Greice Japolla - evz - ppgca

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
CONSTRUÇÃO E SELEÇÃO DE UMA BIBLIOTECA COMBINATORIAL DE
ANTICORPOS CONTRA HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1
Greice Japolla
Orientador: Guilherme Rocha Lino de Souza
GOIÂNIA
2014
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GREICE JAPOLLA
CONSTRUÇÃO E SELEÇÃO DE UMA BIBLIOTECA COMBINATORIAL DE
ANTICORPOS CONTRA HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1
Dissertação apresentada para obtenção
do grau de Mestre em Ciência Animal
junto à Escola de Veterinária e Zootecnia
da Universidade Federal de Goiás
Área de Concentração:
Sanidade, Higiene e Tecnologia de
Alimentos
Linha de Pesquisa:
Etiopatogenia, epidemiologia, diagnóstico e
controle das doenças infecciosas dos
animais
Orientador:
Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza - UFG
Comitê de Orientação:
Prof. Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen
de Brito - UFG
Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus - UFG
GOIÂNIA
2014
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Dedico este árduo trabalho aos meus amados pais Osvaldo e Estela, que me
apoiaram em todos os momentos e não mediram esforços para realização dos
meus sonhos.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por ter trilhado e iluminado meu caminho, me
proporcionado saúde, coragem, disposição e sabedoria para que eu ingressasse
e concluísse o curso de mestrado;
Aos meus pais, Osvaldo e Estela, que sofreram com minha partida, mas nunca
deixaram de me apoiar, obrigada pela vida e por terem me proporcionado todos
os meios para meu crescimento pessoal e intelectual. Vocês são meu norte e
porto seguro, sem os quais não seria possível chegar até aqui;
A minha irmã, meu cunhado e sobrinhos, aos tios e avô, que mesmo com a
enorme saudade nunca deixaram de me apoiar, amo vocês;
Ao meu amigo, noivo e marido Lucas, que calmamente acompanhou minhas
horas de tristeza, cansaço e nunca me desanimou, sempre esteve do meu lado
apoiando. Obrigada por todo esse amor;
Ao meu orientador Prof. Dr. Guilherme Rocha Lino de Souza, pela orientação
nestes dois anos, pela paciência, dedicação e por ter me acompanhado nessa
trajetória;
À minha querida co-orientadora Prof.ª Dr.ª Wilia Marta Elsner Diederichsen de
Brito, por ceder o laboratório e também o material necessário para parte
experimental. Pelos ensinamentos não só acadêmicos, mas também de vida. Este
trabalho não seria possível sem o seu primeiro “sim”, sou eternamente grata a
você. Você foi uma mãe e sabe disso;
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Luiz Arthur e a todos do Instituto de Ciências
Biológicas da UFG, obrigada por abrirem as portas do laboratório e por sempre
estarem dispostos a ajudar;
v
Ao laboratório de virologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
UFG, onde as professoras Fabíola e Menira, juntamente com a funcionária Keili,
sempre estiveram dispostas a me ajudar, aprendi muito com vocês;
Ao Prof. Dr. André Kipnis, do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
UFG, juntamente com seus alunos: Lazáro, Fábio, Duanne, Monalisa e Abadio
por sempre sanar as inúmeras dúvidas que foram surgindo ao longo deste
trabalho;
A todos os amigos do curso de pós-graduação, Hidelbrando, Adriana, Thelma,
Thales, Patrícia, Ana Carla, Ana Flávia, e em especial a Greyciele, obrigada pela
amizade de vocês, pela ajuda e paciência, por compartilharmos muitos bons
momentos e outros tantos de desespero e dúvidas;
Ao programa de Pós-graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG, e aos
professores que o compõe pela disponibilização do conhecimento;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Capes, pela
concessão da bolsa de estudos;
A todos que direta ou indiretamente também contribuíram para a concretização
deste trabalho, todo o meu respeito e agradecimento;
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................1
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................4
2.1 Características gerais dos herpesvírus..............................................................4
2.2 Estrutura viral.....................................................................................................5
2.3 Enfermidades associadas ao BoHV-1...............................................................6
2.4 Latência..............................................................................................................7
2.5 Aspectos epidemiológicos no Brasil...................................................................8
2.6 Testes Diagnósticos...........................................................................................9
2.7 Estrutura geral dos anticorpos.........................................................................13
2.8 Fragmento variável em cadeia única- scFv.....................................................15
2.9 Bibliotecas de Anticorpos Apresentadas em Fagos: Phage Display ..............16
3 OBJETIVOS........................................................................................................19
4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................20
4.1 Local de desenvolvimento................................................................................20
4.2 Cultivo e Manutenção do Herpesvírus Bovino.................................................20
4.3 Imunizações das galinhas com o BoHV-1.......................................................20
4.4 Ensaio Imunoenzimático..................................................................................21
4.5 Extração de RNA total e síntese de cDNA.......................................................21
4.6 Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de
anticorpos de galinha.............................................................................................21
4.7 Produção dos fragmentos scFv – (Overlap) ...................................................22
4.8 Digestão dos fragmentos scFv e do vetor pComb3X.......................................23
4.9 Ligação dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X........................24
4.10 Preparação de células XL1-Blue eletrocompetentes.....................................24
4.11 Transformação de células E. coli (XL1-Blue) por eletroporação....................25
4.12 Extração de DNA fagomidial e digestão das amostras para avaliação da
variabilidade da biblioteca......................................................................................25
4.13 Expressão da biblioteca de anticorpos..........................................................26
4.14 Dot blot para análise da expressão da biblioteca..........................................26
4.15 Preparação do fago auxiliar VCSM13............................................................27
4.15.1 Obtenção do fago auxiliar...........................................................................27
vii
4.15.2 Amplificação do fago auxiliar......................................................................27
4.15.3 Determinação do título da preparação de fagos auxiliares.........................28
4.16 Expressão dos fragmentos de anticorpos scFv como proteínas de fusão na
superfície de bacteriogafos filamentos – phage display........................................28
4.17 Seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1Biopanning.............................................................................................................29
4.18 Ensaio imunoenzimático................................................................................31
4.19 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones
selecionados..........................................................................................................31
4.20 Análise das sequências.................................................................................32
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................33
5.1 Imunizações das aves com o BoHV-1.............................................................33
5.2 Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de
anticorpos de galinha e amplificação dos fragmentos scFv – (Overlap)................35
5.3 Construção da biblioteca combinatorial de anticorpos (scFv) e análise da
diversidade desta biblioteca por enzima de restrição............................................36
5.4 Dot blot para análise da expressão da biblioteca............................................37
5.5 Seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1Biopanning.............................................................................................................38
5.6 Análise da biblioteca pelo ELISA.....................................................................39
5.7
Sequenciamento
das
cadeias
variáveis
pesadas
dos
clones
selecionados..........................................................................................................41
6 CONCLUSÕES...................................................................................................44
REFERÊNCIAS.....................................................................................................45
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1:Representação esquemática da molécula de anticorpo e seus
principais fragmentos.............................................................................................13
FIGURA 2: Representação esquemática de um fago filamentoso........................18
FIGURA 3: Representação esquemática do vetor Pcomb3X................................24
FIGURA 4: Resposta de anticorpos em soros de galinhas imunizadas com o
BoHV-1 e MEIO MEM............................................................................................33
FIGURA 5: Análise estatística dos soros pré e pós imunes e do controle
negativo..................................................................................................................34
FIGURA 6: Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de
anticorpos de galinha.............................................................................................35
FIGURA 7: Clones digeridos com enzima de restrição BstNI................................36
FIGURA 8: Análise por dot blot dos clones expressando fragmentos scFv..........37
FIGURA 9: Seleção de fagos, expressando as diferentes formas scFvs..............38
FIGURA 10: Imunoensaio dos clones do ciclo 6 contra o hespersvírus bovino tipo
1.............................................................................................................................39
FIGURA 11: Gel de agarose 2% dos DNA extraídos dos clones do sexto ciclo de
seleção...................................................................................................................41
FIGURA 12: Alinhamento das cadeias variáveis pesadas dos clones do 6º ciclo de
seleção...................................................................................................................43
ix
RESUMO
O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é reconhecido como um importante
patógeno de perdas econômicas em bovinos, causando nestes animais
enfermidades conhecidas como Rinotraqueite Infecciosa Bovina (IBR),
vulvovaginite pustular infecciosa, balanopostite infecciosa e desordens
neurológicas. Para um efetivo controle destas enfermidades, o diagnóstico correto
se faz necessário, porém nenhuma dos testes disponíveis possibilita um resultado
rápido feito a campo. Considerando isto, o objetivo deste estudo foi construir uma
biblioteca combinatorial de anticorpos, para que esta seja futuramente utilizada no
desenvolvimento de novas abordagens diagnósticas. Duas galinhas da raça White
Leghorn foram imunizadas com 105,5 DICC50/mL de BoHV-1, as aves foram
necropsiadas, seus baços retirados para extração de RNA total, síntese de cDNA,
amplificação dos fragmentos gênicos codificantes das cadeias leve (VL) e pesada
(VH) e produção de fragmentos scF(v). Estes fragmentos foram clonados em
vetores fagomidiais, expressos como proteínas de fusão em bacteriófagos
filamentosos e amplificados pela infecção de bactérias E.coli. Foi realizada a
seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1 (biopanning)
através de seis ciclos. A afinidade da biblioteca de anticorpos scFv ao BoHV-1
observada no teste de ELISA mostra que os fragmentos produzidos são reativos
ao vírus, sendo possível a utilização destes anticorpos no desenvolvimento de
novas plataformas de diagnóstico. Os resultados de sequenciamento mostraram
uma diminuição da variabilidade em comparação ao dot blot realizado
anteriormente, sendo uma característica desejável neste processo, porém não foi
possível sequenciar os clones de modo eficiente, verificando-se, portanto, a
necessidade de analisar de forma mais aprofundada os resultados obtidos .
Palavras-chave: imunoglobulinas, fragmento scFv, phage display.
x
ABSTRACT
Bovine herpesvirus type 1 ( BHV - 1 ) is recognized as an important pathogen of
economic losses in cattle , these animals causing diseases known as infectious
bovine rhinotracheitis ( IBR ) , infectious pustular vulvovaginitis , infectious
balanoposthitis and neurological disorders . For effective control of these
diseases, the correct diagnosis is necessary, but none of the available tests
enables a quick result made the field. Considering this, the aim of this study was to
construct a combinatorial antibody library, for it to be used in the future
development of new diagnostic approaches . Two breed White Leghorn chickens
were immunized with 105.5 TCID50/ml of BoHV - 1, birds were necropsied , their
spleens removed for total RNA extraction , cDNA synthesis , amplification of gene
fragments encoding the light chain ( VL ) and heavy ( VH ) and production of scFv
( v) fragments. These fragments were cloned into vectors fagomidiais expressed
as fusion proteins on filamentous phage and amplified by infection of E. coli.
Selection of viral particles ( fused scFv) binding to the BHV -1 ( biopanning ) by six
cycles were performed. The affinity of the scFv antibody library BHV -1 observed
in ELISA shows that the produced fragments are reactive to HIV, the use of such
antibodies in the development of new diagnostic platforms is possible . The
sequencing results showed a reduction of variability in comparison to the dot blot
previously performed, and a desirable feature of this process , however, it was
possible to sequence the clones efficiently, it has been found , therefore, a need to
further analyze the shape of results
Keywords: immunoglobulins, scFv fragment, phage display.
