecção por HPV, sendo o hábito sexual o principal
fator de risco, sobretudo quando há registro de múltiplos parceiros. Estudos epidemiológicos
e moleculares desenvolvidos nos últimos 20 anos associam a infecção com tipos oncogênicos
de HPV como sendo a causa primária do câncer cervical (Munõz et al., 2003; Shin et al.,
2003; Bosch et al., 2002; Schiffman et al., 1993; Bosch, 1995; Walboomers et al., 1999;
Franco, 1999;). A prevalência do HPV em homens tem sido pouco relatada na literatura.
Os homens com história de múltiplos parceiros sexuais e de ocorrência de DST
possuem risco aumentado de serem infectados pelo HPV. O risco relativo do câncer cervical
após a infecção pelo HPV foi determinado como sendo o mais alto da epidemiologia do
câncer, em estudos caso-controle (IARC, 1995). Os conhecimentos disponíveis indicam que a
associação do HPV com o câncer cervical satisfaz a todos os critérios causais relevantes para
uma ação pública de saúde. Virtualmente, todos os espécimes de carcinomas cervicais contêm
o DNA do HPV, sugerindo que a infecção viral representa uma causa necessária para essa
neoplasia e o homem atuando como disseminador. Os resultados do presente estudo
contribuem para elucidar o papel masculino na gênese dos carcinomas de cérvix uterina e
potencialmente no câncer de pênis.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
67
Capítulo 6. Estudo molecular da carcinogênese dos tumores penianos
Resumo:
O carcinoma peniano está associado a precários hábitos de higiene, principalmente em pacientes nãocircuncizados. No entanto, os estudos têm identificado a associação entre o Papilomavírus Humano (HPV) e
carcinoma de pênis. O objetivo geral do presente estudo foi identificar o genoma de HPV em associação com o
carcinoma peniano, mediante a amplificação do DNA viral pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
Realizou-se um estudo retrospectivo a partir de DNA total, obtido de tecido tumoral embebido em parafina, de
23 casos com diagnóstico histopatológico de carcinomas penianos. Para a identificação de seqüências específicas
do genoma viral, foram usados dois conjuntos de primers, denominados MY09/11 e GP5+/6. Apenas um, dos 23
casos estudados, apresentou amplificação de genoma HPV. Primers específicos para os subtipos virais 6, 11, 16,
18, 33, 35, 45 e 58 foram usados na PCR para genotipagem do vírus. Produtos de PCR não foram obtidos,
sugerindo um tipo diferente, que será definido por seqüenciamento do amplicon gerado pela amplificação
genérica. Embora a associação entre o HPV e a carcinogênese peniana ainda requer elucidação, o vírus é
potencialmente carcinogênico .
Palavras-Chaves: Câncer de pênis, HPV e PCR
Abstract
Penile carcinoma is associated to precarious hygiene habits, mainly in uncircumcised patients. However, studies
have identified an association between HPV and penile carcinoma. The general objective of this study was to
detect the genome of HPV in penile carcinoma, by means of amplification of viral DNA by Polymerase Chain
Reaction (PCR). Aiming to accomplish a retrospective analysis, total DNA was extracted from paraffin
embedded penile cancer specimens from 23 samples. For the identification of specific sequences of the viral
genome, two sets of primers were used, including MY09/11 and GP5+/6. One, of the 23 studied cases, presented
amplification of the HPV genome. Specifics primers for the subtypes 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 and 58 were used
in the PCR to identify the virus genotype. PCR products were inconclusive, suggesting a different virus genotype
that will be subsequently defined by DNA sequencing. The association between the HPV and penile
carcinogenesis still requires further studies, because the virus is potentially carcinogenic.
Key Words: penile cancer, HPV and PCR
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Angela Adamski da Silva Reis
68
1. Introdução
Os carcinomas penianos são caracterizados como um tipo raro de neoplasia (Martins et
al., 2000; Srougi & Simon, 1995;), sendo a faixa etária mais acometida a 6ª década de vida. A
alta incidência é observada em países em desenvolvimento como o Brasil, estando elevada
principalmente nas regiões Norte e Nordeste (Gil et al., 2001), sendo que nas regiões mais
desenvolvidas a incidência vem declinando (Martins et al., 2000). A doença está associada a
maus hábitos de higiene e a pacientes não circuncizados, tendo como fator de risco, a fimose
(Pow-Sang. et al. 2002; Martins et al., 2000; Srougi & Simon, 1995). Em países onde a
circuncisão infantil é um hábito cultural, verifica-se que a incidência do carcinoma escamoso
de pênis é baixa (Schoen et al., 2000).
A infecção pelo HPV é a doença sexualmente transmissível mais freqüentemente
encontrada, envolvendo diversos fatores de risco (Dell et al., 2000). Muitos estudos têm
demonstrado a associação etiológica entre HPV e o carcinoma cervical, pois a infecção
genital ocasionada pelo vírus acomete homens e mulheres (Yu et al., 2005; Burd, 2003; Ho et
al., 1998; IARC, 1995) e a disseminação do vírus ocorre entre os indivíduos sexualmente
ativos, sendo o homem um importante fator propagador deste vírus entre as mulheres
(Baldwin et al., 2003; Barasso et al., 1987). O avanço das técnicas de detecção moleculares
tem possibilitado a identificação de genoma do papilomavírus humano (HPV) em associação
com diversos tecidos, incluindo com as células neoplásicas malignas (Hart et al., 2001;
Elnifro et al., 2000; Villa, 1998).
A presença do HPV em carcinomas de pênis foi demonstrada pela primeira vez no
Brasil no início da década de 80 por Villa & Lopes (1986). Dados epidemiológicos têm
mostrado que 40-50% dos carcinomas de pênis apresentam DNA de HPV, estando associado
ao tipo viral 16 (Buechner, 2002; Dillner et al., 2000; Dillner et al., 2000). Contudo, estudos
da associação entre HPV e carcinoma de pênis são limitados devido à reduzida incidência
desta doença.
O presente estudo teve como objetivo identificar o genoma de HPV associado aos
carcinomas penianos mediante a amplificação do DNA viral pela técnica da Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) (Gravitt et al., 2000). Conhecer os prováveis agentes etiológicos
responsáveis pela carcinogênese dos tumores penianos é necessário, visto que esta doença
tende a evoluir com metástase e disseminação para região pélvica e inguinal (Young et al.,
2000). A principal forma de tratamento para o câncer de pênis é a penectomia, promovendo
agravos do quadro psicológico, dentre outros transtornos.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
69
O progresso no entendimento da etiologia, patogênese e prognóstico dos tumores
malignos de pênis, têm sido lento devido à carência de estudos moleculares que investiguem
as prováveis alterações genéticas associadas ao desenvolvimento e progressão dessa
neoplasia. O desenvolvimento e avanço das técnicas moleculares são fatores adicionais que
poderiam contribuir para a interpretação e análises de agentes biológicos e clínicos,
permitindo o estabelecimento de um prognóstico real e mais acurado dos tumores do pênis.
Nesse contexto, a detecção molecular do genoma do HPV se faz necessária pelo fato de que
uma crescente percentagem de tumores epitelial com a presença do HPV vem sendo
identificada.
2. Materiais e Métodos
2.1. Grupo amostral
Foi realizado um estudo retrospectivo no Laboratório de Histopatologia do Serviço de
Patologia do Hospital Araújo Jorge (SP-HAJ) com 23 blocos de parafina contendo tecidos de
pacientes com carcinoma peniano oriundo do período de 2001, 2002 e 2003, obtidos dos
arquivos do SP-HAJ.
2.2. Obtenção das amostras
Para a abordagem molecular, foram obtidos de cada bloco 3 (três) cortes de 30μm os blocos
de parafina, contendo tecidos dos 23 pacientes selecionados, para a extração e amplificação de
DNA por PCR. Após a obtenção dos cortes parafinados, estes foram desparafinizados e em
seguida realizado a extração de DNA (Anexo 12).
2.3.Extração de DNA
O material histológico foi desparafinado e submetidas à extração de DNA com o kit de
purificação de DNA genômico Pure Gene ® Purification Kit – Gentra Systems, USA,
seguindo as instruções do fabricante (Anexo 12).
2.4. Reação em Cadeia da Polimerase
Todas as amostras foram submetidas a reações de PCR utilizando-se primers
genéricos MY09/11 e GP5+/6+ para a detecção de qualquer HPV. Foram realizadas reações
de acordo com o protocolo proposto por Levi et al., 1998, utilizando-se como volume final da
reação 25 μl, contendo aproximadamente 50 ng de DNA genômico, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3,
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
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70
50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 uM de cada dNTP, 0.5 U de Taq DNA polimerase. As
amostras só foram consideradas negativas para o HPV após serem submetidas a três PCRs,
com posterior repetição das reações para confirmação do resultado. Posteriormente utilizou-se
a mesma abordagem, com os primers tipo especifico para os HPVs 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 e
58 (Jacob et al., 2002; Hart et al., 2001; Smith et al., 2000; Karlsen et al., 1996).
Foi utilizado também um conjunto de primers que amplificam fragmentos de
aproximadamente 100pb da região D8S135 do 8p,11, como controle interno da reação. As
seqüências dos primers utilizados no presente estudo encontram-se na Tabela I e o protocolo
de termociclagem da PCR usado encontra-se no Anexo 15.
Tabela I. Seqüências dos primers utilizados, mostrando o tamanho do fragmento amplificado, segundo Karlsen
e colaboradores (1996).
Seqüências 5’ Æ 3’
TGC AAC GAC CAT
AAT TCT AGG CAG
GAT ATA TGC ATA
AAG CAA CAG GCA
CCA CTG TGT CCT
CTT GAT GAT CTG
ACG ACA GGA ACG
TCT TCC TCT GAG
ATG AGA GGA CAC
AAA CGA ACT GTG
GCA ACT GAC CTA
CAC TAT TCC AAA
TTT GTG CAC AGA
CCA GTG TCT CTC
TGC ATG ATT TGT
GTG GAC ACA ATG
CTT TAT AAT TAT
AAC AGA GTG GGA
S*
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
F
R
CAC
CCA
CGC
AGT
TCA
CGT
CCG
TCG
AAC
ACA
CCC
GGG
ACC
TTT
GGA
TTT
GGG
CTG
MY 09
R
CGT CCA AGA GGA TAC TGA TC
MY 11
F
GCC CAG GGT CAT AAC AAT GG
GP 05
F
TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC
GP 06
R
GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C
Tipos
HPV 6
HPV 11
HPV 16
HPV 18
HPV 33
HPV 35
HPV 45
HPV 58
D8S135
GTC
TGA
AGA
TCT
AAG
GTT
AGC
TTT
GCC
CAT
GAG
GCA
AGA
TTT
CAT
CTT
AGG
GGC
Fragmento (pb)
AG
CA
TGC
CAC
GA
CAA
ACT
TCG CTT
AAG
GTG
TA
TG
AT
CA
GT
GT
TTA GC
C
195
90
119
172
211
230
236
314
100
450
170
*S: Sentido - F: Forward (Senso) e R: Reverse (Anti-senso).
