Amanda Ferreira Neves, Maurília Martins de Oliveira, Suélen

1
ANÁLISE DE DOIS PROTOCOLOS DE CULTURAS CELULARES
PARA ESTUDOS COM MATRIZ MULTIELETRODO
AMANDA FERREIRA NEVES1a, MAURÍLIA MARTINS DE OLIVEIRA2b, SUÉLEN
MOREIRA MARQUES3a, JOÃO BATISTA DESTRO-FILHO4, ELISÂNGELA DE PAULA
SILVEIRA-LACERDA5, CELINA MONTEIRO DA CRUZ LOTUFO6
R E S U M O : Muitas células animais podem ser estudadas sob culturas,
mantendo suas características fisiológicas originais. As culturas estabelecidas
diretamente de tecidos de um organismo são denominadas culturas primárias.
Culturas de células primárias imortalizadas, ou seja, com modificações
genéticas que lhes conferem a capacidade de multiplicar-se indefinidamente,
são denominadas de linhagem celular. Ambos os tipos de culturas podem ser
utilizados
em
pesquisas
de eletrofisiologia neural,
por
exemplo,
com
diferentes abordagens. Este trabalho propôs comparar o protocolo de uma
cultura primária padrão de estudo em matriz multieletrodo com o protocolo d e
uma cultura de linhagem de glioblastoma, à luz de critérios tais como
procedimentos, materiais e reagentes necessários para implementação e
manutenção
das
culturas. Diante das
especificidades
de cada cultura,
concluímos que compete ao pesquisador escolher a cultura mais adequada ao
seu experimento, já que essas culturas possuem praticamente os mesmos
custos de implementação.
PALAVRAS-CHAVE: cultura neural primária, cultura de linhagem,
glioblastoma humano, matriz multieletrodo.
1
Graduação em Ciências Biológicas - UFU, Campus Umuarama, Uberlândia - MG, <[email protected]>.
Graduação em Biomedicina - UFU, Campus Umuarama, Uberlândia - MG, <[email protected]>.
3
Graduação em Engenharia Elétrica - UFU, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, <[email protected]>.
4
Docente da Faculdade de Engenharia Elétrica - UFU, Bloco 1E, Uberlândia – MG, <[email protected]>.
5
Docente do Instituto de Ciências Biológicas - UFG, Goiânia - GO, <[email protected]>.
6
Docente do Instituto de Ciências Biomédicas - UFU, Bloco 2A, Uberlândia - MG, <[email protected]>.
2
a
b
Bolsistas pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).
Bolsistas pela Universidade Federal de Uberlândia (UFU).
2
ANALYSIS OF TWO PROTOCOLS OF CELLULAR CULTURES
FOR STUDIES WITH MULTIELECTRODE ARRAYS
ABSTRACT:
Man y
animal
cells
can
be
studied
under
culture,
maintaining their unique ph ysiological characteristics. Cultures which are
established directl y from organism tissues are called primary cultures.
Immortal primary cell cultures or else geneticall y modified cells that have the
abilit y to multipl y for an indefinite period are called "cell line". Both cultures
can be used, for example, in neural electroph ysiology researchs with different
approaches. This paper proposed to compare a standard protocol of primary
culture
studied
in
multielectrode
arrays
with
a
cell
line
culture
of
glioblastoma, under criteria such as procedures, equipment and reagents
needed for implementation and maintenance of cultures. Considering the
specificities of each culture, we suggest that it is up to the researcher to
choose what kind of culture is the most appropriate for his/her experiment,
since the implementation costs are nearl y the same.
KEYWORDS: primary neural culture,
glioblastoma, multielectrode array.
cell line culture,
human
3
características
1. I NTRODUÇÃO
fenotípicas
genotípicas
do
tecido
de
e
origem
(COOPER & HAUSMAN, 2007).
Em
condições
adequadas,
Existem
a
diferentes
tipos
de
maioria das células pode viver, se
células animais utilizadas em culturas,
reproduzir e até mesmo expressar suas
das
propriedades em uma placa de cultura,
neurônios, células especiais capazes
ou seja, in vitro (ALBERTS et al.,
de restabelecerem conectividade in
2006). As culturas de células animais
vitro, semelhante àquela presente no
são realizadas a partir do isolamento
tecido vivo. Assim é possível estudar
de células de tecidos vivos, que são
aspectos
adicionadas em placas de cultivo
neurônios como, por exemplo, os
contendo meio nutritivo (COOPER &
impulsos
HAUSMAN, 2007).
