Capítulo 05

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CAPÍTULO 5
METAEMOGLOBINEMIAS, CORPOS DE HEINZ
E GERAÇÃO DE RADICAIS LIVRES
METAEMOGLOBINEMIAS
As atividades fisiológicas da hemoglobina obedecem a um processo
dinâmico que inclui a transformação do seu estado oxigenado para a forma oxidada
e vice-versa. Esse desempenho é constante quando, em resposta à queda na
pressão de oxigênio, a oxiemoglobina é convertida à hemoglobina oxidada e o
oxigênio é liberado aos tecidos. Esse processo, de ocorrência natural, faz com que a
hemoglobina seja continuadamente oxidada, "in vivo", do estado ferroso para o
estado férrico. Diariamente cerca de 1% de hemoglobina total circulante (ou
oxiemoglobina) converte-se espontaneamente em metaemoglobina, devido a um
equilíbrio entre o processo de formação natural de metaemoglobina e uma série de
eficientes mecanismos de proteção, entre os quais a enzima metaemoglobinaredutase, que a reconverte de volta à oxiemoglobina, conforme o esquema a seguir:
Indução natural
OXIEMOGLOBINA
METAEMOGLOBINA
MetaHb - redutase
Em pessoas normais, a concentração de metaemoglobina no sangue é
variável de 0,3 a 3% em relação ao total de hemoglobina. A elevação acima de 3%
de
concentração
de
metaemoglobina
no
sangue
é
designada
por
metaemoglobinemia. A metaemoglobina não tem valor como pigmento respiratório,
pois a forma férrica (Fe+++) do grupo heme é incapaz de se ligar quimicamente com
a molécula de oxigênio (O2--). A impossibilidade de fixar o oxigênio, e de transportálo, muda a cor vermelha do sangue para uma tonalidade de cor castanho. A
incapacidade do transporte de oxigênio quando a concentração de metaemoglobina
127
está acima de 5% se torna visível pela cianose das extremidades dos dedos das
mãos e pela coloração azulada da pele. A metaemoglobina pode decorrer de três
causas: tóxica ou extrínseca, por deficiência enzimática hereditária (ou intrínseca), e
por substituição dos aminoácidos que sustentam o grupo heme (ou Hb M). No
presente livro se dará maior destaque às duas primeiras causas, pois são situações
que podem estar associadas às doenças das células falciformes.
Metaemoglobinemia tóxica – A metaemoglobinemia tóxica está associada à
indução tóxica da transformação de oxiemoglobina em metaemoglobina, superando
a atividade redutora normal da enzima metaemoglobina-redutase conforme mostra o
esquema:
indução tóxica
indução natural
OXIEMOGLOBINA
Meta Hb - redutase
METAEMOGLOBINEMIA
Muitas drogas são capazes de provocar a metaemoglobinemia tóxica, como a
fenacetina, sulfas e derivados, nitritos, nitratos, derivados do benzeno (nitrobenzeno
e anilina), entre outros.
As fontes de compostos químicos metaemoglobinizantes encontrados na natureza
são principalmente de nitritos e nitratos, abundantes em águas poluídas por
produtos fecais.
No ar, pode ocorrer excesso de óxidos de nitrogênio (NOx) e de enxofre (SOx)
expelidos principalmente por indústrias de fertilizantes e refino de petróleo, que
rapidamente tomam o lugar do oxigênio no grupo heme e, conseqüentemente,
oxidam o ferro causando a ferriemoglobina, ou metaemoglobinemia, desencadeando
uma série de reações físico-químicas no interior dos eritrócitos afetados, iniciando
com a degradação da metaemoglobina e geração de radicais livres por espécies
ativadas do oxigênio livre. A figura 57 mostra as três principais conseqüências da
metaemoglobinemia: precipitação de corpos de Heinz, estresse oxidativo (ambos
processos são lesivos à membrana eritrocitária) e anemia.
128
Clinicamente, a metaemoglobinemia tóxica pode representar grave emergência
médica devido a perda da capacidade de transporte de oxigênio do sangue,
notadamente nas exposições agudas com excessiva toxicidade. Devido ao desvio
da curva de dissociação de oxigênio, que ocorre quando há alta concentração da
metaemoglobina, e metaemoglobinemia aguda pode ameaçar a vida quando a taxa
de metaemoglobina excede a metade da hemoglobina total circulante. Nas
exposições crônicas o efeito cumulativo é deletério, prejudicando a oxigenação das
células, tecidos, sistemas e órgãos, além da persistente degradação dos eritrócitos.
