Relatorio Final Edson

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UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO
RIO GRANDE DO SUL
DEPARTAMENTO DE ESTUDOS AGRÁRIOS
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
Edson Felipe Silva
Ijuí, RS, Brasil
2014
1
RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
Edson Felipe Silva
Relatório de Estágio Curricular Supervisionado apresentado ao Curso de
Medicina Veterinária, na Área de Clínica e Reprodução de Grandes
Animais, da Universidade Regional do Noroeste
do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ, RS), como
requisito parcial para obtenção do grau de
Médico Veterinário.
Orientadora: Profª Denize da Rosa Fraga
Ijuí, RS, Brasil
2014
2
Universidade Regional do Noroeste do Estado do
Rio Grande do Sul
Departamento de Estudos Agrários
Curso de Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova o Relatório de
Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária
RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
elaborado por
Edson Felipe Silva
como requisito parcial para obtenção do grau de
Médico Veterinário
COMISSÃO EXAMINADORA:
___________________________________
Denize da Rosa Fraga
(Orientadora)
___________________________________
Maria Andreia Inkelmann
(UNIJUÍ)
Ijuí, dezembro de 2014.
3
DEDICATÓRIA
Ao término desta importante etapa dedico
este trabalho à minha família e em
especial à minha esposa Aline Titzmann e
meu filho João Vitor que é a razão da
minha vida.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade de viver e por me dar a
sabedoria, o maior dom da vida.
Ao meu pai Airton dos Santos Silva e minha mãe Salete Terezinha Varini
Silva pelo estímulo e a confiança depositada para que fossem suplantados os
obstáculos nesta etapa. Também quero destacar aqui o esforço de vocês para que
hoje eu alcançasse o meu sonho. Muitas vezes o trabalho dobrado renunciando
muitas vezes seus sonhos e objetivos para que eu pudesse seguir o meu caminho
como estudante.
A minha vó Maria Rottili pelo amor e carinho e pela experiência de vida
transmitida. Agradeço também pelo carinho e amizade de minha irmã Vanessa
Maria Silva que sempre esteve ao meu lado nos momentos difíceis.
Agradeço também às famílias KRYSCZUN e TITZMANN pelo apoio nas horas
difíceis, a estes meu profundo agradecimento.
A minha esposa Aline Krysczun Titzmann que sempre esteve disposta a
qualquer hora que eu precisasse me ajudando e me apoiando.
Ao meu anjinho, João Vitor, pelo sorriso nas horas difíceis, pelas primeiras
palavrinhas me chamando de “Papa” e pelo amor incondicional.
A minha orientadora professora Denize da Rosa Fraga, pela orientação,
paciência, clareza, disponibilidade e dedicação em seus ensinamentos, sempre
disposta em atender as minhas dificuldades. Também agradeço pela confiança e a
humildade sempre em suas palavras.
A todos os professores pelo conhecimento transmitido e toda a equipe do
Departamento de Estudos Agrários (DEAg) pelo auxílio e orientação dada durante a
minha vida acadêmica.
Ao IRDeR, que me proporcionou a estrutura necessária para a realização das
aulas práticas, as quais foram determinantes para a formação acadêmica.
A Embrapa Clima Temperado e toda a equipe do laboratório de reprodução
que não mediram esforços para o meu aprendizado.
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A Drª Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro pela compreensão e conhecimento
transmitidos e por sempre despertar de forma animadora e constante a busca pelo
diferencial.
Aos colegas Felipe Terres de Campos, Janaína Fadrique da Silva e Karolyni
Ronhiski pela amizade e auxílio durante o estágio.
Ao Médico Veterinário Christiano Fanck Weissheimer pela experiência e
conhecimento transmitido.
A UNIJUÍ por possibilitar a estruturação de ideias e a aplicação no ambiente
acadêmico.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para esta realização.
MUITO OBRIGADO!
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RESUMO
Relatório de Estágio Curricular Supervisionado
Curso de Medicina Veterinária
Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul
RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM
MEDICINA VETERINÁRIA – ÁREA CLÍNICA E
REPRODUÇÃO DE GRANDES ANIMAIS
AUTOR: EDSON FELIPE SILVA
ORIENTADORA: DENIZE DA ROSA FRAGA
Data e Local da Defesa: Ijuí, dezembro de 2014
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado na
Embrapa Clima Temperado, localizado na BR 392, km 78, em Pelotas, Rio Grande
do Sul, Brasil. O estágio foi realizado de 01 de agosto a 04 de setembro de 2014,
perfazendo um total de 150 horas, na Área de Reprodução e Clínica Animal sob
supervisão da Médica Veterinária Drª Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro e
orientação da Médica Veterinária Msc. Denize da Rosa Fraga. O horário de
atendimento da Embrapa Clima Temperado é das 8 h às 11 h e das 13 h às 15 h de
segunda a sexta-feira. A Embrapa conta com um Laboratório de Reprodução Animal
onde são desenvolvidas pesquisas envolvidas com biotécnicas direcionadas para a
produção de embrião in vitro. No período de estágio tive a oportunidade de
acompanhar tecnologias de reprodução assistida, as quais serão mencionadas no
decorrer do relatório. A técnica de produção de embrião in vitro foi selecionada para
discussão e revisão bibliográfica. As atividades foram divididas em duas etapas:
laboratório e campo, sendo que a última englobava atividades relacionadas também
à clínica de grandes animais. Ressaltando ainda que o contato profissional com
pessoas tecnicamente qualificadas proporcionou um aprimoramento na minha
formação acadêmica. Concluo que o estágio exerceu papel fundamental na minha
formação acadêmica, bem como despertou o conhecimento de novas experiências.
