Tese Adriana Daumas Perfil Imune anal e NIA_final_2014

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AS COINFECÇÕES VIRAIS E O PERFIL IMUNOLÓGICO DE PACIENTES HIV
POSITIVOS PORTADORES DE NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL
ADRIANA GONÇALVES DAUMAS PINHEIRO GUIMARÃES
MANAUS
2014
i
ADRIANA GONÇALVES DAUMAS PINHEIRO GUIMARÃES
AS COINFECÇÕES VIRAIS E O PERFIL IMUNOLÓGICO DE PACIENTES HIV
POSITIVOS PORTADORES DE NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas, para obtenção do grau de Doutor em
Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof°. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira
Co-Orientador: Profª. Dra. Adriana Malheiro
MANAUS
2014
G963a
Guimarães, Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro.
As coinfecções virais e o perfil imunológico de pacientes
HIV positivos portadores de neoplasia intraepitelial anal /
Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro Guimarães. -- Manaus :
Universidade do Estado do Amazonas, UFAM, 2014.
45 f. : il.
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas, 2014.
Orientador: Prof°. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira
Co-Orientador: Profa. Dra. Adriana Malheiro
1. Virus – HIV 2.Coinfecção anal 3. Perfil imunológico –
Paciente – HIV I. Título.
CDU: 616.98
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária. Sheyla Lobo Mota.
CRB: 484
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
AS COINFECÇÕES VIRAIS E O PERFIL IMUNOLÓGICO DE PACIENTES
HIV POSITIVOS PORTADORES DE NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL
ADRIANA GONÇALVES DAUMAS PINHEIRO GUIMARÃES
“Esta tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
Prof. Luiz Carlos de Lima Ferreira, Dr. Presidente
Prof. Marcelo Cordeiro dos Santos, Dr. Membro
Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr. Membro
Prof. Carmem Ruth Mazione Nadal, Dr. Membro
Prof. Olindo Assis Martins Filho, Dr. Membro
iii
DEDICATÓRIA
Aos meus amores:
José Jorge Pinheiro Guimarães
Paulo Daumas Kale Martins
Roberta Daumas Kale Martins
Bárbara Daumas Kale Martins
iv
AGRADECIMENTOS
Aos pacientes que se doam à pesquisa na esperança de alcançarem a cura para suas
dores nem sempre físicas, nem sempre abordáveis.
Aos orientadores Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira e Prof. Dra. Adriana Malheiro
pelo estímulo, apoio, disponibilidade e por acreditarem em mim.
Aos colegas patologistas da FMTHVD José Ribamar de Araújo e Rosilene Viana de
Andrade pelo apoio, carinho e esntusiasmos com o qual sempre trataram minha
pesquisa.
A técnica de enfermagem Elizabeth Monteiro, pela dedicação, pelo amor aos pacientes,
por se doar a esta pesquisa e por sestar sempre pronta a ajudar.
Os autores agradecem ao Dr Leandro Baldino, aos estudantes de medicina Aline Lury
Hada, Bruno Queiroz e Isabelle Gracinda Aguiar; aos farmacêuticos Andreza Fernandes,
Carolina Marinho e Cristiana Lima Laranjeira.
Aos técnicos da patologia da FMT-HVD, Sandra Caranhas, Carlos Melquiades Marques,
Sandra Eline e Sra. Maria Araújo pela ajuda incondicional e por sempre me acolherem
com um soriso.
A toda a equipe de suporte hospitalar da FMT-HVD pelo carinho e suporte indispensável
a conclusão deste estudo.
A Secretaria Estadual de Saúde do Amazonas, na figura do Exmo Sr Secretário de
Saúde Dr Wilson Duarte Alecrin por acreditar e apoiar o sonho de uma jovem médica.
A FAPEAM, PPSUS e a FMT-HVD por alocarem os recursos necessários à realização
deste estudo.
Ao Dr Joaquim Alves de Barros Neto por sua amizade e apoio fundamental a este
estudo.
Aos colegas do plantão de domingo do Hospital Dr João Lúcio Pereira Machado por seu
apoio, amizade e incentivo à concretização deste estudo.
Ao diretor do Hospital de Aeronáutica de Manaus, Cel Med Jorge Viana Annibal pelo
apoio e concessões indispensáveis à concretização deste projeto.
A coordenação e mestres do programa de Doutorado strictu sensu em Doenças
Tropicais e infecciosas da Universidade Estadual do Amazonas e Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela confiança, apoio e estímulo a conclusão deste
estudo.
A farmacêutica Andreza Fernandes pelo apoio e dedicação na execução dos
procedimentos imunohistoquímicos, tão necessários ao fortalecimento deste estudo.
Ao Farmacêitico João Paulo Pimentele e ao Enfermeiro Allyson Guimarães pelo apoio,
esclarecimentos e auxílio indispensáveis a execução dos procedimentos de citometria de
fluxo.
v
A farmacêutica Carolina Marinho e a biomédica Renata Galvão pela presteza e esmero
na execução dos testes moleculares cumprindo meu exíguo prazo.
Aos alunos do projeto de pesquisa “Câncer Anal”, em especial a Aline Hada, Josy
Abranches, Isabella Aguiar e Bruno Queiroz pelas horas de dedicação a este trabalho,
por compartilharem a minha angústia e por me incentivarem a permanecer na pesquisa.
Aos amigos que souberam compreender minha ausência e esquecimentos, em especial
à Paula Hargraves e à Júnia Ferreira Dutra que nos momentos de angústia sempre me
ofereceram afeto.
Ao meu pai, Bento Daumas, in memoriam, pela herança do prazer pelo estudo e pelo
orgulho refletido em seu olhar.
A minha mãe, Sebastiana de Carvalho Gonçalves, por ser tão maravilhosa e por sua
docura, braveza e honestidade com os quais nos educou. Jamais conseguirei
compensar seus esforços!
A meus filhos Paulo, Roberta e Bárbara, meus verdadeiros tesouros, pelo seu amor, por
terem suportado minha ausência, e por permanecerem junto à mim.
Ao meu amado marido José Jorge Pinheiro Guimarães pelo exemplo, impulso à vida
acadêmica, questionamentos científicos certeiros e principalmente por seu grande e
maravilhoso coração.
A Deus por tanto ter me dado sem que houvesse merecimento algum. A Ti, meu Senhor
e Salvador toda Honra e Toda a Glória!
vii
RESUMO
INTRODUÇÃO: Em todo o mundo a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana
(HIV) estendeu-se primariamente como resultado da exposição sexual ocasionando um
acentuado aumento da incidência global do câncer anal. Nestes indivíduos, as interaçoes
entre vírus como o HPV, Herpes simples, Citomegalovírus e Epstein-Barr são frequentes
na região perianal e parecem aumentar o risco de células infectadas pelo HPV causarem
lesões neoplásicas, decorrente da indução à respostas imunes tolerogênicas associadas
as falhas na resposta citotóxica. Apesar do advento da terapia antiretrovital (TARV) ter
sido essencial para a queda da morbidade e mortalidade associada a infecção pelo HIV,
a reconstrução imune celular apresenta falhas traduzidas pelo aumento dos tumores não
definidores de aids, entre eles o câncer anal. MATERIAIS E MÉTODOS: No primeiro
estudo as taxas de co-infecção anal em pacientes com NIA foram avaliadas em 69
pacientes HIV-positivos e 30 HIV-negativos do sexo masculino submetidos à avaliação
citológica por captura híbrida para a detecção do HPV e PCR em tempo real vírus para
detecção do Epstein-Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpes (HSV) tipo 1 e 2,
anuscopia magnificada e análise histopatológica. No segundo estudo, uma abordagem
de biologia de sistemas foi utilizado, a fim de integrar diferentes parâmetros
imunológicos do tecido da mucosa anal e do sangue periférico avaliada por análise
fenotípica e intra-citoplasmática de linfócitos e subpopulações de células dendríticas. Os
pacientes foram submetidos à análise histopatológica, seguida de análise, por citometria
de fluxo, das células dendríticas (CD11c+/CD123-, CD11c-/CD123+, CD1a+ e CD209+),
de linfócitos (CD45+ e CD3+/CD4+) além da expressão de citocinas séricas e
citoplasmáticas. RESULTADOS: No primeiro estudo a taxa de coinfecção viral foi de
16,9% nos casos de DST e diretamente correlacionada à carga viral HIV-1 maior que
10,001 cópias / mL (p= 0,017). A prevalência de NIA foi de 35% e restrita aos pacientes
HIV positivos. Os pacientes infectados com o HPV de alto risco e com contagem inferior
a 50 células T CD4+/mL apresentaram taxa de neoplasia intraepitelial anal(NIA) de
85,7%, (p <0,01). No segundo estudo, avaliamos 60 pacientes HIV-positivos e 25 HIVnegativos (sem fatores de risco para o câncer anal). Os dados demonstram que as
células mononucleares da mucosa anal de pacientes HIV(+)NIA(+) mostraram uma
robusta capacidade de produção de citocinas pró-inflamatórias/reguladoras,
principalmente mucosa (m)TNF-α > IL-4> IL-10> IL-6 = IL-17a. TNF-αIFN-γ/IL-17a da
mucosa são biomarcadores seletivos da HSIL. Níveis circulantes elevados de células
CD11c+ CD123Low e CD1a+, juntamente com níveis elevados de células IFN-γ+ TCD4+
são características importantes associadas ao HSIL em pacientes (NIA+)(HIV+).
Independentemente da presença de NIA, pacientes HIV(+) apresentaram uma rede
complexa de biomarcadores, rico em conexões negativas. Entre esses pacientes, no
entanto, os pacientes HSIL+ exibiram vínculos positivos mais fortes entre o sangue
periférico e o ambiente da mucosa anal, exemplificadas pela sub-rede de IL-17a/TNFα/CD4+ IFN-γ+/ células CD11c+CD123Low.
CONCLUSÕES: Na principal Instituição para o tratamento de HIV/aids na região
amazônica do Brasil, a co-infecção anal pelo HPV, CMV, HSV-1, HSV-2 e EBV ocorreu
seletivamente em pacientes HIV-positivos sendo influenciada pela carga viral do HIV. A
associação significativa entre HSIL e os níveis de TNF-α / IL-17A / IFN-γ juntamente com
os diferentes subconjuntos de DC presentes no ambiente da mucosa anal deve ser
estudado em mais detalhe como uma maneira de identificar e categorizar os pacientes
HIV (+) sob alto risco de desenvolvimento do câncer anal.
PALAVRAS-CHAVE: Canal anal, Células dendríticas, Co-infecção anal, HIV, aids,
Papilomavírus Humano, HPV, PCR em tempo real, Análise Histopatológica, Epstein-Barr
Vírus, EBV, Citomegalovírus, CMV, Herpes Simples Vírus, HSV, Neoplasia intraepitelial
escamosa anal, NIA, Resposta imune, Citocinas, Citometria de fluxo.
vii
ABSTRACT
INTRODUCTION: Worldwide infection by the human immunodeficiency virus (HIV)spread
primarily as a result of sexual exposure causing a sharp increase in the overall incidence
of anal cancer. In these individuals, the interactions between viruses like HPV, herpes
simplex, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus are frequent in the perianal region and
appear to increase the risk of HPV-infected cells cause neoplastic lesions resulting from
the induction of tolerogenic immune responses associated with failures in the response
cytotoxic. Despite the advent of antiretrovital therapy (ART) have been essential to the fall
of the morbidity and mortality associated with HIV infection, the cellular immune
reconstruction has flaws translated by the increase in non-AIDS-defining tumors, including
anal cancer. In the studies we demonstrate rates of NIA and anal coinfection and that the
evaluation of systemic and compartmentalized anal mucosa immune response is relevant
to differentiating HIV(+) patients at risk of anal intraepithelial neoplasia (AIN). MATERIALS
AND METHODS: In the first study, anal rates in co-infected patients with NIA were
evaluated in 69 HIV negative (-) and 30 HIV (+) male patients undergoing cytologic
evaluation by hybrid capture assay for HPV detection and real time PCR for detection by
Epstein-Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV), herpes (HSV) types 1 and 2, magnified
anuscopy and histopathological analysis. In the second study, a systems biology approach
was utilized in order to integrate different immunological parameters from anal mucosal
tissue and peripheral blood assessed by phenotypic and intra- cytoplasmic analysis of
lymphocytes and dendritic cell subsets. RESULTS: In the first study, the rate of viral
coinfection was 16.9% in cases of STD and directly HIV-1 viral load greater than 10,001
copies/mL correlated (p = 0.017). The anal intraepithelial neoplasia (AIN) prevalence was
35% and restricted to HIV (+) patients. Patients infected with high-risk HPV and with less
than 50 TCD4+ cells/mL showed count rate of AIN of 85.7% (p <0.01). In the second
study, we evaluated 60 HIV (+) patients and 25 HIV negative (-) (no risk factors for anal
cancer). Our data demonstrated that anal mucosal mononuclear cells from
AIN(+)HIV(+)patients showed a robust capacity in producing proinflammatory/regulatory
cytokines, mainly (m)TNF-α > IL-4> IL-10> IL-6 = IL-17a. Mucosal TNF-α IFN-γ/IL-17a are
selective HSIL-related biomarkers. Higher levels of circulating CD11c+CD123Lowcells,
and CD1a+ cells along with elevated levels of IFN- γ+CD4+ T-cells are major features
associated with HSIL in AIN(+)HIV(+)patients. Regardless of the presence of AIN, HIV(+)
patients presented a complex biomarker network, rich in negative connections. Among
those patients, however, HSIL+ patients displayed stronger positive links between
peripheral blood and anal mucosa environments, exemplified by the subnet of IL-17A/TNFα /CD4+IFN- γ+/CD11c+CD123Low cells. CONCLUSIONS: In the main Institution for the
HIV/AIDS treatment of in the Amazon region of Brazil, the co-anal infection by HPV, CMV,
HSV-1, HSV-2 and EBV selectively occurred in HIV(+) patients with viral load HIV
associated. The significant association between HSIL and the levels of TNF-α/IL-17A/IFNγ along with the different subsets of DCs present in the anal mucosa milieu should be
studied in more detail as a way to identify and cathegorize HIV(+) patients vis à vis the
high risk of anal cancer outcome.