(potenciais de ação) por meio de
As
culturas
estabelecidas
diretamente de um tecido vivo são
denominadas
Quando
as
culturas
células
primárias.
das
culturas
quais
pode-se
da
Toda
essa
ser
emitidos
discussão
envolve
principalmente profissionais ligados à
Paralelamente,
deve
entre
GRISCOM et al., 2002).
da
delas
os
biossensores (LAKARD et al., 2005;
pesquisa
parte
comunicação
elétricos
primárias preenchem toda a superfície
placa,
destacar
na
área
biomédica.
pesquisadores
em
removida e colocada em uma nova
Engenharia Biomédica desenvolvem
placa para haver a expansão celular.
mecanismos
Esse processo é chamado de “repique”
traduzem um impulso nervoso de um
e a cultura dele derivada recebe, por
neurônio em informação para circuitos
alguns autores, a denominação de
eletrônicos,
“cultura secundária” (ALBERTS et
digital destes potenciais de ação e,
al., 2006). Outro tipo de cultura é
ainda, possibilitando controlar esse
aquela de linhagem, a qual é formada
impulso local através do conceito de
por
“neuromodulação
células
modificadas,
que
geneticamente
se
proliferam
indefinidamente, porém conservando
(FROMHERZ,
nanotecnológicos
efetuando
2003).
um
que
registro
controlada”
Um
exemplo
desses nanodispositivos é a matriz
4
multieletrodo
(MEA),
na
qual
é
possível estimular e fazer a aquisição
período
de
dias
a
semanas
(CLAVEROL-TINTURÉ et al., 2005).
A
de sinais elétricos a partir de culturas
tecnologia
da
MEA
é
neurais, de maneira não-destrutiva
comumente utilizada para estudar a
(POTTER & DE-MARSE, 2001).
atividade e a plasticidade do sistema
A matriz multieletrodo, desde o
nervoso durante o desenvolvimento
seu desenvolvimento nos anos 70, é
das
considerada
celulares
como
uma
tecnologia
redes
neurais
ou
em
em
culturas
fatias
cerebrais
potencialmente útil para estudos de
(RUTTEN, 2002; RUTTEN et al., 2001).
processamento
Isso é possível a partir da aquisição de
de
informações
em
redes do sistema nervoso (MERCER
potenciais
&
MEAs
visando à análise de aglomerados,
representam circuitos de dimensões
pequenos grupos de células neurais
micrométricas (Figura 1) montados
(FREEMAN, 2000 ).
WHITE,
sobre
um
1978).
As
substrato
elétricos
extracelulares,
A tecnologia da MEA pode ser
transparente
integrado a um número de 10-100
aplicada
em
qualquer
tecido
microeletrodos de 10 µm de diâmetro,
eletrofisiológico, ou seja, que exibe
geralmente (RUTTEN, 2002).
características elétricas, por exemplo,
A principal característica de uma
neurônios, cardiomiócitos e células
MEA é o intercâmbio bidirecional de
musculares. Uma aplicação prática da
informação que ela proporciona, no
MEA
qual
interface
dispositivos protéticos que controlam
do mundo biológico
e ou substituem as funções de um
com o eletrônico, onde células neurais
tecido danificado no sistema nervoso
são cultivadas sob um microcircuito
(LAKARD et al., 2005; GRISCOM et al.,
elétrico
2002). Além disso, a MEA constitui
atua
como
bioeletrônica,
(RUTTEN,
situação
oferece
uma
2002).
um
Essa
ambiente
um
são
sistema
os
in
neuroimplantes,
vitro
ideal
para
controlado no qual as células vão se
monitorar os efeitos de drogas e
aderir a partir de moléculas de adesão
toxinas,
conhecidas,
seu
importantes
um
bioquímica específica para o estudo
monitoramento
possibilitando
constante
por
promovendo
sobre
conclusões
a
atuação
5
também de novos fármacos (POTTER
transparente, adequado para se fazer
& DE-MARSE, 2001). Ao mesmo
visualizações
tempo,
a
monitorar
MEA
em
microscópios
também
permite
invertidos, de fluorescência, confocal
facilmente
o
ou de varredura dupla (POTTER &
desenvolvimento da morfologia das
DE-MARSE, 2001).
células, já que possui um substrato
Figura 1. A- Foto de uma matriz multieletrodo (MEA) sem a cultura. B- Substrato da MEA
destacando os microeletrodos ao centro. C- Micrografia dos eletrodos dispostos sobre o
substrato, indicando suas dimensões (MULTI CHANNEL SYSTEMS, 2005).