2.5. Análise dos fragmentos de PCR
Para a análise dos produtos de PCR, o DNA foi submetido a eletroforese em campo
elétrico constante de 10V/cm em gel de poliacrilamida 8% em TBE 1X. Para a visualização
do DNA amplificado, o gel foi corado em solução de solução de brometo de etídio (5µg/mL)
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
71
e as imagens foram capturadas e reveladas pelo sistema de vídeo documentação Image Master
VDS (Amersham Pharmacia Biotech, EUA) ®, (Anexo 16).
3. Resultados
O grupo amostral consistiu de 23 pacientes diagnosticados com câncer de pênis. A
média das idades do grupo foi de 64 anos, a topografia demonstrou 4% para glande e 96%
para pênis sem outras especificações, e morfologia de carcinoma escamoso invasor
Das 23 amostras analisadas, foi observado a amplificação com os primers genéricos
GP5+/6+, identificando-se o genoma de HPV em 4% (1/20) dos casos (Figura 1). A
amplificação para o genoma viral só foi detectável para os primers GP5+/6+. Os primers
MY9/11 não amplificaram nenhuma amostra
Ld
A1
A2
A3
A4
A5
C+
C-
GP5+/6+
170 pb
Figura 1. Gel em poliacrilamida a 8% com produtos de amplificações: Detecção de HPV
utilizando os primers genéricos GP5+/6+. Ladder (Ld): o marcador de peso molecular de
tamanho de100pb; A1-A5 (pacientes analisados); Controle negativo (C-) e Controle positivo
(C+) utilizando-se células HeLa para do genoma de HPV 18.
Para o HPV amplificado por GP5+/6+ (Figura 1), tentou-se a genotipagem com
primers tipo-especificos 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 e 58.Todas as amplificações observadas
foram inespecíficas (Figura 2), sugerindo um tipo viral diferente. Assim, não foi possível
genotipar o HPV pela metodologia proposta, mas a definição do tipo viral será realizada por
seqüenciamento do DNA viral amplificado.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
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Ld
6
11
16
18
33
35
45 58
c+
c-
Figura 2. Gel em poliacrilamida a 8%: Genotipagem utilizando primers tipo especifico HPV6
(195pb), HPV 11 (90pb), HPV 16 (119pb), HPV 18 (172pb), HPV 33 (211pb), HPV 35
(230pb), HPV 45 (236 pb) e HPV 58 (314pb). Controle positivo (C+: 172pb) utilizando-se
celulas Hela para a amplificação do HPV 18.
4. Discussão
A proposta deste estudo foi determinar a associação entre HPV e os tumores de pênis,
utilizando amostras de tecido embebido em parafina. As amostras apresentaram DNA
degradado e, apesar dos primers MY9/11 serem considerados mais sensíveis e de triagem
inicial em relação aos primers GP5+/6+ (Coutlée et al., 2002; Fernández-Contrera et al.,
2000), no presente estudo não se observou amplificação por MY9/11. Os dados sugerem que
os primers MY9/11, por apresentarem fragmentos de 453 a 548 pb (Fernández-Contrera et al.,
2000) são eficazes para amplificação de DNA total e não em DNA degradado.
Vários métodos moleculares têm sido utilizados em estudos moleculares, como:
hibridização in situ, amplificação por PCR e seqüenciamento do DNA, a mais utilizada dentre
elas é a PCR que consiste no uso de primers de consenso genérico e que amplificam regiões
conservadas do vírus. Neste contexto, apenas um dos 23 casos estudados, apresentou
amplificação de genoma para o HPV. Primers específicos para os subtipos virais 6, 11, 16,
18, 33, 35, 45 e 58 foram usados na PCR para genotipagem do vírus. Produtos de PCR não
foram obtidos, sugerindo um tipo diferente, que será definido por seqüenciamento do
amplicon gerado pela amplificação gênica. A dificuldade na identificação do genoma viral
presente nas amostras tumorais é uma conseqüência do grande número de tipos virais que
atualmente ultrapassa a casa da centena (Fernández-Contrera et al., 2000).
O Brasil é considerado como país de alta incidência de câncer de pênis sendo os tipos
virais 16 e 18 os mais prevalentes (Cruz et al., 2004; Bezerra et al., 2001; Gil et al., 2001;
Tornesello et al., 2000). Villa & Lopes, (1986) detectaram 44% (8/18) a presença de HPV em
amostras de carcinomas penianos avaliados por Southern blotting, sendo os HPVs 18 e 11 os
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Angela Adamski da Silva Reis
73
tipos virais encontrados, McCance e colaboradores (1986) encontraram 49% de associação de
genoma de HPV com os casos câncer de pênis. No estudo de Kiyabu e colaboradores (1989)
de carcinoma verrucoso de pênis foi realatado 40% de HPV 16. Masih e colaboradores (1992)
não conseguiram detectar nenhum dos tipos de HPVs 6, 11, 16, 18 e 31 em carcinomas
penianos. Chan e colaboradores (1994) sugeriram que outro tipos de HPVs devem ser
avaliados para o esclarecimento da patogênese nos tumores de pênis por técnicas moleculares.
Gil e colaboradores (2001) verificaram a presença do genoma de HPV em 30,9% dos tumores
penianos analsados, utilizando os primers MY9/11, sendo o HPV 18 o mais incidente. Neves
e colaboradores (2002) demonstram mediante o uso de RT-PCR que é importante conduzir
estudos que avaliam a freqüência dos tipos de HVPs associados as neoplasias, incluindo o
câncer de pênis.
No presente estudo, o genoma de HPV foi identificado em 4% (1/23) dos casos
Adicionalmente, inúmeros estudos moleculares tem sido desenvolvidos com o objetivo de
compreender o papel dos genes E6 e E7 e de seus produtos nos tipos virais de alto risco
oncogênico, pois as proteínas oncogênicas interferem na função das proteínas pRb e p53,
mantendo a célula em constante proliferação. A infecção pelo HPV é insuficiente para causar
malignidade, mas tem sido implicado como fator causal de muitos cânceres. Neste estudo a
faixa etária mais incidente e a presença de fimose em 91,3% dos pacientes, corroboram com
dados publicados na literatura. Os resultados de estudos epidemiológicos indicam numerosos
fatores para o desenvolvimento de neoplasia peniana, dentre eles, a presença de fimose, a não
circuncisão infantil e a presença de HPV. O mecanismo exato pelo qual esses fatores
aumentam o risco de câncer de pênis ainda não foram elucidados.
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ANEXO 1. CARTILHA: HPV E SUA RELAÇÃO COM O CÂNCER.
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Angela Adamski da Silva Reis
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Angela Adamski da Silva Reis
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Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
77
ANEXO 2. QUESTIONÁRIO APLICADO AOS PARTICIPANTES DO ESTUDO PILOTO DA CARTILHA: HPV
E SUA RELAÇÃO COM O CÂNCER
Questionário de caráter de pesquisa para avaliação da cartilha “HPV e sua relação com o
câncer”
Instruções para a resolução do questionário
1)
2)
3)
4)
As questões, a seguir, fazem parte de uma pesquisa para avaliação da Cartilha “HPV e sua relação
com o câncer”.
Neste questionário as questões são referentes às informações contidas na cartilha.
A participação é de caráter voluntário e a identidade do avaliado não será exigida
A sua participação é muito importante; ao término do questionário devolva-o.
Idade: _________ Sexo:
Masculino
Feminino
O Núcleo de Pesquisa Replicon agradece a sua participação!!!
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Angela Adamski da Silva Reis
78
1) O Papilomavírus humano (HPV) é considerado uma DST
(Doença Sexualmente Transmissível)?
( ) sim
( ) não
2) Você já conhecia o vírus HPV e sabia que ele podia causar
câncer?
( ) sim
( ) não
3) Tanto o homem quanto a mulher podem transmitir o vírus do
HPV?
( ) sim
( ) não
4) Os vários tipos virais são detectados por técnicas
altamente específicas e sensíveis como forma de
diagnóstico?
( ) sim
( ) não
5) A transmissão do HPV ocorre por roupas íntimas e pelo
canal do parto?
( ) sim
( ) não
6) O câncer de colo de útero é ocasionado pelo HPV em 20%
dos casos?
(
) sim
(
) não
7) O HPV pode infectar a região genital e a região da
cabeça e pescoço, como: boca, laringe, lábios e cavidade
oral?
( ) sim
( ) não
8) A prevenção é a melhor arma contra o vírus HPV?
( ) sim
( ) não
9) Está cartilha informativa atendeu suas expectativas em
relação ao conhecimento e esclarecimento sobre o vírus
HPV?
( ) sim
( ) não
10) Você acha importante a publicação desta cartilha para
a população?
( ) sim
( ) não
11) Você gostou da cartilha “HPV e sua relação com o
câncer” ?
( ) sim
( ) não
12) Você gostaria de saber mais sobre o HPV?
( ) sim
( ) não
Obrigada pela sua partipação!