KEYWORDS: Anal cancer, dendritic cells, anal co-infection, HIV, aids, Human
Papillomavirus, HPV, Histopathological analysis, Real time-PCR, Epstein-Barr Vírus, EBV,
Herpes Simplex Virus, HSV, Anal Intraephitelial Neoplasia, AIN, Anal cancer, Immune
response, Cytokines, Flow cytometry.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Anatomia do canal anal- Secção longitudinal ..............................................2
Figura 2 - Modelo de Diferenciação das DC.................................................................11
Figura 3 - Interação entre DC imatura, contendo o vírus da imunodeficiência símia
e linfócitos t cd4+. ..........................................................................................................14
Figura 4 - Identificação dos Leucócitos (CD45+) no programa FlowJo (versão 9.4) 29
Figura 5 - Identificação dos Linfócitos T CD4+ no programa FlowJo (versão 9.4)...29
Figura 6 - Identificação das Células Dendríticas Epiteliais (CD1a+) no programa
FlowJo (versão 9.4) ........................................................................................................30
Figura 7 - Identificação das Células Dendríticas Subepiteliais DC-SIGN (CD209+) no
programa FlowJo (versão 9.4).......................................................................................30
Figura 8 - Identificação dos Linfócitos T CD4+no programa FlowJo (versão 9.4)....34
Figura 9 - Identificação dos Monócitos (CD14+)no programa FlowJo (versão 9.4)..35
Figura 10 - Identificação das Células Dendríticas CD1a+no programa FlowJo
(versão 9.4)......................................................................................................................35
Figura 11 - Identificação das Células Dendríticas Mielóides (CD11c+/CD123-)(A) e
Plasmocitóides (CD11c-/CD123+)(B) no programa FlowJo (versão 9.4) ....................36
ARTIGO 4.1
Figura 1 - Representative flow cytometric analysis of mononuclear cell
subsets…………………………………………………………………………………………..66
Figura 2 - Phenotypic and functional features of peripheral blood and anal mucosal
mononuclear cells from AIN(-)HIV(-) ( ),AIN(-)HIV(+) ( ) and AIN(+)HIV(+) ( )
individuals.......................................................................................................................67
Figure 3 - In vitro cytokine secretion profile (IL-6, TNF, IL-2, IFN-Y, IL-4, IL-10
AND IL-17A) of anal mucosa (M) and peripheral blood (PB) mononuclear cells from
AIN(-)HIV(-), AIN(-)HIV(+) and AIN(+)HIV(+) individuals……………………….………68
Figura 4 - Histopathology, phenotypic and functional features associated with anal
intraepithelial neoplasia (AIN).......................................................................................69
Figura 5 - Systemic analysis of phenotypic and functional features of peripheral
blood and anal mucosa of HIV(+) patients and
controls............................................................................................................................70
ARTIGO 4.2
Figura 1 - Rates of anal viral coinfection......................................................................83
ix
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 - Classificação clínica e laboratorial dos pacientes com infecção pelo HIV
............................................................................................................................................7
Quadro 2 - Anticorpos utilizados para a marcação celular da mucosa anal ............28
Quadro 3 - Anticorpos utilizados na marcação das células mononucleares do
sangue periférico............................................................................................................33
ARTIGO 4.1
Tabela 1 - Description of the study population ..........................................................65
ARTIGO 4.2
Tabela 1 - The association of ain with oncogenic
HPV…………………………………80
Tabela 2 - The relationship between ain severity and the duration of HAART
use………………………………………………………………………………………………..82
Tabela 3 - The occurrence of ain in relation to the peripheral levels of t CD4 cells in
HIV-positive individuals infected with high-risk HPV..…………………………………83
Tabela 4 - Histopathological studies of coinfected patients………………………….84
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Aids
AMI
APC
AR
CBA
CDC
CD
CD1a
CD4+
CD8+
céls/mm2
CMV
CTL
CXCR4
CXCR7
DST
DC
DC-SIGN
DNA
EDTA
EFV
FACS
FCECON
FITC
FMT-HVD
Fms-like
FLT3
FSC
Síndrome da imunodeficiência adquirida
Anuscopia com magnificação de imagens
Células apresentadoras de antígenos
Adeptos do sexo anal receptivo
Cytometric bead array
Center of diseases control and prevention
Cluster of differentiation
Membro da família do grupo I das proteínas CD1. Glicoproteína
expressa na superfície de células apresentadoras de antígenos
Grupo especializado de linfócitos T que expressam o receptor CD4,
também chamado de linfócito T helper
Grupo especializado de linfócitos T que expressam o receptor CD8,
também chamado de linfócito T citotóxico
Células por milímetro ao quadrado
Citomegalovírus
Cytotoxic T Lymphocyte (linfócitos T citotóxico)
Receptor celular (de quimiocinas) tipo 4
Receptor celular (de quimiocinas) tipo 7
Doenças sexualmente transmissíveis
Células dendríticas
DC-specific, ICAM-3 grabbing, nonintegrin
Ácido desoxiribonucleico
ácido etilenodiamino tetraacético
Efavirenz
Fluorescence-Activated Cell Sorter
Fundação Centro de Controle de Oncologia do Estado do Amazonas
isotiocianato de fluoresceína
Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado
Soluble Fms-like tyrosine kinase-1
fms-like tiyrosine kinase 3 ligant
Forward Light Scatter
xii
GM-CSF
HAART
HEMOAM
HIV
HPV
HSH
HSIL
HSV
IC
ICAM
IL
iNOs
IFN
INCA
INTR
INTR
LC
LPG
LPV/r
LSIL
M-CSF
MDDC
MDSC
MSC
MFI
MFF
MHC
Nef
NIA
NIA I
NIA II
NIA III
NIC
NK
NIC I
NIC II
NIC III
OR
PMA
PBS
PBMC
PCR
PE
PERCP
RNA
Fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos
High activity antiretroviral therapy (terapia anti-retroviral de alta
potência)
Fundação de hematologia e hemoterapia do Amazonas
Human immunodeficiency vírus (vírus da imunodeficiência humana)
Human Papillomavírus (papilomavírus humano)
Homens que fazem sexo com homens
High Squamous Intraepithelial Lesion (lesão intra-epitelial escamosa
de alto grau)
Herpes simples vírus
Intervalo de confiança
intercellular adhesion molecule (molécula de adesão intercelular)
Interleucinas
Oxido nítrico síntase
Interferon
Instituto de Oncologia
Inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa
Inibidores não-nucleosídeos da transcriptase reversa
Langerhan’s cells (células de Langerhan’s)
Linfadenopatia generalizada persistente
Lopinavir/ritonavir
Low Squamous Intraepithelial Lesion (lesão intraepitelial escamosa
de baixo grau)
macrophage colony-stimulating factor
Célula dendrítica derivada de monócitos
Células supressoras de linhagem mielóide
Myeloid suppressor cells (células mielóides supressoras)
média de intensidade de fluorescência
Macs Facs fix (Solução Fixadora)
Major Histocompatibility Complex (complexo principal de
histocompatibilidade)
Negative factor (fator negativo)
Neoplasia Intraepitelial anal
Neoplasia Intraepitelial anal de baixo grau ou leve
Neoplasia Intraepitelial anal de moderado grau
Neoplasia Intraepitelial anal de alto grau ou grave
Neoplasia Intraepitelial cervical
Natural Killer
Neoplasia Intraepitelial cervical de baixo grau
Neoplasia Intraepitelial cervical de moderado grau
Neoplasia Intraepitelial cervical de baixo grau
Odds ratio (razão de chances)
acetato miristato de forbol
Phosphate buffered saline
Peripheral blood mononuclear cell (Células mononucleares do
sangue periférico)
Reação de cadeia da polimerase
phico eritrina
peridina-clorofila
Ácido ribonucléico
xiii
RLU
RNA
RPMI
RR
R5
SCC
STAT5
SIV
TA
TAM
TAP
TARV
TCLE
TDF
TGF-ß
TILs
TNF-α
TNF- ß
TLR
Treg
UFAM
UEA
VEGF
ZTA
3TC
WHIM
relative light units
Ácido ribonucleico
Roswell Park Memorial Institute médium
Risco relativo
Vírus tipo 1 do HIV que utiliza o receptor CCR5
Right Angle Scatter
signal transducer and activator of transcription 5
Simian immunodeficienty vírus (vírus da imunodeficiência dos símios)
Temperatura ambiente
Macrógagos associados a tumor
Transporter associated with antigen presentation
Terapia anti-retroviral de alta potência
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Tenofovir
Fator de crescimento e transformação tumoral beta
tumor infiltrating lymphocytes
Fator α de necrose tumoral
Fator ß de necrose tumoral
Receptores TOLL-like( receptores do tipo Toll)
Células T Regulatórias
Universidade Federal do Amazonas
Universidade Estadual do Amazonas
Vascular endothelial growth factor
Zona de transição anal
Lamivudina
Warts, Hypogammaglobulinemia, Infections and Myelokathexis
syndrome
xiv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 1
1.1 Aspectos Relevantes que Cercam a Anatomia do Canal Anal ..................................1
1.2 A Neoplasia Intraepitelial Cervical e Anal ..................................................................2
1.2.1 Incidência do Câncer Anal ....................................................................................3
1.2.2 Fatores de Risco Relacionados à Neoplasia Intraepitelial Anal ...........................4
1.3 O papel do Papilomavírus humano (HPV) .................................................................5
1.4 Incidência da aids e Epidemiologia do HIV na Neoplasia Intraepitelial Anal e no
Câncer ..............................................................................................................................6
1.5 Classificação Clínica e Laboratorial da Infecção pelo HIV-1......................................6
1.5.1 A Terapia Antirretroviral de Alta Potência (TARV) ................................................8
1.5.2 O papel da TARV na progressão da NIA/câncer ..................................................8
1.6 Resposta Imune e a Caracterização das Células Dendríticas ...................................9
1.6.1 Maturação das Células Dendríticas ....................................................................10
1.6.2 Origem e Diferenciação das DC .........................................................................10
1.6.2.1. Facilitação da Aquisição Sexual do HIV ......................................................13
1.6.2.2 Células Dendríticas não-LC, co-receptores e a Infecção pelo HIV ..............14
1.6.2.3 O papel da DC DC-SIGN+ nas Infecções Via DC .........................................14
1.6.3 Variações nas Frequências das DC e o Risco de Câncer ..................................15
1.6.4 A geração de respostas regulatórias ..................................................................16
1.6.5 DC e a importância dos Mecanismos de Tolerância ..........................................16
1.6.6 Estratégias de escape tumoral ...........................................................................18
2 OBJETIVOS................................................................................................................... 21
2.1 Geral.........................................................................................................................21
xv
2.2 Específicos ...............................................................................................................21
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 22
3.1 Modelo de Estudo ....................................................................................................22
3.2 Universo de Estudo ..................................................................................................22
3.2.1 População de Estudo ..........................................................................................22
3.2.2 Critérios de Inclusão ...........................................................................................22
3.2.3 Critérios de Exclusão (para ambos os grupos) ...................................................23
3.3. Classificação e definição dos Grupos de Estudo ....................................................23
3.4 Procedimentos .........................................................................................................24
3.4.1 Coleta..................................................................................................................24
3.4.2 Emprego dos meios diagnósticos .......................................................................24
3.4.2.1 Anuscopia com Magnificação de Imagens (AMI) e Obtenção das Amostras
Teciduais ..................................................................................................................24
3.4.2.2 Coleta de amostra sanguínea ......................................................................25
3.4.2.3 Diagnóstico Histológico ................................................................................26
3.4.2.4 Preparo dos Fragmentos de Mucosa Anal ...................................................26
3.4.2.5 Cultura in vitro das células isoladas da Mucosa Anal ..................................27
3.4.2.6 Imunofenotipagem das células obtidas dos Fragmentos de Mucosa Anal ..27
3.4.2.7 Isolamento das Células Mononucleares (PBMC) por Gradiente de Ficoll ...31
3.4.2.8 Cultura in vitro das Células do Sangue Periférico ........................................31
3.4.2.9 Imunofenotipagem das Células do Sangue Periférico e marcação das
citocinas citoplasmáticas ..........................................................................................32
3.4.2.10 Dosagem de Citocinas no Sobrenadante de Cultura dos Fragmentos de
Mucosa Anal (Cytometric Bead Array - CBA) ...........................................................36
3.4.3 Detecção do HPV por Captura Híbrida ...............................................................37
3.4.4 Diagnóstico Molecular dos vírus Herpes 1 e 2, EBV e CMV através do Rapid
Real-Time PCR System .................................................................................................38
3.4.5 Diagnóstico sorológico do HIV ............................................................................38
3.4.6 Contagem de linfócitos T CD4+ e determinação da carga viral do HIV ..............38
3.5 Análise dos Resultados ............................................................................................39
3.5.1 Amostra...............................................................................................................39
3.5.2 Cálculo da Amostra.............................................................................................39
3.5.3 Tratamento Estatístico ........................................................................................39
3.5.4 Considerações Éticas .........................................................................................40
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 40
xvi
4.1 Artigo 1. CD11c+CD123Low Dendritic Cell subset and the triad TNF-α/IL-17A/IFN-γ
integrate mucosal and peripheral cellular responses in HIV patients with High-grade
anal intraepithelial neoplasia – a systems biology approach. ........................................41
4.2 Artigo 2. Coinfection of Epstein-barr Virus, Cytomegalovirus, Herpes Simplex Virus,
Human Papillomavirus and Anal Intraepithelial Neoplasia in HIV Patients in Amazon,
Brazil. .............................................................................................................................71
5 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 85
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 86
7 ANEXOS ........................................................................................................................ 97
7.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .........................................................97
7.2 Cronograma de Execução Física .............................................................................99
7. 3 Orçamento – PPSUS-FAPEAM ............................................................................100
7.4 Equipe Científica ....................................................................................................103
7.5 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisas (CEP) ............................................104
7.6 Certificado de edição na língua inglesa referente ao artigo 4.1.............................105
7.7 Artigo suplementar - IHQ CD1a e DCSIGN ...........................................................106
7.8 Outras produções científicas ocorridas durante o doutoramento...........................125
1
1 INTRODUÇÃO
Em todo o mundo, a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV)
estendeu-se primariamente como resultado da exposição sexual através das superfícies
mucosas, o que ocasionou significante aumento da incidência global do câncer anal
principalmente entre homens HIV positivos que fazem sexo com homens (Levis, 2010). o
câncer anal, à semelhança com o câncer cervical, apresenta como estágio precedentes
a neoplasia escamosa intraepitelial (NIA) e a forte associação causal com o HPV
(MELBYE e SPROGEL, 1991; PALEFSKY et al., 1991; ZAKI et al., 1992).