Muito embora as novas opções
culturas
primárias
de
neurônios
de culturas baseadas em linhagem
(FROMHERZ, 2003; NOVELINO et al.,
celular imortal já incluam alguns tipos
2003; RUTTEN, 2002; POTTER, 2001).
de neurônios, os experimentos atuais
Na montagem dessas culturas, vários
em
animais são sacrificados a fim de se
MEA
utilizam
quase
sempre
6
obter células
suficientes para um
experimento. Deve-se destacar ainda
que uma cultura primária é inviável
muito tempo de preparo e maiores
custos com materiais e reagentes.
É necessário, então, encontrar
por longos períodos (NOVELINO et al.,
novas
2003), geralmente não sobrevivendo
implementação dessa cultura como as
por mais de dois meses, mesmo em
linhagens de células imortalizadas,
ambiente limpo de estufa (POTTER,
que permanecem viáveis por vários
2001). Tais culturas são, portanto,
anos, o que agiliza o processamento
descartadas e assim novos animais
dos resultados e reduz os custos de
devem ser sacrificados para montar
preparo. Somada a isso, a utilização
outro
um
de culturas associadas a outros tipos
prejuízo tanto em termos bioéticos
de células neurais, por exemplo as
(quantidade de animais sacrificados),
células da glia (células de suporte dos
quanto
econômicos,
neurônios), implica também em novas
incluindo-se também o próprio tempo
investigações fisiológicas, as quais
despendido pelos pesquisadores.
podem gerar resultados mais coerentes
experimento,
em
gerando
termos
Atualmente grupos de pesquisa
que estudam as respostas neuronais,
possibilidades
para
a
com o contexto biológico envolvido
na atividade dos neurônios.
via MEA, ainda utilizam a cultura
primária de neurônio (NOVELINO et
1.1 Objetivos
al., 2003; POTTER, 2001). Como essas
células não sobrevivem mais do que
O objetivo desse trabalho foi
algumas semanas, as culturas são
comparar dois tipos principais de
descartadas
procedimentos
protocolos de culturas, analisando as
iniciais de extração devem ser refeitos
principais semelhanças e diferenças
freqüentemente
a
existentes entre estes. Ao final da
pesquisa (ALBERTS et al., 2006).
comparação foi possível confrontar as
Dessa maneira, deve-se destacar que a
diferentes
abordagens
atual abordagem de culturas MEA
visualizar
aquelas
exige
coerentes com as questões bioéticas e
vários
e
os
para
animais,
manter
acarretando
que
e,
portanto,
são
mais
com o contexto brasileiro de pesquisa.
7
2. M ATERIAL E M ÉTODOS
cada etapa de preparação da cultura
primária
Neste trabalho, foram abordados
de
neurônios
estão
em
destaque na Tabela I.
dois tipos principais de protocolos de
culturas: uma cultura primária de
neurônios e uma cultura de linhagem
de
células
gliais.
É
importante
destacar que as culturas de linhagem
de glioblastoma não são utilizadas em
MEA, visto que são células da glia e
não
participam
impulsos
diretamente
elétricos
neurônios.
Porém,
emitidos
dos
pelos
estudando
seu
protocolo, é possível extrapolar o
conhecimento adquirido acerca dos
procedimentos, materiais e reagentes
para os diferentes tipos de culturas de
linhagens neuronais já existentes.
Figura
2.1 Cultura Primária de Neurônios
2.
Resumo
esquemático
da
preparação da cultura primária de neurônios
(NOVELINO et al., 2003). A- Etapa de
(A) Origem das células
dissecação: os cérebros de cada embrião são
São
do
extraídos para então isolar os tecidos corticais
cerebral,
e hipocampo. B- Etapa de dissociação: os
obtidos de seis a oito embriões de
tecidos são tratados três vezes com soluções
ratos Wistar em seu 18º dia de
enzimáticas e com meio nutritivo. C- Etapa de
desenvolvimento (NOVELINO et al.,
manutenção: as células e o meio nutritivo são
córtex
2003).
e
Os
utilizados
do
neurônios
hipocampo
procedimentos
para
a
preparação do protocolo dessa cultura
estão resumidos na Figura 2. Os
materiais e reagentes utilizados em
adicionados em recipientes de cultura, os
quais serão armazenados em estufas.