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Angela Adamski da Silva Reis
79
ANEXO 3. DADOS BRUTOS DA ANÁLISE DAS RESPOSTAS DOS QUESTIONÁRIOS APLICADOS AOS INDIVÍDUOS QUE
LERAM A CARTILHA INFORMATIVA: HPV E SUA RELAÇÃO COM O CÂNCER
N
Questão 2
Questão 3
Questão 4
Questão 5
Questão 6
Questão 7
Questão 8
Questão 9
1
Idade Sexo Questão 1
19
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2
16
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
3
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
4
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
5
16
1
2
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
6
21
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
7
17
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
8
18
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
9
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
10
17
1
2
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
11
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
12
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
13
17
1
1
2
1
0
1
2
1
1
1
1
1
1
14
18
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
15
16
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
16
18
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
17
1
2
1
2
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
19
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
19
16
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
20
44
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
21
35
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
22
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
23
21
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
24
25
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
25
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
26
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
Questão 10 Questão 11 Questão 12
80
N
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
Idade Sexo Questão 1
Questão 2
Questão 3
Questão 4
Questão 5
Questão 6
Questão 7
Questão 8
Questão 9
Questão 10 Questão 11 Questão 12
15
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
16
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
2
17
1
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
2
16
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
0
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
2
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
16
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
19
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
19
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
19
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
16
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
81
N
55
56
57
58
59
60
61
62
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64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
Idade Sexo
Questão 1
Questão 2
Questão 3
Questão 4
Questão 5
Questão 6
Questão 7
Questão 8
Questão 9
20
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
19
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
19
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
17
1
1
2
1
0
1
2
1
1
1
1
1
1
16
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
40
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
34
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
18
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
19
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
28
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
16
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
26
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
20
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
25
2
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
16
1
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
18
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
19
2
1
2
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
22
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
22
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
22
1
2
1
1
1
2
1
1
1
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1
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
Questão 10 Questão 11 Questão 12
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Idade Sexo Questão 1
Questão 2
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Questão 10 Questão 11 Questão 12
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Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
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Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
Questão 10 Questão 11 Questão 12
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Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
Questão 10 Questão 11 Questão 12
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Idade Sexo Questão 1
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1
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1
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Questão 4 Questão 5
Angela Adamski da Silva Reis
Questão 10 Questão 11 Questão 12
86
Questão 1
Sim (1)
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Não (2)
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Sem Resposta (0)
Questão 2
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Sem Resposta (0)
Questão 3
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Não (2)
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Não (2)
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Sexo
2
Sim (1)
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Sem Resposta (0)
Questões
8
Sim (1)
Sem Resposta (0)
Questão 6
0
Sim (1)
Sem Resposta (0)
Questão 5
1
Sim (1)
Sem Resposta (0)
Questão 4
3
Sim (1)
1
2
Sim
Não
1
2
4
95%
36%
200
200
81
119
1
200
184
1% Questão 9 Não (2)
Sem Resposta
(0)
0%
15
1
Sim (1)
200
197
4% Questão 10 Não (2)
Sem Resposta
(0)
4%
1
2
Sim (1)
200
196
7% Questão 11 Não (2)
Sem Resposta
1%
(0)
24%
200
1
Sim (1)
92%
200
0
198
64% Questão 8 Não (2)
Sem Resposta
1%
(0)
92%
200
6
Sim (1)
99%
200
194
Questão 7 Não (2)
Sem Resposta
(0)
200
Masculino Fem inino
Masculino
Feminino
Sim (1)
2
2
Sim (1)
200
185
74% Questão 12 Não (2)
Sem Resposta
(0)
2%
13
2
200
Faixa Etária
Média
Erro padrão
25,09
0,6852792
Mediana
21
Modo
17
Desvio padrão
9,6913109
Variância da amost 93,921508
Curtose
Assimetria
1,1293449
Intervalo
39
Mínimo
15
Máximo
54
Soma
Contagem
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
0,117665
5018
200
Angela Adamski da Silva Reis
87
ANEXO 4. FLUOXOGRAMA DE NOTIFICAÇÃO DO REGISTRO DE CÂNCER DE
BASE POPULACIONAL DE GOIÂNIA DA ACCG
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
88
ANEXO 5. CÁLCULO DA SOBREVIDA PELO MÉTODO DA TÁBUA DE VIDA
ATUARIAL
Para a estimativa da sobrevida é necessário considerar três importantes aspectos. O
primeiro deles é a correta definição das variáveis associadas a patologia considerada. No caso
de pacientes com câncer, este primeiro aspecto estaria associado, por exemplo, com o sítio
anatômico acometido, histologia, estadiamento e o sexo dos pacientes. O segundo aspecto está
relacionado com o momento exato do início da doença, podendo ser denominado tempo
inicial ou tempo zero, o que corresponde a entrada do paciente no estudo. Geralmente, neste
caso, são usados dados como as datas do diagnóstico, do início da terapia ou da admissão
hospitalar.
Finalmente, o terceiro aspecto é a definição das metas que se deseja alcançar com a
estimativa da sobrevida. Neste contexto, geralmente a meta de interesse é o óbito, mas pode
variar como, por exemplo, a recorrência do tumor ou o aparecimento de uma complicação
particular; a única exigência é que o evento final seja uma variável binária (ex., vivo ou
morto) e que cada indivíduo possa ter somente um evento final, considerado o momento de
saída do paciente do estudo (Silva, 1999).
Entendendo como eventos inicial e final os momentos, respectivamente, da entrada e
da saída de um determinado paciente do estudo, tem-se então que o período entre o evento
inicial e a ocorrência do evento de interesse (evento final) é conhecido como tempo de
sobrevida. Neste contexto, nos estudos de sobrevida na área da saúde, o tempo zero
corresponde a data do diagnóstico ou um evento no curso da doença, ao passo que o evento
final corresponde, geralmente, a data de óbito ou a variação do parâmetro biológico ou ainda
um determinado evento que indique alteração do estado inicial. Assim, a sobrevida traduz a
probabilidade do paciente estar vivo após um determinado período do diagnóstico.
Os índices mais importantes na determinação da sobrevida são a probabilidade de
sobrevivência no curso de cada um dos intervalos considerados e a probabilidade de sobrevida
acumulada, ou melhor, a probabilidade de sobreviver do tempo zero até o tempo considerado.
Na presente análise, a sobrevivência é considerada o tempo transcorrido desde a entrada do
indivíduo no estudo (data do diagnóstico), até a ocorrência do evento de interesse, também
conhecido como falha (data do óbito), ou até a censura. Neste último caso em particular, a
censura representa um tipo de perda durante o tempo de observação, ou seja, é o número de
indivíduos que não puderam ser considerados no estudo, pois faleceram por outras causas não
relacionadas à doença de interesse, abandonaram o estudo ou foram perdidos durante a
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
89
observação. É de suma importância que o grupo censurado seja apenas uma pequena fração
do total de pacientes em estudo (Curado, 2000).
Para um melhor entendimento deste conceito, deve-se lembrar que nas análises de
sobrevida, considera-se um grupo fechado, um conjunto de indivíduos com apenas
observações completas. Desta forma, um grupo fechado raramente é encontrado, pois, quase
sempre, existem indivíduos cujo o seguimento é incompleto. Isso ocorre porque estes
indivíduos deixam o estudo antes do término do período de seguimento ou porque eles são
perdidos, como por exemplo, pela mudança de endereço ou migração. Assim, toda e qualquer
saída de pacientes do seguimento, por causas não relacionadas com o evento final, é
considerada precoce e estes pacientes devem ser excluídos dos cálculos de sobrevida. Essa
exclusão é denominada censura (Silva, 1999).
Os dados dos cálculos de sobrevida são freqüentemente apresentados na forma de
tábua de vida atuarial, onde podem ser observados os números de óbitos e censuras que
ocorreram em cada um dos intervalos consecutivos. Um exemplo de tábua de vida atuarial,
que traz os cálculos da sobrevida geral deste estudo, está na Tabela I.
Tabela I. Tábua de vida atuarial para o cálculo da sobrevida geral do câncer de pênis, em Goiânia no
período de 1988 a 1999.
Intervalo
Tempo (anos)
Lx
Dx
Ux
Wx
Lx`
qx`
px`
S(x)
0—1
38
9
11
1
13
0,692
0,308
0,308
1—2
17
0
3
3
5,5
0,000
1,000
0,308
2—3
11
1
1
2
4
0,250
0,750
0,231
3—4
7
2
0
0
3,5
0,571
0,429
0,099
4—5
>5
5
2
1
0
0
1
2
1
1,5
0
0,667
0,000
0,333
0,000
0,033
0,000
13
16 (42%)
9
TOTAL
Onde:
X - representa o intervalo de tempo considerado para o cálculo variável;
Lx - número de pessoas exspostas ao risco de morrer;
Dx - número de óbitos;
Ux - número de censuras;
Wx - número de pessoas vivas;
Lx’ - número de indivíduos expostos ao risco de morrer, corrigido pela censura, assim :
Lx’ = [ Lx - ( Wx + Ux ) ] / 2
qx’ - probabilidade de óbito em decorrência da doença considerando, assim : qx’= Dx/Lx’
px’ – probabilidade de sobreviver a doença considerada, assim: px’ = 1 – qx’
S (x) - probabilidade de sobrevida acumulada.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
90
A sobrevida acumulada é calculada a partir da multiplicação das possibilidades de sobrevida (px’) de cada
período consecutivo da análise.
Análise dos dados gerada pelo programa Spss®
Sequence Plot
Model Description
Model Name
Series or Sequence
MOD_5
1
Sx
Transformation
None
Non-Seasonal Differencing
0
Seasonal Differencing
0
Length of Seasonal Period
No periodicity
Horizontal Axis Labels
Intervalo
Intervention Onsets
None
Reference Lines
Overall mean
Area Below the Curve
Not filled
Applying the model specifications from MOD_5
Case Processing Summary
Sx
Series or Sequence Length
Number of Missing
Values in the Plot
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
User-Missing
System-Missing
7
0
0
Angela Adamski da Silva Reis
91
ANEXO 6 DADOS BRUTOS DE IDENTIFICAÇÃO, SÓCIO DEMOGRÁFICOS E CLÍNICOS DOS 38 PACIENTES QUE FIZERAM
PARTE DO ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO EM GOIÂNIA, NO PERÍODO DE 1988 A 1999.
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Iniciais
TPM
VMG
DAS
JNS
BPO
AJL
MAF
MSRS
EAA
JRA
JVM
MFL
AFS
ALS
JBS
SGO
SJS
BVS
ARA
DSR
CC
JVR
BO
JPS
APS
ADS
ABL
LBS
Pront.
771555
830570
850176
882107
882897
884007
884328
895799
900770
905462
916400
9203082
9207482
9306366
9307844
9405184
9406694
9409667
9502243
90100830
92100783
94102973
94104478
94105105
95108453
96100628
96100690
97101930
Dt. Nasc.
21/12/2008
31/10/2018
8/1/2020
4/12/2005
18/4/2019
23/8/1925
6/6/2006
30/6/1959
27/11/1936
10/1/1935
31/8/1932
12/12/2004
29/7/2018
6/8/1936
9/6/1957
8/8/1955
26/7/1936
29/6/1931
4/2/1939
3/4/2019
16/9/2007
4/5/2016
16/2/1932
25/12/1936
25/12/1931
17/2/1962
22/7/1947
21/4/1956
Id
83
73
71
83
72
64
83
30
53
56
60
87
75
57
37
39
58
63
56
71
86
79
63
58
64
33
48
40
Prof.
0
3
0
0
0
8
0
1
8
3
7
0
8
10
11
3
8
12
4
0
8
8
7
0
4
11
11
5
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Tab
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
1
0
2
2
2
0
2
2
1
2
2
2
2
1
Et
0
0
0
0
0
0
0
2
2
2
2
1
1
2
2
0
2
2
2
0
2
2
2
2
1
2
2
2
EG
9
0
0
0
0
1
9
9
9
1
0
1
1
0
1
0
1
1
0
0
1
0
1
0
0
3
0
0
CID
9
9
9
9
9
9
1
9
9
0
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
1
0
Top
2
2
2
1
2
2
2
2
2
3
1
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
1
1
T
N
M
Estádios
2
0
0
2
2
3
0
3
0
0
2
4
3
0
0
3
2
0
0
2
2
3
3
0
0
0
0
0
0
2
3
3
2
2
0
0
0
0
2
2
Dat. Diag.
22/5/1991
24/9/1991
29/6/1990
10/9/1988
19/12/1990
7/12/1988
28/9/1988
12/10/1989
15/3/1989
2/4/1990
5/11/1991
17/7/1991
29/9/1992
25/8/1993
4/11/1993
5/5/1994
8/9/1994
20/10/1994
6/2/1995
3/3/1990
26/2/1992
21/7/1994
10/6/1994
6/7/1994
5/9/1995
11/12/1995
5/2/1996
17/3/1997
Angela Adamski da Silva Reis
Dat.Ret.