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é um grande produtor e exportador de carne bovina, sendo o
centro-oeste brasileiro a principal região detentora de rebanho bovino, com 34,4%
do efetivo nacional. O Estado de Goiás possui o quarto maior rebanho do País
com uma população bovina de, aproximadamente, 21 milhões de animais, cerca
de 10% do total do nacional (IBGE 2010). Estas posições são ameaçadas, pois o
rebanho bovino está exposto a agentes causadores de enfermidades que afetam
diretamente a sua produtividade, destacando-se desta forma a importância em
relação à sanidade dos animais.
Os principais microrganismos causadores de doenças nos bovinos são
bactérias, protozoários e vírus. No grupo dos vírus são encontrados os
herpesvírus causadores de diversas manifestações clínicas e consequentes
prejuízos para pecuária mundial. Estima-se que as perdas geradas por
enfermidades relacionadas aos herpesvírus alcancem um bilhão de dólares por
ano em todo o mundo (DEL MÉDICO ZAJAC et al., 2010). O herpesvírus bovino
tipo 1 (BoHV-1) pertence a família Herpesviridae, sub-família Alphaherpesvirinae,
gênero Varicellovirus. Uma das características desta família refere-se à
capacidade de estabelecer infecções latentes (THIRY et al., 2005), ou seja, o
vírus persiste no organismo do animal de forma silenciosa, não detectável por
procedimentos
virológicos
usuais
podendo
ser
reativado
e
reexcretado
possibilitando a multiplicação viral. O BoHV-1 é um vírus neurotrópico que está
associado a uma variedade de afecções clínicas, incluindo rinotraqueíte (IBR),
conjuntivite, infecções genitais e abortos (ENGELS & ACKERMANN, 1996).
Embora existam diferenças na prevalência e incidência da infecção
pelo BoHV-1, este encontra-se presente em todos os continentes (D’ARCE et al.,
2002; GUARINO et al., 2007; FRANCO & ROEHE, 2007). Em Goiás, a primeira
identificação de anticorpos contra o vírus foi na década de 80 (ANUNCIAÇÃO et
al., 1989). Posteriormente, vários levantamentos sorológicos executados no Brasil
demostraram a alta frequência de animais soropositivos (CERQUEIRA et al.,
2000; MÉDICI et al., 2000; TAKIUCHI et al., 2001; VIEIRA et al., 2003; BARBOSA
et al., 2005; DIAS, 2006; DEL FAVA et al., 2007; SOUSA et al., 2009; AFFONSO,
2010; AMARAL, 2013; DIAS et al., 2013 ).
2
Para um efetivo controle das enfermidades causadas por esses vírus é
necessário um correto diagnóstico dos mesmos, várias técnicas de diagnóstico
vêm sendo utilizadas, incluindo entre outras, testes de isolamento viral, técnicas
sorológicas como soroneutralização e ensaio imunoenzimático (ELISA), e
técnicas moleculares como a reação em cadeia pela polimerase (PCR). Na
maioria dos laboratórios, a técnica de diagnóstico utilizada é o ensaio de ELISA
(“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”), no entanto, o método mais seguro para
se diagnosticar uma infecção é o isolamento e a caracterização do agente
infeccioso, porém, isto nem sempre é possível ou prático por várias razões como
pela inexistência de métodos simples, práticos ou seguros para o isolamento ou
cultivo viral (WHO & TDR, 2010). O teste de ELISA possibilita a detecção de
anticorpos contra o vírus. Algumas das desvantagens dessa técnica é a
necessidade de equipamento especializado, manipulação de reagentes e custo
de aquisição de kit, levando alguns laboratórios produzir e padronizar seu próprio
material. Outra questão seria a impossibilidade de diferenciar anticorpos
produzidos em resposta à infecção natural daqueles produzidos pela vacinação,
sendo que, a vacina é uma forma de controle do vírus e é utilizada no Brasil.
(TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005; BAUERMANN et al., 2010).
A utilização de fragmentos de anticorpos no desenvolvimento de testes
diagnósticos é uma opção interessante levando em consideração os pontos
negativos apresentados por algumas técnicas.
Uma tecnologia que tem
contribuído com a produção destes fragmentos é a técnica de Phage Display, que
também vem sendo amplamente utilizada na busca de peptídeos e proteínas com
diversas atividades biológicas (SOUZA, 2007; NASCIMENTO, 2009; CARDOSO,
2008; OZAKI, 2011).
A técnica de Phage Display baseia-se no desenvolvimento de uma
biblioteca de apresentação de fragmentos de anticorpos monoclonais (scFv single chain Fv) em bacteriofagos, a fim de se selecionar clones relevantes,
produtores de anticorpos (scFv) para o antígeno desejado. Para obtenção de
anticorpos monoclonais, as aves são bastante utilizadas por apresentarem
vantagens quando comparadas aos mamíferos, uma delas é devido a maior
facilidade de obtenção das sequencias codificadoras das regiões variáveis de
anticorpos, pois possuem apenas um gene VH e um gene VL funcional, que têm
alteradas suas sequencias internas (CDRs - Regiões Determinantes de
3
Complementariedade) pela inserção de segmentos de pseudogenes. Assim,
apenas um par de iniciadores e necessário para a amplificação dos genes
codificadores de cada cadeia de imunoglobulina (leve e pesada) e, por
conseguinte, a construcao da biblioteca de anticorpos se torna relativamente mais
simples (BARBAS et al., 2001; SOUZA, 2007).
A construção de uma biblioteca de anticorpos especifica ao BoHV-1
possibilitara a utilização desta no desenvolvimento de testes diagnósticos rápidos
para detecção de antígenos do vírus em bovinos, sendo que a detecção rápida de
animais doentes feita a campo auxiliaria no controle da enfermidade evitando
maiores prejuízos.
4
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Características gerais dos herpesvírus
Os
herpesvírus
Herpesviridae,
que
se
fazem
divide
parte
em
três
da
ordem
Herpesvirales,
sub-famílias:
família
Alphaherpesvirinae,
Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae, englobando vírus que ocorrem em
diversas espécies animais, como moluscos, peixes, anfíbios, répteis, pássaros e
mamíferos.
Diferente
das
outras
duas
sub-famílias,
os
alfaherpesvírus
apresentam um ciclo de replicação rápido e lítico tanto in vitro quanto in vivo, e
possuem capacidade de infectar células epiteliais e nervosas, estabelecendo
infecção latente em neurônios de gânglios do sistema nervoso (ROIZMAN et al.,
1992; DAVISON et al., 2009; ICTV, 2012). Os membros da sub-família
Betaherpesvirinae replicam lentamente, também estabelecem latência e possuem
poucos hospedeiros (ROIZMAN & KNIPE, 2001). Já os vírus da subfamília
Gammaherpesvirinae infectam linfócitos de forma lítica ou latente e alguns deles
possuem potencial oncogênico (FRANCO & ROEHE, 2007; FRANCO et al.,
2012).
Os herpesvírus que mais frequentemente infectam os bovinos são:
herpesvírus bovino (BoHV) tipo 1, BoHV-2, BoHV-4 e BoHV-5. Os tipos BoHV-1 e
5 pertencem ao gênero Varicellovirus da sub-família Alphaherpesvirinae, o BoHV2 pertence ao gênero Simplexvirus, também um Alphaherpesvirus e é
responsável pela mamilite herpética bovina, o BoHV-4 pertence a subfamília
Gammaherpesvirina, ao qual ainda não foi atribuído ser causa de nenhuma
patologia específica. O BOHV-5 subdivide-se em BoHV-5a, BoHV-5b e BoHV5na/nb e causam doenças neurológicas. O BoHV-1 tem grande impacto na
bovinocultura e subdivide-se em BoHV-1.1, BoHV-1.2a e BoHV-1.2b responsáveis
pela rinotraqueíte infecciosa bovina, aborto, vulvovaginite pustular infecciosa,
balanopostite infecciosa e desordens neurológicas. O impacto econômico traduzse entre outros por morte embrionária, aborto, nascimento de animais debilitados,
redução da eficiência reprodutiva de matrizes e touros, diminuição de conversão
alimentar e retardo no crescimento de animais jovens, diminuição da produção
5
leiteira (D’ARCE et al., 2002; OLIVEIRA, 2006; SILVA et al., 2007; BATISTA et al.,
2010).
Os bovinos também podem ser infectados naturalmente por outros
herpesvírus animais: o herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) e o herpesvírus
alcelafino tipo 1 (AlHV-1), agentes etiológicos da febre catarral maligna, além do
hespesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1) causador da doença de Aujeszky/pseudoraiva.
A ocorrência destas infecções em bovinos não é alta, mas quando ocorre pode
ser fatal (DAVISON et al., 2009; FRANCO et al., 2012).
A latência é uma característica marcante dos herpesvírus, aonde o
vírus persiste no organismo do animal de forma silenciosa, não detectável por
procedimentos virológicos usuais. Durante o período de latência não ocorre à
expressão de genes virais requeridos para uma infecção produtiva, não ocorrendo
assim à produção de vírus infeccioso (PASTORET & THIRY, 1985). A reativação
viral pode ocorrer após a exposição a estímulos naturais (estresse, transporte,
parto, desmame) ou por tratamento com corticosteroides (JONES et al., 2006).
2.2 Estrutura viral
A estrutura da partícula viral do BoHV-1 consiste em um núcleo (ou
core) que contém o genoma viral contendo uma molécula de DNA de fita dupla
linear; um capsídeo icosaédrico de aproximadamente 100 a 110 nm de diâmetro
envolvendo o núcleo; uma proteica camada amorfa, chamada tegumento, que
recobre o capsídeo; e um envelope lipoprotéico contendo espículas de
glicoproteínas na sua superfície. O diâmetro dos vírions varia entre 120 e 300 nm.
(ICTVDB MANAGEMENT, 2006; FRANCO & ROEHE, 2007).
O genoma viral é constituído por uma molécula de DNA linear de dupla
fita viral, pode ser dividido em uma região longa (UL) e uma região curta (US)
cercada por duas regiões repetidas e invertidas, sendo uma interna (IR) e outra
terminal (TR) (DELHON et al., 2003). O genoma codifica em torno de 70
proteínas, entre elas as glicoproteínas inseridas no envelope viral. Essas
glicoproteínas são conhecidas como: gB, gC, gD, gE, gI, gH, gL, gG, gK e gM, na
qual apresentam diferentes funções na replicação e na interação vírus-célula
(SCHWYZER & ACKERMANN, 1996).
6
A gB e a gC são as principais glicoproteínas envolvidas no processo de
adsorção dos vírions à superfície das células hospedeiras. A gD é uma
glicoproteína essencial para a replicação viral e sugere-se que também esteja
envolvida na adsorção, penetração e fusão celular. A gC vem sendo estudada
para o desenvolvimento de testes diagnósticos, como a PCR e suas variações
(nested PCR e multiplex PCR) para a detecção de BoHV-1 ou diferenciação deste
do tipo 5. (ESTEVES et al., 2003; CLAUS et al., 2005; CLAUS et al., 2007;
ESTEVES, 2007; SILVA, 2009). Há também estudos que utilizam a gC como
antígenos, produzindo anticorpos monoclonais diferenciais entre BoHV-1.1 e
BoHV-1.2, bem como provas tipo ELISA diferenciais entre BoHV-1.1 e 1.2 e
BoHV-1 e BoHV-5 ( RIJSEWIJK et al., 1999; SPILKI et al., 2005).
A gE tem sido alvo de deleção para a produção de vacinas diferenciais
(HÜBNER et al., 2005). Através da clonagem e expressão de um fragmento da
glicoproteína E do BoHV-1 é possível a realização de testes com intuito de
diferenciação sorológica entre animais vacinados e animais infectados com o
vírus de campo (OLIVEIRA, 2012).
