Amanda Bandeira Lima

AMANDA BANDEIRA LIMA
Análise de Aspectos Estruturais e Antigênicos do
Nucléolo na Esclerose Sistêmica
Introdução/objetivo: A esclerose sistêmica (ES) é uma doença reumática
autoimune de etiopatogenia desconhecida, baseada em 3 hipóteses
fisiopatológicas:
hiperatividade
de
fibroblastos,
microangiopatia
endoproliferativa e distúrbios imunitários sugestivos de autoimunidade.
Cerca de 80% dos pacientes com ES apresentam autoanticorpos contra
constituintes do núcleo e, principalmente, do nucléolo. Considerando que o
nucléolo é alvo preferencial de autoanticorpos na ES, mas não em outras
doenças autoimunes, e que os fibroblastos são células primordialmente
envolvidas na sua fisiopatologia, é válido imaginar que alterações
específicas no nucléolo dessas células poderiam tornar antígenos
nucleolares autoimunogênicos. Métodos: Os fibroblastos são obtidos a
partir de biópsias de pele acometida e não acometida de pacientes com ES
do ambulatório de Reumatologia da UNIFESP e da USP. Como controle,
são obtidos fibroblastos a partir de sobras da pele excisada durante cirurgias
plásticas de pequeno porte. Os fibroblastos são cultivados, fixados e
permeabilizados para imunofluorescência indireta (IFI) ou para microscopia
eletrônica. Para IFI são utilizados anticorpos contra antígenos nucleolares
em marcação simples ou dupla. Os anticorpos usados são: anti-DNA
topoisomerase I, fibrilarina, UBF, PM/Scl, nucleolina e B23. As imagens de
microscopia de fluorescência são capturadas por uma câmera digital. A
dupla marcação é analisada no microscópio confocal de varredura. Para a
microscopia eletrônica, o material fixado é incubado com anticorpos
primários utilizando conjugado com partículas de ouro coloidal. Os cortes
ultrafinos são observados no microscópio eletrônico de transmissão. As
peles obtidas das biópsias foram também imediatamente imersas em formol
tamponado 10%, incluídas em blocos de parafina e processadas pelas
tradicionais técnicas histopatológicas. Foram obtidos cortes histológicos em
micrótomo rotativo, colocados em banho-maria e depositados em lâminas
previamente tratadas com silano. As lâminas foram incubadas com
anticorpos monoclonais primários (UBF, nucleolina, Ki-67, B23), e em
seguida lidas em microscópio óptico por dois observadores independentes.
Resultados: Foram analisadas 10 amostras de pacientes com ES e 10 de
indivíduos sadios. Na IFI simples na marcação com anticorpo monoclonal
antifibrilarina foi observado alguns nucléolos com aspecto grumoso e outros
compacto. Na marcação com anticorpo monoclonal anti-UBF foi observado
que
algumas
células
apresentaram
nucléolos
pequenos
e
outras
apresentaram nucléolos grandes. A freqüência de nucléolos grumosos e
compactos foi maior em pele acometida de pacientes com ES do que em
pele não acometida e indivíduos sadios. A frequência de nucléolos
pequenos foi maior em indivíduos sadios do que em pacientes com ES (pele
acometida e não acometida). Mediante a dupla-marcação e microscopia
confocal, foi possível analisar a localização recíproca das proteínas
fibrilarina e UBF e, fibrilarina e nucleolina. Estudou-se a organização
tridimensional dessas proteínas no nucléolo através de uma ferramenta do
programa ImageJ MacBiophotonics. A análise desses casos pelo coeficiente
de correlação de Pearson não indicou diferença na colocalização entre as
proteínas nucleolares testadas, no entando, ambas mostraram alta
colocalização. A distribuição individual de cada uma das proteínas nos
nucléolos, foi estudada através de uma ferramenta que mede a intensidade
de fluorescência. Foi encontrada diferença estatisticamente significante na
distribuição da proteína UBF entre os grupos. As análises por microscopia
eletrônica mostraram que os nucléolos de fibroblastos de indivíduos sadios
apresentaram forma arredondada enquanto os nucléolos de fibroblastos de
pacientes com ES (pele acometida e não acometida) apresentaram forma
irregular. A imunomarcação com UBF foi homogênea e localizada no centro
fibrilar e componente fibrilar denso do nucléolo tanto em indivíduos sadios
quanto na pele não acometida de pacientes com ES. Já na pele acometida
de pacientes com ES a marcação ocorreu não apenas no nucléolo, como
também no nucleoplasma. Conclusão: Os nucléolos de pacientes com ES
apresentam diferenças morfológicas em relação aos nucléolos de indivíduos
sadios. A expressão do autoantígeno nucleolar UBF é maior em indivíduos
sadios do que em pacientes com ES.