2/9/1987
5/5/1983
18/10/1993
3/10/1989
6/2/1992
óbito
7/5/1989
31/1/1990
óbito
2/12/1990
22/6/1993
24/9/1992
15/9/1993
ñ voltou
ñ voltou
19/10/1994
2/11/1994
óbito
ñ voltou
22/11/1999
ñ voltou
21/7/1994
21/1/2000
óbito
ñ voltou
ñ voltou
1/2/2001
16/4/2001
Óbito
22/5/1991
24/9/1991
12/8/1991
19/5/1989
31/7/1990
19/10/1992
15/11/1994
31/5/1995
2/10/1992
11/2/1996
30/9/1995
Meses
0
0
116
5
13
32
2
8
40
120
28
49
12
0
8
42
2
7
0
6
7
19
65
0
1
0
60
19
Classif
d
d
u
u
u
d
d
u
d
u
u
d
u
u
u
d
u
d
u
w
d
u
w
d
d
u
w
w
92
N
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
Iniciais
SJC
MVS
OBC
VSS
AL
VBA
JPSL
JSL
CRJ
OTC
Pront.
97102962
97104512
97110381
98100726
98101683
98104701
98105723
98107865
99106861
99106869
Tabagismo
Etilismo
Topografia
CID
Dt. Nasc.
26/1/1935
10/10/1999
2/6/1936
14/11/1953
10/6/1935
13/5/2017
1/10/1956
8/3/1931
6/6/1942
20/9/2029
NC
Sim
Não
Glande
Pênis
Prepúcio
C600
C601
C608
C609
Id
62
97
61
44
63
81
41
67
55
66
Prof.
13
8
11
9
8
8
2
8
8
8
0
1
2
1
2
3
0
1
8
9
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Tab
1
0
2
2
2
1
2
2
1
2
Et
2
0
1
2
2
2
2
2
1
2
EG
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
Profissão
CID
9
0
9
9
9
9
1
9
9
9
Top
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Aposentado
As.administr.
Aux.motorista
Carpinteiro
Comerciante
Eletricista
Enc.depósito
Func.público
Lavrador
Mecânico
Militar
Motorista
Pintor
Vigia
T
3
N
0
M
0
Estádios
3
1
0
0
1
3
0
0
3
2
3
0
4
Dat. Diag.
22/4/1997
30/4/1997
1/12/1997
1/4/1998
9/7/1998
9/6/1998
2/7/1998
13/10/1998
12/9/1997
31/5/1996
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Angela Adamski da Silva Reis
Dat.Ret.
4/10/1997
6/6/1997
2/6/2001
29/1/1998
12/1/2001
18/6/1998
17/11/2000
óbito
19/4/2001
19/2/2001
Óbito
13/3/1999
Meses
6
15
57
0
30
0
13
0
36
3
Classif
u
u
w
u
w
u
w
d
w
w
93
1,000
0,900
0,800
0,700
Sx
0,600
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
0--1
1--2
2--3
3--4
4--5
5
Intervalo
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
94
ANEXO 7. TERMO DE CONSENTIMENTO DOS INDIVÍDUOS DE CÉLULAS
ESFOLIADAS DA GLANDE
O papel do Papilomavírus Humano (HPV) na carcinogênese dos tumores de
pênis: Uma abordagem epidemiológica e molecular.
I. DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL
1. Nome do paciente:.................................................................................................................
Documento de Identidade............................................
Data de nascimento: _____/ ______/ ______
Endereço: ______________________________________________________________
Bairro: ______________________ Cidade: _________________ Estado: ___________
CEP: _________________ Telefone: (
) _________________________________
2. Responsável legal ________________________________________________________
Natureza (grau de parentesco, tutor, curador, etc) _______________________________
Documento de identidade _________________________ Sexo: M ( ) F ( )
Endereço: ______________________________________________________________
Bairro: ______________________ Cidade: _________________ Estado: ___________
CEP: _________________ Telefone: (
) _________________________________
II. DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA
1. Título do protocolo de pesquisa: O papel do Papilomavírus Humano (HPV) na
carcinogênese dos tumores de pênis: Uma abordagem molecular e epidemiológica;
2. Pesquisador responsável: Aparecido D. da Cruz, Registro de Câncer de Base Populacional
de Goiânia. Fone: (062) 227 1385; e-mail: [email protected]
3. Avaliação do risco da pesquisa: Os procedimentos da pesquisa não oferecem nenhum
risco de ocorrência de algum dano imediato ou tardio para o paciente;
4. Duração da pesquisa: abril de 2003 a abril de 2004.
III. REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU
REPERESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA
Nós estamos conduzindo um estudo para investigar se certas características e hábitos dos
homens estão relacionados com doença viral. Para isso, estamos solicitando aos pacientes neste e em
outros hospitais para participarem da pesquisa.
A sua participação na pesquisa inclui: a) responder a perguntas de um questionário; b) doação
de células da glande através de escovado. Esclarecemos que estes procedimento podem lhe trazer
algum desconforto.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
95
Dependendo da sua doença e, somente se isto fizer parte dos procedimentos habituais e
necessários de diagnóstico ou de tratamento de sua doença, serão coletadas pelo seu médico assistente
amostras de tecido da parte doente e isto fará parte dos dados da pesquisa.
IV. ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO
DA PESQUISA
Todas as informações prestadas durante a entrevista serão de caráter confidencial e as
informações colhidas serão utilizadas somente para fins científicos descritos no protocolo
desta pesquisa, sem qualquer identificação pessoal.
Qualquer provável benefício do estudo para o bem–estar da população depende da
exatidão de suas respostas. Portanto, se o Senhor não entender alguma das questões, por
favor, solicite todos os esclarecimentos que julgar necessário sobre os procedimentos, riscos e
benefícios relacionados à pesquisa ou qualquer dúvida.
O Sr. Tem a liberdade de não participar do estudo e retirar seu consentimento a qualquer
momento deixando de participar do estudo, sem que isto traga qualquer prejuízo à continuidade de sua
assistência.
Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi
explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa.
Goiânia, ________/ ________/ ________.
_____________________________________________
(Assinatura do sujeito da pesquisa ou responsável legal)
____________________________________________
(Assinatura do Médico responsável)
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
96
ANEXO 8. QUESTIONÁRIO APLICADO AOS INDIVÍDUOS QUE FIZERAM
PARTE DO ESTUDO DE CÉLULAS ESFOLIADAS DA GLANDE
O papel do papilomavírus humano (HPV) na Carcinogênese dos tumores de
pênis; uma abordagem molecular e epidemiológica.
Nome do paciente __________________________________________________________
Idade: _____________________ Data da entrevista ______________________________
1) O Sr. Já esteve casado ou vivendo junto com alguém? (
2) O Sr. ainda é casado ou vive com alguém? (
)Sim (
)Sim (
)Não
)Separado ou Divorciado(
)Viúvo
3) Quantas vezes o Sr. já esteve casado ou vivendo como casado? ____________________
4) No total, quantos parceiros sexuais o Sr. já teve (regulares e/ou casuais) ______________
5) Se difícil responder:
( )2–5
( ) 6 – 10
( ) 11 – 20
( ) 21 –50
( ) 51 –100
6) Destas parceiras, quantas eram prostitutas? _________________(
7) Se difícil responder:
( )2–5
( ) 6 – 10
( ) 11 – 20
( ) 21 –50
( ) mais de 100
)
( ) 51 –100
8) O Sr. já fez sexo oral? [colocou sua boca nos genitais do (a) parceiro (a)]
( ) mais de 100
(
) Sim (
) Não
9) Com que freqüência?
( ) ocasionalmente ( ) freqüentemente ( ) quase sempre
10) O Sr. já teve verrugas na pele ?
( ) Sim (
) Não, se SIM onde? ______________________________________
11)O Sr. já teve sapinho (Monília, Cândida albicans) ?
( ) Sim (
) Não, se SIM onde? ______________________________________
12) O Sr. já teve lesões de herpes (boqueira)?
( ) Sim (
) Não
13) O Sr. já teve alguma doença venérea ?
( ) Sim (
) Não, se SIM, qual?
( ) Sífilis–cancro; ( ) Gonorréia; ( ) Condiloma–verrugas; (
) HIV–AIDS
( ) Outra: _____________________
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
97
ANEXO 9. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA
DE CÉLULAS DA GLANDE
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE ESCOVADO DE GLANDE
1. Amostras: células esfoliadas do epitélio da glande fixada em solução álcool - ácido à
3%.
2. Fundamentação Teórica:
O DNA pode ser obtido de qualquer tecido, a extração e a purificação do DNA genômico
compreendem os seguintes procedimentos: (1) lise das células (citólise) e (2) purificação do
DNA, separando moléculas como proteínas e RNAs por digestão enzimática e / ou processos
físico-químicos (Farah, 2000).
A técnica utilizada para a amplificação de material genômico é a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), amplificação enzimática de uma seqüência específica de DNA, visando a
produção de milhares de cópias da seqüência alvo. No entanto, se durante o processo de
extração e purificação de DNA ocorrer contaminação por manuseio, desencadeará problemas
nas reações e a seqüência alvo poderá não ser amplificada. Assim, o local do laboratório e o
material utilizado para a extração de DNA devem ser separado daqueles dedicados ao
manuseio de DNA clonado ou outros tipos de vetores.
A preparação das amostras deve ser realizada em separado ao aparelho de termociclagem.
É preferível possuir um local separado para a preparação de amostras de extração e
purificação de DNA, guardar em separado as pipetas e outros utensílios para o trabalho com
reações PCR, impedindo a formação de aerossóis, a troca freqüente de luvas de procedimento
poderá impedir a contaminação da amostra com células epiteliais das mãos e sempre adicionar
o DNA por último nos tubos da reação (Passaglia & Zaha, 2003; Barker, 2002).
3. Kit utilizado:
Kit de purificação de DNA genômico Wizard ® (Wizard ® Genomic DNA Purification
Kit – Promega Corporation, EUA).
4. Coleta:
As amostras foram coletadas pelo Serviço de Urologia do HAJ, os 100 indivíiduos foram
selecionados randomicamente sem história de infecção prévia por papilomavírus humano
(HPV) na faixa etária de 25 a 60 anos, sexualmente ativos e sem lesão peniana. Os pacientes
assinaram um termo de consentimento para participarem do referido estudo e responderam a
um questionário, sobre os hábitos sexuais, número de parceiras e doenças sexualmente
transmissíveis.
A coleta foi realizada com swab diretamente no epitélio da glande por fricção
(esfregaço), posteriormente o swab foi colocado dentro de um Falcon contendo solução de
fixação de álcool – ácido 3% (metanol – ácido acético), as células coletadas presas nas cerdas
do swab, foram espalhadas com movimentos circulares, na superfície da solução, e
posteriormente foram armazenadas em refrigeração e em seguida realizadas a extração de
DNA e amplificação do genoma viral por PCR.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
98
5. Armazenamento
As amostras foram encaminhadas ao laboratório (NPR) pelo Serviço de Urologia do
HAJ, em tubos Falcon, com o escovado de glande. Imediatamente, as amostras foram
processadas por centrifugação e separado o pellet (células da glande) do sobrenandante
(solução de fixação) e feita a extração e purificação de DNA.