Para que ocorra a replicação viral, a interação de algumas
glicoproteínas com a célula hospedeira é essencial. Todo processo desta
multiplicação segue as etapas de: adsorção; penetração; transporte do
nucleocapsídeo e proteínas virais contidas no tegumento ao núcleo das células
infectadas; transcrição, replicação e síntese do DNA e proteínas virais; montagem
e preenchimento dos capsídeos e por fim liberação da progênie infecciosa. A
ocorrência destas fases garante a replicação dos vírus e a possível disseminação
das doenças (ROIZMAN & KNIPE, 2001).
2.3 Enfermidades associadas ao BoHV-1
O BoHV-1 é um vírus que está associado a uma variedade de afecções
clínicas, os isolados de campo do vírus podem ser divididos em três diferentes
genótipos: 1 (BoHV-1.1), 2a (BoHV-1.2a) e 2b (BoHV-1.2b). Esta subdivisão em
genótipos foi proposta com base em características genômicas e antigênicas.
Entretanto, associações de determinados genótipos com certos quadros clínicos
foram também evidenciadas (FRANCO & ROEHE, 2007). O subtipo 1 (BoHV- 1.1)
7
geralmente está relacionado ao grupo que causa doença respiratória clássica; o
subtipo 2a (BoHV-1.2a) abrange as cepas associadas com a rinotraqueite
infecciosa bovina/vulvovaginite pustular infecciosa (IBR/IPV) e abortos, enquanto
o subtipo 2b (BoHV-1.2b) causa vulvovaginite ou balanopostite, mas geralmente
não está associado com abortos (MILLER, 1991). A forma respiratória é
caracterizada por corrimento nasal, aumento da temperatura corporal, lesões
erosivas na mucosa nasal, rinite e dispneia, quando associada a infecção
bacteriana secundária, pode desenvolver pneumonia (TAKIUCHI et al., 2001).
Na forma reprodutiva os animais podem apresentar repetição de cio,
mortalidade embrionária, natimortos, nascimento de bezerros fracos e abortos
que leva a uma redução dos índices reprodutivos dos rebanhos infectados
(TAKIUCHI et al., 2005).
Esporadicamente, o BoHV-1 também tem sido isolado de casos de
doença neurológica (ENGELS & ACKERMANN, 1996; ROIZMAN & PELLETT,
2001; SILVA et al., 2007; HENZEL et al., 2008; BATISTA et al., 2010), relatos
recentes atribuem a ocorrência de encefalites à infecção por BoHV-1 e BoHV1.2b, sendo este último o menos patogênico (BATISTA et al., 2010), porém a
maioria das informações sobre enfermidade neurológica, são associadas apenas
com o herpesvírus bovino tipo 5.
O vírus pode infectar fetos, ocasionando morte fetal seguido de aborto
e infecção genital em vacas prenhas e, em bezerros pode ocorrer viremia fatal na
ausência de anticorpos maternos no leite. No caso de bovinos adultos, o BoHV-1
geralmente não causa a morte do animal (AUSTRÁLIA, 2005).
2.4 Latência
Com a recuperação dos animais, estabelece-se um quadro de latência
nos gânglios nervosos sensoriais, como o gânglio trigêmeo (no caso de infecção
respiratória) e gânglios sacrais (no caso de infecção genital) por toda a vida do
animal e, sob certas condições, reativação e reinfecção dos tecidos periféricos
podem ocorrer (ROIZMAN & PELLETT, 2001; PEREZ et al., 2002). O
estabelecimento da latência ocorre durante a infecção primária, o vírus penetra
nos gânglios regionais periféricos e é transportado por fluxo axonal retrógrado até
8
os gânglios regionais (trigêmeo e sacral). Nesta fase a excreção de genes virais é
praticamente extinta, ocorrendo somente a produção de pequenos transcritos,
denominados de “transcritos relacionados a latência” ou LRT (“latency - relatedtranscripts”) (WORKMAM et al., 2011). Nesta fase ocorre a manutenção da
latência, que dura por toda vida do animal. Os LRT são transcritos
abundantemente e aparentemente não são traduzidos em proteína, a sua função
na manutenção e reativação da infecção latente permanece deconhecida,
provavelmente para manutenção, estes transcritos reprimem a expressão do gene
α, que são os primeiros transcritos a serem produzidos na replicação viral, que
posteriormente são traduzidos em proteínas α, induzindo a transcrição e tradução
do gene β envolvido na replicação do genoma viral (ROIZMAN & KNIPE, 2001;
FRANCO et al., 2012). A reativação viral pode ocorrer em resposta a estímulos
como estresse, transporte, parto, desmame ou até pela aplicação de
corticosteroides. Nesta fase há uma redução da expressão de LRT e ativação dos
genes virais (JONES & CHOWDHURY, 2008). Após este processo de reativação
os vírions são transportados de volta aos locais de replicação primária, onde
replicam e são excretados, assim o hospedeiro volta a disseminar e produzir o
vírus, sendo responsáveis pela transmissão a hospedeiros susceptíveis
(PASTORET & THIRY, 1985; DEL MEDICO et al., 2010). A ocorrência de
reativação pode ser observada com (VOGEL et al., 2003) ou sem (BELKNAP et
al., 1994) sinais clínicos mas de uma maneira geral os sinais clínicos geralmente
são mais brandos do que aqueles resultantes da infecção aguda (FRANCO et al.,
2012).
2.5 Aspectos epidemiológicos no Brasil
Embora existam diferenças na prevalência e incidência da infecção
pelo BoHV-1, este encontra-se presente em todos os continentes. No Brasil o
BoHV-1 foi isolado pela primeira vez a partir de um caso de vulvovaginite no ano
de 1978, no estado da Bahia e por MUELLER no mesmo ano a partir do rim de
um feto bovino proveniente de um matadouro em São Paulo (ALICE, 1978;
MULLER, 1978) e vem sendo diagnosticado até nos dias de hoje (SILVA et al.,
9
2007; SILVA, 2009; SILVA, 2011; AMARAL, 2013; SILVA, 2013; PIOVESAN et al.,
2013, DIAS et al., 2013).
No estado de Goiás, a primeira detecção de anticorpos para esse vírus
foi na década de 80 (ANUNCIAÇÃO et al., 1989). Posteriormente vários
levantamentos sorológicos foram realizados não só em Goiás, como em outros
estados brasileiros, apontando a presença de anticorpos para o BoHV-1 em soros
de animais de propriedades com rebanhos de leite, corte e misto, e também
animais antes do abate (CERQUEIRA et al., 2000; MÉDICI et al., 2000;
TAKIUCHI et al., 2001; VIEIRA et al., 2003; BARBOSA et al., 2005; DIAS, 2006;
DEL FAVA et al., 2007; SOUSA et al., 2009; AFFONSO, 2010; AMARAL, 2013;
DIAS et al., 2013 ).
Os bovinos são os hospedeiros naturais do BoHV-1, entretanto
anticorpos já foram encontrados em ovinos, caprinos e bubalinos de animais
infectados experimentalmente (DIEL et al., 2007).
As infecções pelo BoHV-1 podem ser transmitidas pelo contato direto e
indireto entre animais, pois o vírus é disseminado através de secreções
respiratórias, oculares e genitais, sendo excretado em grandes quantidades por
animais durante a infecção aguda. Quando presente no sêmen de touros
infectados, pode ser disseminado tanto por monta natural como por inseminação
artificial (FRANCO & ROEHE, 2007). OLIVEIRA et al., (2011) encontraram
positividade em quase 50% de amostras de sêmen colhidas nos estados do Rio
Grande do Sul e de Goiás. LACERDA, 2013 também constatou o risco da
transmissão do vírus pelo sêmen no Brasil. O vírus também já foi encontrado em
leite de vacas, sendo esta mais uma possível fonte de infecção para bezerros
(CAMPOS, 2009).
2.6 Testes Diagnósticos
A diversidade dos sinais clínicos, bem como a semelhança destes
sinais com outras doenças infecciosas e parasitárias, não permite a elaboração
de um diagnóstico clínico conclusivo da infecção ocasionada pelo vírus. Mesmo
nos casos de vulvovaginite, onde as lesões são características, o diagnóstico
baseado no exame clínico é apenas presuntivo (TAKIUCHI et. al., 2001). Assim
10
sendo, o auxilio das técnicas laboratoriais são necessárias para estabelecer um
diagnóstico preciso. Os métodos disponíveis para detecção de anticorpos ou
antígenos são: isolamento viral, testes sorológicos e testes moleculares.
O isolamento viral em cultivo celular é considerado o método de
diagnóstico etiológico padrão ouro (TAKIUCHI et. al., 2001; OLIVEIRA, 2006).
Muitos vírus, quando infectam as células, promovem sua destruição e infectam
novas células, produzindo alterações e possibilitando a visualização dessas
alterações, os chamados efeitos citopáticos (ECP) (FLORES & CARGNELUTTI,
2012). O método destaca-se pela universalidade (aplicável a quase todos os
vírus) e a obtenção do vírus viável para manutenção e posteriores estudos.
Porém o método possui desvantagens por ser uma técnica laboriosa, com alto
custo e que necessita de correto acondicionamento das amostras por depender
de partículas virais viáveis. Além disto, o tempo necessário para obtenção dos
resultados pode levar alguns dias e os tecidos podem conter enzimas que são
tóxicas para o cultivo de células (FLORES, 1999; TAKIUCHI et. al., 2001).
KUNERT FILHO, 2011 utilizou o isolamento viral em encéfalos bovinos
submetidos ao diagnóstico de raiva, na busca do BoHV-1 e também do tipo 5,
todas as amostras foram negativas, porém as mesmas amostras quando
submetidas à amplificação por “nested PCR” apontaram como positivas. Estes
resultados devem ser analisados com cautela, pois mesmo com presença do
genoma dos vírus não é possível afirmar que ambos os vírus são causadores de
encefalites devido a impossibilidade de isolar o vírus em forma infecciosa.
Apenas com a observação do efeito citopático pode não ser possível a
identificação viral, sendo necessário agregar outras técnicas como a como
imunofluorescência (IF), imunoperoxidase (IPX) e técnicas moleculares (ROEHE
et al., 1997).
Os testes sorológicos podem ser usados na pesquisa de antígenos
virais ou de anticorpos. Várias técnicas têm sido aplicadas para o diagnóstico do
herpesvírus bovino, como a imunofluorescência( IF), soroneutralização (SN) e o
teste de ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay") (FRANCO & ROEHE,
2007).
A imunofluorescência (IF) permite a visualização de antígenos nos
tecidos ou em suspensões celulares utilizando substâncias fluorescentes
(FLORES, 1999). A especificidade e a rapidez de obtenção dos resultados são
11
vantagens da técnica. No entanto o sucesso da técnica depende da correta coleta
e estocagem do material, apesar de não exigirem a infecciosidade da partícula
viral, é fundamental a integridade estrutural da partícula e das proteínas virais.
(TAKIUCHI et al., 2001; KUNRATH et al., 2004). ALKAN e colaboradores (2000)
apontaram a técnica de imunofluorescência como importante ferramenta para
detectar o antígeno do BoHV-1 em suabes. KUNRATH et al., 2004 detectaram
antígenos
virais
do
BoHV-1
em
secreções
nasais
de
bezerros
por
imunofluorescência em células descamativas e compararam o resultado com a
técnica de isolamento viral, 89,6% apresentaram resultados concordantes nos
dois testes, demostrando que a IF pode representar uma alternativa para o
diagnóstico de infecções agudas pelo BoHV-1.
Outra técnica é a soroneutralização, que detecta a presença de
anticorpos neutralizantes. Alguns autores pesquisaram métodos para a realização
do teste de soroneutralização utilizando anticorpos monoclonais no intuito de uma
técnica mais rápida e obtiveram sucesso nos resultados (KUNRATH et. al, 2004).