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LISTA DE ABREVIATURAS
AF – Aspiração Folicular
BSA – Albumina Sérica Bovina
CCO – Complexos Cumulus Ovócito
CIV – Cultivo in vitro
CL – Corpo Lúteo
E.P.V – Espaço Perivitelíneo
FIV – Fecundação in vitro
FSH – Hormônio Folículo Estimulante
LH – Hormônio Luteinizante
MIV – Maturação in vitro
MP – Membrana Plasmática
PIV – Produção in vitro
SFB – Soro Fetal Bovino
SISPEL – Sistema de Pesquisa e Desenvolvimento em Pecuária Leiteira
SOF – Fluído Sintético do Oviduto
US – Ultrassonografia
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
–
Figura 2
–
Figura 3
–
Figura 4
–
Figura 5
–
Figura 6
Figura 7
–
–
Figura 8
–
Figura 9
–
Figura 10
–
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil........................................................................................
Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil......................
Bomba de vácuo para realização da AF utilizada durante
Estágio no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa
Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil............
Punção folicular realizada durante Estágio no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas,
Rio Grande do Sul, Brasil.........................................................
Seleção dos ovócitos realizada durante Estágio no
Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil......................
Preparação da placa para MIV com as microgotas de meio
de maturação no Laboratório de Reprodução Animal,
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil........................................................................................
Estufa de cultivo de embriões do Laboratório de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do
Sul, Brasil.................................................................................
Manipulação de rotina da PIV efetuada na capela de fluxo
laminar do Laboratório de Reprodução Animal Embrapa
Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil............
Avaliação da concentração espermática por câmera de
Neubauer no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa
Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil............
Avaliação da clivagem de embrião bovino no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas,
Rio Grande do Sul, Brasil.........................................................
13
13
20
21
22
24
24
25
28
29
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
– Atividades laboratoriais desenvolvidas durante o Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária na
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa
Clima Temperado), Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no
período de 01 de agosto a 04 de setembro de
2014.......................................................................................... 14
– Atividades clínicas e reprodutivas acompanhadas durante o
Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária
na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa
Clima Temperado), Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no
período de 01 de agosto a 04 de setembro de
2014.....................................................................
15
– Resumo dos cursos e palestra acompanhados durante o
Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária
na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa
Clima Temperado), Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no
período de 01 de agosto a 04 de setembro de
2014.......................................................................................... 16
10
LISTA DE ANEXOS
Anexo A
Anexo B
Anexo C
Anexo D
Anexo E
Anexo F
– Certificado do Curso de Ultrassonografia em Bovinos
realizado durante período de Estágio Supervisionado em
Medicina Veterinária.................................................................
– Certificado de participação no V Encontro de Iniciação
Científica e Pós-graduação da Embrapa Clima Temperado
durante realização do Estágio Supervisionado em Medicina
Veterinária................................................................................
– Certificado do Curso de Reciclagem de Inseminadores
durante Estágio Supervisionado em Medicina Veterinária.......
– Certificado de Inseminador Profissional obtido no XII Curso
de Reciclagem em Inseminação Artificial de Bovinos..............
– Ficha da produção in vitro de embrião bovino..........................
– Atestado...................................................................................
36
37
38
39
40
42
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................... 12
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ...................................................... 14
3 DISCUSSÃO ...................................................................................... 18
3.1 Coleta de ovário ................................................................................................. 19
3.2 Procura e seleção de ovócitos .......................................................................... 22
3.3 Maturação in vitro .............................................................................................. 23
3.4 Fecundação in vitro ........................................................................................... 25
3.5 Preparo do sêmen .............................................................................................. 26
3.6 Seleção espermática .......................................................................................... 26
3.7 Avaliação da concentração espermática ......................................................... 27
3.8 Cultivo de embriões ........................................................................................... 28
3.9 Clivagem ............................................................................................................. 29
3.10 Avaliação do desenvolvimento embrionário ................................................. 30
4 CONCLUSÃO .................................................................................... 32
5 REFERÊNCIAS .................................................................................. 33
ANEXOS ............................................................................................... 35
12
1 INTRODUÇÃO
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária foi realizado no
período de 01 de agosto a 05 de setembro de 2014, perfazendo 150 horas, este foi
realizado na Embrapa Clima Temperado (Figura 1) na área de Reprodução e Clínica
Animal, tendo como supervisora a Médica Veterinária Drª Lígia Margareth Cantarelli
Pegoraro e como orientadora a Médica Veterinária Msc. Denize da Rosa Fraga.