6. Protocolo do fabricante
6.1. Preparo da amostra
As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por 30 minutos, desprezado o
sobrenadante, e retirado com pipeta de Pasteur o pellet e transferido para tubos Ependorff.
Os tubos Ependorff contendo o pellet foram centrifugados em microcentrifuga a 14.000
rpm por 20 minutos.
6.2. Lise e precipitação protéica
1. Adicionar 3μL de solução de Rnase (Rnase solution) na solução lisada e misturar a 37º
C por 30 minutos. Resfriar a temperatura ambiente.
2. Adicionar 200μL de solução de precipitação protéica (Protein precipitation solution).
Levar ao vortex e resfriar em gelo por 5minutos.
3. Centrifugar a 14.000 rpm por 4 minutos.
6.3. Precipitação e reidratação do DNA
4. Tranferir o sobrenadante para um tubo ependorff fresco contendo 600μL de
isopropanol à temperatura ambiente.
5. Misturar gentilmente por inversão.
6. Centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto.
7. Remover o sobrenadante e adicionar 600μL de etanol a 70% à temperatura ambiente e
misturar.
8. Centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto
9. Aspirar o etanol e seacr o pellet ao ar por 15 minutos.
10. Reidratar o DNA em 50μL de solução de reidratação de DNA (DNA rehydratation)
por 1 hora a 65ºC ou overnigth a 4 º C.
7. Conclusão
O kit Wizard® mostrou-se eficaz para a extração e purificação de DNA de material
proveniente de escovado de glande. Porém, ficou evidente que amostras de escovado de
epitélio da glande são escassas em DNA.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
99
ANEXO 10. DADOS BRUTOS DAS RESPOSTAS DOS QUESTIONÁRIOS APLICADOS AOS INDIVÍDUOS QUE FIZERAM
PARTE DO ESTUDO MOLECULAR DE CÉLULAS ESFOLIADAS DA GLANDE.
Dados Pessoais
Hábitos Sexuais
N
Data de Nasc
Idade
Casado
Vive c alguém
nº parc sex
1
12/1/1973
30
1
1
6
Doença
Prost S oral
1
1
Freq SO
Verugas pele
local verruga
C albicans
1
2
0
2
Herpes DST
2
1 e
2
18/4/1958
44
1
1
4
1
1
1
2
0
2
2
1 b
3
24/11/1973
29
2
2
3
0
1
3
1
1
2
2
2 0
4
15/4/1973
29
2
2
3
0
1
1
2
0
2
2
2 0
5
8/7/1971
31
1
1
1
0
1
1
2
0
2
2
2 0
6
24/2/1963
40
1
1
1
0
1
1
2
0
2
2
2 0
7
1/3/1975
28
1
1
4
1
1
1
1
1
2
2
2 0
8
16/4/1968
35
2
2
6
1
1
1
1
0
0
1
1 b
9
25/12/1966
36
2
2
5
1
1
1
2
0
0
1
1 b
10
2/12/1969
33
1
1
5
2
1
2
2
1
1
1
1 b
11
1/2/1967
36
1
1
1
0
2
0
0
0
1
1
1 b
12
5/1/1963
34
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
1 b
13
6/10/1965
37
1
1
3
0
1
1
2
0
2
1
2 0
14
10/9/1967
35
1
1
5
2
1
2
1
0
2
2
1 b
2 0
15
7/5/1969
33
1
1
1
3
1
1
2
0
2
2
16
11/9/1979
23
2
2
2
1
0
0
2
0
2
2
2 b
17
3/3/1975
28
1
1
4
1
1
2
2
0
2
1
2 0
20
5/7/1976
26
2
2
3
0
1
1
2
0
2
1
2 0
21
26/7/1968
34
1
1
4
1
1
1
2
0
2
2
2 0
22
16/6/1967
35
1
1
4
1
1
2
2
0
2
2
2 0
23
22/3/1970
33
1
1
1
0
1
1
1
0
2
1
2 0
24
6/8/1970
33
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2 0
25
20/12/1946
55
1
1
1
1
2
0
1
1
2
2
1 b
26
15/8/1959
43
1
1
1
2
1
1
1
0
2
2
2 0
27
14/11/1932
71
1
1
2
0
2
0
2
0
2
2
2 0
28
18/10/1938
74
1
1
1
1
2
0
2
0
2
2
1 b
29
2/7/1968
35
1
1
2
1
1
1
2
0
2
2
2 0
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
100
Dados Pessoais
Hábitos Sexuais
Doença
N
Data de Nasc
Idade
Casado
Vive c alguém
Verugas pele
local verruga
C albicans
30
22/2/1933
70
1
1
nº parc sex Prost S oral Freq SO
3
0
2
0
2
0
2
Herpes DST
2
2 0
31
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
32
25/11/1931
72
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
33
13/2/1925
78
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
34
8/8/1925
78
1
1
1
1
2
0
1
1
2
2
1 b
35
11/6/1943
69
1
1
2
1
1
1
2
0
2
2
2 0
36
20/2/1913
89
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
37
24/5/1925
78
1
1
1
0
2
0
1
3
2
2
2 0
38
16/7/1946
57
1
1
1
1
2
0
2
0
2
2
2 0
39
2/12/1951
52
1
1
2
1
1
1
1
1
2
2
2 0
40
13/7/1920
81
1
1
1
0
2
0
1
1
2
2
1 b
41
24/10/1951
51
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
42
18/11/1964
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
43
23/3/1939
39
1
1
3
1
1
1
2
0
2
2
1 b
44
27/7/1933
70
1
1
2
1
1
1
2
0
2
2
2 0
45
29/1/1942
61
1
1
1
3
2
0
1
1
2
2
2 0
46
17/4/1976
27
2
*
2
0
2
0
2
0
2
2
2 0
47
16/1/1933
70
1
1
5
2
1
1
2
0
2
2
1 b
48
27/1/1938
65
1
1
1
1
1
1
2
0
2
2
2 0
49
5/5/1942
61
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2 0
50
31/10/1938
68
1
1
1
0
1
1
1
1
2
2
2 0
51
9/9/1949
53
1
1
1
1
2
0
2
0
2
2
2 0
52
14/10/1939
65
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
53
12/3/1932
70
*
*
0
0
0
0
0
0
0
0
0 0
54
26/4/1962
41
1
1
3
0
1
3
2
0
2
2
1 b
55
12/12/1959
43
1
1
3
0
1
1
1
1
2
2
2 0
56
22/11/1926
75
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
1 b
57
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
58
18/9/1967
35
1
1
2
0
2
0
2
0
1
2
1 b
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
101
Dados Pessoais
Hábitos Sexuais
Idade Casado
Doença
N
Data de Nasc
Vive c alguém
nº parc sex
Verugas pele
local verruga
C albicans
59
*
68
1
1
1
Prost S oral Freq SO
0
1
1
2
0
2
Herpes DST
2
1 b
60
20/7/1927
75
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
61
26/5/1930
72
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
62
16/10/1950
52
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
63
18/10/1938
74
1
1
2
1
2
0
2
0
2
2
1 b
64
2/7/1968
35
1
1
2
2
1
1
2
0
2
2
2 0
65
22/2/1933
70
1
1
3
0
2
0
2
0
2
2
2 0
66
25/11/1931
72
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
67
13/2/1925
78
1
1
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
68
8/8/1945
67
1
1
1
1
2
0
1
1
2
2
1 b
69
11/6/1943
69
1
1
2
2
1
1
2
0
2
2
2 0
70
20/2/1913
89
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
71
*
78
1
1
1
0
2
0
1
4
2
2
2 0
72
12/7/1937
66
1
1
4
0
*
*
2
0
2
2
1 b
73
1/4/1967
36
1
1
1
4
2
0
1
*
1
2
1 b
74
5/9/1951
53
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
75
20/5/1921
84
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
76
5/12/1931
74
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
77
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
78
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
79
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
80
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
81
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
82
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
83
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
84
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
85
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
86
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
102
Dados Pessoais
N
Data de Nasc
Hábitos Sexuais
Idade Casado
Vive c alguém
nº parc sex
Doença
Prost S oral Freq SO
Verugas pele
local verruga
C albicans
Herpes DST
87
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
88
15/8/1959
43
1
1
2
2
1
1
2
0
3
3
2 0
89
14/11/1932
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
90
8/11/1946
57
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
91
15/8/2022
80
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
92
2/12/1951
53
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
93
13/8/1937
64
1
1
1
0
1
1
2
0
2
2
2 0
94
19/8/1939
63
1
1
1
1
2
0
2
0
2
2
1 b
95
13/7/1937
65
1
1
2
1
1
1
2
0
2
2
1 b
96
27/9/1923
79
1
1
1
0
2
0
2
0
2
2
2 0
97
23/3/1944
59
1
1
1
1
1
2
2
0
2
2
2 0
98
16/7/1946
57
1
1
1
*
2
0
2
0
2
2
2 0
99
20/2/1946
55
1
1
1
1
2
0
1
1
2
2
1 b
100
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
Legenda
Hábitos Sexuais
Vive com álguém
Doença
Sexo oral
Prostitutas
1
Sim
1
Sim
0
2
Não
2
Não
1 2 a 5 prostitutas
Nº de parceiros
Freq. Sexo oral
nenhuma prostituta
Veruga Pele
Candida albicans
1
Sim
1
Sim
2
Não
2
Não
2 6 a 10 prostitutas
Local da Verruga
Herpes
1 Sim
2 Não
DST
a Sífiis
1
b Gonorréia
Sim c Condiloma
1
2 a 5 parceiros
0
não faz
3 11 a 20 prostitutas
0
Sem verruga
2
pé
d HIV- AIDS
2
6 a 10 parceiros
1
ocasionalmente
4 21 a 50 prostitutas
1
mão
3
órgão genital
e outra
3
11 a 20 parceiros
2
frequentemente
5 51 a 100 prostitutas
4
joelho
4
21 a 50 parceiros
3
quase sempre
6
5
51 a 100 pareceiros
6
mais de 100 parceiros
*
2 Não
mais de 100 prostitutas
0 ausência
Não
respondeu
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
103
ANEXO 11. DADOS DA ANÁLISE MOLECULAR DE DNA GENÔMICO DOS INDIVÍDUOS DE
CÉLULAS ESFOLIADAS DA GLANDE
N
My9/My11 D8S135 Genotip
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
17
18
19
20
21
22
23
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
24
25
26
27
28
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
N
My9/My11 D8S135 Genotip
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
45
46
47
48
49
50
51
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
52
53
54
55
56
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
N
My9/My11 D8S135 Genotip
N
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo HPV16 85
Positivo HPV 16 86
87
Positivo
NC
NC
88
Positivo
89
Negativo
NC
Positivo HPV 11 90
Positivo HPV 18 91
Positivo HPV 18 92
Positivo HPV 18 93
NC
94
Positivo
95
Positivo
NC
Positivo HPV 16 96
Positivo
NC 97
Positivo
NC 98
Positivo HPV 11 99
Positivo HPV 16 100
NC
NC
NC
NC
HPV 11
HPV 18
73
74
75
76
77
78
79
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
HPV 11
HPV16
HPV 16
NC
HPV 18
80
81
82
83
84
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
NC
NC
NC
NC
NC
NC
HPV16
HPV16
NC
NC
HPV18
NC
NC
NC
NC
NC
NC
My9/My11 D8S135
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Genotip
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo
NC
NC
Positivo
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo HPV 11 e 18
Positivo
NC
NC
Positivo
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo
NC
Positivo
HPV 6
HPV 16
HPV16
HPV16
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
NC
Legenda: NC – Não Necessário
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
104
ANEXO 12. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA
EM MATERIAL BIOLÓGICO PARAFINADO DE CÂNCER DE PÊNIS
8. Amostras: biópsias em material parafinado de pacientes com carcinoma de pênis
armazenadas a temperatura ambiente.