Outro aspecto a ser levado em consideração é o fato de existir vários subtipos de
vírus, tornando difícil a escolha de qual subtipo utilizar para realização do teste.
Com relação a este fato, estudos comprovaram que existe variação na detecção
de soros positivos dependente da amostra viral utilizada, podendo alterar a
sensibilidade da técnica. Para a otimização da técnica HOLZ, 2008 realizou uma
investigação constatando que a utilização de apenas um subtipo viral nos testes
pode prejudicar a detecção de animais soropositivos, comprometendo programas
de controle. Ao utilizar apenas um cepa viral a sensibilidade mostrou-se reduzida.
Porém, quando o teste foi realizado com seis cepas virais (entre tipos e subtipos),
a sensibilidade apresentou-se bastante elevada e viável para utilização em
estudos soroepidemiológicos.
Geralmente é utilizado somente uma amostra viral para realização da
SN, sendo que o uso de várias amostras demonstrou melhorar a sensibilidade do
teste. (HOLZ et al., 2009, VARELA et al., 2010; HOLZ et al., 2010). Para
minimizar o risco da introdução de animais infectados em rebanhos, os testes
sorológicos devem ser sensíveis o suficiente para evitar resultados falsonegativos.
O teste sorológico imunoenzimático conhecido como ELISA é bastante
utilizado, sendo uma técnica sensível e especifica, é aplicado para detectar
12
antígenos ou anticorpos, com base em interações anticorpo-antígeno, estando
disponíveis comercialmente testes que visam a detecção de anticorpos. No caso
do BoHV-1 que causa infecções persistentes, a detecção de anticorpos indica a
condição de portador, podendo ser utilizada para a detecção individual ou do
rebanho
em
estudos
de
monitoramentos
epidemiológicos
(FLORES
&
CARGNELUTTI, 2012).
A técnica apresenta vantagens em comparação a SN, permitindo o
processamento de um grande número de amostras, é também de relativa
facilidade e de rápida execução. Uma das principais desvantagens dessa técnica
é que o uso destes testes é dificultado pelo custo de aquisição de kit para
realização do ELISA, em virtude disto alguns laboratórios produzem e padronizam
seu próprio material (TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005; ESTEVES,
2007).
Outro aspecto a ser levado em consideração é a incapacidade de
diferenciação sorológica entre os animais vacinados e os naturalmente infectados.
Devido a isso, vacinas diferenciais com deleção da glicoproteína E (gE) têm sido
desenvolvidas. Na vacina o gene está deletado, desta forma, apenas animais
naturalmente infectados irão apresentar o antígeno da gE (BRUM et al., 2010;
OLIVEIRA, 2012). A utilização de testes diagnósticos capazes de diferenciar a
produção de anticorpos vacinais dos induzidos pelo vírus de campo são
necessários quando utilizadas estas vacinais. Esta diferenciação pode se
realizada por um teste de ELISA que detecta anticorpos contra a proteína ausente
no vírus vacinal (gE), mas presente no vírus de campo (OLIVEIRA, 2012).
Na Europa, há algum tempo já se utiliza testes de ELISA para detecção
da gE, devido ao uso de vacinas com vírus com deleção da gE (MUYLKENS et
al., 2007), no Brasil, OLIVEIRA et al., 2013, desenvolveram um teste diferencial
de ELISA com esta finalidade que foi capaz de diferenciar sorologicamente
animais vacinados com a cepa gE deletada do herpesvírus bovino tipo 5 dos
animais experimentalmente infectados com BoHV-1 ou BoHV-5. Apesar da
padronização da técnica por alguns autores do Brasil, o teste não é
comercializado, e as vacinas diferenciais não estão disponíveis no país.
Visando a detecção do genoma viral, a técnica molecular conhecida
como reação em cadeia da polimerase (PCR) tem bastante utilidade, apresenta
elevados índices de sensibilidade e especificidade, além da rapidez de execução
13
(ESTEVES, 2007). Existe uma ampla variedade de amostras biológicas que
podem ser utilizadas no diagnóstico, contendo partículas virais viáveis e não
viáveis, sendo que a técnica possibilita a detecção de partículas virais latentes,
pois a análise é feita por meio da identificação do genoma viral, o que confere a
técnica com de extrema importância nos casos de latência. Também pode ser
realizada em tecidos parafinizados, permitindo estudos retrospectivos (TAKIUCHI
et al., 2001, ARRUDA et al., 2010; FINO et al., 2012).
Vários protocolos de PCR (ESTEVES, 2007; FIGUEIREDO, 2009), e
suas variações como a nested PCR (CAMPOS, et al., 2009) e multiplex-PCR
(CLAUS et al., 2005; ARRUDA et al., 2010; FONSECA Jr. et al., 2011) vêm sendo
desenvolvidos e padronizados para identificação do BoHV-1.
2.7 Estrutura geral dos anticorpos
Os anticorpos ou imunoglobulinas fazem parte do sistema imune dos
vertebrados, sendo capazes de reconhecer, localizar e ligar-se a antígenos
específicos com intuito de inativar ou elimina-los. Sua produção é restrita aos
linfócitos B, existindo cinco classes de imunoglobulinas (IgM, IgG, IgA, IgD e IgE)
(MARANHÃO & BRIGIDO, 2001).
A molécula de imunoglobulina apresenta estrutura básica, simétrica,
apresentando forma de Y e pode ser caracteristicamente separada em duas
cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. (MARANHÃO &
BRIGIDO, 2001). Tanto as cadeias leves quanto as cadeias pesadas possuem
regiões aminoterminais variáveis e regiões carboxiterminais constantes. A cadeia
leve é composta por uma porção variável (VL do inglês Variable Light) e uma
porção constante (CL do inglês Constant Light), e a cadeia pesada é composta de
uma porção variável (VH do inglês Variable Heavy) e três ou quatro porções
constantes, dependendo da classe de imunoglobulina, chamadas de CH (do
inglês Constant Heavy) CH1, CH2, CH3 e CH4 ( Figura 1). As cadeias pesadas e
leves são unidas entre si por pontes dissulfeto, essas pontes variam de acordo
com o tipo de anticorpo e a espécie que os produziu (PAUL, 2003; MAK &
SAUNDERS).
14
Figura 1- Representação esquemática da molécula de anticorpo e seus principais
Fragmentos. Fonte: Adaptado de MARANHÃO & BRIGIDO (2001).
A justaposição das regiões variáveis de ambas as cadeias forma os
dois sítios de ligação ao antígeno (região Fab- fragment antigenbinding),
enquanto as regiões constantes (Fc- fragment cristallizable) são separadas do
local de ligação ao antígeno e não participam do seu reconhecimento. Regiões
aminoterminais dos domínios variáveis nas cadeias leve (VL) e pesada (VH)
constituem a região variável (Fv) e representam os pontos de ligação aos
antígenos. Cada domínio variável (V) possui três regiões que são hipervariáveis
em suas seqüências de aminoácidos, e ocorrem em forma de loops. Estes loops
hipervariáveis, denominados regiões determinantes de complementariedade
(CDRs), são os principais responsáveis pelo reconhecimento antigênico e, em
conjunto, formam o paratopo do anticorpo. Os resíduos de aminoácidos presentes
nas regiões variáveis, porém fora das CDRs, são enovelados de forma a dar
suporte aos loops, assim, estes resíduos apresentam a função de manter cada
loop em posição adequada para interagir com o antígeno (KIM et al., 2005).
15
2.8 Fragmento variável em cadeia única- scFv
A molécula de anticorpo intacta possui aproximadamente 150 kDa,
uma molécula grande, estimulando pesquisadores a desenvolveram métodos
para criação de fragmentos de anticorpos – scFv (single-chain variable fragment)
para utilização em vários fins, como por exemplo no diagnóstico e tratamento de
doenças. Os primeiros scFvs foram desenvolvidos independentemente por
HUSTON et al., (1988) e BIRD et al., (1988) e foram originalmente derivados de
genes isolados de linhagens celulares de hibridomas. Os fragmentos de
anticorpos scFv são moléculas de 26 a 28 quilodalton (kDa), compostas pelas
cadeias VH e VL unidas por um peptídeo conector flexível (MAYNARD &
GEORGIOU, 2000). Os peptídeos conectores que ligam as cadeias VH e VL são
usualmente compostos por 10 a 25 aminoácidos, sendo o decapeptídeo
(Gly4Ser)3 o mais comum deles. As regiões variáveis podem ser conectadas no
sentido VH-conector-VL ou VL-conector-VH e a orientação das cadeias no scFv
pode afetar a eficiência da expressão, a estabilidade e a capacidade de ligação
do mesmo ao antígeno (DESPLANCQ et al., 1994; MERK et al., 1999; LEONG &
CHEN, 2008; WEISSER & HALL, 2009).
Os fragmentos scFv quando comparados com moléculas de anticorpos
inteiras, apresentam várias vantagens atribuídas ao tamanho reduzido e a
ausência da porção Fc, contribuindo na diminuição de ligação em alvos
inespecíficos. Outros aspectos positivos da utilização destes fragmentos são: a
maior facilidade de manipulação gênica, alta capacidade de penetração em
tecidos e tumores, curto tempo de circulação e rápida eliminação do organismo,
facilitando a administração em radioimunoterapias e desintoxicação de drogas
(LEONG & CHEN, 2008).
Quando selecionados para fins diagnósticos, estes
fragmentos apresentam-se bastante eficientes, podendo ser fusionados com
fosfatase alcalina, proteínas fluorescentes e estreptoavidina, desenvolvendo
reações em menor tempo quando comparadas com moléculas inteiras fusionadas
com as mesmas substancias, pois a detecção do antígeno é feita diretamente
com a molécula marcada, diminuindo o número de incubações e reagentes
utilizados (PETRENKO & SOROKULOVA, 2004; CONROY et al., 2009)
Estudos demonstram a produção de scFv contra vários patógenos e
finalidades, como no diagnóstico hepatite B (SANCHEZ et al., 1999), da raiva
16
(RAY et al., 2001), detecção de metabólitos de drogas (MOGHADDAM et al.,
2003) e príons (NAKAMURA et al., 2004), detecção de poluentes orgânicos
(BROMAGE et al., 2007), análise de qualidade na indústria alimentícia (VICO et
al., 2010) para seleção e caracterização de antígenos do carrapato bovinoBoophilus microplus visando posterior desenvolvimento de novas vacinas conta o
parasita (SOUZA, 2007), contra o parvovírus canino-2 (BATISTA, 2008), seleção
de clone scFv neutralizante de toxinas presentes na peçonha de Bothrops
pauloensis (CARDOSO, 2008), para seleção e caracterização de scFv ligante a
proteínas intestinais de diatraea saccharalis (NASCIMENTO, 2009), na detecção
do vírus da bronquite infecciosa aviária e diferenciação de estirpes variantes
desse vírus (FERNANDES et al., 2010) e contra toxina termo-lábil Escherichia coli
enterotoxigênica (OZAKI, 2011).