A Embrapa Clima Temperado está localizada na BR 392, km 78, em Pelotas,
Rio Grande do Sul. O Laboratório de Reprodução Animal (Figura 2) foi inaugurado
em 06 de novembro de 1998 e atua no desenvolvimento e adaptação das
tecnologias de reprodução assistida para os sistemas de produção animal. Suas
instalações estão localizadas na Estação Experimental Terras Baixas da Embrapa
Clima Temperado. As ações de pesquisa e desenvolvimento são desenvolvidas em
parceria com a Faculdade de Medicina Veterinária da UFPel e Emater RS.
O SISPEL da Embrapa Clima Temperado possui um rebanho de 150 animais
da raça Jersey, sendo destas atualmente 50 em lactação. Esses animais
apresentam uma produção média de 19 litros por vaca/dia. No SISPEL são
desenvolvidas as atividades de campo e principalmente manejo de ordenha,
reprodutivo e de pastagens.
Entre as principais atividades atualmente desenvolvidas na área da
reprodução animal da Embrapa Clima Temperado destacam-se as pesquisas
relacionadas à produção de embrião in vitro e também as atividades de capacitação
de técnicos que atuam na área.
O laboratório de reprodução é dividido em escritório, sala de procedimentos
laboratoriais e sala de cultivo. A equipe de funcionários conta com um técnico em
química e uma Médica Veterinária, além de estagiários de mestrado, doutorado e
graduação que auxiliam nas atividades de rotina.
O estágio na Embrapa Clima Temperado teve como intuito principal
maximizar meus conhecimentos na área de reprodução animal e clínica veterinária,
aliando a prática com a teoria ministrada no decorrer da graduação.
13
Figura 1 – Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Figura 2 – Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
14
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
As atividades realizadas no Estágio Curricular Supervisionado em Medicina
Veterinária foram direcionadas em um primeiro momento para a produção de
embriões in vitro compreendendo basicamente as três fases: MIV, FIV e CIV.
Também foram realizadas atividades ligadas à manutenção do laboratório como a
esterilização de materiais e equipamentos. A parte clínica que é um processo
indispensável quando se menciona reprodução, também foi realizada sob orientação
do
Médico
Veterinário
da
Embrapa
Clima
Temperado,
Christiano
Fanck
Weissheimer, que é responsável pelo SISPEL.
No Laboratório de Reprodução Animal também foram desenvolvidas
atividades ligadas à manutenção do mesmo, tais como a limpeza e esterilização de
materiais utilizados na técnica de PIV. Sendo possível acompanhar os cursos
disponibilizados pela Embrapa, como o de Ultrassonografia e Reciclagem em
Inseminação Artificial de Bovinos.
Os procedimentos laboratoriais e clínicos serão descritos em forma de tabelas
e gráficos distribuídos conforme área do conhecimento veterinário no transcorrer
deste relatório.
As atividades realizadas no decorrer do estágio curricular no laboratório de
produção de embriões in vitro estão descritas na Tabela 1.
Tabela 1 – Atividades laboratoriais desenvolvidas durante o Estágio Curricular
Supervisionado em Medicina Veterinária na Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (Embrapa Clima Temperado), Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil, no
período de 01 de agosto a 04 de setembro de 2014
Atividades Laboratoriais
Atividades complementares de laboratório
Aspiração folicular in vitro de bovinos
Preparação de meio de cultivo de bovinos
Preparação de solução salina para transporte
de ovários
Aspiração in vivo guiado por US
Avaliação de clivagem embrião bovino
Avaliação de clivagem embrião ovino
Cultivo in vitro bovinos
Número de Rotinas
4
3
3
3
%
10,26
7,69
7,69
7,69
2
2
2
2
5,13
5,13
5,13
5,13
15
Atividades Laboratoriais
Cultivo in vitro ovinos
Concentração espermática por câmera de
Neubauer
Criopreservação pelo método de vitrificação
Bovinos
Fecundação in vitro bovinos
Maturação in vitro bovinos
Preparação de meio de maturação bovinos
Aspiração folicular in vitro bovinos
Criopreservação pelo método de vitrificação
Ovinos
Fecundação in vitro ovinos
Maturação in vitro ovinos
Preparação de meio de cultivo ovinos
Preparação de meio de maturação ovinos
TOTAL
Número de Rotinas
2
2
%
5,13
5,13
2
5,13
2
2
2
1
1
5,13
5,13
5,13
2,56
2,56
1
1
1
1
39
2,56
2,56
2,56
2,56
100
Os atendimentos clínicos acompanhados durante o Estágio Supervisionado
em Medicina Veterinária estão descritos na Tabela 2.
Tabela 2 – Resumo das atividades clínicas e reprodutivas acompanhadas durante o
Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária na Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (Embrapa Clima Temperado), Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil, no período de 01 de agosto a 04 de setembro de 2014
Diagnósticos
Diagnóstico de gestação
Mucometra
Mastite clínica
Cisto folicular
Cisto luteínico
Cetose
TOTAL
Nº
30
5
3
3
2
1
44
%
68,18
11,36
6,82
6,82
4,55
2,27
100,00
Os cursos e palestras acompanhados durante o Estágio Supervisionado em
Medicina Veterinária constam na Tabela 3.