9. Kit utilizado:
Kit de purificação de Pure Gene ® Purification Kit – Gentra Systems, USA.
10. Obtenção das amostras:
As amostras de carcinomas penianos foram encaminhadas ao laboratório (NPR) pelo
Serviço de Patologia do HAJ com seus respectivos laudos. Após identificação as amostras
foram processadas para análise molecular.
11. Processamento das amostras
As amostras de biópsia em material de blocos parafinado encaminhadas ao laboratório
(NPR) pelo Serviço de Patologia do HAJ, foram realizados cortes em micrômetro de 3µm,
estes cortes foram armazenados em tubos eppendorf, os quais posteriormente foram
realizados o processo de desparafinização dos tecidos e a extração de DNA.
12. Desparafinização do tecido embebido em parafina e Extração de DNA
Isolamento de DNA de 5 – 10mg de tecido fixado ou embebido em parafina
Desparafinização do tecido
1.Coloque 5 -10 mg de tecido dentro de tubo de 1,5mL. Adicionar 300µL de xileno e
incubar por 5 minutos, misturando constantemente a temperatura ambiente.
2.Centrifugar a 13.000 – 16.000 rpm por 1-3 minutos, descartar o sobrenadante (xileno),
observar pellet.
3. Repetir etapa 1 e 2, duas vezes (no total 3 lavagens)
4.Adicionar 300µL de etanol (100%) e incubar por 5 minutos com constante
homogeneização em temperatura ambiente.
5.Centrifugar a 13.00 – 16.000 rpm por 1-3 minutos, descartar o etanol.
6. Repetir passo 4 e 5 (no total de 2 lavagens)
Lise Celular
1. Adicionar 300 µL de solução de lise celular e homogeneizar
2. Adicionar 1,5 µL de Proteinase K (20mg/mL) invertendo 25 vezes e incubar a 55ºC
por 3 horas a overnigth. Se o tecido não estiver completamente digerido depois da
incubação overnigth, adicionar 1,5 µL de Proteinase K e continuar a incubação a 55 º
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
105
C por 3 horas a overnigth. Se possível, inverter os tubos periodicamente durante a
incubação.
Precipitação de Proteína
1.
2.
3.
4.
Manter a amostra a temperatura ambiente
Adicionar 100µL de solução de precipitação de proteína
Vortex a alta velocidade por 20 segundos
Centrifugar a 13.000 – 16.000 rpm por 3 minutos. A proteína precipitada ira formar
um pellet pequeno. Se o pellet de proteína não se formar, repetir a etapa 3, seguida da
incubação em banho de gelo por 5 minutos, e então repetir a etapa 4.
Precipitação de DNA
1. Colocar o sobrenadante contendo DNA (deixando o pellet precipitado de proteína) e
colocar em um tubo de 1,5 mL contendo 300 µL de isopropanol 100%. Se o DNA dor
estimado em ≤ 1µg, adicionar solução de glicogênio (20mg/µL) – 0,5 µL para carrear
o DNA.
2. Inverter delicadamente 50 vezes
3. Centrifugar a 13.000- 16.000 rpm por 5 minutos.
4. Retirar o sobrenadante e deixar secar os tubos de boca para baixo em papel
absorvente. Adicionar 300 µL de etanol 70% e inverter o tubo para lavar o pellet de
DNA.
5. Centrifugar a 13.000 – 16.000 rpm por 1 minuto (cuidado: DNA fica solto)
6. Inverter e deixar secar o tubo de boca para baixo em papel absorvente por 10 a 15
minutos.
Hidratação DNA
1. Adicione 20µL solução de hidratação de DNA
2. Reidratar o DNA incubando a amostra por 1 hora a 65º C e ou overnigth a temperatura
ambiente
3. Armazenar a 4º C
13. Conclusão
A desparafinização e a extração de DNA mostraram-se eficaz para o material biológico
parafinado. Porém, ficou evidente que o DNA de amostras de tecido embebido em parafina se
mostram degradados.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
106
ANEXO 13. DADOS DA ANÁLISE MOLECULAR DE DNA EM MATERIAL BIOLÓGICO PARAFINADO DE CÂNCER DE PÊNIS
DADOS DO PACIENTE
N Paciente
TNM
Prontuário
Biópsia
Idade
Resultado
RESULTADO ANÁLISE MOLECULAR
Grau Topografia T
N M DNA GP5/6 My9/11 6
11
16
18
33
35
45
58
1
APR
2002100811
B200201922
50
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
2
MC
20021011031 B200201080
66
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
3
AMO
2001111295
B200200948
94
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
4
AKRS
2002108186
B200210025
52
Carcinoma Escamocelular (CEC))
II
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
5
EMM
2002110862
B200213651
39
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Glande
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
6
NLE
2002109311
B200212672
33
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
1
1 00
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
7
LFA
2002108329
B200210672
42
Carcinoma Escamoso
I
Pênis
2
X
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
8
AMQ
2002107289
B200208886
74
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
2
X
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
9
FVS
2002102186
B20020649
66
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
10
MPS
2002105875
B200207260
74
Carcinoma Escamoso Invasor
NC
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
11
ALS
2001104357
B200201185
57
Carcinoma Escamoso Invasor
III
Pênis
3
2
0
+
+
-
12
JA
2001108258
B200201819
75
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
1
0
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
13
MRS
2001109855
B200112640
75
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
2
0
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
14
EPA
2001111186
B200113916
68
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
15
MFO
2003106991
B200313655
76
Carcinoma Escamoso Invasor
III
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
16
AI
2003101967
B200303084
62
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
3
2
0
3
0
0
-
-
-
-
-
-
-
-
17
PFF
2003110739
B200314794
49
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
18
DAA
2003105988
B200313708
64
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
19
DS
2003101682
B200304313
74
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
NC NC NC
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
20
JQC
2003105188
B200307866
84
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
2
0
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
21
FPM
2003106085
B200308248
71
Carcinoma Escamoso Invasor
III
Pênis
2
2
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
22
MNS
2003107731
B200310748
53
Carcinoma Escamoso Invasor
I
Pênis
3
2
0
+
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
23
ACF
2003107403
B200310677
84
Carcinoma Escamoso Invasor
II
Pênis
NC NC NC +
-
-
NN NN NN NN NN NN NN NN
Legenda: NN: Não necessário NC: Não Consta + :Positivo - : Negativo
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Angela Adamski da Silva Reis
107
ANEXO 14. INFORMAÇÕES SOBRE OS PRIMERS UTILIZADOS
GIBCO BRL Custom Primers
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 002488 01
Data da Ordem: 24/08/2000
Certificado de Análise
Número do Primer: D0294G10
Primer: MY09
Pesquisador:
(G10)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): CGT CCA AGA GGA TAC TGA TC
Escala de Síntese:
μg por OD:
Peso Molecular (μg/μmol):
6449,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
225,0
Padrão
Tm (1M Na+)
68
Tm (50 mM Na+)
47
%CG
50
28,6
OD’s
34,55
990,28
nmoles
153,4
Coupling Eff. 98%
Número do Primer: D0294G11
Dr. Aparecido da Cruz
(G11)
Seqüência (5’ → 3’): GCC CAG GGT CAT AAC AAT GG
Peso Molecular (μg/μmol):
6474,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
227,5
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
28,52
70
μg’s
Tm (50 mM Na+)
49
nmoles
%CG
55
Coupling Eff. 98%
Seqüência (5’ → 3’): GGG AGG CTT TAT AAT TAT TTA GC
Peso Molecular (μg/μmol):
7482,6
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
+
125,4
(G12)
Dr. Aparecido da Cruz
Tm (1M Na )
811,60
Número do Primer: D0294G12
Primer: D8S135
+
200 nmol
28,4
Tm (1M Na+)
Pureza
20
nmoles por OD: 4,4
OD’s
Padrão
Pesquisador:
200 nmol
nmoles por OD: 4,4
μg’s
Primer: MY11
Pesquisador:
20
261,1
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
OD’s
66
μg’s
45
%CG
34
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
200 nmol
28,6
nmoles por OD: 3,8
Padrão
Tm (50 mM Na )
23
nmoles
34,06
976,09
130,4
Angela Adamski da Silva Reis
108
Número do Primer: D0294H01
Primer: D8S135
Pesquisador:
(H01)
Dr. Aparecido da Cruz
Seqüência (5’ → 3’): CTG GGC AAC AGA GTG GGA C
Peso Molecular (μg/μmol):
6208,8
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
219,1
Padrão
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
200 nmol
28,3
nmoles por OD: 4,5
OD’s
9,11
258,16
Tm (1M Na+)
72
μg’s
Tm (50 mM Na+)
50
nmoles
%CG
63
Invitrogen Brasil Custom Primers
19
41,5
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 011685 01
Data da Ordem:
Certificado de Análise
24/09/2002
Número do Primer: D1124F06
Primer: HPV-GP5+ F
(F06)
Pesquisador:
Tamanho do Primer:
Dr. Aparecido da Cruz
Seqüência (5’ → 3’): TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC
Peso Molecular (μg/μmol):
7433,6
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
250,7
Padrão
Escala de Síntese:
μg por OD:
23
200 nmol
29,6
nmoles por OD: 3,9
OD’s
μg’s
33,42
990,95
Tm (1M Na+)
66
nmoles
133,3
Tm (50 mM Na+)
45
Coupling Eff. 98%
%CG
20
Primer: HPV-GP6+ R
Número do Primer: D1124F06
Pesquisador:
(F06)
Dr. Aparecido da Cruz
Seqüência (5’ → 3’): GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C
Peso Molecular (μg/μmol):
8073,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
+
Tm (1M Na )
+
309,8