A defesa do organismo contra invasores virais potenciais nas mucosas é realizada
principalmente pela imunidade inata, que entre seus agentes efetores destaca-se as
células dendríticas dispostas nos sítios de interação entre o indivíduo e o meio, que
capturam e carreiam partículas virais até as estações linfáticas dando início a resposta
imune. Nos pacientes imunocomprometidos são descritos alterações no perfil fenotípico
e funcional das células dendríticas que acarretariam uma deficiente resposta imune
frente à infecções facilitando o desenvolvimento de neoplasias malignas locais (TAY et
al., 1987; SOBHANI et al., 2004; NADAL et al., 2006; BURG et al., 2007).
1.1 Aspectos Relevantes que Cercam a Anatomia do Canal Anal
O canal anal é a porção terminal do aparelho digestivo que mede cerca de 2,5 cm
e inicia-se à altura da linha pectínea e termina no orifício anal ou ânus, sendo revestido
por pele completa que se abre na região perineal em forma de fenda longitudinal (DINIZ,
1999). O ânus é precedido, por um segmento revestido por pele modificada desprovida
de pêlos, o anoderma, até a linha pectínea (Figura 1). O epitélio de revestimento do
canal anal é do tipo estratificado escamoso abaixo da linha pectínea e colunar simples
acima desta. A região é envolta pela musculatura puborretal.
2
Figura 1 - Anatomia do canal anal- Secção longitudinal
Fonte: http://www.medscape.com/viewarticle/489483_2
1.2 A Neoplasia Intraepitelial Cervical e Anal
O epitélio displásico ou portador de lesões intraepiteliais escamosas é
caracterizado pela presença de graus progressivos de anomalias de diferenciação
celular e de maturação, ocorridas desde a membrana basal até a superfície epitelial. As
alterações são classificadas em leve ou neoplasias intraepitelial escamosa de baixo grau
(NIAI), cujas alterações ocupam 1/3 da espessura do epitélio escamoso, podendo
apresentar células atípicas, porém sem mitoses atípicas. O grau moderado ou neoplasia
intraepitelial escamosa de grau moderado (NIAII), apresenta alterações que ocupam 1/2
da espessura do epitélio, onde células atípicas podem ser vistas, mas não figuras de
mitoses. Na forma grave ou neoplasia intraepitelial escamosa de alto grau (NIAIII) há
extensa destruição da arquitetura de todo epitélio, presença de atipias citoplasmáticas,
nucleares e mitoses. Por fim, a NIA pode evoluir para o carcinoma in situ ou o carcinoma
invasivo escamoso quando ocorre infiltração da lâmina própria por aglomerados de
células tumorais (BANDEIRA et al., 2001; APGAR e ZOSCHNICK, 2003; ABRAMOWIT
et al., 2007).
A neoplasia intraepitelial já é bem estabelecida como precursora do câncer cervical e
parece desempenhar papel semelhante na gênese do câncer anal. Sendo assim, a
3
transposição do conhecimento da oncogênese do câncer cervical para o câncer escamoso
anal foi apresentada por compartilharem características biológicas, inclusive sob aspectos
histopatológicos e anatômicos, como a zona de transição epitelial, o papel do HPV e
similaridades entre a lesão intraepitelial escamosa cervical e a anal, consideradas precursoras
dos cânceres cervicais e anais, respectivamente (MELBYE e SPROGEL, 1991; PALEFSKY
et al., 1991; ZAKI et al., 1992)
Chin-Hong et al. (2005) postulam que a evolução para o desfecho do carcinoma
anal ocorra entre 9 a 10 anos. Apesar da progressão da NIA de neoplasia intraepitelial
anal leve (NIA I) a NIA III nem sempre ocorrer, ela é clinicamente importante, conforme
relatado por Palefsky J. (2000), quando reporta 62% de NIA I em pacientes portadores
do vírus da imunodeficiência humana e em 36% de homossexuais masculinos HIV
negativos, com progressão da lesão para NIA III em 2 anos
1.2.1 Incidência do Câncer Anal
O câncer anal é incomum na população geral, com uma incidência de 0,8 casos
para cada 100.000 habitantes, sendo até cinco vezes mais incidente em mulheres e,
após a sexta década de vida (FRIEDMAN et al., 1998; LOIOLA, 2007). Após a epidemia
de aids, a prevalência do câncer anal entre homens que fazem sexo com homens (HSH)
tornou-se superior a do câncer cervical, antes do emprego da técnica do Papanicolau
para o seu rastreamento (PALEFSKY e HOLLY, 1995), sendo impulsionada a
35/100.000 em HSH HIV negativos a até 80/100.000 em HSH HIV positivos com baixos
níveis periféricos de linfócitos T CD4+ (MARTINS, 2005; VOLBERDING, 2000),
passando, nestes grupos, a ser mais prevalente na terceira e quarta décadas de vida
(FRIEDMAN et al., 1998)
No Brasil, o Instituto Nacional do câncer (INCA) publicou que no período de 2000
a 2004, foram registrados 234 casos de câncer anal na cidade de São Paulo, enquanto
no mesmo período apenas 10 casos foram registrados no Amazonas (INCA, 2010). Na
revisão realizada no banco de dados da Fundação Centro de Controle de Oncologia do
Estado do Amazonas (FCECON), principal Instituição pública de referência no
tratamento de neoplasias malignas do Estado do Amazonas, no período de 2002 a
outubro de 2011, foram registrados 42 casos de carcinoma do ânus, 12 em homens, dois
4
destes em pacientes HIV-positivos (FCECON, 2011). Na
Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), principal unidade de referência para o
tratamento do HIV/aids no Estado do Amazonas, em quase sete anos de rastreamento
do câncer anal, somente 01 caso de carcinoma epidermóide anal foi detectado em
paciente HIV-positivo, do sexo feminino e que apresentava histórico de radioterapia por
carcinoma de colo uterino. (DAUMAS et al., 2011- dados referentes aos anos de 2005 e
2006; GIMENEZ et al., 2008; TRAMUJAS et al., 2011)
1.2.2 Fatores de Risco Relacionados à Neoplasia Intraepitelial Anal
Vários eventos têm sido imputados no desfecho NIA/câncer, com importâncias
díspares entre os estudos, em especial os relacionados aos fatores sóciocomportamentais, dentre eles a multiplicidade de parceiros sexuais, o tabagismo, as
doenças sexualmente transmissíveis (DST) e a prática do sexo anal receptivo (AR)
(DALING et al.,1987; KREUTER et al., 2005). Fatores biológicos como a presença de
NIA, a frequência das células dendríticas na mucosa e a imunodepressão sistêmica são
também apontados como contribuintes à este desfecho (SOBHANI et al., 2002,
YAGHOOBI et al., 2010)
Entre homossexuais HIV negativos, adeptos da prática do sexo anal receptivo,
Chin-Hong et al. (2005) descreveram importantes taxas de NIA, 15% de NIA I e 5% de
NIA III e taxas de detecção do HPV entre 20% e 57% respectivamente. O risco de
desenvolvimento do câncer quando relacionado com AR tem apresentado conflitos entre
os dados dos autores, não se mostrando como fator de risco isolado para Sobhani et al.
(2001; 2004), embora os estudos de Daling et al. (1987) tenham relatado NIA III em
37% dos HSH homossexuais ou bissexuais e em apenas 1 caso no grupo controle,
representando risco de 33,1 para o grupo masculino e de 1,8 para o feminino
Quanto a progressão da NIA, Palefsky et al. (1997) relataram estimativa da
progressão à NIA III de 49% em 04 anos entre os HSH HIV positivos e de 17% nos
demais, e segundo Palefsky et al. (2002), a taxa de NIA III, mesmo com o descontinuar
do sexo anal receptivo, tende a se manter
O papel das doenças sexualmente transmissíveis foi elegantemente abordado por
5
Daling et al. (1987) que descreveram risco de 17,2% para pacientes com histórico de
infecção pela Neisseria gonorrhoeae e de 2,3% para Chlamydia trachomatis e Herpes
simples virus tipo 2 (HSV-2)
em mulheres sem história de verrugas genitais. Em
indivíduos heterossexuais com verrugas genitais, o RR de câncer anal foi de 32,5
(DALING et al., 1987), sendo também elevado entre pacientes HIV positivos
heterossexuais (PIKETTY et al., 2003; WILKIN et al., 2004)
Estudos abordando a relação entre HPV - NIA - câncer, têm recebido ênfase nas
últimas décadas alavancado pelo aumento epidêmico das lesões intraepiteliais nos pacientes
coinfectados com o HIV. Em 1987, Pfister imputou ao HPV o papel de principal agente
iniciador da lesão intraepitelial cervical (NIC) e do carcinoma escamoso cervical (apud
PALEFSKY et al., 1991), sendo mais recentemente implicado na maioria dos tumores do trato
anogenital, com prevalências díspares (STEENBERGEN et al., 2005). Roka et al. (2008),
utilizando a captura híbrida encontraram o DNA do HPV de baixo potencial oncogênico
em 58,6%, e de alto risco em 51,4% de 555 amostras anais de HSH, independente do
status do HIV
1.3 O papel do Papilomavírus humano (HPV)
Os HPVs são vírus essencialmente epiteliotrópicos que necessitam romper a
barreira epitelial para invadirem as células da camada basal. Eles não são líticos e,
portanto não se liberam da célula até sua chegada à superfície epitelial (MARCHETTI et
al., 2002). Mais de 40 tipos de HPV foram descritos como capazes de infectar o trato
anogenital humano de ambos os sexos. A classificação do risco oncogênico é baseada
na freqüência de associação dos tipos com as neoplasias epiteliais de alto grau e o
carcinoma cervical (MUNOZ et al., 2003). Na população saudável, em mais de 80% dos
casos a evolução é frustra, com regressão às características epiteliais normais em torno
da décima sexta semana após a infecção, quando se observa a infiltração da mucosa
por linfócitos T citotóxicos (PALEFSKY e HOLLY, 2003; STEENBERGER et al., 2005)
Segundo Daling et al. (2004), o HPV é fator determinante na oncogênese do
câncer anal. A interação direta HPV-HIV tem sido demonstrada mesmo em pacientes
sem alterações nos níveis de linfócitos T CD4+, onde partes do genoma do HIV, como a
proteína tat, potencializariam a expressão de E6 e E7 do HPV (VERNON et al., 1993).
6
Para Palefsky (1997), a presença do HPV, o número de tipos detectados e a
quantidade de DNA são inversamente proporcionais aos níveis periféricos de células T
CD4+, tornando os pacientes mais propensos a desenvolverem NIA III, sugerindo que a
imunossupressão influenciaria a patogênese viral. Welters et al. (2006), demonstraram
resposta T específica contra HPV 18 satisfatória apenas em doadores saudáveis, o que
sugere falha na resposta T imune específica nos pacientes co-infectados com o HIV
1.4 Incidência da aids e Epidemiologia do HIV na Neoplasia Intraepitelial Anal e no
Câncer
A exposição sexual através das superfícies mucosas, foi em todo mundo,
imputada como o fator inicial relacionado a difusão da infecção pelo vírus HIV
(JAMESON et al., 2002). No Brasil até o ano de 2009 foram registrados 492.581 casos
de aids. No Amazonas, 5.341 casos foram notificados e cerca de 40% destes pacientes
declararam-se homossexuais ou bissexuais (BRASIL, 2010), a grande maioria destes
pacientes encontram-se em acompanhamento na FMT-HVD, principal Instituição de
referência no Estado.
Em pessoas infectadas pelo HIV o câncer é uma significante causa de mortalidade.
Segundo Spamo et al. (2002) apud Fernandez (2003), 30% a 40% desses pacientes irão
desenvolver alguma doença maligna durante a vida. O câncer anal é descrito nesta população
como “malignidade associada a aids” ou “câncer oportunista” (MELBYE et al., 1994;
FERNANDEZ, 2003), ocorrendo cerca de duas décadas mais precoce em relação ao grupo
controle (NADAL et al., 2006, YAGHOOBI et al., 2010). Na análise de 11 Estados americanos, o
risco do câncer anal em pacientes HIV positivos, foi de 6,8 nas mulheres e de 37,9 entre os
homens, elevando-se para 134 e 162,7 respectivamente, quando se avalia apenas indivíduos
com menos de 30 anos (KLENCKE e PALEFSKY, 2003). Sobhani et al., (2004), apontaram a
carga viral como ferramenta de valor na seleção dos pacientes com risco elevado para o
desenvolvimento da NIA.