Metaemoglobinemia por deficiência enzimática hereditária – Esse estado é
muito complexo devido à diversidade de enzimas intraeritrocitárias que atuam como
anti-oxidantes, com destaques para a metaemoglobina-redutase, superóxido
dismutase (SOD), catalase e glutatião peroxidase (GPx). A deficiência da
metaemoglobina-redutase está quase sempre ligada à deficiência da sua coenzima
NADH-diaforase. A NADH-diaforase participa da via fosfoglutamato (ciclo da
pentose) do metabolismo eritrocitário (ver figura 28, capítulo 2). De forma indireta,
essa enzima catalisa a reconversão do estado de metaemoglobina para o de
oxiemoglobina. A redução dessa enzima determina o acúmulo de metaemoglobina
que pode acentuar-se nas exposições tóxicas já apresentadas no item da
metaemoglobinemia tóxica, ou na geração patológica de metaemoglobina como a
que ocorre nas hemoglobinas instáveis, talassemias, e doenças falciformes. A
superóxido dismutase (SOD) atua no sentido de catalisar a transformação do íon
superóxido (O2•) em peróxido de hidrogênio (H2O2) com a introdução de dois átomos
de hidrogênio na molécula do íon superóxido:
SOD
O2• + 2H + e- → H2O2
A catalase e GPx atuam no sentido de transformar a H2O2 em H2O, incluindo um
processo intermediário com liberação do radical HO e a adição de um íon H+ e
elétrons para resultar em água (figura 57).
Metaemoglobinemia por Hb M – A Hb M é uma hemoglobina variante causada por
substituição da histidina distal ou proximal, das globinas alfa ou beta, por outro
129
aminoácido – geralmente a tirosina. Essa troca de aminoácido instabiliza as ligações
químicas do grupo heme e permite a entrada de água continuadamente para o seu
interior. Como conseqüência da entrada de água o ferro se oxida espontaneamente,
passando do estado ferroso (Fe++) para o férrico (Fe+++), com formação de
metaemoglobina, anemia e cianose. A cianose devido à Hb M ao contrário das
metaemoglobinemias tóxica e por deficiência enzimática, não responde ao
tratamento com ácido ascórbico ou azul de metileno, porque o heme permanece no
estado férrico. Os diferentes tipos de Hb M são caracterizados por meio da avaliação
da absorção espectrofotométrica em determinados comprimentos de onda (nm). A
Hb M, igualmente a outras variantes, é transmitida como caráter co-dominante, com
a Hb A apresentando maior concentração. O estado de homozigose da Hb M é
incompatível com a vida.
130
OXI Hb
Meta Hb
redutase
+
Meta Hb
O2•
SOD
Hemicromo
reversível
H2O2
GPx
Catalase
H2O
HO
Danos ao DNA
Hemicromo
irreversível
Mutagênese
O2•
Precipitação
da Globina
Corpos de Heinz
Depleção do
Grupo Heme
Fe+++
liberado
Canceres
Estresse
Oxidativo
Rigidez da Membrana
Agregação junto à Proteína Banda 3 da Membrana
Reconhecimento Imunológico
Ação fagocitária no Baço pelos Macrófagos
Hemólise
Anemia
Figura 57: Esquema representativo da degradação da metaemoglobina,
liberação de subprodutos, estresse oxidativo e precipitados de
corpos de Heinz, durante processo desencadeado pela elevaç.
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CORPOS DE HEINZ
Corpos de Heinz são inclusões intraeritrocitárias de globinas "livres"
que se precipitam e se aglomeram no interior dos eritrócitos, geralmente ligados à
membrana. Essas inclusões foram descritas pela primeira vez em 1890 por R. Heinz
em eritrócitos incubados com acetilfenilhidrazina. O autor demonstrou também que a
indução química que induz a formação dos corpos de Heinz pode ser causada por
um grande número de compostos amino e nitro-aromáticos, bem como por oxidantes
inorgânicos como o cloreto de potássio. Em 1962 J.V. Dacie relatou a ocorrência de
corpos de Heinz "in vivo" em pacientes com hemoglobinas instáveis, e essas
inclusões eram formadas por aglomerados de globinas anormais resultantes da
troca de aminoácidos nas superfícies internas ou nas regiões estabilizantes da
molécula de hemoglobina (ver figura 40, capítulo 3), provocando o afrouxamento das
ligações químicas dos aminoácidos que dão sustentação ao grupo heme. Como
conseqüência dessas mutações e do afrouxamento molecular a água penetra no
interior do grupo heme, oxida o ferro, eleva a concentração de metaemoglobina a
níveis que impossibilitam a sua reconversão à oxiemoglobina, e a degradação dos
subprodutos da metaemoglobina resulta na formação de corpos de Heinz. O mesmo
autor demonstrou a presença de corpos de Heinz na deficiência de glicose-6-fosfato
desidrogenase
(ou
G-6-PD).