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
OD’s
66
μg’s
41
%CG
20
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
200 nmol
26,0
nmoles por OD: 3,2
Padrão
Tm (50 mM Na )
25
nmoles
35,82
933,42
115,7
Angela Adamski da Silva Reis
109
Invitrogen Brasil Custom Primers
LIFE TECHNOLOGIES
Certificado de Análise
Número de Ordem: 004799 01
Data da Ordem: 09/05/2001
Primer: HPV-6 LEFT
Número do Primer: D0482D03
Pesquisador:
Dr. Aparecido da Cruz
(D03)
Seqüência (5’ → 3’): CAC GTC TGC AAC GAC CAT AG
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
Peso Molecular (μg/μmol):
6384,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
218,7
Padrão
+
Tm (1M Na )
Tm (50 mM Na )
49
%CG
55
μg’s
Pesquisador:
29,6
30,48
891,13
nmoles
Primer: HPV-6 RIGTH
139,2
Número do Primer: D0482D04
Dr. Aparecido da Cruz
(D04)
Seqüência (5’ → 3’): CCA TGA AAT TCT AGG CAG CA
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
Peso Molecular (μg/μmol):
6433,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
228,5
Padrão
+
Tm (1M Na )
Tm (50 mM Na )
45
%CG
45
20
200 nmol
28,1
nmoles por OD: 4,3
μg’s
25,19
709,18
nmoles
110,3
Número do Primer: D0482G05
Primer: HPV- 11 PR1
Pesquisador:
μg por OD:
OD’s
66
+
200 nmol
nmoles por OD: 4,5
OD’s
70
+
μg por OD:
23
(D05)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): CGC AGA GAT ATA TGC ATA TGC
Peso Molecular (μg/μmol):
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
Padrão
Tm (1M Na+)
67
Tm (50 mM Na+)
45
%CG
42
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
6794,2
242,2
Escala de Síntese:
μg por OD:
21
200 nmol
28,0
nmoles por OD: 4,1
OD’s
μg’s
nmoles
24,55
688,68
101,3
Angela Adamski da Silva Reis
110
Invitrogen Brasil Custom Primers
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 004799 01
Data da Ordem: 09/05/2001
Certificado de Análise
Número do Primer: D0482D06
Primer: HPV- 11 PR2
(D06)
Pesquisador:
Tamanho do Primer:
Dr. Aparecido da Cruz
Seqüência (5’ → 3’): AGT TCT AAG CAA CAG GCA CAC
Escala de Síntese:
μg por OD:
Peso Molecular (μg/μmol):
6748,2
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
241,9
+
Tm (1M Na )
27,9
OD’s
22,44
626,00
69
nmoles
Tm (50 mM Na )
47
Coupling Eff. 98%
%CG
47
+
200 nmol
nmoles por OD: 4,1
μg’s
Padrão
21
92,6
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 002488 01
Data da Ordem: 24/08/2000
Invitrogen Brasil Custom Primers
Certificado de Análise
Primer: HPV- 16
Pesquisador:
Número do Primer: D0294F10
Dr. Aparecido da Cruz
(F10)
Seqüência (5’ → 3’): TCA AAA GCC ACT GTC TCC TGA
Peso Molecular (μg/μmol):
6730,2
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
Padrão
Tm (1M Na+)
69
Tm (50 mM Na+)
47
%CG
47
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
229,9
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
21
200 nmol
29,2
nmoles por OD: 4,3
OD’s
μg’s
nmoles
25,14
735,96
109,3
Angela Adamski da Silva Reis
111
Número do Primer: D0294F11
Primer: HPV-16
Pesquisador:
(F11)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): CGT GTT CTT GAT GAT CTG CAA
Escala de Síntese:
Peso Molecular (μg/μmol):
μg por OD:
6767,2
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
200 nmol
30,1
nmoles por OD: 4,4
224,2
OD’s
Padrão
26,02
μg’s
785,38
Tm (1M Na+)
67
Tm (50 mM Na+)
45
nmoles
%CG
42
Coupling Eff. 98%
Invitrogen Brasil Custom Primers
21
116,0
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 002488 01
Data da Ordem: 24/08/2000
Certificado de Análise
Número do Primer: D0297F12
Primer: HPV-18
Pesquisador:
(F12)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): CCG AGC ACG ACA GGA ACG ACT
Escala de Síntese:
μg por OD:
Peso Molecular (μg/μmol):
6774,2
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
239,0
Padrão
+
Tm (1M Na )
75
Tm (50 mM Na+)
53
%CG
61
nmoles por OD: 4,4
OD’s
28,08
795,90
nmoles
117,3
Coupling Eff. 98%
Número do Primer: D0294G01
(G01)
Dr. Aparecido da Cruz
Seqüência (5’ → 3’): TCG TTT TCT TCC TCT GAGTCGCTT
Peso Molecular (μg/μmol):
7633,8
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
200 nmol
33,7
μg’s
Primer: HPV-18
Pesquisador:
21
Padrão
225,9
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
200 nmol
33,7
nmoles por OD: 4,4
OD’s
38,66
Tm (1M Na+)
72
μg’s
Tm (50 mM Na+)
51
nmoles
%CG
45
Coupling Eff. 98%
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
24
1306,43
171,2
Angela Adamski da Silva Reis
112
Número do Primer: D0294G02
Primer: HPV- 33
Pesquisador:
(G02)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): AAC GCC ATG AGA GGA CAC AAG
Escala de Síntese:
Peso Molecular (μg/μmol):
μg por OD:
6822,2
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
254,8
26,7
μg’s
31,95
855,45
Tm (1M Na+)
71
Tm (50 mM Na+)
49
nmoles
%CG
52
Coupling Eff. 98%
125,2
Número do Primer: D0294G03
Primer: HPV- 33
Pesquisador:
200 nmol
nmoles por OD: 3,9
OD’s
Padrão
21
(G03)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): ACA CAT AAA CGA ACT GTG GTG
Peso Molecular (μg/μmol):
6803,2
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
248,2
Padrão
Tm (1M Na+)
67
Tm (50 mM Na+)
45
%CG
42
Escala de Síntese:
μg por OD:
21
200 nmol
27,4
nmoles por OD: 4,0
OD’s
μg’s
33,96
930,85
nmoles
136,8
Coupling Eff. 98%
Número do Primer: D0294G04
Primer: HPV-35
Pesquisador:
(G04)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): CCC GAG GCA ACT GAC CAT TA
Escala de Síntese:
μg por OD:
Peso Molecular (μg/μmol):
6394,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
Padrão
+
Tm (1M Na )
70
Tm (50 mM Na+)
49
%CG
55
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
218,7
20
200 nmol
29,2
nmoles por OD: 4,5
OD’s
μg’s
22,79
666,30
nmoles
104,1
Coupling Eff. 98%
Angela Adamski da Silva Reis
113
Primer: HPV-35
Pesquisador:
Número do Primer: D0294G05
Dr. Aparecido da Cruz
(G05)
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): GGG GCA CAC TAT TCC AAA TG
20
Escala de Síntese:
Peso Molecular (μg/μmol):
6449,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
μg por OD:
225,0
Tm (1M Na )
OD’s
68
+
Tm (50 mM Na )
47
%CG
50
μg’s
33,12
949,29
nmoles
147,0
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 002488 01
Data da Ordem: 24/08/2000
Invitrogen Brasil Custom Primers
Certificado de Análise
Número do Primer: D00294G06
Primer: HPV-45
Pesquisador:
28,6
nmoles por OD: 4,4
Padrão
+
200 nmol
(G06)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): ACC AGA TTT GTG CAC CAC AGA AT
Peso Molecular (μg/μmol):
6448,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
230,4
Escala de Síntese:
μg por OD:
200 nmol
27,9
nmoles por OD: 4,3
OD’s
Padrão
20
μg’s
33,22
929,70
Tm (1M Na+)
64
Tm (50 mM Na+)
45
nmoles
%CG
40
Coupling Eff. 98%
144,1
Número do Primer: D0294G07
(G07)
Primer: HPV-45
Pesquisador:
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): TTT TTT CCA GTG TCT CTC CA
Escala de Síntese:
μg por OD:
Peso Molecular (μg/μmol):
6323,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
191,6
Padrão
Tm (1M Na+)
64
Tm (50 mM Na+)
43
%CG
40
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
20
200 nmol
33,0
nmoles por OD: 45,2
OD’s
μg’s
23,32
769,58
nmoles
121,7
Coupling Eff. 98%
Angela Adamski da Silva Reis
114
Número do Primer: D0294G08
Primer: HPV-58
Pesquisador:
(G08)
Dr. Aparecido da Cruz
Seqüência (5’ → 3’): GGA CAT TGC ATG ATT TGT GT
Peso Molecular (μg/μmol):
6501,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
221,2
Tamanho do Primer:
Escala de Síntese:
μg por OD:
200 nmol
29,3
nmoles por OD: 4,5
OD’s
Padrão
20
35,97
Tm (1M Na+)
64
μg’s
Tm (50 mM Na+)
43
nmoles
%CG
40
Coupling Eff. 98%
1057,15
162,5
LIFE TECHNOLOGIES
Número de Ordem: 002488 01
Data da Ordem: 24/08/2000
Invitrogen Brasil Custom Primers
Certificado de Análise
Número do Primer: D0294G09
Primer: HPV-58
Pesquisador:
(G09)
Dr. Aparecido da Cruz
Tamanho do Primer:
Seqüência (5’ → 3’): TTT CTT GTG GAC ACA ATG GT
Peso Molecular (μg/μmol):
6461,0
Coef. Milimolar de Extringência (OD/μmol):
Pureza
Padrão
216,8
Escala de Síntese:
μg por OD:
200 nmol
29,8
nmoles por OD: 4,6
OD’s
μg’s
29,11
867,53
Tm (1M Na+)
64
Tm (50 mM Na+)
43
nmoles
%CG
40
Coupling Eff. 98%
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
20
134,2
Angela Adamski da Silva Reis
115
ANEXO 15. AMPLIFICAÇÃO DE DNA POR PCR
1. Protocolo de amplificação por PCR
Os fragmentos de DNA de Papilomavírus Humano (HPV) foram amplificados pela
técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR), utilizando primers específicos para
regiões genômicas de HPV (anexo 15).
As reações de PCR foram realizadas de acordo com o protocolo apresentado na Tabela
I, sendo o volume final de cada reação igual a 25μL. Os volumes de água e de DNA
acrescidos na reação oscilarão em alguns casos de acordo com a concentração de DNA da
amostra.
Tabela I. Protocolo das reações de PCR individuais para amplificação de fragmentos de
genoma de HPV.
Reagentes
H2O dd
Tampão Gold STR
10X
Primers
Taq DNA pol
DNA (amostra)
Total
Concentração
Inicial
N/A
Concentração Final
N/A
Volume / Reação
(µL)
19,2
10X
15pmol
5,0U/mL
8 -12 ng/mL
*1X
15pmol
5,0U/mL
8 - 12 ng/mL
2,5
1,0
0,3
2,0
25
* Usar 2,5 do tampão 10x, porém na solução ficará a 1x
N/A: Não aplicável
Para cada análise de amplificação foi utilizado um protocolo específico de acordo com
os primers utilizados, os protocolo seguem as tabelas II, III, IV e V.