2.9 Bibliotecas de Anticorpos Apresentadas em Fagos: Phage Display
Em 1985, SMITH estabeleceu um método para exibir polipeptídeos na
superfície de bacteriófagos filamentosos. A técnica conhecida como Phage
Display baseia-se na tecnologia do DNA recombinante, que conduz a criação de
uma biblioteca de apresentação de fragmentos de anticorpos monoclonais de
cadeia única (scFv) ou peptídeos em bacteriófagos, para seleção de clones
relevantes, produtores de anticorpos scFv para o antígeno desejado (SMITH ,
1985; SCOTT & SMITH, 1990)
Para que todo este procedimento de construção de biblioteca de
anticorpos seja realizado através da técnica de Phage Display, é necessária a
imunização dos hospedeiros com o antígeno de interesse, induzindo a produção
de anticorpos específicos e aumentando significativamente as chances de
sucesso da seleção (BURTON et al., 1991). O repertório da biblioteca é
geralmente criado a partir de RNAs codificantes de imunoglobulinas obtidos de
humanos (DOUGUCHI et al., 2009), coelhos (RADER, 2009), camelídeos
(ARBABI-GHAHROUDI et al., 2009), camundongos (MAKVANDI-NEJAD et al.,
2010) e galinhas (NAKAMURA et al., 2004) e os transcritos são extraídos de
órgãos produtores de linfócitos B, como baço, medula óssea e amídalas, ou ainda
17
de células do sangue periférico (SOUZA, 2007; SCHOFIELD et al., 2007; JUNG et
al., 2008; CHEN et al., 2008; URUSHIBATA et al., 2010).
Basicamente a técnica se refere à exposição de moléculas na
superfície de vírus bacteriófagos e à seleção destas com base na sua afinidade
por uma molécula-alvo (BENHAR, 2001). Os primeiros fragmentos de anticorpos
expressos em fagos ocorreram na década de 90 (McCAFFERTY et al., 1990).
Os bacteriófagos utilizados são na grande maioria da família Inoviridae
(M13, fd, f1) (SIDHU, 2001), vírus bacteriófagos filamentosos que parasitam
bactérias gram-negativas que possuem o pílus F(Figura 2) (BRÍGIDO &
MARANHÃO, 2002; RUSSEL et al., 2004). O vírus aproveita a maquinaria de
replicação, transcrição e tradução da bactéria para se reproduzir. O bacteriófago
M13 não provoca lise na célula hospedeira, mas induz um estado no qual a célula
infectada origina e libera partículas virais, causando uma queda na taxa de
reprodução bacteriana (AZZAZY & HIGHSMITH, 2002; MCAULIFFE et al., 2007).
Estes bacteriófagos são compostos por uma fita simples e circular de DNA de
cerca de 6400 bases, envolta em um capsídeo composto pelas proteínas pIII, pVI,
pVII, pVIII e pIX (SMITH & PETRENKO, 1997), e as mais empregadas para
apresentação de moléculas são as pVIII e pIII, sendo que das cinco, a pVIII
apresenta 2800 cópias e a pIII apresenta cinco cópias. (RUSSEL et al., 2004).
Neste sistema, o gene codificador da proteína de interesse é geralmente
fusionado a um dos genes destas duas proteínas da capa protéica do fago
(PHIZICKY & FIELDS, 1995). A pVIII é a principal componente da partícula viral ,
formando o corpo cilíndrico do vírus. A proteína pIII tem papel fundamental na
reprodução viral, pois é ela a responsável pela ligação do fago ao pilus sexual da
célula bacteriana.
Neste sistema é possível o uso de fagomídeos como alternativa prática
ao uso e manipulação do DNA viral para expressão de anticorpos recombinantes.
Fagomídeos são plasmídeos que possuem origem de replicação bacteriana,
origem de replicação viral, gene de fusão (pIII ou pVIII), sítio de inserção do
fragmento codificante do anticorpo ou qualquer outra proteína de interesse e
genes de resistência a antibióticos para seleção em meio apropriado. Porém os
fagomídeos não possuem todas as proteínas necessárias para a encapsidamento
da partícula viral, desta forma, é necessário o acréscimo nas culturas de células
transformadas com o fagomídeo de fagos auxiliares (helper) contendo todos os
18
genes dos bacteriófagos,
codificando
assim,
todas as proteínas virais
indispensáveis à replicação. Durante a infecção viral o DNA proveniente dos
fagomídeos é preferencialmente revestido pelas proteínas estruturais, pois os
fagos helper (fagos auxiliares) possuem mutações na origem de replicação,
dificultando sua reprodução e empacotamento de seu próprio material genético
(BARBAS et al., 2001).
Figura 2: Representação esquemática de um fago filamentoso.
Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e
PIX com ênfase no fragmento scFv fusionado ao
fago.
19
3 OBJETIVOS
Com o presente estudo objetivou-se:

Construir uma biblioteca de anticorpos (scFv) apresentada em fagos
(Phage Display) a partir de galinhas imunizadas com herpesvírus bovino
tipo 1 (BoHV-1).

Selecionar os anticorpos específicos ao vírus para que estes possam ser
utilizados no desenvolvimento de testes diagnósticos.

Avaliar os clones reativos ao BoHV-1.
20
4 MATERIAL E MÉTODOS
Para a construção da biblioteca foram utilizados kits e suas
recomendações, e os protocolos de produção com algumas modificações de
BARBAS et al., 2001 e RADER et al., 2000.
4.1 Local de desenvolvimento
O estudo foi desenvolvido na Universidade Federal de Goiás, no
Instituto de Ciências Biológicas 2 (ICB 2) e no Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública (IPTSP).
4.2 Cultivo e manutenção do herpesvírus bovino tipo 1
Os procedimentos de multiplicação, manutenção e quantificação do
BoHV-1 foram realizados utilizando células “Madin-Darby bovine kidney” (MDBK)
cultivadas em meio essencial mínimo- GIBCO® (MEM) suplementado com soro
fetal bovino 10%- GIBCO® e antibiótico- estreptomicina (10.000 ug/ml) e
penicilina (10.000 Units/ml)- GIBCO®. A titulação viral foi realizada pelo método
de Späerman-Kärber (THRUSFIELD, 1997).
4.3 Imunizações das galinhas com o BoHV-1
Duas galinhas de três semanas de idade, da raça White Leghorn foram
imunizadas com 0,5ml de uma suspensão de BoHV-1 a uma concentração de
105,5 DICC50/mL e em uma galinha foi inoculado apenas meio MEM – meio
essencial mínimo - Gibco®, como controle. As aves foram mantidas em gaiolas do
aviário da Universidade Federal de Goiás, supridas com ração própria para a
idade, assim como água foi fornecida a vontade. O esquema de imunização
seguiu o método descrito por BARBAS et al. (2001). Foi coletado soro pré-imune
21
das três aves e realizadas quatro imunizações por via intramuscular em intervalos
de 15 dias e a coleta de soro foi realizada na quarta semana das imunizações
para avaliação por imunoensaios (ELISA) do título de anticorpos específicos.
4.4 Ensaio imunoenzimático
Para o teste de ELISA, placas de microtitulação de alta afinidade
(NUNC) foram sensibilizadas com 100µl de vírus a concentração de 105,5
DICC50/mL, diluído em tampão carbonato/ bicarbonato, durante toda a noite a
4°C. Em seguida, as placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio (tampão
carbonato/bicarbonato, leite desnatado 1%), para posterior adição das amostras
de soro das galinhas antes e após as imunizações e soro controle sendo
incubadas por 1 hora a 37°C. Após esse período, as placas foram lavadas 5
vezes com PBST 0,5% e adicionado o 50µl de conjugado (anti IgY de galinhas
marcado com peroxidase) diluído em tampão de bloqueio, durante 1 hora a 37°C.
A reação foi revelada pela adição de substrato enzimático contendo ofenilenodiamino (OPD). Após a constatação da reação medida visualmente entre
as reações positivas e controles negativos (cerca de 20 min após a colocação do
substrato OPD) a reação foi interrompida com ácido sulfúrico e efetuada a leitura
a 492 nm em leitor de microplaca (Flow Titertek Multiskan Plus - USA).
Verificado um título satisfatório (acima de 1:2000), as galinhas foram
sacrificadas, seus baços retirados e imediatamente acondicionados em
recipientes com nitrogênio líquido e posteriormente em ultrafreezer a uma
temperatura de – 80ºC até sua utilização.
4.5 Extração de RNA total e síntese de cDNA
Os baços das aves foram macerados em cadinho com nitrogênio
líquido e imediatamente transferidos para tubos Falcon contendo Trizol. A
extração de RNA total dos baços foi realizada conforme protocolo descrito pelo
fabricante (Invitrogen). Após a extração, o RNA foi quantificado, aliquotado,
analisado quanto a sua qualidade, em gel de agarose 2% e armazenado a –
80ºC.
22
Aproximadamente 60g/l de RNA total foram utilizados para a síntese
de cDNA pelo kit Acess Quick RT-PCR system (Promega) e oligo(dT)12-18
(invitrogen), de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante. As condições
para a reação no termociclador foram otimizadas em 70ºC por 10 min, 4ºC por 1
min, adição da enzima transcriptase reversa (AMV) e continuação do ciclo por 1h
a 48ºC. O produto foi mantido a -20ºC.
4.6 Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de
anticorpos de galinha
Para amplificação dos fragmentos de DNA das cadeias leves e
pesadas dos anticorpos, foram realizadas cinco reações utilizando 10 μL de cDNA
como molde. Cada reação terá um volume final de 50 μL (10 μL de tampão de
PCR 10X, 8 μL de dNTPs 2,5 mM e 0,5 μL de Taq DNA polimerase 5U/ μL) com
60 pmoles dos pares de oligonucleotídeo para amplificação dos genes VH e VL
respectivamente:
CSCVHo-F
(senso)
5’GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG3’
CSCG-B
(reverso)5’CGTGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC
3’ CSCVK (senso) 5'GTGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC3'
CKJo-B (reverso) 5'GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG3'. As
reações foram otimizadas em termociclador inicialmente utilizando 94ºC durante 5
min; 30 ciclos de: 94ºC durante 45s; 56ºC durante 1 min; 72ºC durante 2 min e
uma
extensão
final:
72ºC
durante
10
min.
Os
fragmentos
de
DNA
correspondentes aos genes VH e VL foram purificados utilizando o kit Wizard SV
Gel up-System (Promega). As amostras eluídas e purificadas do gel foram
quantificadas em gel de agarose 1% utilizando um marcador padrão (Low DNA
Mass ladder - Invitrogen).
4.7 Produção dos fragmentos scFv – (Overlap)
Overlap definido como a sobreposição dos fragmentos VH e VL e
posterior amplificação do fragmento unido (scFv) só é possível pelo fato de os
23
iniciadores utilizados na amplificação dos fragmentos variáveis possuírem uma
“cauda” complementar entre os fragmentos, formando um peptídeo conector
(linker), permitindo sua ligação. Um novo par de oligonucleotídeos externos foi
utilizado para a amplificação do scFv. Dez reações de PCR foram realizadas para
um volume final de 50 μL contendo os seguintes componentes: 200ng de VH e VL
purificados,
60
pmoles
de
oligonucleotídeos
CSC-F
(senso)
5'
GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAG 3' e CSC-B
(reverso)5'GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTG
GAGG 3', 10 μL de tampão de PCR 10X, 8 μL de dNTPs 2,5 mM, MgCl2 50 mM,
0,5 μL de Taq DNA polimerase 5 U/μl e água MilliQ q.s.p 50 µl. As reações de
PCR foram conduzidas em termociclador com as seguintes condições: 94ºC
durante cinco minutos; 25 ciclos de: 94ºC durante um minuto; 56ºC durante um
minuto; 72ºC durante 1,5 segundos e extensão final: 72ºC durante 11 minutos.
Os fragmentos scFv amplificados foram visualizados em gel de
agarose 1%, purificados utilizando o kit Wizard SV Gel up-System (Promega),
quantificados em nanodrop 2000 Thermo Scientific®.
