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CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGIA MACROSCÓPICA E MICROSCÓPICA DO
FÍGADO DE EMBRIÕES BOVINOS
Rafael Garcia Karam, Celina Almeida Furlanetto Mançanares
Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos - UNIfeob
[email protected]
Resumo
Diversas tecnologias estão sendo aplicada à reprodução bovina, como transferência de embrião, inseminação
artificial e clonagem, isso se deve pela grande perda de embriões bovinos por anomalias no desenvolvimento
e/ou aberrações na placentação. Em bovinos a maior parte dos órgãos é formada entre a 2ª e a 6ª semana
de gestação, entre eles está o trato digestivo, os pulmões, o fígado e o pâncreas que se desenvolvem do
intestino primitivo. O fígado é a maior glândula isolada do corpo, correspondendo por 2-5% do peso corpóreo
do animal, que possui diversas funções metabólicas desempenhadas por dois tipos celulares, os hepatócitos
e as células de Kupffer. Doenças envolvendo órgãos endodermicamente derivados, particularmente pulmões,
fígado e pâncreas, incluindo fibrose cística, hepatite crônica e diabetes respectivamente, afetam milhares de
pessoas no mundo. Uma via de tratamento para esses pacientes é estimular a regeneração do tecido atingido
in vivo ou gerar tecido de substituição in vitro. Este projeto tem como objetivo avaliar morfologicamente o
desenvolvimento embrionário do fígado de embriões bovino e futuramente marcar as células pluripotentes
existentes neste órgão, através do antígeno de proliferação celular PCNA, visando futuro isolamento e cultivo
“in vitro” destas células e para utilização em terapia celular. Essas linhagens além de promover possíveis
tratamentos para doenças hepáticas, também têm importância nas pesquisas “in vitro”, visto que o fígado é o
principal órgão de destoxificação do corpo. Nos resultados observados até o momento podemos concluir que
o fígado estava localizado centralmente ocupando grande parte da cavidade abdominal, caudal ao diafragma,
coração e o pulmão e cranial ao duodeno, pâncreas e estômago.
Palavras Chaves: Bovino, Fígado, Embriões
Abstract
Several technologies are being applied to bovine reproduction, such as embryo transfer, artificial insemination
and cloning, this is due to the great loss of bovine embryos by abnormalities in the development and / or
aberrations in placentation. In cattle most organs is formed between the 2nd and the 6th week of pregnancy
among them is the digestive tract, the lungs, the liver and pancreas which develop from the primitive gut. The
liver is the single largest gland in the body, accounting for 2-5% of the body weight of the animal, which has
several metabolic functions performed by two cell types, hepatocytes and Kupffer cells. Diseases involving
derivatives endodermicamente organs, particularly the lungs, liver and pancreas, including cystic fibrosis,
chronic hepatitis and diabetes, respectively, affect millions of people worldwide. A course of treatment for these
patients is to stimulate tissue regeneration achieved in vivo or in vitro to generate replacement tissue. This
project aims to evaluate morphologically embryonic development of liver bovine embryos and future mark the
existing stem cells in the body through cell proliferation antigen PCNA, aiming future isolation and cultivation
"in vitro" and these cells for use in cell therapy . These strains and promote possible treatments for liver
diseases, are also important in research "in vitro", since the liver is the main organ of detoxification of the body.
In the results obtained so far we conclude that liver was located centrally occupying a large portion of the
abdominal cavity, the flow diaphragm, heart and lung and cranial to the duodenum, pancreas and stomach.
Key words: Bovine, Liver, Embryo
Introdução
A embriologia estuda o desenvolvimento dos organismos, proporcionando à anatomia uma
perspectiva dinâmica, pois ao estudar os estágios embrionários e fetais sobre um padrão simplificado,
podemos compreender com maior facilidade a complexa anatomia de um indivíduo adulto (NODEN;
LAHUNTA, 1990).
Nos bovinos, a maioria dos órgãos e partes do corpo são formados entre a 2ª e a 6ª semana de
gestação. Durante este período, os pulmões, o fígado e o pâncreas se desenvolvem do intestino primitivo,
sendo estabelecidos os primórdios do sistema muscular, esquelético, nervoso e urogenital. No 21º dia de
gestação o coração começa a bater e inicia-se a circulação (HAFEZ, 1964).