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Tabela 3 – Resumo dos cursos e palestra acompanhados durante o Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária na Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária (Embrapa Clima Temperado), Pelotas, Rio Grande do Sul,
Brasil, no período de 01 de agosto a 04 de setembro de 2014
Atividades
Curso de Reciclagem de Inseminadores
Curso de Ultrassonografia
Palestra sobre Produção in vitro de Embrião
Reunião de estagiários
V Encontro de Iniciação Científica e Pós-Graduação da Embrapa
TOTAL
Nº
1
1
1
1
1
5
%
20
20
20
20
20
100
Também foram acompanhados três projetos de pesquisa que estão em
andamento como o “uso do monometil éter na solução de vitrificação de embriões
bovinos produzidos in vitro” que é um experimento de doutorado da aluna Elisangela
Mirapalheta Madeira do Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da
UFPel.
O “efeito da paraoxanase-1 na maturação ovocitária sobre o desenvolvimento
e expressão dos genes BAX, BCL E MnSOD de embriões bovinos produzidos in
vitro” que faz parte do experimento de mestrado do aluno João Alvarado Rincón do
Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFPel.
Outro projeto é o “desenvolvimento in vitro de embriões ovinos com sêmen
fresco e congelado usando o método de seleção espermática mini Percoll®” da
graduanda em Medicina Veterinária da UFPel Janaína Fadrique da Silva.
Quanto às medidas de limpeza e esterilização de materiais no Laboratório de
Reprodução Animal da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária sempre eram
seguidas normas básicas de segurança sendo que a limpeza dos materiais devia ser
procedida de acordo com sua categoria. O material utilizado na produção de
embriões deve ser cuidadosamente limpo para evitar a presença de material tóxico
ou de contaminantes que possam ser incorporados aos meios de cultivo e prejudicar
o desenvolvimento embrionário.
Para entrar no laboratório colocava-se avental e chinelo e lavam-se as mãos
com sabonete desinfetante. Na sala de cultivo vestíamos um avental especifico para
a área de cultivo de cor azul claro, touca e máscara cirúrgica e para trabalhar no
fluxo laminar sempre usávamos solução antisséptica nas mãos. O material de FIV
17
devia ser preparado na sexta-feira juntamente com a limpeza das bancadas com
álcool 70%. O chão também era limpo com desinfetante a cada sete dias,
começando pela sala de cultivo.
18
3 DISCUSSÃO
A PIV de embriões é uma importante biotécnica de reprodução associada à
maximização
da
produtividade,
compreendendo
basicamente
três
etapas
desenvolvidas em laboratório: a MIV que compreende as técnicas de maturação, a
FIV que é a fecundação e a CIV que é estabelecida como o cultivo até os estágios
de mórula e blastocisto quando os embriões poderão ser transferidos ou
criopreservados (VAGARO et al., 2008).
Para Gouveia (2011) a PIV não envolve apenas a MIV, FIV e CIV, mas
também a avaliação ginecológica e a sincronização das doadoras e receptoras, bem
como diagnóstico precoce de gestação identificando perdas embrionárias e
sexagem fetal por US.
Inúmeros fatores podem influenciar nos resultados da PIV, entre eles
podemos citar diferentes metodologias de maturação, cultivo, capacitação
espermática, sêmen, características inerentes da doadora e do touro, entre outros
(CAMARGO et al., 2006).
Para Scanavez et al. (2013) a grande vantagem da PIV é o aumento
significativo no número de descendentes produzidos por fêmea, também pode-se
citar o aproveitamento de fêmeas com patologia no trato reprodutivo que limitem a
sua atividade de produzir naturalmente, o melhoramento genético acelerado
basicamente pela utilização de gametas de animais superiores e a otimização de
importação e exportação do material genético.
Com o emprego da PIV podem ser obtidas mais de 30 crias/vaca/ano,
entretanto ainda são necessárias condições que propiciem o aumento da eficiência
principalmente nas taxas de mórulas e blastocisto e redução de custos, ressaltando
o aperfeiçoamento da técnica de criopreservação (FERREIRA, 2010).
De acordo com Gonçalves et al. (2007) entre as limitações da PIV na
produção de embriões bovinos pode-se destacar a inconsistência dos resultados
referentes às taxas de mórulas e blastocistos, o custo inicial para construção da
infraestrutura e o tempo gasto para executar a rotina de produção de embriões, que
vai desde a punção folicular in vivo até a PIV de embriões. A grande limitação é a
sua baixa eficiência, ao redor de 40% dos ovócitos inseminados atingem o estágio
19
de blastocisto. Isto se deve ao grande número de fatores que influenciam o sucesso
da técnica (que começa na dinâmica folicular das doadoras até a obtenção de
embriões viáveis à transferência e/ou criopreservação).