Tabela II. Protocolo de termociclagem para amplificação de fragmentos de genoma
HPV, utilizando os primer D8S135.
Temperatura °
Tempo
Número de
Estágios
C
(minuto)
Ciclos
Desnaturação Inicial
94
5
1
Desnaturação Cíclica
94
1
10
Anelamento
(Touchdown)
56
0,4
20
Extensão
72
0,4
Desnaturação Cíclica
94
1
Anelamento
46
0,4
Extensão Cíclica
71
0,4
20
Desnaturação Cíclica
94
1
Anelamento
46
0,4
Extensão Cíclica
72
0,4
1
Extensão Final
72
4
Repouso
4
∞
N/A
N/A: Não aplicável
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
116
Tabela III. Protocolo de termociclagem para amplificação de fragmentos de genoma
HPV, utilizando os primers MY9/11 e D8S135.
Estágios
Desnaturação Inicial
Desnaturação Cíclica
Anelamento
(Touchdown)
Extensão Cíclica
Desnaturação Cíclica
Anelamento
Extensão Cíclica
Extensão Final
Repouso
N/A: Não aplicável
Temperatura °
C
94
94
Tempo
(minutos)
5
1
62
72
94
48
72
72
4
1
0,5
1
0,5
0,5
5
∞
Número de
Ciclos
1
10
40
1
N/A
Tabela IV. Protocolo de termociclagem para amplificação de fragmentos de genoma
HPV, utilizando os primer GP5+/6+
Estágios
Desnaturação Inicial
Desnaturação Cíclica
Anelamento
Extensão Cíclica
Extensão Final
Repouso
N/A: Não aplicável
Temperatura °
C
95
95
50
72
72
4
Tempo (minutos)
5
0,3
2
1
7
∞
Número de Ciclos
1
40
1
N/A
Tabela V. Protocolo de termociclagem para amplificação de fragmentos de genoma
HPV, utilizando os primers específicos para genotipagem: HPVs 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 e
58.
Temperatura °
Tempo
Número de
Estágios
C
(minutos)
Ciclos
Desnaturação Inicial
94
10
1
Desnaturação
Cíclica
94
1
10
Anelamento
51
1
Extensão Cíclica
72
1
Desnaturação
Cíclica
94
1
35
Anelamento
46
1
Extensão Cíclica
72
1
Extensão Final
72
1
1
Repouso
4
∞
N/A
N/A: Não aplicável
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
117
2. Produtos de PCR
Os produtos de PCR foram analisados através de eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
118
ANEXO 16. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
1. Protocolo de eletroforese
No Caso particular desta dissertação, todos os géis utilizados para separar os
fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram de poliacrrilamida a 8% (Tabela I). Para a
realização da eletroforese submeteram-se os géis a uma voltagem constante de 10V/cm, por
um tempo médio de 2:00h em TBE 1X. Em cada canaleta foram aplicados cerca de 10µL de
amostra amplificada com 3µL de corante de corrida. Após realizada a corrida eletroforética,
os géis foram corados utilizando solução de brometo de etídeo (0,5μg/ml) por 20 a 30
minutos. E finalmente, os fragmentos forram visualizados em luz ultravioleta. utilizando
Video Documentation System (VDS)® Amersham Pharmacia Biotech, EUA.
A acrilamida é um monômero neurotoxico potente com ação cumulativa. O brometo
de etídeo é uma substancia altamente mutagênica e carcinogênica. Por isso, para trabalhar
com acrilamida e brometo de etídeo é necessário utilizar todos os procedimentos de
segurança.
O gel de poliacrilamida é o recomendado para o tamanho dos fragmentos esperados,
pois permitem a separação de fragmentos muito pequenos de até 500pb
Tabela I. Protocolo de preparação do gel de poliacrilamida a 8%
Gel para cuba de 45 mL
Reagentes
Acrilamida 40%*
TBE 10X
H2O dd
APS 10%
TEMED
Volume
9,0 mL
4,5 mL
31,5 mL
450 µL
45µL
*Para a confecção da acrilamida a 40% acrescenta-se acrilamida e bis-acrilamida em uma proporção de 19:1 ou 38g de
acrilamida para 2 g de bis - acrilamida q.s.p. 100mL
2. Soluções utilizadas
2.1 TRIS-BORATO DE EDTA (TBE 10x)
- Tris Base 108 g
- Ácido Bórico 55 g
- EDTA 0,5 M (pH 8.0) 40 ml.
- H2Odd q.s.p 1 litro
2.3. PERSULFATO DE AMÔNIA
(APS 10%)
- APS 10 g
- H2Odd q.s.p 100 ml
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
2.2. EDTA 0,5M pH (8.0)
- EDTA (p.m. 372,24) 186.12 g
- H2Odd q.s.p 1000 ml
- Controle o pH com NaOH (20 g de
NaOH)
2.4. CORANTE DE CORRIDA 6X
- Azul de Bromofenol 0,25%
- Xileno Cianol FF 0,25%
- Ficol tipo 4000 15%
- EDTA 120mM
Angela Adamski da Silva Reis
119
2.5. TAMPÃO DE ELETROFORESE
Usa-se o tampão de corrida TBE 1X produzido a partir do tampão stock TBE
10x.
A corrida é controlada a 10V/cm.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
120
Considerações Finais
A proposta inicial desta dissertação foi submetida à apreciação do Comitê de Ética da
Associação de Combate ao Câncer em Goiás (ACCG). Sendo a coleta de material realizada
pelo Serviço de Urologia (SU) e do Serviço de Patologia (SP) do Hospital Araújo Jorge
(HAJ). Os dados dos prontuários para o estudo epidemiológico seguiram as normatizações do
Registro de Câncer de Base Populacional (RCBP) da ACCG, tendo toda a documentação
arquivada e poderá ser disponibilizada sob pedido formal dos avaliadores.
A presente dissertação de mestrado refere-se a um estudo sobre o câncer de pênis,
podendo ser dividida em quatro abordagens: (1) Revisão bibliográfica, (2) Proposta de uma
cartilha informativa: HPV e sua relação com o câncer, (3) Análise epidemiológica e (4)
Investigação molecular de amostras de indivíduos randômicos sem história clínica de infecção
pregressa por HPV e amostras de pacientes com câncer de pênis.
O capítulo 1, aborda a anatomia, fisiologia e histologia do órgão genital masculino e
os aspectos relacionados ao câncer de pênis, tendo como objetivo, fundamentação teórica para
toda a dissertação.
No capítulo 2, foram discutidos vários aspectos relativos a história natural da doença
por HPV, demonstrando os aspectos moleculares do processo de infecção e neoplásico
ocasionado pelo vírus. O conteudo do segundo capítulo foi apresentado, sob a forma de
minicurso: Vírus e Câncer, na VIII Semana Nacional e VII Internacional de Biologia da
Universidade Católica de Goiás (UCG).
O capítulo 3 foi a elaboração da cartilha: HPV e sua relação com o câncer, tendo como
propósito de informar a população sobre a prevenção e as formas de transmissão do HPV e
sua relação com o processo neoplásico. O conteúdo do terceiro capítulo foi apresentado no
49º Congresso Nacional de Genetica, realizado em Águas de Lindóia-SP, sob forma de pôster
e publicação em Anais (CD-ROM, Sociedade Brasileira de Genética). Sendo que a cartilha
intitulada: HPV e a sua relação com o câncer, será publicada pela Universidade Católica de
Goiás (UCG).
O capítulo 4 foi resultado do estudo epidemiológico realizado com dados do RCBP de
Goiania / GO da ACCG. Neste estudo, foram calculados os coeficiente brutos de incidência e
mortalidade para o câncer de pênis, e a sobrevida dos pacientes. O conteúdo do quarto
capítulo foi apresentado no 48º Congresso Nacional de Genetica, realizado em Águas de
Lindóia-SP, sob forma de pôster e publicação em Anais (CD-ROM, Sociedade Brasileira de
Genética).
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
121
O capítulo 5 foi realizado um estudo randômico para detectar a prevalência do HPV
em 100 indivíduos do sexo masculino sem história de lesão subclínica ou história pregressa de
infecção por HPV, com o objetivo de verificar o papel masculino na disseminação do vírus.
Este estudo foi aceito para apresentação em forma de pôster e publicação em anais (CDROM, Sociedade Brasileira de Genética) do 50º Congresso Nacional de Genética, no Costão
do Santinho, Florianópolis – SC.
O capítulo 6 investiga a associação de HPV e câncer de pênis. Este estudo foi
apresentado em forma de pôster no XXXII Congresso Brasileiro de Análises Clínicas –
Goiânia /GO e publicação na Revista da Sociedade Brasileira de Análises Clínicas.
Os capítulos 4, 5 e 6 serão formatados para compor dados em formato de trabalho
científico para ser submetido a Comissão Científica do 30° Congresso Brasileiro de Urologia /
Brasília –DF (outubro/2005) para a apresentação em forma de pôster.
A formatação da dissertação foi padronizada em capítulos mantidos no formato de
artigos, sendo que os capítulos 2, 3, 5 e 6 serão encaminhados para a apreciação do Corpo
Editorial da Revista Brasileira de Doencas Sexualmente Transmissíveis e Journal of Urology.
Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Angela Adamski da Silva Reis
122
Referências Bibliográficas
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Medicine Today 2000; 6: 365-372.
3. Arbyn M, Buntinx F, Van Ranst M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Dilner J.
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pap smears: A meta
analysis of the accuracy to detect high-grade intraephitelial neoplasia. Journal of the
National Cancer Institute 2004; 96(4): 280-293.
4. Badaracco G, Venuti A, Morello R, Muller A, Marcante ML. Human papillomavirus
in head and neck carcinomas: prevalence, physical and relationship with
clinical/pathological parameters. Anticancer Research 2000; 20: pp. 1301-1306.
5. Baldwin SB, Wallace DR, Papenfuss MR, Abrahansen M, Vaught LC, Kornegay JR,
Hallun JA, Redmonnd SA, Giuliano AR. Human papillomavirus infections in men
attending a sexuually transmittted disease clinic. Journal Infection Disease 2003; 187:
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6. Barasso R, De Brux J, Croissant O, Orth G. High prevalence of papillomavirus
associaated peenile intraephitelial neoplasia in sexual partners of women with cervical
intraephitelial neoplasia. The New England Journal of Medicine 1987, 317 (15):916923.
7. Barker, K DNA, RNA e Proteínas. In: Na bancada – Manuel de Iniciação científica em
laboratórios de pesquisas biomédicas. São Paulo: ArtMed, 2002. p.295-327.
8. Bechtold V, Beard P, Raj K. Human papillomavirus type 16 E2 protein has no effect
on transcription from episomal viral DNA. Journal of Virology 2003; 77(3): 20212028.
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