Estudos
posteriores
realizados
por
vários
pesquisadores mostraram que os corpos de Heinz também ocorrem no desequilíbrio
entre globinas alfa e beta, como são os casos das talassemias, bem como por
autoxidação da Hb S nos vários genótipos das doenças falciformes. A figura 59
apresenta em dez etapas os diversos processos da degradação da hemoglobina,
passando pela formação de corpos de Heinz, e a destruição precoce dos eritrócitos
pelos macrófagos. A etapa 1 mostra as principais causas de oxidação da
oxiemoglobina. Qualquer uma dessas causas induzem a formação excessiva de
metaemoglobina que supera a capacidade das enzimas antioxidantes. A elevada
concentração de metaemoglobina, conforme mostra a etapa 2 impede a ligação de
moléculas de oxigênio com o ferro que está no estado férrico (Fe+++). Assim o
oxigênio livre se liga com elétrons e desencadeia a formação de espécies ativadas
de oxigênio (O2•, HO, H2O2) que são radicais livres. Como a molécula de
metaemoglobina é instável ela se degrada (etapa 3), com liberação de dois
subprodutos importantes: globinas livres que se precipitam e grupo heme oxidado
132
que ataca rapidamente a membrana do eritrócito (etapa 4). Pelo fato do processo
oxidativo da hemoglobina ser contínuo, o acúmulo de globina (etapa 5) forma
múltiplas pelotas que se precipitam e cujo conjunto configura os corpos de Heinz
(figura 60). O acúmulo de globinas junto à membrana eritrocitária provoca lesões
oxidativas por meio de seus aminoácidos, notadamente metionina e cisteína,
alterando a configuração da proteína Banda 3 da membrana (etapa 6). Essa
alteração deforma o eritrócito (figura 61) e atrai a ação de macrófagos durante sua
passagem pelos microcapilares do sistema retículo endotelial (SRE) do baço, fígado
e medula (etapa 7). A ação dos macrófagos contra eritrócitos lesados pela
precipitação de corpos de Heinz pode ser saneadora ou parcial (etapa 8). A ação
saneadora se caracteriza pela fagocitose do eritrócito inteiro, enquanto que a ação
parcial decorre da retirada da parte do eritrócito que contém grande acúmulo de
corpos de Heinz (figura 62), e seu retorno à circulação sangüínea com a morfologia
típica de célula "mordida" (figura 63). O acentuado processo da fagocitose
saneadora de bilhões de eritrócitos resulta em processos hemolíticos (etapa 9), e
conseqüente anemia (etapa 10).
Toxicidade por drogas e químicos oxidantes
133
Autoxidação de globinas despareadas nas talassemias
Autoxidação por baixa ação antioxidante na Hb S
(1)
Autoxidação por lesão estrutural nas Hb instáveis
Hb O2
Enzimas
antioxidantes
(2)
(3)
Meta Hb
Liberação de radicais livres (O2•, HO, H2O2)
Degradação da Meta Hb (Hemicromos)
(4)
Precipitação Desnaturação do heme oxidado
das globinas
(5)
Acúmulo de globinas junto à membrana eritrocitária
Estresse oxidativo
na membrana
(6) Formação dos “Corpos de Heinz” e lesões oxidativas da membrana (proteína Banda 3)
(7) Ação dos macrófagos contra eritrócitos com corpos de Heinz
(8) Ação saneadora
(9)
Hemólise
(10)
Anemia
Ação parcial
Eritrócitos “mordidos”
Figura 59: Esquema representativo das causas de oxidação da hemoglobina,
caracterizados por etapas, para destacar a formação de corpos de
Heinz e suas lesões oxidativas.
134
Figura 60: Eritrócitos de sangue periférico com corpos de Heinz visualizados
após coloração com azul de crezil brilhante a 1%, em paciente com
Hb instável.
135
Figura 61: Microscopia eletrônica de varredura de um eritrócito deformado por
várias pelotas de acúmulo de globinas, cujo conjunto forma os
corpos de Heinz.