Basicamente os sistemas de PIV utilizam duas soluções definidas como a
base para todas as etapas de produção que é o TCM-199 e/ou SOF, portanto, os
mais variados protocolos podem ser realizados em laboratório como a composição
própria dos hormônios, sais, aminoácidos e atmosferas adequando sempre as
condições subjetivas de trabalho, desde a AF até consequente transferência do
embrião produzido (BRANDÃO, 2006).
3.1 Coleta de ovário
Para a produção de embrião bovino in vitro os ovócitos podem ser obtidos de
ovários de matadouros ou de animais vivos. Segundo Martinez e Souza (2007) após
o abate das fêmeas os ovários podem ser coletados e transportados ao laboratório,
em solução PBS, após a chegada no laboratório devem ser puncionados os folículos
que medem entre 2-8 mm de diâmetro. Basicamente existem duas formas de
aspiração: in vivo, quando usamos a AF na doadora viva através do US; e após o
abate das fêmeas ou morte acidental quando são recuperados os ovários e levados
ao laboratório para a AF após a morte.
Durante o estágio os ovários utilizados na técnica da PIV eram provenientes
de abatedouros e transportados em solução salina de 0,9% de NaCl suplementada
com antibiótico e mantidos aquecidos a uma temperatura de 30 a 32ºC. O antibiótico
de eleição para esses casos foi a gentamicina. No laboratório os ovários eram
lavados com solução salina e retirados os tecidos adjacentes, dessa forma
deixando-os limpos para a AF. Na sala de punção os ovários eram colocados em
vidros estéreis que ficavam em banho-maria até o fim da aspiração. É importante o
controle da temperatura que não deve ficar abaixo de 30 a 32ºC. Gonçalves et al.
(2007) definem que a obtenção dos ovários e o início da colheita não parece afetar a
viabilidade dos ovócitos quando realizada no período de até 3 horas.
20
Durante o estágio os ovários eram puncionados com agulha afiada 19G e
sempre realizando a aspiração pela parede do ovário e não diretamente no folículo.
É importante ressaltar que a recuperação dos ovócitos depende basicamente da
prática do técnico, condição fisiológica do animal e seus anexos e equipamentos
utilizados na técnica. De acordo com Oba e Camargos (2011) há uma variação
extrema na qualidade e no número de ovócitos recuperados, dependendo do tipo de
animal, localização geográfica e condição corporal entre outros. O sistema de
punção é composto de uma bomba de vácuo (Figura 3) que deve ser ligado com no
mínimo 1 hora de antecedência para aquecimento dos tubos, sendo interligados a
duas mangueiras de silicone, tubo cônico de 15 mL e escalpe de 19G. A pressão da
bomba de vácuo deve ser sempre ajustada para aspirar um volume de 10 mL de
líquido folicular por minuto para não comprometer a quantidade, a qualidade e a
posterior viabilidade dos ovócitos aspirados.
Figura 3 – Bomba de vácuo para realização da AF utilizada durante
Estágio no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
De acordo com Rumpf (2007) a aspiração de ovócitos imaturos por punções
foliculares, associada à maturação e fecundação in vitro dos mesmos e ao CIV dos
embriões, permite que sejam produzidas, em média, 36 crias por ano de uma única
fêmea. Domingues et al. (2014) concluíram que o número de ovócitos viáveis é de
extrema importância se tratando de PIV de embrião bovino, pois está diretamente
21
correlacionada com a quantidade de folículos presentes no ovário no momento da
AF.
Quando terminada a punção folicular no transcorrer do estágio (Figura 4) era
possível notar depois de 10 minutos a sedimentação dos ovócitos nos tubos Falcon®
de 15 mL, sendo denominado este sedimento de pellet. Depois disso com o auxílio
de uma pipeta de Pasteur coloca-se este pellet em uma placa de Petri, contendo
meio de lavagem à base de sais de Hanks, soro fetal bovino e antibióticos e, por
último, os ovócitos são colocados em placas Nunc®, de quatro poços, com meio para
maturação.
Figura 4 – Punção folicular realizada durante Estágio no Laboratório de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
De acordo com Hafez e Hafez (2004) a obtenção de ovócitos atualmente,
pode ser realizada através da coleta de ovários provenientes de frigoríficos, sendo
que os ovócitos podem ser coletados por dissecação que permite o isolamento de
folículos individuais, por fatiamento de tecidos ovarianos, fornecendo um maior
número de ovócitos ou aspiração que é a técnica mais eficiente em termos de tempo
para obtenção de ovócitos.
De acordo com Bols et al. (2005) existem algumas diferenças básicas entre a
recuperação de ovócitos in vivo e post-mortem, entre essas diferenças estão a
manipulação ovariana que, em doadoras vivas, é realizada através da manipulação
transretal, para que seja possível visualizar o folículo por meio de imagem
22
laparoscópica ou ultrassonográfica, já em animais provenientes de abatedouros a
manipulação ovariana é feita de forma direta, onde um folículo específico pode ser
puncionado por meio de visualização direta, portanto, o que difere os dois métodos
está na pressão do vácuo, que é diferente in vivo e post-mortem, onde a pressão
deve ser ajustada para cada aspiração especificamente.