1.5 Classificação Clínica e Laboratorial da Infecção pelo HIV-1
Pacientes infectados pelo HIV são classificados pelos níveis plasmáticos de
linfócitos T CD4+ e pela ocorrência das doenças definidoras de aids, conforme mostrado
7
no Quadro 1
Quadro 1 - Classificação clínica e laboratorial dos pacientes com infecção pelo HIV
Células CD4/mm3
Assintomáticos ou
Sintomáticos
Doenças
Infecção aguda
exceto A e C
indicadoras de aids
LPG
(1997)
> 500 mm3
A1
B1
C1
201 a 499 mm3
A2
B2
C2
< 200 mm3
A3
B3
C3
Fonte: World Health Organization (WHO-CDC) (2005)
Uma vez classificado como A3, B3, C1, C2 e C3 os pacientes devem ser
notificados como aids, não podendo, o paciente, ser reclassificado quando cessarem os
sintomas. Segundo Bazin (2005) são considerados portadores de aids os pacientes que
apresentam as doenças definidoras da doença com quaisquer níveis de T CD4+ ou os
com contagem de linfócitos T CD4+ inferior a 200/mm³, mesmo sem relato de infecção
oportunista.
Apesar do conhecimento prévio sobre a importância da queda dos linfócitos T
CD4, existe, segundo a convenção de Amsterdam (2010), evidências de que altos níveis
de ativação imune seriam prejudiciais aos pacientes HIV-positivos. Hazenberg et al
(2003), descreveram numa coorte prospectiva, que niveis elevados de células TC4+,
TCD8+, de ativação de células T ou de divisão celular como preditores independentes
da progressão da aids. O estudo afirma também que um sistema imune ativado antes da
infecção pelo HIV, como nos pacientes com DST anais por exemplo, onde há erosão das
células T ocasionada pela contínua ativação do sistema imune, ou quando ocorre rápida
depleção das células T após a soroconversão apresentariam maior risco de
desenvolvimento da aids.
Em outro estudo, realizado com pacientes infectados
assintomáticos por longos períodos, revelou que estes pacientes abrigavam vírus de
igual virulência mas que suas células T apresentavam baixas taxas de ativação
(CHOUDHARY et al., 2007).
8
1.5.1 A Terapia Antirretroviral de Alta Potência (TARV)
A ampliação do acesso da população aos esquemas TARV foram responsáveis
pela queda da morbimortalidade associada a aids na maioria dos países (FERNANDEZ,
2003). Os antirretrovirais são classificados em três grupos e a terapia inicial utiliza
frequentemente dois inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa (INTR) associados
a uma droga dentre as duas classes restantes (RAMOS FILHO, 2005). A terapia deve
ser iniciada antes do aparecimento de sintomas e de quedas pronunciadas nos linfócitos
T CD4+. Dados do encontro de Amsterdam em 2010, reafirmam que o início precoce da
TARV têm sido correlacionado a doença de progressão mais lenta e com menos falhas
terapêuticas.
Vários países relatam a elevação do número de casos de NIA após o início da
TARV. Segundo estudo de Critchlow et al., (1995), a incidência de câncer anal na era
pré-TARV era de 35 x 105 casos, passando a 92 x 105 na era pós-TARV e a não
regressão de neoplasias intraepiteliais de médio e alto grau em 75% destes pacientes.
1.5.2 O papel da TARV na progressão da NIA/câncer
A progressão de NIA grave ao câncer parece ocorrer em torno de uma década
(STEENBERGEN et al., 2005), sendo impulsionado pela incompleta restauração imune
proporcionada pela TARV, a prolongada exposição aos vírus oncogênicos e a
instabilidade genômica que podem resultar em prejudicada vigilância imune e
subseqüente elevação da incidência de tumores (FERNANDEZ, 2003).
Segundo Doorbar (2005), apesar da imunossupressão aumentar o risco de
desenvolvimento da NIA III, uma vez estabelecida a NIA, fatores genéticos como os
induzidos pelas oncoproteínas E6 e E7 do HPV parecem desempenhar um papel mais
direto na progressão da NIA ao câncer (DOORBAR, 2005), e uma vez instaladas as
mutações, a reconstrução do sistema imune pela TARV não se acompanha da
reconstrução da resposta imune específica ao HPV, como ocorre com outros patógenos
(PALLEFSKY e HOLLY, 2003).
Retamozo-Palacios (2004) e Abramowitz et al., (2007) concluíram que a melhora
9
da imunidade associada à era TARV não é capaz de prevenir a recorrência das lesões
relacionadas ao HPV. Porém, estudos recentes relatam taxas similares de sobrevida
entre pacientes HIV positivos e negativos acometidos pelo câncer anal (ABRAMOWITZ
et al., 2009), onde a restauração das funções imunológicas promovidas pela TARV,
como a redução de citocinas pró-inflamatórias associadas ao HIV (BARRETTA et al.
(2003), permitiria uma resposta imune satisfatória e tolerância a quimioterapia
(ABRAMOWITZ et al., 2009). A mudança do prognóstico destes pacientes em relação a
algumas doenças associadas ao HIV também foram descritas por Hessol et al. (2007).
Apesar do possível aumento da incidência da NIA ter uma parcela apoiada na
maior acessibilidade aos testes diagnósticos, o crescimento da patologia é alarmante e
vem encorajando a implementação de programas de rastreamento precoce das lesões
precursoras do câncer anal (PALEFSKY et al., 1998), principalmente em indivíduos
transplantados renais, HIV positivos e portadores de defeitos genéticos que acometam o
sistema
imune,
que
também
apresentem
particular
susceptibilidade
para
o
desenvolvimento de quadros infecciosos difusos e refratários (DOORBAR, 2005).
1.6 Resposta Imune e a Caracterização das Células Dendríticas
As células apresentadoras de antígenos (APC) são representadas por linfócitos,
células de Langerhan’s (células dendríticas imaturas) (LC), células dendríticas da
epiderme, macrófagos e linfócitos epiteliais disponibilizados nas camadas do epitélio,
sendo seu papel parte fundamental da resposta imune. As células dendríticas capturam
antígenos, processam-os e os expressam, em sua superfície, através do complexo
principal de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex - MHC) de classe II,
e os apresentam aos linfócitos auxiliares T CD4+, desencadeando a resposta imune.
As formas imaturas das DC são levadas pela corrente sangüínea aos órgãos
periféricos como pele e mucosas, onde se instalam. As DC da pele ou LC possuem
grande poder migratório através dos plexos subepidérmicos, localizando-se nos sítios de
interação entre o indivíduo e o meio externo, onde formam extensa rede unidirecional
ascendente até os órgãos linfóides secundários iniciando, juntamente com linfócitos
intraepiteliais, a resposta imune contra antígenos inalados, ingeridos ou inoculados
(ABBAS e LICHTMAN, 2005c; PACHIADAKIS et al., 2005; ABBAS e LICHTMAN, 2005d;
10
JAMESON et al., 2002).
1.6.1 Maturação das Células Dendríticas
As DC antes de capturarem e fagocitarem os antígenos por macropinocitose ou
endocitose, são consideradas imaturas por expressarem pouco MHC, moléculas coestimuladoras e devido a expressão elevada de CD1a e receptores de quimiocinas como
os CCR1, CCR2, CCR5 e CCR6 que recrutam outras DC para os tecidos inflamados
(ZIMMER et al., 2002).
Durante o processo migratório, a expressão de MHC I, MHC II, como o HLA-DR,
moléculas co-estimuladoras, CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2) e CD4 aumentam nas DC,
enquanto diminui a ligação e o processamento de novos Ag. exógenos, sendo então
consideradas DC maduras, que expressam ainda CXCR4 e CCR7 que direcionam a
migração celular até as áreas T dos tecidos linfáticos, auxiliadas pelas quimiocinas
linfonodais CCL19 e CCL21 (ZIMMER et al., 2002; KAWAMURA et al., 2005).
Na zona de células T, as DC maduras, têm a expressão de CD1a reduzida,
apresentam os antígenos capturados ( ZIMMER et al., 2002; KAWAMURA et al., 2005)
às células T que em resposta às citocinas e moléculas co-estimuladoras expressas
ativam macrófagos, fundamentais à resposta infecciosa aguda, que sofrem expansão
clonal e então migram para a pele para participarem da resposta inflamatória (ABBAS e
LICHTMAN, 2005c).
1.6.2 Origem e Diferenciação das DC
As DC são um grupo de APC bastante heterogêneas. Quanto à origem, as DC
apresentam precursores mielóides e linfóides; que, conforme a exposição e expressão
de receptores de citocinas, irão se diferenciar em DC mielóides, LC e DC
plasmocitóides, classificadas de acordo com seu fenótipo e morfologia. Os eventos são
sumarizados na figura 2 (ARDAVÍN et al., 2001; WU e KEWALRAMANI, 2006).
11
Figura 2 - Modelo de Diferenciação das DC
Via comum de diferenciação das DC. Após as setas estão representados os produtos
finais de cada via de diferenciação. As principais citocinas envolvidas estão indicadas.
Legenda: FLT3: fms-like tyrosine kinase 3 ligant; IL: interleucina; TGF-ß: fator ß de
crescimento e transformação; TNF-α: fator α de necrose tumoral. Fonte: Ardavín et al.
(2001).
As DC mielóides(CD11c+/CD123-) são APC clássicas, pois apresentam os
produtos antigênicos degradados aos linfócitos T CD4+ e TCD8+, secretam citocinas próinflamatórias como a IL-12, essenciais ao desenvolvimento da resposta imune efetiva,
além de interferon I, quando infectadas por vírus, porém em menor quantidade que as
DC plamocitóides(CD11c-/CD123+) consideradas produtoras naturais de interferon,
porém com capacidade 10 a 50 vezes inferior para expandir células T CD4+ e TCD8+
(PACHIADAKIS et al., 2005; WU e KEWALRAMANI, 2006)
A secreção de citocinas pelas DC guiam as propriedades efetoras dos linfócitos T
naive (Reis e Sousa, 2006), onde a secreção de IL-12 parece induzir fortes respostas
efetoras nas células T, já a IL-10 parece induzir as células T a produzirem mais IL-10
com propriedades supressoras (SVENSSON et al., 2004). Numa abordagem simplificada
a
relação
entre
essas
citocinas
parece
definir
a
resposta
imune
como
predominantemente pró-inflamatória ou anti-inflamatória, o que também é influenciado
pela quantidade de antígenos e ligantes dos receptores do tipo toll nos patógenos
12
(PACHIADAKIS et al., 2005).
Turville et al., 2003 e Geijtenbeek et. al. (2000) descreveram, in vitro, as seguintes
subpopulações de DC no epitélio:
Ø LC intraepiteliais langerina+ CD1a+
Ø DC da derme, submucosas ou subepiteliais CD1a- CD14+ DC-SIGN+ (DCspecific, ICAM-3 grabbing, nonintegrin)
Ø DC da derme, submucosas ou subepiteliais CD1a+ CD14- DC-SIGNØ Células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC) CD1a+ CD14+ DC-SIGN+
No sangue periférico Ito et al.(1999) descreveram 03 populações distintas de DC,
caracterizadas inicialmente pela expressão de CD1a e CD11c. As células eram
CD1a+/CD11c+/Lin-/DR+,
CD1a-/CD11c+/Lin-/DR+
e
CD1a-/CD11c-+/Lin-/DR+,
segundo os autores, a primeira e última populações eram as mais prevalentes
perfazendo aproximadamente 0,50 a 0,18% das PBMC de 30 voluntários saudáveis.
Com base na expressão de CD2, CD9, CD11b, CD11c, CD13, CD32, CD33,
CD64, e GM-CSFR, a população de células CD1a+/CD11c+, denominada fração 1, foi
definida como proveniente de linhagem de monócitos, derivadas do progenitor CD34,
não LC. Já a população de DC CD1a-/CD11c-, fração 3, expressavam pobremente
CD33, CD13, CD1c, CD2, CD49e, CD45RO, CD32, CD64, mas apresentavam
significativa expressão de CD45RA, possuindo portanto morfologia e fenótipo
compatíveis com DC plasmocitóides. Por fim, as DC CD1a-/CD11c+ ou fração 2, não
apresentam expressão de CD1a, CD1c, CD11b ou de CD64, mas expressam CD11c,
CD33, CD13 e GM-CSFR, indicando também serem da linhagem dos monócitos (CAUX
et al., 1997).
A capacidade de estimular células T e de endocitose de partículas de FITcdextran foram superiores nas frações 1 e 2, e após sete dias de cultura, apenas a cultura
da fração 1 das DC e em presença de GM-CSF, IL-4 e TGF- β1, foi capaz de diferenciar
DC à LC, confirmadas pela expressão de Langerin, CD1a e presença dos grânulos de
Birbeck (ITO et al., 1999).
13
1.6.2.1. Facilitação da Aquisição Sexual do HIV
Yaghoobi et al. (2010) descreveram a coinfecção HPV-HIV como fator de risco
para o câncer anal. Segundo Sheth et al., (2005) e Grosskurth et. al.,1995), a presença
de uma DST favorece a aquisição do HIV, por alterações induzidas no sistema imune
local, o que segundo Coen et al (1998) e Kaul et al. (2008) seria fator determinante local
para a aquisição da infecção. Na mucosa LC e queratinócitos respondem a infecção
induzindo o afluxo de monócitos, macrófagos, e células T CD4, além do aumento de
células NK, mediado pelas IL-12, IL-1 e IL-6 e DC plasmocitóides que secretam mais
IFN-α culminando, na maioria dos eventos, com o clareamento viral (DIVITO et al.,
2006).
Segundo Bosnjak et al.( 2005), os vírus como o HSV podem desencadear a
apoptose em LC, monócitos e células T, e Anzala et al. (2000), descreveram elevação
em até 10x nos níveis de IL-4, IL-6 e IL-10 e de HIV no sêmen de pacientes com
gonorréia, o que de acordo com Sheth et al (2006), independem da carga viral do HIV e
dos níveis periféricos das células T CD4.
Sprecher e colaboradores em 1986 demonstraram que a depleção de LC da
mucosa estaria associada ao aumento da virulência do HSV, e Jones et al (2003),
relataram o efeito deletério do HSV sobre as DC ocasionando a diminuição da produção
de IL-12. As alterações se estendem à resposta imune adaptativa pois de acordo com
Sheth et al. (2005) as células TCD8+ de pacientes infectados pelo HIV, apresentam
aumento das citocinas pró-inflamatórias no sêmem e na cérvix uterina.
