Amanda Bandeira Lima
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AMANDA BANDEIRA LIMA Análise de Aspectos Estruturais e Antigênicos do Nucléolo na Esclerose Sistêmica Introdução/objetivo: A esclerose sistêmica (ES) é uma doença reumática autoimune de etiopatogenia desconhecida, baseada em 3 hipóteses fisiopatológicas: hiperatividade de fibroblastos, microangiopatia endoproliferativa e distúrbios imunitários sugestivos de autoimunidade. Cerca de 80% dos pacientes com ES apresentam autoanticorpos contra constituintes do núcleo e, principalmente, do nucléolo. Considerando que o nucléolo é alvo preferencial de autoanticorpos na ES, mas não em outras doenças autoimunes, e que os fibroblastos são células primordialmente envolvidas na sua fisiopatologia, é válido imaginar que alterações específicas no nucléolo dessas células poderiam tornar antígenos nucleolares autoimunogênicos. Métodos: Os fibroblastos são obtidos a partir de biópsias de pele acometida e não acometida de pacientes com ES do ambulatório de Reumatologia da UNIFESP e da USP. Como controle, são obtidos fibroblastos a partir de sobras da pele excisada durante cirurgias plásticas de pequeno porte. Os fibroblastos são cultivados, fixados e permeabilizados para imunofluorescência indireta (IFI) ou para microscopia eletrônica. Para IFI são utilizados anticorpos contra antígenos nucleolares em marcação simples ou dupla. Os anticorpos usados são: anti-DNA topoisomerase I, fibrilarina, UBF, PM/Scl, nucleolina e B23. As imagens de microscopia de fluorescência são capturadas por uma câmera digital. A dupla marcação é analisada no microscópio confocal de varredura. Para a microscopia eletrônica, o material fixado é incubado com anticorpos primários utilizando conjugado com partículas de ouro coloidal. Os cortes ultrafinos são observados no microscópio eletrônico de transmissão. As peles obtidas das biópsias foram também imediatamente imersas em formol tamponado 10%, incluídas em blocos de parafina e processadas pelas tradicionais técnicas histopatológicas. Foram obtidos cortes histológicos em micrótomo rotativo, colocados em banho-maria e depositados em lâminas previamente tratadas com silano. As lâminas foram incubadas com anticorpos monoclonais primários (UBF, nucleolina, Ki-67, B23), e em seguida lidas em microscópio óptico por dois observadores independentes. Resultados: Foram analisadas 10 amostras de pacientes com ES e 10 de indivíduos sadios. Na IFI simples na marcação com anticorpo monoclonal antifibrilarina foi observado alguns nucléolos com aspecto grumoso e outros compacto. Na marcação com anticorpo monoclonal anti-UBF foi observado que algumas células apresentaram nucléolos pequenos e outras apresentaram nucléolos grandes. A freqüência de nucléolos grumosos e compactos foi maior em pele acometida de pacientes com ES do que em pele não acometida e indivíduos sadios. A frequência de nucléolos pequenos foi maior em indivíduos sadios do que em pacientes com ES (pele acometida e não acometida). Mediante a dupla-marcação e microscopia confocal, foi possível analisar a localização recíproca das proteínas fibrilarina e UBF e, fibrilarina e nucleolina. Estudou-se a organização tridimensional dessas proteínas no nucléolo através de uma ferramenta do programa ImageJ MacBiophotonics. A análise desses casos pelo coeficiente de correlação de Pearson não indicou diferença na colocalização entre as proteínas nucleolares testadas, no entando, ambas mostraram alta colocalização. A distribuição individual de cada uma das proteínas nos nucléolos, foi estudada através de uma ferramenta que mede a intensidade de fluorescência. Foi encontrada diferença estatisticamente significante na distribuição da proteína UBF entre os grupos. As análises por microscopia eletrônica mostraram que os nucléolos de fibroblastos de indivíduos sadios apresentaram forma arredondada enquanto os nucléolos de fibroblastos de pacientes com ES (pele acometida e não acometida) apresentaram forma irregular. A imunomarcação com UBF foi homogênea e localizada no centro fibrilar e componente fibrilar denso do nucléolo tanto em indivíduos sadios quanto na pele não acometida de pacientes com ES. Já na pele acometida de pacientes com ES a marcação ocorreu não apenas no nucléolo, como também no nucleoplasma. Conclusão: Os nucléolos de pacientes com ES apresentam diferenças morfológicas em relação aos nucléolos de indivíduos sadios. A expressão do autoantígeno nucleolar UBF é maior em indivíduos sadios do que em pacientes com ES.