8
TABELA I
Materiais e Reagentes Utilizados na Cultura Primária
Dissecação
Dissociação
Oito Ratos
Eppendorf
Microscópio óptico
Centrífuga
Tesoura peq.
Materiais
Manutenção
Estufa úmida
Fórceps peq.
Fluxo laminar
Fluxo laminar
Placas-de-Petri
Recipiente de cultura
Fluxo laminar
Pipeta
Banho-maria
Reagentes
Pipeta
Solução salina HBSS
Tripsina (enzima)
Meio Neurobasal
Meio Neurobasal
B-27 e Glutamax-1
Soro fetal bovino
Ara-C
(B) Dissecação
Os embriões são retirados de
(C) Dissociação
uma ou mais ratas grávidas. As partes
Nessa
etapa,
o
córtex
e
o
do cérebro que serão utilizadas são
hipocampo de cada cérebro passam
removidas com a ajuda de um fórceps
por diversos momentos de digestão
afiado e, em seguida, são cortadas em
enzimática e subsequente maceração
pedaços menores (NOVELINO et al.,
(NOVELINO
2003).
procedimento é importante para que as
Todo
dissecação
o
ocorre
procedimento
em
de
ambiente
células sejam
et
al.,
2003).
Esse
isoladas, permitindo
esterilizado, como aquele de uma
maior
homogeneidade
na
amostra
capela de fluxo laminar (Figura 2a).
final, onde a concentração de células
9
deve ser 8·10 5 neurônios/mL (Figura
pesquisadores
2b).
estabeleceram
células:
a
isolaram
duas
e
linhagens
M059J
e
a
de
M059K
(ALLALUNIS-TURNER et al., 1993).
(D) Manutenção
As duas linhagens foram retiradas
A cultura é mantida em uma
estufa
umedecida
atmosfera
de
a
5%
37°C,
CO2.
com
O
meio
nutritivo é trocado a cada quatro dias
por meio fresco e o cultivo das células
é realizado em monocamada, com
inibição do crescimento de células da
glia (NOVELINO et al., 2003). Os
concomitantemente do mesmo tumor e
se diferem principalmente em relação às
suas sensibilidades para radiação ionizante
e em quimioterápicos (BELENKOV et al.,
2002). A partir disso, ambas as linhagens
celulares representam um modelo útil para
estudar o desenvolvimento e a replicação
de células tumorosas (ATCC, 2009).
experimentos são executados somente
após duas semanas (Figura 2c).
(A) Origem das células
2.2 Cultura
de
Linhagem
de
São utilizados glioblastomas da
linhagem M059J obtidas da ATCC ®
Glioblastoma
comercialmente (ATCC, 2009). Como
Glioblastoma multiforme (GBM)
as células de linhagem M059J já
é a forma mais comum de tumor
foram estabelecidas anteriormente e
maligno
difícil
podem ser comercializadas, as etapas
tratamento efetivo e se caracteriza
de dissecação e dissociação não são
pelo crescimento anormal de células
realizadas
gliais (MENDONÇA et al., 2005). O
entanto,
GBM
adquiridas congeladas, existem outras
no
tem
células
diversos
da
cérebro,
origem
glia
de
nos
astrócitos,
responsáveis
mecanismos
de
por
filtração
etapas
para
como
No
as
células
são
descongelamento,
expansão celular e manutenção da
cultura.
(AVGEROPOULOS, 2001).
procedimentos
maligno de um homem de 33 anos,
cultura.
como
sanguínea, que protegem o cérebro
A partir de um glioblastoma
esta
A
Figura
para
3
a
resume
os
preparação
dessa cultura e a Tabela II mostra os
10
materiais e reagentes utilizados em cada
serão
distribuídas
etapa de preparação da cultura.
recipientes
com
em
novos
novos
meios
de
cultura e suplementos (Figura 3a).
(C) Manutenção
A cultura é mantida em estufa
umedecida a 37°C com atmosfera de
5% CO 2 . O meio nutritivo é trocado a
cada dois ou três dias (Figura 3b).
Para os experimentos, foram utilizadas
culturas em crescimento, de três dias a
uma semana após a preparação (DALPIZZOL & RITTER, 2003).
2.3 Análise dos Protocolos
Figura
3.