4.8 Digestão dos fragmentos scFv e do vetor pComb3X
Os fragmentos scFv e o vetor pComb3x (fagomídeo) foram digeridos
separadamente em duas reações, cada uma contendo 15 unidades de enzima Sfi
I (20 U/μL - Biolabs) para cada 1 μg de DNA e tampão NEBuffer 2, em
concentração final de 1X e água destilada autoclavada q.s.p. 50 µl. As reações
foram incubadas a 50ºC durante 16 horas, e em seguida analisadas em gel de
agarose. Os fragmentos digeridos foram purificados do gel utilizando o
NucleoSpin ® (Macherey-Nagel), seguido de quantificação em nanodrop 2000
Thermo Scientific®. A Figura 3 demonstra o esquema do vetor fagomidial
pComb3X.
24
Figura 3: Representação esquemática do vetor Pcomb3X. (H6) região com seis
histidinas utilizada para purificação do fragmento em coluna de Niquel.
(HA) epítopo de hemaglutinina que possibilita a detecção por anticorpos
anti-HA, Códon âmbar (TAG) que dependendo da linhagem bacteriana
utilizada permite a produção do fragmento scFv solúvel. Fonte: SOUZA,
2007.
4.9 Ligação dos fragmentos de DNA scFv com o vetor pComb3X
Após a digestão separada do scFv e do vetor, eles foram ligados
seguindo as condições: 20ng de pComb3X digerido com Sfi I, 18 ng de scFv
digeridos com Sfi I, 2 L de tampão da enzima 5X (Promega), 0,5L de T4 DNA
Ligase (Promega 3U/L) e água MilliQ q.s.p para 20L. As reações foram
incubadas a 16ºC durante 20 horas. Cinco sistemas de ligação idênticos foram
realizados para aumentar a variabilidade da biblioteca. As amostras foram
armazenadas no freezer -20°C para posterior transformação de células
competentes- E. coli XL1-Blue.
4.10 Preparação de células XL1-Blue eletrocompetentes
Uma colônia de células XL1-Blue foi isolada e inoculada em 10 mL de
meio SB contendo tetraciclina (20 μg/mL), este pré-inóculo foi incubado a 37ºC
durante a noite, sob agitação de 230 rpm. Foi inoculado 5 mL do pré-inóculo em
500 mL de meio SB contendo e incubado a 37ºC sob agitação de 250 rpm até
D.O.600nm de 0,6. Os frascos foram resfriados no gelo durante 15 minutos e a
cultura foi centrifugada a 5000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi
25
descartado e os sedimentos ressuspendidos em 20 mL de glicerol 10% gelado. A
suspensão de células foi centrifugada a 7000 rpm durante 15 minutos a 4ºC e o
sobrenadante descartado. Os sedimentos foram submetidos a mais duas
lavagens com 20 mL de glicerol 10% gelado. Após a terceira lavagem, as células
foram ressuspendidas no volume residual de glicerol e aliquotadas em volume de
50 μL e transferidas para microtubos novos e estéreis. As alíquotas foram
congeladas em banho de álcool e gelo seco e estocadas a -80ºC até serem
utilizadas para eletroporação e para os experimentos de seleção.
4.11 Transformação de células E. coli (XL1-Blue) por eletroporação
Para a transformação das células, 2 μL do sistema de ligação foi
misturado a 50 μL de células competentes. Em seguida, a mistura foi transferida
para uma cubeta de 0,2cm (Biorad®) previamente resfriada em gelo e submetida
ao choque no eletroporador com os seguintes parâmetros elétricos: 2,5 kV, 25 μF
e 200 Ω. O esperado nessas condições é entre 4,0 e 5,0 milisegundos. Após a
eletroporação, as células foram recuperadas, imediatamente, em 1 mL de meio
SOC, transferidas para um tubo Falcon de 50 mL estéril e incubadas a 37ºC sob
agitação de 250 rpm durante 1 hora. Diluições desta cultura foram semeadas em
placa de petri com meio LB ágar contendo carbenicilina 100 μg/mL para a
determinação da eficiência de transformação.
4.12 Extração de DNA fagomidial e digestão das amostras para avaliação da
variabilidade da biblioteca
Foram utilizadas 15 colônias da etapa anterior e a extração de DNA
fagomidial foi realizada utilizando o Qiaprep Spin Mini Kit. Para digestão das
amostras foi utilizado 5U- 0,5 µl de enzima BstNI (New England Biolabs®, sítio de
restrição: CCWGG), tampão- 2,4µl, BSA- 0,25µl, amostra- 1µl, e água
autoclavada 11,85µl com incubação de 2 horas a 60°C.
26
4.13 Expressão da biblioteca de anticorpos
Foi inoculado 10ml de meio SB com 200 µl da biblioteca de anticorpos
acrescido de 50 μg/mL de carbenicilina com agitação de 250 rpm a 37 ºC por 1214 h. Após a incubação foi transferido 10 mL da cultura para 300 mL de meio SB
+ carbenicilina + 6 ml de MgCl2 1M e incubados a 37ºC com agitação de 250 rpm
por 8 horas. Foi adicionado 800µl de IPTG 0,5M e incubados 12 horas a 37°C. A
cultura foi centrifugada por 30 minutos a 3000xg em 4°C. O pellet foi
ressuspendido em 1 ml de PBS 1X, coloca em novo frasco e sonicado em
sonicador de células (Sonics Vibra Cell, Sonics & Materials, VCX 500), no gelo
durante 3 minutos. O material foi centrifugado a 14000 rpm durante 30 minutos a
4°C e o sobrenadante transferido para tubo limpo.
4.14 Dot blot para análise da expressão da biblioteca
Para analisar a expressão da biblioteca foi realizado um ensaio de dot
blot. Para isso, uma membrana de nitrocelulose 0,45 μm (Hybridization transfer
membranes Amersham Biosciences) foi pipetada com 5μL do BoHV-1 e 5 μL da
cultura da biblioteca, deixado secar a temperatura ambiente. Em seguida, a
membrana foi bloqueada com uma solução de BSA 3% em PBS e incubada a 4ºC
sob agitação, durante a noite. A membrana foi lavada, rapidamente, 3 vezes com
PBST 0,05%, imersa com o sobrenadante da biblioteca de anticorpos scFv
sonicado na etapa anterior e deixado a temperatura ambiente por 2 horas. A
membrana foi imersa em uma solução contendo o anticorpo primário (coelho- IgG
anti-HA), diluído 1:1000 em PBS e incubada durante 2 horas a temperatura
ambiente, sob agitação. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes,
rapidamente, com PBST e incubada com o anticorpo secundário (anti IgG de
coelho conjugado com fosfatase alcalina), diluído 1:000 em PBS. A membrana foi
lavada 3 vezes com PBST e 1 vez com APB (tampão da fosfatase alcalina). O
ensaio foi revelado com o substrato NBT/BCIP. Para parar a reação, a membrana
foi lavada em água corrente.
27
4.15 Preparação do fago auxiliar VCSM13
4.15.1 Obtenção do fago auxiliar
Foram inoculadas 5 μL de células XL1- Blue competente em 5 mL de
meio SB contendo tetraciclina 20 μg/mL, incubado a 37ºC sob agitação até atingir
D.O.600nm entre 0,6–1,0. Em seguida, foram feitas alíquotas de 50 μL de células
em microtubos, adicionado 1 Μl (1x1011ml) de fagos auxiliares diluídos (10-6, 10-7
e 10-8), para garantir a formação de placas de lises isoladas, e incubados durante
15 minutos a temperatura ambiente. Os 50 μL da cultura foram adicionados em 3
mL de meio LB top ágar liquefeito (50ºC) e vertido em uma placa de petri
contendo LB ágar. As placas foram Incubadas a 37ºC durante a noite e no dia
seguinte à incubação observou-se a formação de placas de lise.
4.15.2 Amplificação do fago auxiliar
Para a amplificação das placas de lise, foram inoculados 10 μL de
células XL1-Blue competente em 10 mL de meio SB pré-aquecido a 37ºC,
contendo tetraciclina 10 μg/mL, em um tubo Falcon de 50 mL e incubado a 37ºC
durante uma hora sob agitação. Uma placa de lise foi selecionada com o auxílio
de um palito estéril e transferida para o tubo contendo a cultura de bactérias, para
que ocorresse a infecção, incubado a 37ºC sob agitação durante 2 horas. A
cultura infectada foi então transferida para um erlenmeyer de 1litro com 250 mL
de meio SB pré-aquecido a 37ºC contendo tetraciclina 10 μg/mL e incubada a
37ºC sob agitação durante 1 hora, adicionado kanamicina 70 μg/mL e incubado a
37ºC sob agitação durante a noite. No dia seguinte, a cultura foi transferida para
tubos, centrifugado a 2500 x g durante 15 minutos e o sobrenadante coletado em
tubos novos. O sobrenadante foi submetido à incubação a 70ºC durante 20
minutos para eliminar as células residuais e centrifugado a 2500 x g durante 15
minutos. O sobrenadante foi estocado em tubos estéreis a 4ºC.
28
4.15.3 Determinação do título da preparação de fagos auxiliares
Para determinar o título da preparação dos fagos auxiliares foram
inoculados 2 mL de meio SB, contendo tetraciclina 20 μg/mL, com 2 μL de células
XL1-blue competentes e incubado a 37ºC em agitação até atingir a D.O.600nm de
0,6 a 1,0. As células foram aliquotadas em 50 μL para microtubos e adicionado
1μL de fagos auxiliares diluídos (10-6, 10-7 e 10-8) e incubado a temperatura
ambiente durante 15 minutos. Foram adicionados os 50 μL de células infectadas a
3 mL de meio LB top ágar, misturado e espalhado em placas contendo meio LB
ágar. As placas foram incubadas a 37ºC durante a noite e no dia seguinte a
incubação as placas de lise foram contadas e o título de fagos foi determinado em
unidades formadoras de placas pfu/mL de fagos.
4.16 Expressão dos fragmentos de anticorpos scFv como proteínas de fusão na
superfície de bacteriogafos filamentos – phage display
Foram adicionados 13,5 ml de meio SB em 1,5 ml de cultura de células
transformadas juntamente com 3 μL de carbenicilina (100 mg/mL) e 7,5 μL de
tetraciclina (20 mg/mL) e incubado a 250 rpm durante 1 hora a 37°C.
Em seguida, foram adicionados 4,5 μL de carbenicilina (100 mg/mL) incubando as
células por mais uma hora, nas mesmas condições anteriores. A cultura foi então
transferida para um erlenmeyer de 1 L e foram adicionados 3 mL de fago auxiliar
VCSM13 (1,52 x 108 pfu/mL) e 183 mL de meio SB pré-aquecido a 37°C,
contendo 92,2 μL de carbenicilina (100 mg/mL) e 92,5 μL de tetraciclina (20
mg/mL) e incubado em agitador durante 1,5 a 2 horas, a 300 rpm, a 37°C. Foram
adicionados 280 μL de kanamicina (50 mg/mL) e mantido nas condições descritas
anteriormente durante a noite.
No dia seguinte a cultura foi submetida à centrifugação a 3000 x g
durante 15 minutos a 4°C. O sedimento foi estocado a -20ºC para futuras
preparações plasmidiais. Ao sobrenadante foram adicionados 8g de PEG 8000
(polietilenoglicol) e 6g de cloreto de sódio e agitado a 250 rpm, durante 10
minutos, a 37°C para dissolver a fase sólida. Em seguida, o sobrenadante foi
incubado em banho de gelo durante 30 minutos. Os fagos foram coletados por
29
centrifugação a 10.000 x g durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi
descartado e a garrafa mantida invertida sobre papel toalha, por pelo menos 10
minutos. Para garantir a secagem do sedimento, as bordas da garrafa foram
enxugadas com papel toalha. O sedimento foi ressuspendido em 2 mL de
TBS/BSA 1% (p/v), a suspensão foi transferida para dois microtubos e
centrifugada a 12000 rpm, durante 5 minutos, a 4°C. Em seguida, o
sobrenadante, contendo as partículas virais, foi transferido para um tubo novo e
estocado a 4°C.