Frank et al. (2008), enfatizaram a necessidade de pesquisas contínuas
objetivando as estratégias múltiplas para impedir a interação vírus-célula e a
amplificação viral nas DC. Neste sentido, duas moléculas capazes de vincular-se as
DC-SIGN (DC-specific, ICAM-3 grabbing, nonintegrin), a BSSL (sais biliares lipase
estimulada) encontrada no intestino e no leite humano e a MUC 6 no sêmen foram
descritas como capazes de bloquear a transferência do HIV às células T CD4, via DC e
devem alavancar estudos futuros (AMSTERDAN, 2010).
14
1.6.2.2 Células Dendríticas não-LC, co-receptores e a Infecção pelo HIV
Segundo Kawamura et al. (2005), o caminho a ser seguido pela infecção parece
depender do tipo celular encontrado inicialmente pelo HIV ao invadir o organismo e de
acordo com Hu et al. (2000) toda a subpopulação de DC são capazes de transportar o
HIV até o linfonodo.
Na figura 3 observa-se, à microscopia eletrônica, a interação entre a DC madura,
o vírus da imunodeficiência símia, semelhante ao HIV, e as células T CD4+.
A
B
Figura 3 - Interação entre DC imatura, contendo o vírus da imunodeficiência símia
e linfócitos t cd4+.
A: interação dc-célula t CD4+, b: vírus da imunodeficiência símia e linfócitos t CD4+.
Aumento de 60x à microscopia eletrônica. Os vírus intactos estão identificados pelo
símbolo estrela. Fonte: Frank et al. (2008).
Geijtenbeek et al., 2000 relataram a capacidade do HIV em subverter a função
habitual das DC DC-SIGN+, ocasionando a transmissão viral às células T, via exossomo,
o que pode ter impacto no controle da infecção, considerando-se a produção artificial de
exossomos, visando o estímulo da resposta imune contra agentes infecciosos e tumorais
(SEGURA et al., 2005).
1.6.2.3 O papel da DC DC-SIGN+ nas Infecções Via DC
A ICAM-3 (intercellular adhesion molecule) é uma molécula de adesão intercelular
que adere a não-integrinas, inicialmente designadas como específicas das DC imaturas
15
e denominadas DC-SIGN. As células DC-SIGN+ são dispostas na derme, placenta,
mucosas, tecidos linfóides e de forma difusa nas fibras de tecido conjuntivo fibroso, mas
não em LC (SOILLEUX, 2002). Com o uso de Anticorpos específicos, Geijtenbeek et al.
(2000) demonstraram que as células que expressam DC-SIGN, na mucosa do reto e
vagina, são distintas dos linfócitos T e B, macrófagos ou monócitos, mas compatíveis
com as DC.
As DC DC-SIGN+ formam uma banda estreita logo abaixo do lúmem epitelial,
separadas apenas por uma tênue camada única de epitélio colunar, sendo o acesso viral
às estas células facilitado (JAMESON et al., 2002), ocasionando portanto, um maior
risco de transmissão do HIV-1 através do intercurso retal (VOELER, 1991; JAMESON et
al., 2002; KAWAMURA et al., 2005).
1.6.3 Variações nas Frequências das DC e o Risco de Câncer
A diminuição das DC tem sido relacionada a eventos como o agravamento da NIA
e o câncer anal (SOBHANI et al., 2002; NADAL et al., 2006, YAGHOOBI et al., 2010).
Para Arany et al. (1998) alguns tumores parecem secretar substâncias que incapacitam
as células dendríticas na promoção da imunidade antitumoral. Nos pacientes infectados
pelo HIV, o cenário é agravado pela diminuição do número total de células T CD4+ na
aids e pelo estado tolerogênico dos linfócitos associados à mucosa intestinal
(SCHIEFERDECKER et al., 1992).
Sobhani et al. (2004) encontraram uma média de 15 a 19 cél/mm2 em DC CD1a+
da camada basal anal na população geral, um aumento destas células, 24 a 27 cél/mm2,
em pacientes com condiloma anal e diminuição, 16 cél/mm2 à zero, nos pacientes com
NIA III ou câncer anal. Os achados foram corroborados por Nadal et al.( 2006) que
demonstraram uma diminuição de aproximadamente 50% na média das LC em
pacientes com câncer anal e de 50-75% nos pacientes HIV positivos com câncer anal.
Bella et al (2003) e Ferrari et al (2005) descreveram, em pacientes com câncer,
alteração nas populações de DC tipo-1 (mielóides) e tipo-2 (plasmocitóides) no sangue
periférico.
Quanto as DC plasmocitóides, sua resposta imune parece depender do tipo de
16
estímulo à ativação, do estágio de maturação e do tipo de antígeno (BOONSTRA et al.,
2003). Em relação a infecção pelo HIV, a frequência e a função das DC plasmocitóides
são inversamente proporcionais a carga viral do HIV (DONAGHI et al., 2001), e segundo
Levy et al. (2003), a TARV parece restaurar estas DC a níveis próximos a normalidade.
1.6.4 A geração de respostas regulatórias
Segundo Marguti, (2007) após o estímulo a maturação, as DC aumentam a
produção de citocinas pró-inflamatórias como a IL-12 e o TNF-α e mantêm os níveis de
TGF-ß e de citocinas supressoras, estando este evento relacionado à manutenção e
geração de células T regulatórias (Treg) Foxp3+.
Diferentemente de indivíduos saudáveis, onde as células T CD4+ específicas
produzem IFN-γ, em pacientes com câncer cervical associado a oncoproteína E6 do
HPV 16, a produção de IL-10 foi relacionada a geração de Linfócitos Treg específicos,
capazes de suprimir a produção de IFN-γ e IL-2 (BURG et al., 2007). Na mucosa anal,
foram descritos recentemente o aumento da IL-8 e IL-23 como associados a NIA III e o
câncer (YAGHOOBI et al., 2010).
Nos pacientes HIV-positivos, a infecção das DC prejudica o estímulo às células T
devido a perda da capacidade de maturação, consequente à deficiência de expressão de
moléculas co-estimuladoras e do MHC, ocasionando a inibição da secreção de citocinas
como a IL-12 e o retardo da resposta imune (PACHIADAKIS et al., 2005, LORÉ et al.,
2002), e associado a produção de citocinas regulatórias como a IL-10, induzidas por
células Treg.
1.6.5 DC e a importância dos Mecanismos de Tolerância
Na periferia, foi demonstrado que a manutenção da interação entre células Treg e
DC imaturas constituí importante mecanismo de manutenção da geração e expansão
das células reguladoras a partir dos linfócitos T naive, estando envolvida nos
mecanismos de tolerância e na manutenção da viabilidade de órgãos transplantados
(MIN et al., 2003) independente da IL-10 e do TGF-ß (CONG et al., 2005). Portanto, as
DC
estão
implicadas
nos
mecanismos
de
regulação
das
células
Treg
(CD4+CD25+highFoxp3+) por mecanismos de apoptose, anergia ou hiperexpressão de IL-
17
10 (MARGUTI, 2007).
De acordo com Burchill et al. (2007), a produção de células Treg é influenciada
pelos níveis de IL-15 e IL-2, onde cadeias ß do receptor ativariam o fator de transcrição
STAT-5 que se ligaria a regiões do Foxp3. A geração destas células depende também
da IL-10 produzidas pelas DC, porém a forma de ação das citocinas sobre a função
efetora das células Treg ainda não foi totalmente esclarecida (MARGUTI, 2007).
Gabrilovith et al., (2004) sumarizou as falhas na diferenciação de células
mielóides no câncer que acarretariam diminuição do número de DC mielóides no sangue
periférico e aumento proporcional do número de DC imaturas. Efeitos estes mediados
por fatores solúveis produzidos pelo tumor e reversíveis após a remoção da neoplasia e
quando colocadas em meio sem a presença de fatores tumorais (Gabrilovith et al.,
1997), como o VEGF, o Fator de Estimulação de Colônias de Granulócitos e monócitos
(GM-CSF) in vitro, Fator de Estimulação de Colônias de monócitos (M-CSF), Interferon-γ
(IFN-γ),
Fator
de
Crescimento
Transformador-β
(TGF-β),
Interleucina-6
(IL-6),
Interleucina-10 (IL-10) e gangliosideos (GABRILOVITH et al.,1999; MENETRIER-CAUX
et al., 2001; RATTA et al., 2002; BRONTE et al., 1999; STEINBRINK et al., 2002;
PEGUET-NAVARRO et al., 2003).
Diversos efeitos inibitórios imputados a IL-10, como a supressão de respostas T,
induzidas por DC tolerogênicas imaturas (SHARMA et al., 1999), a diminuição da
expressão de moléculas co-estimuladoras (STEINBRINK et al., 1999) e a supressão da
proliferação da resposta T CD4+ e TCD8+ ocorrem devido ao contato direto célula-célula
entre DC tratadas e células T naïve (STEINBRINK et al., 2002). Almand et.(2010) não
encontrou correlação entre IL-10 séricas e defeitos na diferenciação de DC em pacientes
com câncer, mas em ratos a diferenciação de DC pode ser alterada pela IL-10,
GABRILOVICH; 2004, SHARMA et al ,1999).
A importância do STAT3 foi demonstrada na diferenciação anormal de células
mielóides em pacientes infectados com HPV (NEFEDOVA et al., 2004; WANG et al.,
2004), já que o STAT3 é necessário na via usada pelas citocinas para diferenciar estas
células juntamente com a JAK2 (NEFEDOVA et al., 2004). A IL-10 é um reconhecido
ativador da atividade da STAT3, Gabrilovith et al., (2004) sintetizou as interações entre
IL-10, DC e STAT3, os autores associaram o aumento da STAT3, na presença de
18
fatores derivados do tumor, com o acúmulo de DC imaturas e diminuição da produção de
DC no sangue periférico.
A capacidade de células supressoras de linhagem mielóide (MDSC) em induzir a
formação de Treg foi descrita por Huang et al. (2006), na presença de células T tumorais
específicas ativadas, IFN-γ e IL-10 e independente dos níveis do óxido nítrico (NO)
observados no sobrenadante de cultivo de MSC e Linfócitos T CD4+ de esplenócitos de
ratos transgênicos.
Em sua revisão Gabrilovich e Nagaraj (2009) descreveram os indícios de que a
supressão tumoral ocorra de maneira distinta no sítio tumoral e na periferia, onde MDSC
chegariam ao sítio tumoral e aumentariam a expressão de arginase e induziriam o iNOs
(Oxido nítrico síntase) e a diminuição da expressão de reactive oxygen species (ROS) e
então as MDSC se diferenciariam em macrófagos associados a tumores (TAM)
(KUSMARTSEV E GABRILOVICH, 2005). O TAM produzem elevados níveis de citocinas
que suprimem a resposta nas células T, de forma não específica. O somatório dos
mecanismos antígeno específico, via STAT 3, e inespecífico via STAT1 e TAM
potencializariam os efeitos supressivos sobre os linfócitos T
Nas áreas de NIC, Kobayash et al. (2004), descreveram células CD1a+ produtoras
de IL-10 dispostas no estroma e não no epitélio, indicando a produção de células
regulatórias por células CD1a+, porém em quantidade menor nos pacientes HIV+NIC II/III
(15 cells/mm2) do que nos controles (23 cells/mm2) e nos HIV-CIN+ (69 cells/mm2). No
câncer de mama, Pinzon-Charry et al. (2005) descreveram apoptose de DC LIN-CD40- e
defeitos na maturação celular reversíveis na presença de CD40-L
1.6.6 Estratégias de escape tumoral
Vários são os mecanismos utilizados pelos tumores para forjarem sua presença e
evitarem seu reconhecimento e exterminação, um dos mais antigos é a produção direta
de IL-10 ou induzida por fatores solúveis tumorais. Como APC e macrófagos que podem
diminuir os níveis de MHC II, moléculas co-estimulatórias B7-1 e B7-2 e de citocinas
inflamatórias como IL-2 e IFN-γ (KELLY & BANCROFT, 1996; STEINBRINK et al., 1999)
19
e induzirem tolerância nas células Th1, T CD4+ (STEINBRINK et al., 1997) e TCD8+
(STEINBRINK et al., 1999) além de suprimirem células NK (KURTE et al., 2004).
O IFN-γ apesar de desempenha um papel fundamental na inclinação de células T
naive a um fenótipo Th1, através da inibição da produção de IL-4 (GAJEWSKI et al.,
1988) e indução da secreção de IL-12, pode ainda suprimir o desenvolvimento das
células Th17 a partir de células T naive em camundongos, mas também estimular
fortemente a expressão de IL-1 e IL-23 por APC mielóides levando a expansão de
memória de células Th17 em humanos (KRYCZEK et al., 2008).
O aumento da expressão da B7-H1 tem sido descrito em pacientes de alto risco
de progressão a leucemia aguda, onde o IFN-γ associado ao TNF-α induziria uma maior
expressão em blastos MDS (Kondo et al., 2010). O IFN-γ induz também o aumento da
IDO em DC e células Treg mediando a progressão ao câncer (MELLOR et al, 2008).
Macrófagos IFN+ foram associados à sobrevivência de células do melanoma (Garbe et
al., 1990). O IFN-γ também foi associado a apoptose de células T CD4+, afetando
indiretamente a função das células TCD8+ (Berner et al., 2007).
A apresentação de um efeito antagônico ao usual desempenhado por algumas
citocinas têm sido descrito na resposta tumoral. Wilke et al. (2011) e Yanagawa et al.
(2011) demonstraram que citocinas antagônicas podem trabalhar em sinergismo
suprimindo respostas imunoestimulatórias de DC através do aumento do óxido nítrico.