Resumo
esquemático
dos
procedimentos para a preparação da cultura de
Os protocolos foram comparados
linhagem M059J (ATCC, 2009). A- Etapa de
entre si seguindo os critérios descritos
descongelamento: as células compradas são
a seguir.
descongeladas, passando por um processo de
climatização o qual consiste em adicionar
(1) Aspectos Procedimentais
meio nutritivo algumas vezes para lavar as
células. B- Etapa de manutenção: as células e
o
meio
recipientes
nutritivo
de
são
cultura,
adicionados
os
quais
em
serão
armazenados em estufas.
Foi
analisado
grau
de
dificuldade/simplicidade
para
a
realização
de
das
o
etapas
cada
procedimento. Além disso, avaliou-se
o intervalo de tempo estimado para
efetuar todas as etapas.
(B) Descongelamento
Nessa etapa as células passam
por um processo de retirada do meio
de congelamento. Logo após elas
(2) Representatividade Fisiológica da
Cultura:
11
Para cada cultura, discutiu-se a
sua
flexibilidade
viabilizar
possibilidade de realizar experimentos
diversos tipos de estudos, ou seja, se
com cada cultura, no que diz respeito
haveria outras maneiras ou outros
aos comitês de bioética animal e
experimentos
humana.
para
para
Discutiu-se a burocracia e a
estudar
essas
células, além daqueles em que são
(6) Biossegurança:
utilizadas normalmente.
Neste critério foi analisado o
grau de risco à vida do operador
(3) Custos de Implementação:
Neste critério foram discutidas
as questões referentes à quantificação
durante a realização dos experimentos,
adicionado à facilidade de utilização
dos equipamentos necessários.
de animais, aquisição das células de
linhagem e reagentes utilizados. Além
disso, também foi considerada a infra-
3. R ESULTADOS E D ISCUSSÃO
estrutura e a mão-de-obra necessárias
ao laboratório, para cada uma das
3.1 Aspectos Procedimentais
culturas.
O estabelecimento da cultura
(4) Viabilidade da Cultura:
primária de neurônios é complexo,
pois envolve as etapas de dissecação
Foi analisado o tempo de vida
do animal, de dissociação do tecido
útil para cada cultura, ou seja, sua
obtido, além da etapa de manutenção
durabilidade para a realização de
das células. A etapa de dissecação
experimentos. Somado a isso, foi
requer do pesquisador um adequado
avaliado a facilidade/dificuldade de se
conhecimento anatômico do animal
manter a cultura viva por um período
utilizado
maior de tempo.
habilidade especial para se extrair o
no
experimento
e
uma
tecido de interesse. A implementação
(5) Aspectos Bioéticos:
deste tipo de cultura é demorada e por
isso, os experimentos são executados
somente após duas semanas.
12
Por outro lado, a implementação
Além
disso,
as
células
de
da cultura de linhagem estabelecida é
linhagem são imortalizadas. Dessa
mais simples, uma vez que envolve
forma,
somente as etapas de descongelamento
exponecial dessas células, enquanto
e manutenção das células adquiridas.
que a cultura primária teria um limite
Devido
os
máximo para o número de células em
experimentos podem ser realizados de
proliferação, as quais começariam a
três dias a uma semana após o
morrer, mesmo em meio nutritivo
estabelecimento da cultura.
adequado.
a
essa
facilidade,
existe
um
crescimento
TABELA II
Materiais e Reagentes Utilizados na Cultura de Linhagem
Materiais
Descongelamento
Manutenção
Células de glioblastoma M059J
Garrafa de cultura
Banho-maria
Pipeta
Pipeta
Microscópio óptico
Eppendorf
Estufa úmida
Centrífuga
Fluxo laminar
Reagentes
Fluxo laminar
Tripsina (enzima)
Meio DMEM ou Ham’s F12 suplementado com sais e
aminoácidos
Solução salina EDTA
Soro Fetal Bovino
de
3.2 Representatividade Fisiológica
glioblastoma
podem
viabilizar
diversos tipos de estudos, dependendo
da Cultura
do fenômeno que se deseja investigar.
Tanto
a
cultura
primária
de
A cultura de linhagem, por exemplo,
neurônios como a cultura de linhagem
pode ser útil em pesquisas celulares
13
que
frequentemente
necessitam
de
fármacos e cosméticos in vitro ou na
grandes quantidades de células, visto
compreensão
que
neoplasia (ALBERTS et al., 2006).
células
de
linhagem
têm
a
de
fenômenos
de
propriedade de proliferar por tempo
indefinido.
quando
Porém,
essas
células,
em
animais
injetadas
3.3 Custos de Implementação
susceptíveis, podem causar tumores.