4.17 Seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1Biopanning
Em dois poços de uma placa de microtitulação foram adsorvidos 50 μL
de BoHV-1 diluídos em 75 μL de tampão bicarbonato de sódio (0,1 M pH 8,6). A
placa foi incubada a 4ºC durante a noite. No dia seguinte, a solução foi
descartada. Aos dois poços foram adicionados 200L de TBS-BSA 3% para
bloquear, seguido de incubação a 37ºC durante 1 hora. A solução bloqueadora foi
descartada e 100 L da biblioteca de anticorpos em fagos, adicionados a cada
poço. A placa foi selada e incubada durante 2 horas a 37ºC, em estufa. A solução
de fagos foi desprezada, e os poços lavados de acordo com o seguinte método: o
volume de 200L de TBST 0,5% foi pipetado vigorosamente por 5 vezes, a
solução de lavagem permaneceu nos poços por 5 minutos antes de ser
desprezada. O número de repetições deste passo variou de acordo com o ciclo de
seleção (1° e 2° ciclos – 5 lavagens, 3° e 4° ciclos – 10 e 15 lavagens,
respectivamente).
Descartada a solução de lavagem, fagos ligados foram eluídos por
incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, com 100 L de tampão de
eluição ácido (Glicina-HCl 0,1M, pH 2,2), e vigorosas pipetagens (10X) foram
realizadas nos poços com este mesmo tampão; de imediato, o eluato foi
transferido a um novo tubo contendo 6 L do tampão de neutralização (Tris-base
2M) e incubou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos. Nesta etapa
30
reservou-se 50 μL da bactéria e foi realizado a titulação dos fagos de entrada e e
posteriormente a titulação dos fagos de saída.
O restante da cultura foi transferida para um tubo falcon de 50 mL, no
qual foram adicionados 6 mL de meio SB pré-aquecido a 37ºC, 1,6 L de
Carbenicilina (100 mg/mL) e 3 L de tetraciclina (20 mg/mL). O tubo foi incubado
a 37C, durante 1 hora, sob agitação de 250 rpm. Após 1 hora, foi adicionado 2,5
L de Carbenicilina (100 mg/mL) e uma nova incubação foi realizada nas mesmas
condições do passo anterior. Em seguida, o volume de 2 mL de fago auxiliar
VCSM13 foi acrescido ao tubo, e a cultura foi transferida para um Erlenmeyer de
500 mL, no qual estavam 91 mL de meio SB pré-aquecido a 37C suplementado
com 46L de carbenicilina (100 mg/mL) e 46L de tetraciclina (20 mg/mL). O
erlenmeyer foi mantido durante 1,5 a 2 horas sob agitação de 300 rpm a 37C.
Seguidas 2 horas, o volume de 140 L de kanamicina (50 mg/mL) foi
acrescentado ao meio e, então, a cultura foi incubada durante a noite nas
condições descritas anteriormente.
No dia seguinte, a cultura foi submetida à centrifugação a 3.000 x g
durante 15 minutos a 4C. O sedimento foi estocado para futuras preparações
plasmidiais a -20ºC. Para precipitar fagos, foram adicionados ao sobrenadante 4 g
de PEG 8000 (polietilenoglicol) e 3 g de cloreto de sódio, esta solução foi agitada
a 250 rpm, durante 10 minutos, a 37C, para dissolver a fase sólida.
Posteriormente, o sobrenadante foi incubado em banho de gelo durante 30
minutos. A solução contendo os fagos foi submetida à centrifugação a 15000 x g,
durante 15 minutos a 4C. O sobrenadante foi descartado e o tubo mantido
invertido sobre papel toalha por, pelo menos, 10 minutos, para garantir a secagem
do sedimento. Após esse tempo, as proximidades da boca do tubo foram
enxugadas com papel toalha e o sedimento ressuspendido em 2 mL de TBS/BSA
1% (p/v). A suspensão foi transferida para dois microtubos e centrifugada a 14000
rpm durante 5 minutos a 4C. Em seguida, o sobrenadante contendo as partículas
virais foi transferido para um novo tubo e estocado a 4C. Foram realizados seis
ciclos de seleção (Biopanning) para que ocorresse um aumento da afinidade dos
anticorpos ao ligante e enriquecimento da biblioteca.
31
4.18 Ensaio imunoenzimático
O teste de ELISA foi realizado para avaliar a reatividade dos
fragmentos de anticorpos- scFv. Dois poços de uma placa de microtitulação foram
sensibilizados com 100 μL do BoHV-1 (105,5 DICC50/mL), dois poços foram
sensibilizados com meio MEM como controles negativos e dois poços foram
sensibilizados com o vírus sendo o controle “branco” da reação. A placa foi
incubada durante a noite a 4ºC. As soluções foram descartadas e os poços
bloqueados com 100 μL da solução bloqueadora (tampão carbonato/bicarbonato,
leite desnatado 1%) e incubados durante 1 hora a 37ºC. A solução bloqueadora
então foi descartada e os poços lavados 2 vezes com PBS. O sexto ciclo da
seleção foi inoculado nos poços (100 µl- aproximadamente 1011 ufp) e a placa foi
incubada durante 2 horas a 37ºC. A solução foi descartada e os poços lavados 6
vezes com PBST. Foram adicionados 50 μL do anticorpo anti-M13 conjugado com
peroxidase diluído 1:2000 em solução de bloqueio e incubado durante 1 hora a
37ºC. Após a incubação, a solução de anticorpo foi descartada e a placa lavada 6
vezes com PBST 0,05%. Foram adicionados 100 μL da solução do substrato OPD
em cada poço e incubado a temperatura ambiente até a visualização da reação
(aproximadamente 15 minutos). A placa foi lida a 492 nm em leitor de microplaca
(Flow Titertek Multiskan Plus - USA).
4.19 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones selecionados
Para a realização do sequenciamento, o DNA foi extraído pelo Qiaprep
Spin Mini Kit e visualizados em gel de agarose 2% corados com brometo de
etídeo. O seqüênciamento foi realizado utilizando o DyEnamic ET Dye Terminator
Cycle Sequencing Kit (Amershan Biosciences) utilizando um sequenciador
automático capilar MegaBaceTM 1000 (GE Healthcare). As amostras foram
preparadas
para
seqüenciamento
em
placas
de
96
wells
contendo
aproximadamente 400 ng de DNA fagomidial e 2,5 pmoles do oligonucleotídeo
mmB5 em um volume final de 10 μL. As condições da reação de sequenciamento
foram: 25 ciclos de: 95ºC por 20 segundos; 50ºC por 15 segundos e 60ºC por 1
minuto. A reação foi precipitada conforme descrito no Kit de sequenciamento e as
32
placas de sequenciamento foram injetadas imediatamente no sequenciador
automático MegaBace (GE).
4.20 Análise das sequências
O sequenciador gerou cromatogramas que foram processados e
analisados nos programas Phred basecalling. A qualidade das seqüências foi
verificada manualmente diante dos cromatogramas. As seqüências obtidas foram
traduzidas com auxílio de alinhamentos realizados com o banco de dados do
programa IgBlast no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) e as regiões
determinates de complementariedade (CDRs) foram definidas e alinhadas
manualmente .
33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Imunizações das aves com o BoHV-1
As duas aves imunizadas com o BoHV-1 apontaram no teste de ELISA
que produziram anticorpos reativos contra o vírus, a ave imunizada como controle
negativo apresentou uma reatividade no teste, provavelmente devido ao fato
desta aves serem vacinadas para doença de Marek, causada pelo vírus da
mesma família do BoHV-1, sendo provável uma reação cruzada, levando a um
resultado falso positivo. Os títulos de anticorpos observados nas diluições no soro
das galinhas imunizadas com o BoHV-1 apresentaram-se altos mesmo na diluição
de 1:4000, indicando que as aves já poderiam ser sacrificadas, uma vez que
títulos acima de 1:1000 são suficientes para a construção da biblioteca de
anticorpos (Barbas et al., 2001). Os títulos obtidos após o esquema de
imunização podem ser visualizados na Figura 4 e a análise estatista demostrando
que houve diferença significativa até a diluição 1/64000 entre os soros das
galinhas imunizadas com o BoHV-1 e as ave controle negativo na Figura 5.
.
Figura 4: Resposta de anticorpos em soros de galinhas imunizadas com o
BoHV-1 e MEIO MEM. G1, G2 e G3 PRÉ- representam o soro préimune das aves. G1- 4ª e G2- 4ª representam as aves 1 e 2
imunizadas com o BoHV-1 e a coleta de soro na quarta semana após
a primeira imunização, a G3-4ª corresponde a ave 3 controle negativo
na quarta semana de inoculação.
34
Figura 5: Análise estatística dos soros pré e pós imunes e do
controle negativo.
A escolha de galinhas para a geração de anticorpos para construção
de uma biblioteca combinatorial de anticorpos apresentada em fagos, se deu
devido à maneira pela qual a diversidade de anticorpos é gerada. Durante os
rearranjos gênicos e o processo de conversão gênica, as cadeias leves e pesadas
são geradas diversificadas e com as extremidades terminais apresentando
sequências de aminoácidos idênticas. Neste caso, o repertório de genes variáveis
(VH e VL) pode ser amplificado utilizando apenas um par de iniciadores distintos
para cada fragmento gênico (WYNGAARDT et al., 2004). Para amplificação dos
segmentos gênicos de mamíferos, por exemplo, necessitaríamos de um maior
número de oligonucleotídeos e de reações de amplificações (DANTAS-BARBOSA
et al., 2004). Desta forma, as galinhas apresentaram-se como uma fonte
adequada de moléculas de mRNA, as quais codificam cadeias variáveis pesadas
e leves de anticorpos, e estes mRNA foram utilizados na confecção da biblioteca
de anticorpos. As aves são capazes de produzir anticorpos com alta afinidade,
altos títulos e de grande persistência na resposta imune (LEMAMY et al. 1999), o
que concorda com os elevados títulos obtidos neste trabalho.
Apenas
a
galinha
1
foi
sacrificada
para
a
sequencia
dos
procedimentos. O RNA extraído do baço da ave foi analisado e quantificado em
gel de agarose mostrando uma concentração de 20g/l. A partir deste RNA
produziu-se a cDNA através de PCR.
35
5.2 Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de
anticorpos de galinha e amplificação do fragmento scFv (Overlap)
Para amplificar os genes da região variável da cadeia leve, foram
utilizados os oligonucleotídeos CSCVK (senso) e CKJo-B (reverso). Os amplicons
foram visualizados em gel de agarose 2% corados com brometo de etídeo. Os
tamanhos observados dos genes para cadeias leve foi em cerca de 350 pb e para
cadeia pesada de 400 pb. Neste ponto de amplificação cita-se novamente a uma
vantagem na utilização de galinhas para produção de anticorpos, utilizando
apenas
um
par
de
iniciadores
distintos
para
cada
fragmento
gênico
(WYNGAARDT et al. 2004).
Posteriormente, os fragmentos VH e VL produzidos foram purificados e
utilizados como molde na montagem do gene scFv (overlap). A reação de
sobreposição é promovida por uma seqüência nucleotídica codificadora de um
peptídeo ligante (short linker) presente nos oligonucleotídeos CkJo-B (VL) e
CSCVHo-F (VH). Outros iniciadores CSC-F (senso) e CSC-B (reverso), externos
ao fragmento sobreposto, foram utilizados para amplificar o gene scFv de
aproximadamente 800 pb (Figura 6).