Outro mecanismo é o aumento da expressão da purified anti-indoleamine 2,3dioxygenase (IDO) nas APC, via IL-10, desencadeando mecanismos imunes regulatórios
(Yanagawa et al., 2008) que podem ser potencializados pelo aumento da IDO em DC e
células Treg, via IFN-γ, mediando assim a progressão ao câncer. Apesar dos efeitos
dúbios, Wilker et al., (2011) relataram que o efeito predominante da IL-10 e do IFN-γ
serão sempre regulatórios e inflamatórios respectivamente.
As citocinas não são as únicas a terem seus efeitos subvertidos. A função
reguladora das LCs tem sido discutida para diversas situações tolerogênicas
apresentadas (LUTZ, AZUKIZAWA, 2010). Segundo Stoitzner (2010), as LCs não são
obrigatórias para a indução de tolerância periférica contra autoantígenos expressos em
20
queratinócitos da epiderme. Assim, as LC podem exercer uma dupla função, ou seja,
induzirem a tolerância ou a imunidade, dependendo da situação específica na pele.
Além das Lc epiteliais, um subconjunto de DC dérmica Langerhan’s positivas
pode assumir o papel de induzir a tolerância periférica e a imunidade. Segundo Ueno et
al., (2010) as LCs parecem importantes para a indução de respostas às células T e DCs
dérmicas e seriam responsáveis pela indução a respostas humorais. Esse papel díspar
das DC tem promovido muita discussão científica como os estudos de Allan et al. ( 2003)
que demonstram que LCs não são necessárias às respostas das células T contra o vírus
herpes simplex que infecta células na epiderme. Burg et al. (2007), encontraram em
pacientes com câncer cervical associados ao HPV16, um aumento do IFN-γ e da citocina
supressora IL-10 como associadas a geração de células Treg.
Sendo o câncer anal uma das patologias de importância ascendente em
indivíduos HIV positivos, por não ser controlada pelo uso da TARV, elegemos esta área
para o estudo desta tese buscando aprofundar o conhecimento a cerca das alterações
imunes periféricas e locais associadas a NIA grave, lesão precursora do câncer anal,
com o intúito de acrescentar ferramentas objetivando manejo futuro do quadro
imunológico apresentado por estes pacientes, ainda na fase pré-neoplásica.
Para conhecer a relação da NIA grave com a produção e secreção de citocinas e
células dendríticas locais e periféricas e as interações virais em pacientes HIV positivos
delineamos este estudo, que analisou a variação na expressão de células dendríticas e
de citocinas na mucosa anal e sangue periférico de pacientes HIV positivos e doadores
sadios, correlacionando-os com a lesão intraepitelial anal e o câncer, em pacientes
atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, principal
instituição pública de apoio a pacientes HIV positivos de Manaus-AM.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Analisar as taxas de coinfecção viral e os aspectos fenotípicos e funcionais da
resposta imune sistêmica e na mucosa anal de pacientes HIV positivos portadores de
neoplasia intraepitelial anal.
2.2 Específicos
1-Descrever as particularidades da resposta imune apresentada pelos pacientes nos
grupos estudados quanto ao status do HIV e a ocorrência de neoplasia intraepitelial anal;
2-Traçar correlações entre as alterações observadas no sangue periférico e na mucosa
anal;
3-Relacionar os tipos oncogênicos de HPV com o grau de neoplasia intraepitelial anal
entre os grupos HIV positivos e negativos;
4-Descrever as taxas de coinfecção anal entre os vírus HPV, CMV, EBV e HSV-1 e
HSV-2 e relacioná-las ao grau de neoplasia intraepitelial anal; e
5-Descrever a influência da carga viral do HIV e dos níveis periféricos de células T CD4+
nas taxas de coinfecção viral dos pacientes HIV-positivos.
22
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Modelo de Estudo
Estudo observacional analítico prospectivo, transversal do tipo detecção de casos.
3.2 Universo de Estudo
3.2.1 População de Estudo
Foram estudados 85 pacientes do sexo masculino, 60 portadores de sorologia
positiva para o HIV e 25 pacientes controle (HIV negativos). A amostra foi composta por
pacientes encaminhados ao ambulatório de coloproctologia da FMT- HVD, provenientes
dos ambulatórios de DSTs/aids, dermatologia e ainda por pacientes HIV negativos que
procuraram a unidade por livre demanda, por apresentarem sintomas proctológicos.
Os indivíduos receberam informações por escrito sobre o conteúdo do estudo,
riscos e benefícios, sendo oferecido aos que se interessaram o termo de consentimento
livre e esclarecido (T.C.L.E.) (Anexo 7.1), para a coleta da assinatura, expressando o
livre interesse na participação deste estudo
3.2.2 Critérios de Inclusão
Grupo caso:
Pacientes do sexo masculino, HIV positivos, com idade compreendida entre 14
anos completos a 70 anos incompletos (com consentimento dos pais ou responsável
quando menores de 18 anos), divididos em grupos quanto à presença ou a ausência das
seguintes características: aids, ocorrência de NIA/câncer anal e se adeptos à prática do
sexo anal receptivo (AR), caracterizado pela prática do ato superior a 1X ao mês por
pelo menos 04 meses no ano.
23
Grupo controle:
Pacientes do sexo masculino, com sorologia negativa para o HIV, não adeptos do
AR e sem NIA/câncer anal nos laudos histopatológicos, com idade compreendida entre
14 anos completos a 70 anos incompletos (com consentimento obrigatório dos pais ou
responsável quando menores de 18 anos).
3.2.3 Critérios de Exclusão (para ambos os grupos)
a) portadores de outras doenças imunossupressoras não relacionadas a aids,
inclusive o câncer (exceto o câncer anal);
b) pacientes em uso de drogas imunossupressoras;
c) neutropênicos (< 500 céls x mm3);
d) em uso de drogas com efeito anticoagulante nos últimos quinze dias;
e) plaquetopênicos (< 75000 céls x mm3);
f) incapazes mentalmente;
g) portadores de quadro infeccioso bacteriano com repercussão clínica (sepse);
h) indígenas; e
i) transplantados de órgãos sólidos em uso de imunosupressores.
Grupo controle (especificamente):
a) pacientes HIV positivos;
b) pacientes em uso de drogas imunossupressoras;
c) tabagistas nos últimos 24 meses, mesmo que na forma interrupta;
d) presença de DST clinicamente detectável;
e) portadores de neoplasia maligna e/ou uso de drogas imunossupressoras; e
f) adeptos do sexo anal receptivo.
3.3. Classificação e definição dos Grupos de Estudo
Objetivando uma melhor caracterização dos casos, foram estudados pacientes
HIV positivos sem aids (aqui definidos como pacientes com diagnóstico laboratorial do
HIV e que não tenha apresentado nenhuma das doenças constantes da lista de doenças
24
definidoras ou sugestiva de aids e que possuam contagem de células T CD4 superior a
201 mm3, ou seja classificados com A1, B1,A2 ou B2) e ainda que não estejam em uso
atual ou passado de antiretrovirais, pacientes com aids (aqui definidos como pacientes
que tenham apresentado uma ou mais doenças definidoras de aids e/ou que
apresentem, ou tenham apresentado, contagem de linfócitos T CD4 inferior a 200 mm3
ou seja classificados como C3 e que estejam em uso regular da TARV. Cabe ressaltar,
que neste estudo, pacientes com aids em uso de TARV há menos de 01 mês foram
considerados aids negativos, desde que não apresentassem doenças definidoras de
aids ou CD4< 200. Os subgrupos foram divididos ainda quanto a ocorrência de
NIA/câncer e em pacientes HIV negativos (denominados controle, ou seja pacientes
HIV negativos, não portadores de infecção pelo HPV, Clamídia, Herpes e Gonococo, ou
outra patologia viral, bacteriana ou fúngica detectada clínica ou laboratorialmente pelos
métodos aqui empregados, e nos quais os laudos histopatológicos, não apresentassem
processos inflamatórios específicos, NIA ou câncer).
Para melhor descrição e compreensão do efeito dos fatores de risco sobre o
indivíduo, combinamos estas variáveis dando origem a três grandes grupos: Pacientes
controle (HIV-/NIA-) e pacientes casos: (HIV+/NIA-) e (HIV+/NIA+).
3.4 Procedimentos
3.4.1 Coleta
Após os experimentos para a validação do métodos, foi iniciada a inclusão dos
pacientes na pesquisa de forma contínua, no período de março de 2010 a julho de 2011,
obedecendo aos critérios de elegibilidade até que se completasse o universo amostral
proposto. Na oportunidade, foi aplicado o protocolo de estudo e compilados os dados
socioculturais dos pacientes.
3.4.2 Emprego dos meios diagnósticos
3.4.2.1 Anuscopia com Magnificação de Imagens (AMI) e Obtenção das Amostras
Teciduais
25
Os pacientes selecionados, foram submetidos a inspeção anal seguida da coleta
de material citológico para a detecção do HPV, por captura híbrida II (Digene®), Herpes
tipos 1 e 2, citomegalovírus e Epstein-Barr vírus, por PCR em tempo real. A coleta
citológica foi adquirida através da rotação de um swab sintético estéril (Dacron®) por 10
vezes no canal anal, sobre a região pectínea, e então colocadas no meio apropriado
fornecido pelo fabricante (ROKA et al., 2008) e encaminhadas ao laboratório
multidisciplinar da FMT-HVD.
Os pacientes foram submetidos ainda ao toque retal e a AMI, onde a pele
perianal, o epitélio transicional e a mucosa foram inspecionados com colposcópio
analógico de aumento (16 a 40 x), após a retirada de eventuais resíduos fecais com
solução fisiológica a 0,9%. A seguir foram realizadas duas biópsias, com pinça
convencional de retossigmoidoscopia, de área(s) suspeita(s) como: lesões elevadas,
plano elevadas, depressões da pele transicional ou da mucosa, ulcerações, presença de
vasos atípicos ou imagens em mosaíco. Nos casos de inexistência de lesões que
sustentassem suspeitas clínicas, a biópsia foi realizada às 3h na linha pectínea.
A(s) amostra(s) designadas ao estudo histopatológico foram conservadas em
formalina tamponada a 10%, processadas e submetidas a exame histopatológico
convencional no laboratório de anatomia patológica da FMT-HVD, o outro fragmento
destinado a análise por citometria de fluxo, foi acondicionado em frasco do tipo
Eppendorf estéril de 2ml contendo RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium)
estéril, mantido em isopor com gelo químico reciclável, do tipo gelox®, e transportado
para o laboratório de pesquisas com citometria de fluxo da Fundação de Hematologia e
Hemoterapia
do
Amazonas
(FHEMOAM)
para
realização
de
cultura
rápida,
imunofenotipagem e detecção de citocinas.
3.4.2.2 Coleta de amostra sanguínea
Durante a consulta inicial do paciente foi realizado a coleta de uma amostra
sanguínea de 8mL de sangue periférico total em tubo estéril contendo EDTA (ácido
etilenodiamino tetra-acético), sendo a seguir mantido em isopor com gelo químico
reciclável e imediatamente transportado para o laboratório de pesquisas da FHEMOAM
26
para realização de hemograma convencional, cultura rápida, imunofenotipagem e
detecção sérica de citocinas citoplasmáticas e secretadas.
3.4.2.3 Diagnóstico Histológico
As amostras permaneceram no formol tamponado por um período de 18 a 24
horas e a seguir foram submersas em solução de zinco da Becton Dickinson (BD)®, por
24 a 48 horas, para propiciar melhor recuperação antigênica necessária a etapa
subsequente
de
imunohistoquímica.
As
amostras
eram
então
submetidas
a
desidratação, inclusão em parafina, confecção dos blocos e seccionadas em fatias de
4µ. A seção histológica foi montada em lâminas de vidro com extremidade fosca, sendo
os cortes histológicos corados pela técnica da hematoxilina-eosina (BEHMER et al.,
1976) e a seguir observadas através de microscopia ótica à procura de alterações
inflamatórias, citopáticas, displásicas ou neoplásicas.
3.4.2.4 Preparo dos Fragmentos de Mucosa Anal
O tecido da mucosa anal foi processado dentro da capela de fluxo laminar nível II,
previamente esterilizado com álcool a 70% e depois por 15 minutos com luz ultravioleta
(UV) no Laboratório de Terapia Celular da Fundação de Hematologia e Hemoterapia do
Amazonas (FHEMOAM). Primeiramente o tecido foi dissociado com o auxílio de lâminas
de bisturi em cubetas de aço inox previamente esterilizadas. Em seguida, o tecido foi
transferido para tubos de 15 mL contendo colagenase (Sigma-AldrichTM, USA) na
concentração de 0,001% (diluída em meio RPMI), para dissociação enzimática
do
tecido, por 30 minutos à temperatura ambiente e sob inversão. Após esse período, a
suspensão contendo o tecido dissociado foi ressupendida em 10 mL de meio RPMI 1640
(Sigma-AldrichTM, USA) estéril e centrifugado a 1300 rpm por 7 minutos a 20°C com
freio. Esta etapa foi repetida 2 vezes e em seguida, o tecido dissociado foi
ressuspendido em 2 mL de meio RPMI 1640 estéril suplementado com 10% de soro
bovino Fetal (SBF) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA) e 1% de penicilina (100 unidades/mL)
e estreptomicina (100 µg/mL) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA).
27
3.4.2.5 Cultura in vitro das células isoladas da Mucosa Anal
A cultura das células isoladas da mucosa anal foi realizada em tubos cônicos de
15 mL (TPPTM, Trasadingen, Switzerland). Para a cultura não estimulada foi utilizado 1
mL de suspensão celular com 500 µL de meio RPMI 1640 (Sigma-AldrichTM, USA)
Suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA) e 1%
de penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 µg/mL) (GibcoTM Invitrogen, NY,
USA). Para a cultura estimulada foi utilizado 1 mL de suspensão celular com 500 µL de
RPMI 1640 (Sigma-AldrichTM, USA) Suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF)
(GibcoTM Invitrogen, NY, USA) e 1% de penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina
(100 µg/mL) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA), além de 10 ηg/mL de PMA (forbol-miristatoacetato; Sigma-AldrichTM, Steinhein, Alemanha) e 125 ηg/mL de Ionomicina (SigmaAldrichTM, Steinhein, Alemanha) de concentração final. As células foram incubadas por
12h à 37°C sob atmosfera de 5% de CO2. Após 12h de cultura foi retirado o
sobrenadante para quantificação de citocinas.