136
Figura 62: Microscopia eletrônica plana mostrando a formação de vários
corpos de Heinz num mesmo eritrócito, e as setas indicam que
duas regiões que continham corpos de Heinz foram fagocitadas
(ação parcial dos macrófagos).
137
Figura 63: Eritrócitos de sangue periférico de paciente com Hb instável. A seta
destaca uma célula "mordida".
138
Proteínas
Carboidratos
Lipídeos
Glicose
Glicólise
Aminoácidos + e-
e- + ácidos graxos
Piruvato
Piruvato
desidrogenase
Acetil - coenzima A
oxidações
oxaloacetato
citrato
Ciclo do
ácido cítrico
eCO2
CO2
Cadeia de Transporte de Elétrons
(NAD + eNADH + H)
H+
e-
Cadeia de Transferência de Elétrons
(respiração celular)
ADP
ATP
Figura 64: Geração de elétrons por catabolismo das proteínas, carboidratos e
lipídeos.
139
RADICAIS LIVRES
Os radicais livres são definidos como íon, átomo, ou molécula com um
elétron desemparelhado. Quando o radical livre envolve o oxigênio em sua estrutura
molecular, passa a ser denominado por espécie ativada de oxigênio. O radical livre
tende a procurar seu equilíbrio e, por isso, toma elétron de outra estrutura
estabilizada, desestabilizando-a e causando reações em cadeia. Por outro lado,
quando um radical livre se encontra com outro, ambos podem se completar e criar
uma molécula, um íon, ou um átomo estabilizado. Por essa razão a vida de um
radical livre é extremamente curta, da ordem de 10-14 segundos, fato que torna
impossível a sua avaliação. Entretanto, os efeitos deletérios causados pelos radicais
livres podem ser avaliados e quantificados e, por essa razão, tornam-se indicadores
biológicos do grau de geração de radicais livres. Entre esses indicadores destacamse a pesquisa citológica de corpos de Heinz, e dosagens da metaemoglobina,
superóxido dismutase e glutatião peroxidase, principalmente.
O oxigênio como fonte de radicais livres – O oxigênio é o elemento químico mais
abundante na natureza e nas células dos organismos vivos, especialmente nas dos
animais. O oxigênio tem oito elétrons, dos quais seis deles estão na camada externa
de sua órbita atômica. Esses elétrons da camada externa da molécula de oxigênio
se dispõe de tal forma que o torna um bi-radical estável com dois elétrons expostos
lateralmente, fato que o deixa altamente reativo para elétrons livres, com grandes
possibilidades de se tornar um radical livre, conforme mostra a representação
abaixo:
••
•
••
O
O
••
••
•
+
e
-
••
Molécula de O2
bi-radical estável
elétron
livre
→
•
••
••
O
O•
••
••
Radical livre
Íon superóxido
ou O2•
140
Conforme se pode observar, quando o oxigênio não é convenientemente utilizado no
eritrócito, quer seja pela excessiva formação de metaemoglobina, ou por
hemoglobina com baixa afinidade ao O2 como é o caso da Hb S, ele se torna alvo
fácil do ataque de elétrons transformando-se em radical livre.
Fontes de elétrons nas células – A principal fonte de elétrons é proveniente do
catabolismo celular de proteínas, lipídios e carboidratos. Os produtos básicos da
degradação desses elementos resultam em aminoácidos, ácidos graxos e glicose. A
glicose ao sofrer o processo de degradação (glicólise) libera elétrons que atuam na
transformação de aminoácidos e ácidos graxos em acetil-coenzima A. A glicose
também se transforma em acetil-coenzima A por ação da piruvato desidrogenase. A
acetil-coenzima A sofre oxidações transformando-se em citrato e oxaloacetato com
liberação de CO2 e elétrons. Esse processo de oxidação da acetil-coenzima A é
também conhecido como ciclo do ácido cítrico. Os elétrons resultantes desse ciclo
participam da respiração celular que resulta em produção de energia (figura 64).
Dessa forma a excessiva destruição de proteínas ou de lipídeos, como ocorre nas
talassemias, Hb instáveis e nos genótipos das doenças falciformes, produz elevada
liberação de elétrons que induzem a geração de radicais livres.
Fontes de hidrogênio na célula – A cadeia de transporte de elétrons ocorre nos
espaços intermembranas das mitocôndrias, com constantes transformações de
NADH em NAD+ e liberação de hidrogênio (H+) que também é utilizado na
respiração celular e na produção de energia (figura 64). No caso do eritrócito esse
processo se desenvolve durante a sua gênese, com os eritroblastos. Assim, nas
células falciformes e talassêmicas a liberação de hidrogênio pode estar afetada,
alterando o metabolismo eritrocitário desde o início da sua formação.