Figura 6: Amplificação dos fragmentos das cadeias leve (VL) e pesada (VH) de
anticorpos de galinha. Análise em gel de agarose 2% do fragmento scFv
purificado.
36
5.3 Construção da biblioteca combinatorial de anticorpos (scFv) e análise da
diversidade desta biblioteca por enzima de restrição.
Para a construção da biblioteca, os fragmentos scFv e o pComb foram
digeridos por enzima de restrição Sfi I e purificados do gel de agarose afim de
eliminar os resíduos de enzima que comprometem a eficiência da ligação. Os
fragmentos foram então clonados no vetor, o procedimento de ligação foi
realizado e utilizado na transformação em XL1-Blue eletrocompetente e
plaqueadas em placas de petri. Foram selecionadas 15 colônias para extração do
DNA fagomidial e o produto foi analisado em gel de agarose 2%. O DNA extraído
foi digerido com a enzima de restrição BstNI afim de avaliar a variabilidade da
biblioteca através da análise dos fragmentos de restrição. A variabilidade dos 15
clones foi demostrada através da visualização de diferentes bandas em gel de
agarose 2% corados com brometo de etídeo sob luz UV. Os clones 5 e 6, 7 e 8,
14 e 15 compartilham o mesmo tamanho de fragmento caracterizando o restante
dos clones (80%) como únicos e com especificidades teoricamente distintas,
necessitando da seleção de anticorpos específicos para o BoHV-1. (Figura 7).
MM 1
2
3 4 5
6
7 8
9 10 11 12 13 14
15
Figura 7: Clones digeridos com enzima de restrição BstNI,
demostrando os diferentes tamanhos de fragmentos.
MM: marcador molecular (Amresco) de 50pb a
2000pb e em seguida os 15 clones.
Observando o gel acima, verificou-se uma variabilidade da biblioteca,
este fato pode ser justificado pelo fato de que as aves utilizadas para a
37
imunização não eram livres de patógeno e nem o ambiente onde viviam era
estéril. Sendo assim, as galinhas entraram em contato com uma ampla gama de
microorganismos presentes no ambiente, alimentos e água. Este contato gera
uma resposta imunológica contra estes organismos e consequentemente a
amplificação de fragmentos gênicos de anticorpos sem especificidade ao BoHV-1,
desta forma o procedimento do Biopanning para seleção dos anticorpos se fez
necessário. Em outro estudo realizado em 2007 esta variabilidade de anticorpos
gerada pelas aves não foi verificada, provavelmente devido a imunodominância
de alguma proteína especifica do antígeno em questão (SOUZA, 2007).
5.4 Dot blot para análise da expressão da biblioteca
Foi realizado o dot blot para analisar a expressão dos fragmentos scFv
indiretamente pela observação da expressão do epítopo da hemaglutinina (HA)
fusionada ao anticorpo clonado no vetor pComb. O reconhecimento do epítopo
HA pelo anticorpo monoclonal anti-HA reflete a expressão correta deste epítopo e,
consequentemente, pela sua proximidade ao fragmento scFv, pode-se inferir a
integridade de todo o sistema de expressão. A área sensibilizada com a biblioteca
de fragmentos scFv apresentou forte marcação, demonstrando níveis de
expressão detectáveis visualmente porém a área sensibilizada com BoHV-1
apresentou-se fracamente marcada, demostrando ainda que os fragmentos de
anticorpos produzidos até o momento não eram específicos para o vírus sendo
necessário a realização dos procedimentos de seleção (Figura 8).
A
B
Figura 8: Análise por dot blot dos clones expressando fragmentos scFv. AMembrana sensibilizada com BoHV-1. B- Membrana sensibilizada com
fragmentos de anticorpos scFv.
38
5.5 Seleção de partículas virais (scFv fusionados) ligantes ao BoHV-1- Biopanning
Esta fase do processo de construção da biblioteca de anticorpos teve
como objetivo a seleção dos clones gerados contra o antígeno de interesse, para
isto, o BoHV-1 foi sensibilizado em placas de microtitulação e submetido ao
reconhecimento pelos anticorpos recombinantes expressos em fagos. Os fagos
não ligantes foram lavados e os reativos eluídos e amplificados em E. coli (Figura
9) (SMITH & SCOTT, 1993). O título de entrada dos fagos no quinto e sexto ciclo
foi aproximadamente 108, o título de saída do quinto ciclo foi de 2x104, já o título
de saída do sexto ciclo foi de 1x106. Esses resultados constatam que houve um
aumento da especificidade da biblioteca de anticorpos durante os ciclos de
seleção, pois mesmo aumentando a estringência da reação (quantidades de
lavagens em cada ciclo) ocorreu enriquecimento dos clones. Nos estudos
disponíveis na literatura, 3 a 4 ciclos são suficientes para um resultado
satisfatório, no caso deste trabalho foram realizados 6 ciclos para aumentar o
enriquecimento de clones ao alvo visando o desenvolvimento de testes
diagnósticos. (SOUZA, 2007; CARDOSO, 2008; NASCIMENTO, 2009; NOLL,
2011).
Figura 9:
Seleção de fagos, expressando as diferentes formas scFvs. A
cada ciclo os ligantes específicos foram selecionados e reamplificados. Fonte: Adaptado de SIDHU & FELLOUSE, 2006;
SOUZA, 2007.
39
A técnica de Phage Display utilizada neste estudo apresenta vantagens
quando comparados com a outra forma de obtenção de anticorpos recombinantes
conhecida como tecnologia de hibridoma. Cita-se como ponto positivo do Phage
Display o consumo de tempo utilizado na construção, já que dispensa o passo de
imunização de animais e cultivo celular em larga escala, além de apresentarem
elevada afinidade pelo alvo (AZZAZY & HIGHSMITH, 2002).
5.6 Análise da biblioteca pelo ELISA
Após os 6 ciclos de ligação, eluição e amplificação na presença do fago
auxiliar e antibióticos adequados foi realizado o teste de ELISA para
monitoramento da reatividade da biblioteca ao vírus, para isto, duplicata das
amostras do sexto ciclo de seleção, das amostras de controle negativo (Meio
MEM) e dos brancos da reação (BR-ausência de clones scFv) foram utilizados.
A leitura (OD) demostrou a reatividade dos clones durante o último
ciclo de seleção. Nenhuma reação inespecífica ocorreu como demonstra a baixa
leitura do branco (BR-ausência de clones scFv). A baixa leitura do controle
negativo (Meio MEM) demonstra que ocorreu uma baixa especifidade da
biblioteca com o meio de cultura, demonstrando que o vírus é que gerou resposta
imune na galinha e não o meio de cultura. Os resultados podem ser observados
na Figura 10. Houve diferença significativa entre os tratamentos.
Figura 10: Imunoensaio dos clones do ciclo 6 contra o hespersvírus bovino
tipo1. B= branco, CN= controle negativo, R6= ciclo 6. Os
tratamentos foram comparados entre si pelo teste ANOVA
seguido do teste de Bonferroni e foi considerada diferença
estatística quando p<0,05.
40
A afinidade da biblioteca de anticorpos scFv ao BoHV-1 observada no
teste de ELISA mostra que os fragmentos produzidos são reativos ao vírus, sendo
possível a utilização destes anticorpos no desenvolvimento de novas plataformas
de diagnóstico, como um teste rápido de fluxo lateral. Na maioria dos laboratórios,
a técnica de diagnóstico utilizada para detecção das doenças causadas pelo
BoHV-1 é o teste de ELISA que possibilita a detecção de anticorpos contra o
vírus, porém uma das dificuldades encontradas com este tipo de diagnóstico, é a
impossibilidade de diferenciar anticorpos produzidos em resposta à infecção
natural daqueles produzidos pela vacinação, sendo que, a vacina é uma forma de
controle do vírus e é utilizada no Brasil. Diante disto, na tentativa de melhor
auxiliar nos resultados dos diagnósticos, e focar na detecção de antígenos em
oposição a anticorpos, eliminando assim o questionamento do animal apresentarse positivo devido à vacina ou vírus de campo, o desenvolvimento de testes
rápidos que detectem antígenos se torna importante, sendo utilizado o scFv
produzido neste trabalho. (TEIXEIRA et al., 2001; SPILKI et al., 2005;
BAUERMANN et al., 2010). Desde a década de 90, testes rápidos vem sendo
estudados
e
disponibilizados
no
mercado
para
diagnóstico
de
várias
enfermidades, como: AIDS, dengue, rotavirose, amebíase, hanseníase, entre
outras (CAVALCANTI et al., 2008). Não existe até o momento um teste rápido
para detecção de antígenos do BoHV-1 em bovinos, sendo que a detecção rápida
de animais doentes feita a campo auxiliaria no controle da enfermidade evitando
maiores prejuízos.
41
5.7 Sequenciamento das cadeias variáveis pesadas dos clones selecionados
Os clones do sexto ciclo de seleção reativos no ELISA foram utilizados
para reação de sequenciamento. O DNA para a reação de sequenciamento foi
extraído segundo o kit Qiaprep Spin Mini Kit. As amostras foram analisadas em
gel de agarose 2% para avaliação da qualidade. (Figura 11)
MM
Amostras
Figura 10:
Gel de agarose 2% dos DNA extraídos dos
clones do sexto ciclo de seleção.MM:
marcado molecular 1Kb Amresco.
A placa contendo amostras de DNA foi sequenciada utilizando o
iniciador mmB5 (extremidade 3’ do fragmento scFv). As reações foram injetadas
no sequenciador automático MegaBace (GE). Após o sequenciamento, as
seqüências foram analisadas utilizando o programa IgBlast e a seqüências
protéicas alinhadas manualmente (Figura 11).
Dos 48 clones sequenciados, apenas 19 (39,6%) tiveram sequencias
capazes de serem analisadas, destes 12 (63,1%) apresentaram regiões hipervariáveis (CDRs) com grande similaridade entre si, demostrando uma provável
diminuição da variabilidade dos anticorpos após a seleção do biopanning o que é
desejado para os ensaios futuros de diagnósticos, porém, apenas a cadeia
42
pesada foi sequenciada, necessitando também do sequenciamento das cadeias
leves e novamente dos clones já sequenciados. A baixa qualidade das
seqüências atribuídas possivelmente a problemas na extração do DNA com
alguns contaminantes ou no próprio equipamento. Devido a estes problemas não
foi possível determinar todas as CDRs presentes em todos os clones.
43
44
6 CONCLUSÕES
A clonagem em vetor pcomb3X dos genes codificadores dos
fragmentos de anticorpos contra o BoHV-1 foi bem sucedida, sendo a expressão
na forma solúvel realizada com sucesso por células de E. coli XL1-BLUE. A
utilização da biblioteca de fragmentos scFvs em fagos por seis ciclos de seleção
mostrou enriquecimento nos títulos de fagos selecionados contra a antígeno. O
imunoensaio
demonstrando
confirmou
a
a
validade
afinidade
do
dos
processo
fragmentos
de
seleção.
scFv
O
ao
BoHV-1
processo
de
sequenciamento mostrou uma diminuição da variabilidade em comparação ao dot
blot realizado anteriormente, sendo uma característica desejável neste processo,
porém não foi possível sequenciar os clones de modo eficiente, verificando-se,
portanto, a necessidade de analisar de forma mais aprofundada os resultados
obtidos. Mesmo com a necessidade deste novo sequenciamento, a realização
deste estudo mostrou que os fragmentos scFv podem ser utilizados futuramente
na detecção do BoHV-1 no desenvolvimento de testes diagnósticos.
45
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