3.4.2.6 Imunofenotipagem das células obtidas dos Fragmentos de Mucosa Anal
Pós-cultura, as células foram lavadas 3 vezes e ressupendidas em 500 µL de
PBS-W (Tampão Fosfato Salino com 0,5% de albumina). Para a caracterização
imunofenotípica das células obtidas dos fragmentos de mucosa anal, foi realizada a
técnica de citometria de fluxo.
As células foram marcadas com anticorpos monoclonais marcados com
fluorescência excitáveis que são captadas pelo Citômetro de Fluxo e que se fixam nas
moléculas de superfície dessas células. Neste estudo foi utilizado o seguinte painel de
anticorpos monoclonais marcados, alocados em 5 tubos: 1. CN, sem marcação; 2. antiCD45 PercP (Clorofilpiridina, code 347464, lote 80096, clone 2D1 marca BD®
Biosciences); 3. anti-CD45 PercP (Clorofilpiridina, code 347464, lote 80096, clone 2D1
marca BD® Biosciences) e anti-CD4 FITC (Isotiocianato de Fluoresceína, code 555346,
lote 75982, clone RPA-T4, marca BD® Biosciences); 4. anti-CD45 PercP (Clorofilpiridina,
code 347464, lote 80096, clone 2D1 marca BD® Biosciences) e anti-CD1a FITC
(Isotiocianato de Fluoresceína, code 555806, lote 74276, clone HI149, marca BD®
Biosciences).; 5. anti-CD45 PercP (Clorofilpiridina, code 347464, lote 80096, clone 2D1
28
marca BD® Biosciences) e anti-CD209 FITC (Isotiocianato de Fluoresceína, code
551264, lote 18335, clone DCN56, marca BD® Biosciences)( quadro 2)
Quadro 2 - Anticorpos utilizados para a marcação celular da mucosa anal
Tubo
Fluorescência
FITC
PercP
Sem marcação
Sem marcação
Tubo 2
-
Anti-CD45
Tubo 3
Anti-CD4
Anti-CD45
Tubo 4
AntiCD1a
Anti-CD45
Tubo 5
Anti-CD209
Anti-CD45
Tubo 1 (CN)
Inicialmente foi incubado 100µL de suspensão celular com 4 µL de cada anticorpo
nos seus respectivos tubos. Estes foram homogeneizados e incubados por 30 minutos a
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a marcação, foi feito a lise das hemácias
com o uso da solução de lise (FACS Lysing solution, BD® Biosciences), diluída 10 vezes
em água destilada estéril. Os tubos foram novamente homogeneizados e incubados por
10 minutos nas mesmas condições. Passado a fase de incubação, os tubos foram
centrifugados a 1300 rpm por 7 minutos. Em seguida o sobrenadante foi descartado e
acrescentou-se 2 mL de PBS-W para lavagem do pellet formado. Os tubos foram
homogeneizados e centrifugados a 1300 rpm por 7 minutos. Após essa centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e foi adicionado 300µL de PBS-W para fazer a aquisição da
amostra no citômetro de fluxo. A leitura foi feita no Citômetro de Fluxo FACSCalibur®
Becton Dickinson (BD) da Fundação HEMOAM.
Para a identificação morfométrica e imunofenotípica das células foi utilizado o
programa FlowJo (versão 9.4). Foram utilizados “gates” para a seleção das populações
de interesse em gráficos que combinaram características morfológicas
com
características imunofenotípicas das células identificadas pelo uso dos anticorpos
monoclonais marcados com fluorescências descritos acima. Os gráficos utilizados foram
do tipo “contour plot” e histograma, por apresentaram uma melhor visualização das
estratégias de análise.
29
A identificação dos Leucócitos foi realizada com um gráfico de SSC x CD45
(Figura 4) e uma “gate” foi feita na região CD45+ cujo marcador é expresso pelos
Leucócitos
Figura 4 - Identificação dos Leucócitos (CD45+) no programa FlowJo (versão 9.4)
Para identificação dos Linfócitos T CD4+ foi feito primeiramente um gráfico de
SSC x FSC (Figura 5) e uma “gate” foi feita na região de linfócitos totais. Em seguida foi
feito um gráfico de CD4 e CD45 (Figura 2xb), sendo selecionado a população CD4+, cujo
marcador é expresso pelos Linfócitos T CD4+.
A
B
Figura 5 - Identificação dos Linfócitos T CD4+ no programa FlowJo (versão 9.4)
30
A identificação das Células Dendríticas Epiteliais (CD1a+) foi realizada com um
gráfico de SSC x CD1a (Figura 6) e uma “gate” foi feita na região CD1a+ cujo marcador é
expresso pelas Células Dendríticas Epiteliais.
Figura 6 - Identificação das Células Dendríticas Epiteliais (CD1a+) no programa
FlowJo (versão 9.4)
Para a identificação das Células Dendríticas Subepiteliais DC-SIGN (CD209+) foi
feito um gráfico de SSC x CD209 (Figura 7) e uma “gate” foi feita na região CD209+ cujo
marcador é expresso pelas Células Dendríticas Subepiteliais DC-SIGN (CD209+).
Figura 7 - Identificação das Células Dendríticas Subepiteliais DC-SIGN (CD209+) no
programa FlowJo (versão 9.4)
31
3.4.2.7 Isolamento das Células Mononucleares (PBMC) por Gradiente de Ficoll
O sangue periférico foi processado dentro da capela de fluxo laminar nível II,
previamente esterilizado com álcool a 70% e a seguir com 15 minutos com luz ultravioleta (UV) no Laboratório de Terapia Celular da Fundação de Hematologia e
Hemoterapia do Amazonas (FHEMOAM). O isolamento das células mononucleares foi
realizado por gradiente de Ficoll-HypaqueTM (Acros, New Jersey, USA) volume a volume
(sangue/Ficoll) em tubo de fundo cônico de 15mL estéril. Este passou por centrifugação
a 2100 rpm por 30 minutos,
a 20°C e sem freio. Em seguida, o anel de células
mononucleares (creme de leucócitos) formado foi cuidadosamente coletado com
micropipeta de 1000µL e transferido para outro tubo de fundo cônico de 15 mL . O anel
foi ressuspendido em 10 mL de meio RPMI 1640 (Sigma-AldrichTM, USA) e centrifugado
a 1300 rpm por 7 minutos e 20°C com freio. O sobrenadante foi desprezado e esta etapa
foi repetida 2 vezes. Ao final, o pellet de células foi ressuspendido em 2 mL de meio
RPMI 1640 (Sigma-AldrichTM, USA) suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (SBF)
(GibcoTM Invitrogen, NY, USA), 1% de penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina
(100 µg/mL) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA) e homogenizado. Uma alíquota da
suspensão foi separada para a realização da contagem e viabilidade celular em câmara
de Neubauer, utilizando a solução de Turk para contagem e o corante vital Azul de
Tripan para análise da viabilidade.
3.4.2.8 Cultura in vitro das Células do Sangue Periférico
Após a contagem e análise da viabilidade celular, a suspensão celular contendo
as células mononucleares do sangue periférico (PBMC, do inglês: Peripheral blood
mononuclear cell) foi colocada em cultura com e sem estímulo em placa de cultura de
fundo chato com 12 poços (TPPTM, Trasadingen, Switzerland).
Para a cultura não
estimulada foi utilizado 1 mL de suspensão celular com 500 µL de meio RPMI 1640
(Sigma-AldrichTM, USA) Suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (SBF) (GibcoTM
Invitrogen, NY, USA) e 1% de penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100
µg/mL) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA), além de 5 µg/mL de concentração final de
Brefeldina A (Sigma-AldrichTM, Steinhein, Alemanha) . Para a cultura estimulada foi
utilizado 1 mL de PBMC com 500 µL de RPMI 1640 (Sigma-AldrichTM, USA)
Suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (SBF) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA) e
32
1% de penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 µg/mL) (GibcoTM Invitrogen,
NY, USA), além de 5 µg/mL de Brefeldina A (Sigma-AldrichTM, Steinhein, Alemanha), 10
ηg/mL de PMA (forbol-miristato-acetato, Sigma-AldrichTM, Steinhein, Alemanha) e 125
ηg/mL de concentração final de Ionomicina (Sigma-AldrichTM, Steinhein, Alemanha). As
células foram incubadas por 12h à 37°C e atmosfera de 5% de CO2. Após às 12h de
cultura foi retirado o sobrenadante para quantificação de citocinas. Quanto às células,
estas foram ressuspendidas com o auxilio de screaper e jato gelado de meio RPMI.
3.4.2.9 Imunofenotipagem das Células do Sangue Periférico e marcação das citocinas
citoplasmáticas
Após a cultura, as células foram lavadas 3 vezes e ressupendidas em 500 µL de
PBS (Tampão Fosfato Salino). Para a caracterização imunofenotípica das células
mononucleares (PBMC), foi realizada a técnica de Citometria de Fluxo.
As células foram marcadas com anticorpos monoclonais marcados com
fluorescência excitável que são captadas pelo Citômetro de Fluxo e que se fixam nas
moléculas de superfície dessas células. Neste estudo foi utilizado o seguinte painel de
anticorpos monoclonais marcados, alocados em 5 tubos: 1. CN, sem marcação; 2. antiCD3 PercP (Clorofilpiridina, code 347344, lote 41864, clone SK7, marca BD®
Biosciences) e e anti-CD4 FITC (Isotiocianato de Fluoresceína, code 555346, lote 75982,
clone RPA-T4, marca BD® Biosciences); 3. anti-CD14 FITC (Isotiocianato de
Fluoresceína, code 555397, lote 56623, clone M5E2, marca BD® Biosciences); 4. antiCD1a FITC (Isotiocianato de Fluoresceína, code 55806, lote 74276, clone HI149, marca
BD® Biosciences); 5. anti-CD11c PE (Ficoeritrina, code 301606, lote B140910, clone 3.9,
marca BioLegend®) e anti-CD123 FITC (Isotiocianato de Fluoresceína, code 306014, lote
B140008, clone 646, marca BioLegend®).(Quadro 3).
33
Quadro 3 - Anticorpos utilizados na marcação das células mononucleares do
sangue periférico
Fluorescência
Tubo
FITC
PE
PercP
APC
-
-
-
-
Tubo 2
Anti-CD4
Anti-IFN-γ
Anti-CD3
Anti-IL-10
Tubo 3
Anti-CD14
-
-
-
Tubo 4
AntiCD1a
Anti-IFN-γ
-
Anti-IL-10
Tubo 5
Anti-CD123
Anti-CD11c
-
-
Tubo 1 (CN)
Inicialmente foi incubado 100µL de suspensão celular com 4 µL de cada anticorpo
nos seus respectivos tubos. Estes foram homogeneizados e incubados por 30 minutos à
T.A. ao abrigo da luz. Após a marcação, foi feito a lise (destruição) das hemácias com o
uso da solução de lise (FACS Lysing solution, BD® Biosciences), diluída 10 vezes em
água destilada. Os tubos foram novamente homogeneizados e incubados por 10 minutos
nas mesmas condições. Passado a fase de incubação, os tubos foram centrifugados a
1300 rpm por 7 minutos. Em seguida o sobrenadante foi descartado e acrescentou-se 2
mL de PBS-W para lavagem do pellet formado. Os tubos foram homogeneizados e
centrifugados a 1300 rpm por 7 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi
descartado e foi adicionado 2 mL de PBS-P (Tampão Fosfato Salino com 0,5% de
albumina e 0,5% de saponina). Os tubos foram homogeneizados novamente e
incubados por 10 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Em seguida os
tubos foram centrifugados a 1300 rpm por 7 minutos. O sobrenadante foi descartado e
acrescentou-se 2 mL de PBS-W para lavagem do pellet formado. Os tubos foram
homogeneizados e centrifugados a 1300 rpm
por 7 minutos.
Ao término da
centrifugação, os tubos foram incubados por mais 30 minutos com 50 µL de anticorpos
diluídos em PBS-P (1:10) complementando o protocolo: Ao tubo 2, foi adicionado antiIL10 APC (Aloficocianina,
code 554707, lote 87108, clone JES3-19F1, marca BD®
Biosciences) e anti-IFN-γ PE (Ficoeritrina, code 340452, lote 47998, clone 2573.11,
marca BD® Biosciences); ao tubo 4. adicionado anti-IL10 APC (Aloficocianina, code
554707, lote 87108, clone JES3-19F1, marca BD® Biosciences) e anti-IFN-γ PE
(Ficoeritrina, code 340452, lote 47998, clone 2573.11, marca BD® Biosciences). Após a
incubação as células foram lavadas com 2 mL PBS-W. Os tubos foram homogeneizados
34
e centrifugados a 1300 rpm por 7 minutos. Ao final, o sobrenadante foi descartado e
adicionado 300µL de PBS-W para realizar a aquisição da amostra no citômetro de fluxo.
A leitura foi feita no Citômetro de Fluxo FACSCalibur® Becton Dickinson (BD) da
Fundação HEMOAM.
Para a identificação morfométrica e imunofenotípica das células foi utilizado o
programa FlowJo (versão
9.4). Foram construídas “gates” para a seleção das
populações de interesse em gráficos que combinaram características morfológicas com
características imunofenotípicas das células identificadas pelo uso dos anticorpos
monoclonais marcados com as fluorescências acima descritas. Os gráficos utilizados
foram do tipo “contour plot” e histograma, por apresentarem uma melhor visualização
das estratégias de análise.