No decorrer do desenvolvimento, os componentes epiteliais do tubo digestivo são derivados do
endoderma que reveste o intestino primitivo e os componentes conjuntivos e musculares, do mesênquima
adjacente, o mesmo ocorrendo com o epitélio – mesotélio que reveste a serosa quando está presente
(MOORE; PERSAUD, 2004).
O fígado maior glândula do organismo animal, foco de nossa pesquisa, é responsável por diversas
funções, como a produção da bile, metabolização das proteínas, carboidratos e gorduras. Localiza-se na parte
mais cranial do abdômen e imediatamente atrás do diafragma. O pâncreas, com funções exócrinas e
endócrinas, relaciona-se intimamente com duodeno na parte dorsal da cavidade abdominal (DYCE, 1997).
Objetivos
Esta pesquisa tem como objetivo, caracterizar morfologicamente o fígado de embriões e fetos bovinos
e localizar os sítios de células pluripotentes em diferentes idades através do antígeno PCNA.
Materiais e Métodos
Para a realização desta pesquisa foram utilizados até o momento 25 embriões e fetos bovinos em
diferentes idades gestacionais (a partir de 24 dias de gestação) provenientes de úteros gestantes de animais
abatidos em Frigoríferos na cidade de Poços de Caldas, MG.
O presente estudo foi realizado no Laboratório de Pesquisas em Ciências Morfológicas do Centro
Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos – São João da Boa Vista – SP.
Os úteros foram dissecados e em cada corno uterino foi realizada uma incisão no sentido craniocaudal
da cérvix uterina em direção ao corno gestante, onde as membranas fetais foram abertas e o embrião
analisado e fotografado. Com o auxílio de uma lupa estereomicroscópica Lambda-3, os embriões foram
analisados e medidos segundo a metodologia determinada por Winters et al. (1942); Melton et al. (1951) e
Evans e Sack (1973), com mensuração da distância do ponto maior da cabeça numa extremidade e a última
vértebra sacral na extremidade oposta (Crown Rump / CR), utilizando-se um paquímetro.
Os embriões foram colocados em solução fixadora de paraformaldeído 4% em PBS e Bouin. Após a
fixação, o material foi desidratado em uma série de etanóis em concentrações crescentes (de 70 a 100%) e
diafanizado em xilol, seguido de inclusão em Histosec®. Após a inclusão foram realizados cortes de 5µm de
espessura e corados por hematoxilina-eosina (HE) e picrossírius e azul de toluidina. Em seguida foi feita a
montagem das lâminas e análise das mesmas. Fotomicrografias finalizam o processo.
Resultados
Os resultados de análise macroscópica caracterizam o embrião, especificamente o fígado em
diferentes estágios gestacionais (figura 1).
O embrião contendo 27 a 29 dias de gestação (CR 0,9cm), pode-se observar os arcos braquiais, as
vesículas do cérebro formadas, somitos e saliência cardíaca (MANÇANARES, 2013; ALBERTO, 2006). Neste
período o fígado localizado ventralmente, ocupa grande parte da cavidade abdominal devido ao seu rápido
crescimento. Estes achados confirmam os relatos de Tse; et al (1999) ao explicarem que no período inicial
do desenvolvimento o fígado aumenta de tamanho com muita rapidez se convertendo em um órgão muito
volumoso, diminuindo com a maturidade do feto, estando diretamente relacionado à sua importante função
hematopoiética, durante o desenvolvimento.
No embrião com idade aproximada de 30 a 32 dias de gestação (CR 1,4cm), mostrou as seguintes
características: curvatura crânio caudal em formato de “C”, arcos branquiais se diferenciando, o olho aparece
delineado devido à pigmentação da retina, fosseta nasal, flexura cervical acentuada, os membros torácicos
mostravam-se em forma de pás, os pélvicos em forma de nadadeira e a cauda ainda em desenvolvimento.
Estes dados estão de acordo com os descritos por Mançanares (2013); Alberto (2006). Na região ventral do
embrião o coração e fígado, predominam esta região.