3.2 Procura e seleção de ovócitos
Para Gonçalves et al. (2007) a placa de Petri deve conter no máximo 2 a 4 mL
de líquido folicular, pois o excesso atrapalha a visualização e o isolamento dos CCO.
Através de estereomicroscópico são realizadas a busca e a seleção dos
ovócitos (Figura 5). Após os mesmos eram transferidos com auxílio de uma pipeta
de vidro para outra placa contendo 2 a 3 mL de meio de lavagem, avaliando
principalmente a uniformidade do citoplasma e a quantidade e aparência das células
dos cúmulos.
Figura 5 – Seleção dos ovócitos realizada durante Estágio no Laboratório de
Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
De acordo com Stojkovic et al. (1999) após recuperados, os ovócitos são
selecionados avaliando principalmente a morfologia que deve apresentar um
23
citoplasma homogêneo ou com poucas granulações e células do cúmulos com três
ou mais camadas ainda compactadas.
Quando terminada a lavagem os ovócitos são transferidos para a gota de
maturação. Geralmente o meio de maturação é composto de meio TCM-199,
adicionado de hormônios gonadotrópicos (LH, FSH), uma fonte de proteína (soro
fetal ou albumina) e antibióticos (penicilina, estreptomicina, gentamicina, etc.), sob o
óleo mineral ou de silicone, sendo que juntos em concentrações e combinações
diferentes estabelecem os princípios de cada sistema (BRANDÃO, 2006).
Ressaltando que todos os requisitos de esterilização devem ser seguidos, no intuito
de evitar contaminações no interior da placa.
É importante salientar que cada laboratório adota formulações e posturas
diferentes quanto ao uso dos meios de cultivo na tentativa de aperfeiçoar a técnica.
São inúmeras as variáveis adotadas dentro do processo de produção de embrião in
vitro e vai depender da acurácia e rotina laboratorial.
3.3 Maturação in vitro
De acordo com Gonçalves et al. (2007) o material para isolamento e
maturação dos ovócitos deve ser preparado por no mínimo 2 horas da previsão de
obtenção do primeiro tubo contendo os ovócitos, placas de 60 mm devem ser
identificadas e preparadas com quatro gotas de 200 µl de meio de maturação,
cobertas com óleo.
Nessa etapa são preparadas as gotas com no mínimo 2 horas de
antecedência e cobertas com óleo mineral para não evaporar a gota e manutenção
das condições de pH. Os ovócitos irão permanecer nesse meio de maturação
(Figura 6) por 22-24 horas, a 39ºC, em estufa com 5% de gás carbônico. É
imprescindível, portanto, o uso de uma estufa (Figura 7) para acondicionar os meios
de PIV e toda rotina de PIV.
Gonçalves et al. (2007) definem basicamente que os meios de maturação são
compostos na maioria por bicarbonato de sódio, piruvato de sódio e hormônios entre
outros. Também é de extrema importância a capela de fluxo laminar que é
necessária para a manipulação de meios e placas de cultivo, deste modo evitando
24
possíveis contaminações. No estágio sempre foi utilizado a capela (Figura 8) para
qualquer procedimento envolvendo os meios de produção de embrião in vitro.
Figura 6 – Preparação da placa para MIV com as microgotas de meio de
maturação no Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
Figura 7 – Estufa de cultivo de embriões do Laboratório de Reprodução Animal,
Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
25
Figura 8 – Manipulação de rotina da PIV efetuada na capela de fluxo
laminar do Laboratório de Reprodução Animal Embrapa Clima
Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
De acordo com Martinez e Souza (2007) a maturação envolve transformações
no núcleo e citoplasma do ovócito, sendo que o ovócito imaturo (ovócito primário) se
encontra parado no estágio de prófase da primeira divisão meiótica, sendo que a
maturação nuclear tem início através da retomada da meiose pela lise do envelope
da vesícula germinal atingindo o estágio de metáfase I, 12 horas após o início do
cultivo, sendo que a completa maturação ocorre entre 20 a 24 horas e é marcada
pela expulsão do primeiro corpúsculo polar e formação da segunda placa metafásica
que podemos chamar de ovócito maturo. Durante o estágio sempre foi preconizado
proceder de forma que folículos maiores de 8 mm não sejam aspirados porque os
ovócitos encontram-se maturos o que não é desejável na execução da técnica de
PIV.
3.4 Fecundação in vitro
Segundo Carvalho (2009) a FIV depende da qualidade dos ovócitos e dos
espermatozoides. Portanto, avaliar vigor e motilidade dos espermatozoides, bem
como concentração espermática compreendem passos essenciais que implicam no
sucesso da técnica.
26
A fecundação in vitro é caracterizada pela fusão do espermatozoide com o
ovócito, após ocorre a exocitose dos grânulos corticais e a retomada da meiose com
extrusão do segundo corpúsculo polar e a formação do pró-núcleo feminino (LOIOLA
et al., 2014).
A fecundação in vitro é estabelecida como o dia 0. Apos às 22 horas de
maturação os ovócitos são lavados em meio de FIV final e transferidos para as gotas
de FIV durante a preparação do sêmen. É de suma importância que a transferência
dos ovócitos seja realizada o mais breve possível para a placa de FIV, deste modo,
evitando mudanças bruscas de pH. O tempo que os ovócitos ficam com os
espermatozoides é de 22-24 horas a 39ºC em estufa de 5% de CO2.