Conforme podemos observar nas
Outra desvantagem é que como as
tabelas I e II, os dois protocolos citam
culturas
linhagem
são
materiais e reagentes semelhantes para
modificadas,
as
fazer a cultura. No entanto, a cultura
pela
primária de neurônios necessita de
correspondem
alguns materiais diferentes e de uma
características
quantidade maior de reagentes, uma
fenotípicas das células in situ. Nesse
vez que seu procedimento é mais
sentido, a cultura primária pode ser
longo e trabalhoso. Além disso, na
mais útil, uma vez que é mais estável,
cultura primária também existe a
em
das
necessidade de comprar os animais
que
necessários para o experimento e
linhagens
ainda há um custo para mantê-los
de
geneticamente
características
cultura
apresentadas
não
necessariamente
relação
às
à
características
alguns
manutenção
fenotípicas
tipos
geneticamente
de
do
modificadas
com
(alimentação,
limpeza,
características neoplásicas. Ademais,
armazenamento em locais específicos,
a cultura primária é mais eficaz em
infra-estrutura).
experimentos em que se deseja avaliar
experimentos
os efeitos da injeção de células em um
pequenas quantidades de células, a
animal, sem o risco acentuado do
cultura primária apresenta-se mais
desenvolvimento de tumores.
viável, visto ser necessário a compra
que
Então,
em
necessitam
de
do
de poucos animais, ficando o valor
objetivo do experimento, ambas as
total de implementação mais barato
culturas
que o da cultura de linhagem. No
Portanto,
podem
dependendo
ser
aplicadas
na
produção de vacinas anti-virais, no
entanto,
se
o
experimento
requer
estudo da imunologia, em ensaios de
muitas células, a cultura primária é
desvantajosa, uma vez que a compra
14
de um grande número de animais
assine um termo de consentimento.
eleva o seu custo. Nesse caso, a
Para
cultura de linhagem é mais viável.
linhagens celulares, esses aspectos
trabalhos
com
culturas
de
burocráticos não são necessários, pois
as células são adquiridas de um banco
3.4 Viabilidade da Cultura
de células
Tanto
as
linhagens
e não
diretamente de
celulares
animais ou de pacientes. Assim, as
quanto as células da cultura primária
culturas com células de linhagem
podem ser estocadas em temperatura
facilitam
de nitrogênio líquido a -196°C, por
humanas.
os
estudos
com
células
um período indefinido e continuarem
viáveis,
(ATCC,
quando
2009;
descongeladas
ALBERTS
et
3.6 Biossegurança
al.,
Em qualquer tipo de experiência
2006). Entretanto, o tempo médio de
vida útil de uma cultura primária de
laboratorial
neurônios
exposto a riscos biológicos, físicos e
é
de
dias
a
semanas,
o
pesquisador
devendo
enquanto que uma cultura de linhagem
químicos,
de glioblastoma pode ser mantida por
utilização
meses ou anos (NOVELINO et al.,
proteção
2003; BELENKOV et al., 2002).
calçados fechados) e coletivos (por
dos
estar
está
atento
equipamentos
individual
(luvas,
a
de
jaleco,
exemplo, capelas de fluxo laminar).
Experimentos com animais para a
3.5 Aspectos Bioéticos
obtenção da cultura primária exigem
Para a realização de pesquisas
uma atenção maior do pesquisador a
com culturas primárias é necessária a
fim
aprovação do comitê de ética da
arranhaduras,
instituição, visto que as células são
animal.
retiradas
tecidos
realizadas com culturas de linhagens,
animais. No caso de células retiradas
basta seguir as normas padrão de
diretamente do paciente humano, além
biossegurança.
diretamente
de
da aprovação do comitê de ética, é
preciso que o paciente ou um familiar
de
se
Já
evitar
estresse
para
mordidas,
e
fuga
do
experiências
15
TABELA III
Comparação Entre as Características Principais das Culturas
Critério
Cultura Primária de Neurônios
A
• Procedimento complexo e demorado
• Exige conhecimentos na anatomia do
animal
• Células mantêm as características
fenotípicas
• Crescimento limitado e pouca
durabilidade
• Maior gasto com reagentes
• Gastos para manter animais
• Vida útil de dias a meses
• Pode ser estocada a –196°C
• Células animais: aprovação do comitê
de ética
• Células humanas: comitê de ética e
termo de consentimento
• Equipamentos de proteção individual e
coletiva
• Atenção com os animais
B
C
D
E
F
Comparando-se
os
dois
protocolos foi possível constatar que a
viabilidade
e
o
menor
custo
Cultura de Linhagem M059J
• Procedimento simples, as células já
estão prontas
• Células geneticamente modificadas por
neoplasia
• Crescimento exponencial e de longa
duração
• Alto custo com a compra das células
• Vida útil de meses a anos
• Pode ser estocada a -196°C
• Células adquiridas em um banco de
células
• Facilitam os estudos com células
humanas
• Equipamentos de proteção individual e
coletiva
estudo requer uma grande quantidade
de células.