Nos embriões com idade gestacional aproximada de 30 a 35 dias (CR 1,2 a 1,9cm) o fígado ocupa
grande parte da cavidade abdominal estando de acordo com Winters et al. (1942) que descreveu que em
bovinos o órgão se destaca do corpo na 4ª semana de gestação. No período inicial do desenvolvimento o
fígado aumenta de tamanho com muita rapidez se convertendo em um órgão muito volumoso, diminuindo
com a maturidade do feto, estando diretamente relacionado à sua importante função hematopoiética, durante
o período de desenvolvimento (SCHWARZE; MICHEL, 1970; TSE et al., 1999).
Através da lupa estereoscópica, toda a região torácica e abdominal do embrião com Crown-rump 2,0
cm (33 a 35 dias de gestação) foi dissecada. Foi possível observar que a face diafragmática do fígado
apresentava-se cônica acompanhando a curvatura do diafragma, contra a qual se comprimia. Localizados
cranialmente ao diafragma encontramos o coração e o pulmão. A face visceral apresentou-se côncava e o
duodeno, pâncreas, vesícula biliar e o estômago estavam intimamente relacionados com o órgão (figura 2).
Já nos resultados de análise microscópica os embriões com (CR 0,3 a 0,5cm) idade gestacional
aproximada entre 24 a 26 dias, verificamos que os órgãos apresentaram-se constituídos por células em
diferenciação para formar o epitélio, estando inicialmente apoiado em mesênquima (figura 3). Conforme a
evolução da gestação e o crescimento do concepto o tecido mesenquimal é substituído por células epiteliais
e especializadas de cada órgão. Provavelmente ainda esteja havendo uma interação recíproca entre o
endoderma (epitélio) e mesoderma esplâncnico circundante. O pâncreas não foi identificado nesta fase
gestacional.
Figura 1 - Fotografia em vista lateral esquerda de embriões
bovinos. Crown Rump: A = 0,9 cm (27 a 29 dias de gestação);
B = 1,4 cm (30 a 32 dias de gestação); C = 1,7cm e D = 2,0
cm (33 a 35 dias de gestação); E = 2,1cm (36 a 38 dias de
gestação). Barra: 1 cm.
Figura 2 - Fotografia de embrião (CR 2,0cm) com idade
estimada entre 36 a 38 dias de gestação. (A) superfície cranial
do fígado (F) relacionada com o diafragma (seta), coração, (C)
e pulmão, (P). Vista lateral esquerda. Em B notar que o fígado
esta ocupando grande parte da cavidade abdominal e
localizado centralmente. Vista ventral. Barra: 1 cm.
Figura 3 - Fotomicrografia de embrião bovino com idade gestacional
aproximada de 24 a 26 dias de gestação (CR 0,4 cm) em corte
longitudinal. Notar o primórdio do fígado localizado ventralmente ao
embrião. Fígado (F); coração (C); telencéfalo (T); mesonefro, (M); saco
vitelino (SV). Coloração Hematoxilina e Eosina. 4x.
Conclusões
Com o trabalho realizado até o momento podemos concluir que o fígado estava localizado
centralmente ocupando grande parte da cavidade abdominal, caudal ao diafragma, coração e o pulmão e
cranial ao duodeno, pâncreas e estômago.
Concluímos também que os hepatoblastos (células precursoras dos hepatócitos) ainda estão
desorganizados e circundados por inúmeras células precursoras sanguíneas denominadas eritroblastos no
fígado dos embriões com idade gestacional entre 27 a 29 dias. O pâncreas apresentou-se de formato irregular,
dividido em lobos direito e esquerdo e um corpo, localizado caudalmente ao fígado e intimamente; relacionado
com o duodeno proximal, estômago (policavitário) e veia cava caudal. Microscopicamente o pâncreas de
embriões com idade gestacional entre 47 a 60 dias apresentou a porção exócrina com suas células secretoras
com formato piramidal e núcleo redondo rodeado por citoplasma basofílico.
O fígado e pâncreas de embriões bovinos sofreram intensas mudanças durante todas as fases
estudadas.
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