3.5 Preparo do sêmen
No estágio, a palheta contendo sêmen era descongelada em banho-maria a
uma temperatura de 35ºC, por 30 segundos, tomando todos os cuidados para que o
sêmen não sofra nenhuma alteração na sua estrutura ,principalmente quanto a
temperatura e secagem da palheta. Posteriormente era retirada uma alíquota para
avaliação da motilidade e vigor. Para Holt (2000) a movimentação dos
espermatozoides é fator determinante para a fertilização, deste modo havendo uma
associação entre a ausência do movimento e os quadros de infertilidade.
3.6 Seleção espermática
Diversas técnicas de preparação de sêmen são usualmente utilizadas na PIV
de embriões bovinos no intuito de melhorar a qualidade espermática após o
descongelamento, dentre estas técnicas, a centrifugação em gradiente de Percoll
tem sido a mais utilizada (MACHADO, 2009). Na rotina do Laboratório da Empresa
Brasileira Agropecuária se opta pela técnica em gradiente Percoll em mini volumes.
Zúccari et al. (2008) concluem que o gradiente de Percoll foi eficaz na seleção
de uma maior população de células móveis, com membranas plasmática e
27
acrossomal íntegras, sem alteração na condensação da cromatina nuclear, no
entanto, a capacitação seguida da reação acrossomal são requisitos fundamentais
quando se trata de fecundação.
O processo usual do gradiente Percoll consiste no aumento da densidade no
sentido da camada superior para a inferior, deste modo, a amostra de sêmen é
depositada sobre as camadas e centrifugada para obtenção de pellet, contendo
espermatozoide selecionado (MACHADO, 2009). Na prática laboratorial pode-se
notar um acúmulo de sedimento na base das alíquotas que é designado “pellet”, o
que indica que os espermatozoides com melhor estrutura e qualidade ficam
depositados na parte inferior das mesmas. Sempre é adaptada a concentração de 1
x 106 espermatozoides/mL de meio FIV junto aos ovócitos. Gonçalves et al. (2007)
descrevem a concentração final de 2 x 106 espermatozoides/mL como sendo a mais
utilizada na FIV.
Segundo Palma (2001) o gradiente de Percoll corresponde a maior parte dos
quesitos de uma técnica eficaz para seleção espermática e, além disso, resulta em
frações límpidas, com espermatozoides de alta motilidade, não causa lesões na
cromatina, elimina leucócitos e proporciona uma alta taxa de recuperação de
gametas, mesmo quando amostras com baixa concentração espermática são
usadas.
3.7 Avaliação da concentração espermática
No estágio, para a avaliação do sêmen o laboratório preconiza a análise dos
parâmetros
espermáticos,
entre
eles
podemos
citar
a
motilidade,
vigor,
concentração. Através da câmera de Neubauer (Figura 9) é possível avaliar a
concentração dos espermatozoides. A motilidade e vigor podem ser avaliados
através de microscópico ótico.
28
Figura 9 – Avaliação da concentração espermática por câmera de Neubauer no
Laboratório de Reprodução Animal, Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
A concentração espermática é calculada pela seguinte equação: Ci X Vi = Cf
X Vf sendo que: Ci (concentração encontrada na câmara de Neubauer); Vi (dose
inseminante); Cf (1 x 106 SPTZ/mL); e Vf (volume da gota de fecundação).
3.8 Cultivo de embriões
Depois
de
decorridas
18-20
horas
do
co-cultivo
dos
ovócitos
e
espermatozoides os zigotos são retirados do meio FIV e submetidos ao
desnudamento e retirada de espermatozoides. Na rotina do laboratório essa etapa
era efetuada por sucessivas pipetagens, com posterior lavagem em meio MIV. O
principal objetivo é a retirada das células do CCO e os espermatozoides ainda
aderidos à zona pelúcida. Após essas etapas os prováveis zigotos são transferidos à
placa de cultivo antecipadamente preparada onde devem ficar em estufa a 39ºC
acondicionados em bags.com 5% CO2 + 5% O2 + 90% N2 durante oito dias.
De acordo com Palma (2001) a fonte de energia dos embriões durante seu
desenvolvimento in vitro baseia-se na fosforilação oxidativa do piruvato e
aminoácidos e da glicose. Desta forma, os aminoácidos são nutrientes essenciais
usados nos meios de cultivo que também atuam como fonte de energia, reguladores
de pH e precursores de proteínas e ácidos nucléicos. A água também é de
fundamental importância, pois constitui quase 99% do conteúdo do meio de cultivo.
29
Durante o período de pré-implantação embrionária ocorrem alguns eventos
como iniciação e continuação da clivagem, ativação do genoma embrionário,
agregação e compactação de blastômeros, diferenciação de trofoblasto e do
embrioblasto, formação e expansão do blastocele e rompimento da zona pelúcida.