de
As células da cultura primária
implementação da cultura dependem
são mais frágeis e por isso possuem um
do experimento a ser realizado. Assim,
tempo de vida menor. Devido a isso,
a cultura primária fica mais barata que
existe a necessidade de se repetir os
a de linhagem quando poucas células
procedimentos
são necessárias para se realizar os
cultura for descartada, ocasionando em
procedimentos, ao passo que a cultura
maiores gastos com animais, materiais
de linhagem é mais viável quando o
e
reagentes.
toda
vez
Enquanto
que
isso,
uma
na
preparação da cultura de linhagem
16
economiza-se reagentes, uma vez que
linhagem, pelo fato do pesquisador
estas
geneticamente
necessitar de habilidades e de estudos
modificadas para aumentar sua vida
aprofundados da anatomia do animal, o
útil.
que pode retardar os experimentos.
células
foram
Outro fator agravante nos custos
Considerando a preparação das
da cultura primária é a compra e a
culturas, em qualquer laboratório, é
manutenção dos animais que serão
necessário seguir algumas normas de
utilizados para o fornecimento das
biossegurança.
células.
dependem
Para qualquer
estudo
que
do
Essas
nível
de
normas
risco
dos
necessite de animais, podem existir
reagentes utilizados. Através da análise
empecilhos com o comitê de ética, que
dos dois protocolos, verificou-se então
exigem
a
que ambos possuem um nível de risco
observância de uma série de normas
semelhante e relativamente pequeno,
para a execução dos experimentos,
embora o
como redução do número de animais e
exposto
conforto desses em laboratórios. Tais
manipulação dos animais.
dos
pesquisadores
pesquisador esteja mais
a
ferimentos
durante
a
exigências são muito mais brandas
para
as
culturas
com
células
de
4. C ONCLUSÕES
linhagem.
Além dos custos financeiros, é
importante também discutir o tempo de
Este
preparação e de repouso das culturas
diferentes
antes
porque
protocolos de culturas celulares para
protocolos mais rápidos agilizam as
então visualizar aquelas mais simples,
pesquisas. A cultura primária, neste
econômicas e que sejam coerentes com
caso, possui maior tempo tanto de
as
preparação quanto de repouso, uma vez
estabeleceram-se alguns critérios de
que existem mais procedimentos de
análise: 1) aspectos procedimentais, 2)
preparação.
representatividade
dos
experimentos,
Além
disso,
esses
questões
trabalho
discutiu
abordagens
bioéticas.
de
Para
fisiológica
as
dois
isso,
da
procedimentos são relativamente mais
cultura, 3) custos de implementação, 4)
complexos que aqueles da cultura de
viabilidade, 5) aspectos bioéticos e 6)
17
biossegurança. A Tabela III compara
podem
de
principais
experimentos. A cultura de linhagem
características da cultura primária de
glioblastoma, ao contrário da cultura
neurônios com a cultura de linhagem
primária de neurônios, não pode ser
de glioblastoma M059J, de acordo com
usada na MEA. No entanto, já existem
os critérios estabelecidos acima.
linhagens de neurônios que podem ser
maneira
sintética
Ambas
as
amplamente
grande
as
culturas
utilizadas
importância
ser
utilizadas
em
diversos
são
adquiridas e estudadas sob uma MEA,
e
possuem
mas para isso é necessário aprofundar
nos
estudos
os estudos nesse sentido para verificar
científicos atuais, cada uma com sua
se elas
especificidade.
nanodispositivos.