Ativação do oxigênio em presença de elétrons e hidrogênio – Quando ocorre
presença
excessiva
de
oxigênio
molecular
–
como
são
os
casos
de
metaemoglobinemia e das células falciformes com concentração de Hb S acima de
50%, inicia-se um processo reativo envolvendo elétrons e hidrogênio, com o
desencadeamento de espécies ativadas de oxigênio ou radicais livres de oxigênio,
conforme o esquema abaixo:
141
O2 •
H2O2 +
HO
•
O2
+
+
e-
H+
+ e-
+
-
e
e-
→
SOD
catalase
GPx
+
H
O2 •
(íon superóxido)
H2O2
(peróxido de hidrogênio)
H2O +
HO• (radical hidroxila)
catalase
GPx
H2O
Lesões dos radicais livres na membrana eritrocitária – A membrana celular atua
como delimitadora do conteúdo celular, em reações químicas, na conservação de
energia, na comunicação intercelular, na seletividade iônica e na promoção e
catálise de vários eventos moleculares. Sua massa é constituída quase
exclusivamente por proteínas, lipídios e pequena quantidade de carboidratos
(glicoproteínas e glicolipídios). Estruturalmente é composta por ampla camada
lipoprotéica. Desse conjunto, destaca-se a composição do folheto bimolecular
formado por dupla camada de fosfolipídios (ácido graxo e fosfato). Essa dupla
camada tem áreas hidrofóbicas onde se situam apenas os ácidos graxos, e áreas
hidrofílicas nas regiões em que se localizam os fosfatos. Assim as áreas hidrofílicas
estão em contato com os meios interno e externo da célula. Quimicamente há dois
tipos de ácidos graxos que compõe a membrana: os saturados e os insaturados. Os
ácidos graxos saturados se caracterizam por terem ligações simples entre seus
carbonos e pela resistência à oxidação. Os ácidos graxos insaturados tem duplas
ligações entre seus carbonos e são sensíveis à oxidação. Um outro elemento
químico importante na estrutura da membrana é o colesterol. O colesterol é o mais
142
importante esterol, e por ser uma substância anfótera (reage com ácido e base) tem
grande facilidade em penetrar na área hidrofóbica e se ligar ao fosfolipídio, formando
uma barreira que impede a ação dos radicais livres contra a região carbonada.
Ação dos radicais livres na membrana – A área hidrofóbica da membrana é
suscetível aos ataques dos radicais livres e, além disso, os ácidos graxos
insaturados são espontaneamente oxidados em presença de oxigênio. Quando o
nível de colesterol no interior da membrana está diminuído, ou quando há presença
de ferro ou cobre, ocorre a oxidação dos fosfolipídios, desencadeando a formação
do radical alquil lipídico, o oxigênio centrado, radical peroxil e hidroperoxil, conforme
o esquema abaixo:
(1)
 CH2
+ O2•
 CH
+
Alquil
(2)
 CH
+ O2•
HO2•
Oxigênio centrado
CH  OO•
Peroxil
(3)
(4)
 CH  OO•
 CH  OOH
+ CH2
+ Fe++
 CH  OOH
+
 CH
Hidroperoxil
Alquil
HO• + Fe+++ +
 CHO•
Hidroxil
Alcoxil
Como se pode observar a etapa 1 se caracteriza pela oxidação do carbono da
cadeia de ácidos graxos insaturados ( CH2), com formação dos radicais alquil e
oxigênio centrado. Na etapa 2, o próprio radical alquil sofre ação do íon superóxido e
dá origem a outro radical livre – o radical peroxil. Na etapa 3 o radical peroxil ataca
outro carbono da cadeia de ácidos graxos insaturados, formando outros dois radicais
livres hidroperoxil e alquil. O radical alquil volta a atacar outros carbonos das cadeias
de ácidos graxos insaturados, enquanto que o hidroperoxil ao reagir com ferro
ferroso resulta na formação de outros radicais livres (hidroxil e alcoxil) além de ferro
143
férrico (etapa 4). Todo esse processo resulta na reação em cadeia promovida pelos
radicais livres.
As principais conseqüências da lipoperoxidação da membrana são as seguintes:
•
Alteração da permeabilidade
•
Alteração do transporte de substâncias orgânicas e inorgânicas
•
Alteração da bomba de Na+, K+, Ca++ e ATPase
•
Danos ao DNA das proteínas celulares
•
Morte celular precoce.