Deste modo, no cultivo embrionário é necessário o uso de meio simples que suporte
a nutrição celular e o desenvolvimento durante a fase de pré-implantação
embrionária, baseando-se assim em fluidos do útero e do oviduto durante o início da
gestação (GULART, 2009).
Na rotina laboratorial podemos perceber que qualquer erro na quantidade ou
qualidade dos nutrientes do meio pode ser crucial, comprometendo todo um trabalho
científico.
3.9 Clivagem
Segundo Gonçalves et al. (2007) na clivagem (Figura 10) encontram-se
embriões com duas, quatro e oito células, sendo que os que possuem duas células
tem menos probabilidade de alcançar o estádio de blastocisto, lembrando que
durante avaliação da clivagem retira-se as estruturas não clivadas da gota. Isto não
era realizado na rotina acompanhada durante o estágio.
Figura 10 – Avaliação da clivagem de embrião bovino no Laboratório de Reprodução
Animal, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil
30
Essa etapa é realizada 48 horas após a inseminação (dia 2), em alguns casos
as estruturas são descoladas do fundo da placa. São imprescindíveis os cuidados na
manipulação para que não sofra mudanças de pH referente ao meio e lesões
celulares implicando no desenvolvimento embrionário.
De acordo com as normas da Sociedade Brasileira de Tecnologia de
Embriões (SBTE, 2014) os embriões podem ser classificados a partir de seu
desenvolvimento embrionário, sendo, no entanto, divididos em sete categorias:
Mo – Mórula: morfologicamente apresentam-se como um aglomerado de
células com separação nítida entre os blastômeros, delineando praticamente a
totalidade do E.P.V.
Mc – Mórula Compacta: os blastômeros estão agrupados entre si formando
uma massa compacta e ocupam 60-70% do E.P.V.
Bi – Blastocisto Inicial: é a fase da formação da blastocele e ocorre neste
momento o início da diferenciação entre trofoblasto e botão embrionário. O embrião
é responsável por ocupar de 70 a 80% do E.P.V.
Bl – Blastocisto: neste estágio é evidente a diferenciação entre as células
trofoblasto e do botão embrionário. As células do botão embrionário estão
condensadas e a blastocele é proeminente, sendo que o embrião ocupa a totalidade
do E.P.V.
Bx – Blastocisto Expandido: a membrana pelúcida diminui 1/3 de sua
espessura, enquanto o embrião aumenta 1,5x o seu diâmetro.
Bn – Blastocisto em Eclosão: o embrião está começando o processo de saída
da zona pelúcida.
Be – Blastocisto Eclodido: o embrião está totalmente livre da membrana
pelúcida, sendo ainda nítido a presença da blastocele.
3.10 Avaliação do desenvolvimento embrionário
Os números de mórulas, blastocistos, blastocistos expandidos e blastocistos
eclodidos são anotados durante o sétimo e décimo dias após a fecundação, deste
modo recomenda-se duas avaliações, uma no sétimo e outra no nono dia no intuito
de acompanhar o desenvolvimento embrionário. Portanto, o índice de blastocisto
31
expandido e eclodido é o principal indício para determinar a eficácia do sistema de
maturação do ovócito, fecundação e desenvolvimento embrionário em bovinos
(GONÇALVES et al., 2007).
Desta forma, no dia 7 os embriões bovinos são destinados à transferência
para receptoras síncronas ou ao processo de criopreservação.
32
4 CONCLUSÃO
O Estágio Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária é o método pelo
qual o aluno é capaz de aliar a teoria ministrada na sala de aula com a prática. A
experiência e a instigação do preenchimento das lacunas do conhecimento foram
parte fundamental nesta etapa. O senso de responsabilidade com a profissão aliado
ao bem-estar animal acima de tudo foram os princípios norteadores durante o
estágio.
A produção de embrião in vitro é uma técnica que exige o comprometimento
de quem a realiza exigindo tempo disponível e conhecimento específico. O ambiente
enriquecedor à pesquisa proporcionado pela Embrapa Clima Temperado juntamente
com a Universidade Federal de Pelotas foram essenciais, perfazendo através dos
profissionais as mais distintas áreas do conhecimento.
Infere-se, portanto, que a realização do estágio na área de Clínica e
Reprodução de Grandes Animais possibilitou a inovação e aproximação com os
futuros colegas de profissão.
33
5 REFERÊNCIAS
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35
ANEXOS
36
Anexo A – Certificado do Curso de Ultrassonografia em Bovinos realizado
durante período de Estágio Supervisionado em Medicina Veterinária
37
Anexo B – Certificado de participação no V Encontro de Iniciação Científica e
Pós-graduação da Embrapa Clima Temperado durante realização do Estágio
Supervisionado em Medicina Veterinária
38
Anexo C – Certificado do Curso de Reciclagem de Inseminadores durante
Estágio Supervisionado em Medicina Veterinária
39
Anexo D – Certificado de Inseminador Profissional obtido no XII Curso de
Reciclagem em Inseminação Artificial de Bovinos
40
Anexo E – Ficha da produção in vitro de embrião bovino
41
42
Anexo F – Atestado