Entretanto,
estão
podem
ser
utilizadas
nos
surgindo novas obrigações para os
estudos com culturas celulares e cada
vez mais as culturas de linhagem
assumem
o
espaço
das
5. A GRADECIMENTOS
culturas
primárias. Do outro lado, são poucos
As autoras principais agradecem
os tipos celulares existentes como
a DIRPE/UFU pela compreensão e
linhagem e não se sabe ao certo se será
esforço, bem como à Fundação de
possível imortalizar todas as células
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
animais existentes, por isso as culturas
Gerais
primárias
amplamente
apoio financeiro através do Programa
utilizadas. Portanto, compete a cada
Institucional de Bolsas de Iniciação
pesquisador estudar as características
Científica (PIBIC) e à Universidade
da cultura desejada para então escolher
Federal de Uberlândia que também
uma que seja adequada aos objetivos e
promoveu apoio financeiro através do
aos
Programa Institucional de Bolsas do
ainda
recursos
são
financeiros
do
seu
experimento.
Por fim, em termos do critério de
representatividade, ambas as culturas
(FAPEMIG)
que
promoveu
Ensino de Graduação (PIBEG).
18
6. A NEXO - F ONTES
ASSOCIADA ÀS
DE INFORMAÇÃO PARA A COTAÇÃO DE PREÇOS ,
T ABELAS I E II.
Empresa
Sítio Oficial da Empresa Online
BUNKER - Equipamentos para
laboratório.
Disponível: <http://www.bunker.ind.br>
Acesso em: 03 de Março de 2009.
CIENLAB - Equipamentos Científicos
Disponível: <http://www.cienlab-loja.com.br>
Acesso em: 03 de Março de 2009.
CIRÚRGICA PASSOS - A Casa do
Profissional da Saúde
Disponível: <http://www2.ciashop.com.br/cpassos>
Acesso em: 03 de Março de 2009.
INVITROGEN CORPORATION
Disponível: <http:www.invitrogen.com.br>.
Acesso em: 03 de Março de 2009.
LABMAIS - Comércio, assistência
técnica e artigos para laboratórios
Disponível: <http://www.labmais.com.br/catalogo>
Acesso em: 03 de Março de 2009.
LGC Biotecnologia
Disponível: <http://www.lgcbio.com.br>
Acesso em: 03 de Março de 2009.
LOJALAB - Equipamentos para
Laboratórios
Disponível: <http://www.lojalab.com.br>
Acesso em: 03 de Março de 2009.
radiation and chemotherapeutic drugs.
7. R EFERÊNCIAS B IBLIOGRÁFICAS
Radiation Research, v. 134, p. 349-354,
1993.
ALBERTS, B. et al. Fundamentos da
biologia celular. Porto Alegre: Artmed,
ATCC® - The Global Bioresource Center.
2006. 866 p.
Disponível:
<http://www.atcc.org>.
Acesso em: 02 de Março de 2009.
ALLALUNIS-TURNER, M.J.; BARRON,
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for glioblastoma multiforme:
lines from a human malignant glioma
review.
specimen
Association. October, 2001.
differing
in
sensitivity
to
American
Brain
a brief
Tumor
19
BELENKOV,
A.I.;
PAIEMENT,
J.P;
PANASCI, L.C.; MONIA, B.P.; CHOW,
FROMHERZ, P.
T.Y.K.
with ion channels, nerve cells and brain.
An
Antisense
Oligonucleotide
Targeted to Human Ku86 Messenger RNA
Semiconductor chips
Physica, vol. 16, p. 24-34, 2003.
Sensitizes M059K Malignant Glioma Cells
to Ionizing Radiation, Bleomycin, and
GRISCOM,
L.;
DEGENAAR,
P.;
Etoposide but not DNA Cross-Linking
LEPIOUFLE,
TAMIYA,
E.;
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HIROYUKI, F. Techniques for patterning
5896, 2002.
and guidance of primary culture neurons
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on micro-electrode arrays. Sensors and
CLAVEROL-TINTURÉ, E.; GHIRARDI,
M.;
FIUMARA,
F.;
ROSELL,
Actuators B, vol. 83, p. 15-21, 2002.
X.;
CABESTANY, J. Multielectrode arrays
LAKARD, S.; HERLEM, G.; VALLES-
with elastomeric microstructured overlays
VILLAREAL; MICHEL, G.; PROPPER,
for extracellular recordings from patterned
A.; GHARBI, T.; FAHYS, B. Culture of
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for biosensor applications. Biosensors and
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fabrication
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performance
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RUTTEN, W.L.C. et al. Neuroelectronic
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electrically stimulated spinal cord neuronal
network cultured on microelectrode arrays.
RUTTEN, W.L.C. Selective electrical
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interfaces
2003.
Annual Review of Biomedical Engineering,
with
the
vol. 4, p. 407-452, 2002.
nervous
system.