A identificação dos Linfócitos T CD4+ foi realizada primeiramente com um gráfico
de SSC x FSC (Figura 8A) e uma “gate” foi construída na região de linfócitos totais. Em
seguida foi feito um gráfico de CD3 e CD4 (Figura 8B), sendo selecionado a população
CD3+/CD4+, cujo marcador é expresso pelos Linfócitos T CD4+. Para selecionar a
população destes linfócitos produtores de IFN-γ e IL-10 foram feitos um gráfico de CD4
e IFN (Figura 8C) e um gráfico de CD4 e IL-10 (Figura 8D), respectivamente.
A
B
C
D
Figura 8 - Identificação dos Linfócitos T CD4+no programa FlowJo (versão 9.4)
(C): Linfócitos T CD4+produtores de IFN-γ. (D) Linfócitos TCD4+ produtores de IL10
35
Para a identificação dos Monócitos (CD14+) foi feito um gráfico de SSC x CD14
(Figura 9) e uma “gate” foi construída na região CD14+ cujo marcador é expresso pelos
monócitos.
Figura 9 - Identificação dos Monócitos (CD14+)no programa FlowJo (versão 9.4)
A identificação das Células Dendríticas (CD1a+) foi realizada primeiramente com
um gráfico de SSC x CD1a (Figura 7A) e uma “gate” foi construída na região CD1a+.
Para selecionar a população de Células Dendríticas (CD1a+) produtoras de IFN-γ e IL-10
foram feitos um gráfico de CD1a e IFN (Figura 7B) e um gráfico de CD1a e IL-10 (Figura
10), respectivamente.
A
B
C
Figura 10 - Identificação das Células Dendríticas CD1a+no programa FlowJo
(versão 9.4)
(B): Células Dendríticas CD1a+produtoras de IFN-γ. (C): Células Dendríticas
CD1a+produtoras de IL-10.
36
A
identificação
das
Células
Dendríticas
Mielóides
(CD11c+/CD123-)
e
Plasmocitóides (CD11c-/CD123+) (CD11c+) foi realizada com um gráfico de SSC x FSC
(Figura 11a) e uma “gate” foi feita na região de monócitos. Para selecionar a população
de Células Dendríticas Mielóides (CD11c+/CD123-) e Plasmocitóides (CD11c-/CD123+)
(CD11c+) foi feito um gráfico de CD11c e CD123 (Figura 11b) e selecionado os
quadrantes para exclusão das populações mencionadas.
A
B
Figura 11 - Identificação das Células Dendríticas Mielóides (CD11c+/CD123-)(A) e
Plasmocitóides (CD11c-/CD123+)(B) no programa FlowJo (versão 9.4)
3.4.2.10 Dosagem de Citocinas no Sobrenadante de Cultura dos Fragmentos de Mucosa
Anal (Cytometric Bead Array - CBA)
A dosagem de citocinas do plasma e do sobrenadante da cultura dos fragmentos
de mucosa anal foram realizados pela técnica de Citometria de Fluxo CBA (Cytometric
Bead Array) seguindo o protocolo descrito no Kit BDTM HU TH1, TH2, TH17 CBA Kit (code
560484, marca BD® Biosciences). Através desse kit foram dosadas as citocinas
Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-4 (IL-4), Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-10 (IL-10),
Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α), Interferon-γ (IFN-γ) e Interleucina-17 (IL-17).
O kit BD™ Cytometric Bead Array (CBA) utiliza uma série de partículas
(microesferas ou beads) com intensidade de fluorescência distinta para detecção das
citocinas solúveis, através de uma superfície simultânea de captura. Cada bead de
captura está conjugada com um anticorpo específico para cada citocina. A detecção das
citocinas presentes na amostra é realizada através do fluorocromo ficoeritrina (PE) conjugado a anticorpos que fornecem um sinal fluorescente proporcional a quantidade
37
de citocina da amostra ligada a bead. Os complexos formados de bead de captura +
citocina da amostra + reagente de detecção são mensurados. A intensidade da
fluorescência PE de cada complexo revela a concentração em pg/mL de cada citocina.
Para a aquisição das amostras, foi utilizado o Citômetro de Fluxo FACScalibur® da
Becton Dickinson (BD) da Fundação HEMOAM. O cálculo das concentrações e
intensidade média de fluorescência de cada citocina foi realizado através do software
FCAP arrayTM versão 1.0.1.
3.4.3 Detecção do HPV por Captura Híbrida
Os testes para detecção dos grupos de risco do HPV foram feitos utilizando a
captura híbrida II, onde foram detectados os HPV de maior relevância designados
segundo o potencial oncogênico para induzir o câncer anal. As amostras foram
analisadas para os seguintes subtipos de HPV: baixo risco: 6, 11, 41, 42, 43 e alto risco:
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 (ROKA et al., 2008).
O processamento das amostras foi feito de acordo com o protocolo do fabricante
DIGENE® (ROKA et al, 2008) e teve como princípio a detecção, via sonda, do ácido
nucléico híbrido RNA-DNA específicos para os subtipos do HPV de baixo e alto grau
previstos. O RNA-DNA híbrido foi marcado com anticorpo fluorescente que ao reagir
com a sonda emite luz capturada pelo luminômetro como unidade de luz relativa (relative
light units) (RLU). O limite de ≥1 pg/ml RLU do HPV 16 foi utilizado como controle
positivo, além dos resultados negativo, positivo de baixo ou alto risco para o HPV. As
etapas de detecção por captura híbrida empregadas foram: Fase de Desnaturação:
Foram feitas alíquotas de 500µl de reagente de desnaturação no tubo com amostra que
deveriam adquirir a cor púrpura e a seguir homogeneizadas no vortex e incubadas a
65ºc por 45 minutos. Fase de Hibridização: alíquotas de 25µl de sonda e 75µl de
amostra foram colocadas no microtubo, cobertas com Plate Sealers e homogeneizadas
a 1.100 rpm por 2 minutos. A coloração deveria se tornar amarela. Incubar a 65ºC por 60
minutos. Fase de Captura dos Híbridos: Todo o material foi transferido para uma
microplaca, centrifugados a 1.100 rpm por 60 minutos a 20-25ºC. Fase de Reação com
o conjugado: O conteúdo da microplaca foi desprezado e adicionado 75µl de reagente
de detecção 1 em cada micropoço e a seguir incubados a 20-25ºC por 30 minutos. As
microplacas foram lavadas 6 vezes. Fase de Amplificação de Sinais: Foi adicionado
75µl de reagente de detecção 2 em cada micropoço e incubado a 20-25ºc por 15
38
minutos. Fase de leitura por quimioluminescência: introduzido a microplaca no dml2000 e realizado a leitura
3.4.4 Diagnóstico Molecular dos vírus Herpes 1 e 2, EBV e CMV através do Rapid
Real-Time PCR System
Para a reação foi utilizado o 7500 Rapid Real-Time PCR System fabricado pela
Applied Biosystems®. Os primers H1P32/H1M32, H2M40/H2P4, HSV-GF/CMV-R e HSVGF/EBV-R foram adquiridos da Invitrogen Life Technologies® Maxima com SYBR
Green/qPCR ROX 2Master Mix (2X). O processamento seguiu as recomendações de
Aldea et al. (2002) com adaptações menores. Os ciclos de anelamento e extensão da
PCR em tempo real foram as seguintes 50°C por 2 mim, 95°C por 10 mim, 95°C 30 seg
e 60 °C por 1 mim, 40 ciclos. Foi observado uma curva de dissociação 85-90 para
Herpes 2, entre 80-85 para Epstein Barr Vírus e de 85-90 para o Citomegalovírus
3.4.5 Diagnóstico sorológico do HIV
Foi realizado no Laboratório de Análises Clínicas da FMT-HVD de acordo com a
rotina estabelecida na Instituição:
a) Indivíduos assintomáticos para aids: teste de reação de ensaio imunoenzimático ELISA;
b) Sintomáticos para aids: dois testes rápidos - Determine® e Rapid Check®, sendo os
casos discordantes confirmados pelo Unigold®.
Em ambos os casos, os resultados positivos foram confirmados pelas técnicas de
imunofluorescência indireta (IFI), e nos discordantes pelo teste de Western Blot.
3.4.6 Contagem de linfócitos T CD4+ e determinação da carga viral do HIV
Foram coletados dos dados do prontuário dos pacientes com HIV/aids da FMTHVD e do laboratório multidisciplinar da Instituição, onde os mesmos são realizados. A
contagem dos linfócitos T CD4+ foi realizada pela técnica da citometria de fluxo no
aparelho BD FACSCalibur® e a determinação da carga viral do HIV-1 pelo ensaio
NASBA Biomérieux®.
39
Os resultados aceitos foram os realizados a até o máximo de 03 meses antes da
coleta da amostra anal, desde que não tenha ocorrido nenhum episódio de infecção
oportunista no período, nos casos contrários, um novo exame foi realizado.
3.5 Análise dos Resultados
3.5.1 Amostra
Foram coletadas amostras histológicas da zona de transição anal e do sangue
periférico de 85 pacientes, divididos em 03 grupos de interesse.
3.5.2 Cálculo da Amostra
Tomando como base a dissertação de Daumas (2007), que analisou a prevalência
de NIA em pacientes HIV positivos em Manaus, Amazonas, o cálculo amostral foi
realizado através do programa EPIINFO® (CDC, 2005), com os seguintes parâmetros:
Estimativa de p: 0.05
Erro: 5%
Coeficiente de Confiança: 95%
N obtido: 96
3.5.3 Tratamento Estatístico
Os dados foram registrados em um banco de dados eletrônico e alimentados
prospectivamente. Para avaliar se as medianas entre dois subgrupos eram iguais foi
utilizado o teste de Wilcox.
A frequência de células, de PBMC produtoras de citicinas e a frequência de
produção de citocinas por células mononucleares da mucosa anal foram comparadas
através de testes não paramétricos baseados na análise de variância (anova), KruskalWallis seguido do teste de comparação múltipla de Dunn’s.
A distribuição dos dados foi não-paramétrica e o nível de significância utilizado foi
de 5%. As análises foram realizadas com o software estatístico livre R na versão 2.14 de
40
31 de outubro de 2011 e o Graphpad Prism software version 5.0 (San Diego, USA). A
assinatura das citocinas (“altos produtores”) foi feita conforme descrito nos métodos.
3.5.4 Considerações Éticas
Em obediência à resolução n. 196 de 10 de outubro de 1996 e emendas, este
estudo somente teve início após a aprovação do comitê de ética em pesquisa da FMTHVD (Anexo 7.5).
Os pacientes receberam os esclarecimentos quanto aos objetivos do estudo,
riscos e benefícios da pesquisa. Os que concordaram, assinaram o TCLE (Anexo 7.1),
ficando-lhes assegurado o caráter confidencial dos dados e o recebimento de uma cópia
do TCLE contendo o telefone de contato e a assinatura do pesquisador responsável.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e a discussão são apresentados, a seguir, na forma de artigos
originais relacionados a tese. Os artigos referem-se a projetos desenvolvidos durante o
Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas (UEA), em convênio com FMT-HVD, para a obtenção do título de Doutor em
Doenças Tropicais e Infecciosas.
O primeiro artigo “ANÁLISE DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS E CITOCINAS NO
SANGUE PERIFÉRICO E MUCOSA ANAL DE PACIENTES HIV POSITIVOS
PORTADORES DE NEOPLASIA INTRAEPITELIAL ANAL” engloba os objetivos
específicos 1 e 2 deste estudo e submetido a revista Journal of AIDS.
O segundo artigo, “Co-infection of Epstein-Barr virus, Cytomegalovirus,
Herpes Simplex VIrus, Human Papillomavirus and anal intraepithelial neoplasia in
HIV patients in Amazon, Brazil”, foi publicado na Revista Brasileira de Coloproctologia
no vol. 32, nº 1 de 2012 (artigo 4.2 desta tese).
No anexo desta tese encontra-se ainda o artigo “Morphometric analysis of
dendritic cells from anal mucosa of HIV-positive patients and the relation to
intraepithelial lesions and cancer seen at a tertiary health institution in Brazil”
41
publicado na revista Acta Cirúrgica Brasileira, vol. 26 (6) 2011, completando assim a
quantidade regulamentar de artigos publicados necessários para a defesa desta tese
(Anexo 7.8).
4.1 Artigo 1. CD11c+CD123Low Dendritic Cell subset and the triad TNF-α/IL-17A/IFN-γ
integrate mucosal and peripheral cellular responses in HIV patients with High-grade anal
intraepithelial neoplasia – a systems biology approach.
Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro Guimarães, MD PhD 1,2,3, Allysson Guimarães da Costa,
Ms2,3,4,7, Olindo Assis Martins-Filho, PhD5, João Paulo Pimentel, Ms 4, Danielle Alves Gomes
Zauli, PhD5, Vanessa Peruhype-Magalhães, PhD5*, Andréa Teixeira-Carvalho, PhD5, Samantha
Ribeiro Béla, PhD5, Marcelo Antônio Pascoal-Xavier, MD PhD6, Jordana G. Coelho-dos-Reis,
PhD5; Josilene da Silva Abranches, Ms 4, José Jorge Pinheiro Guimarães, MD Ms 1, Adriana
Malheiro, PhD 4,7, Luiz Carlos de Lima Ferreira, MD PhD2,3
1- Department of Surgery, Medicine School, Federal University of Amazonas, Manaus, AM,
Brazil
2- Graduate program in Tropical Medicine, State University of Amazonas, Manaus, AM, Brazil
3- Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Manaus, AM, Brazil
4- Hematology and Hemotherapic Foundation of Amazonas, Manaus, AM, Brazil
5- Laboratory of Biomarkers for Diagnosis and Monitoring, René Rachou Research Center,
FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG, Brazil
6- Department of Anatomic Pathology, Medicine School, Federal University of Minas Gerais,
MG, Brazil
7- Graduate program in Basic and Applied Immunology, Federal University of Amazonas,
Manaus, AM, Brazil
*Corresponding Author:
Vanessa Peruhype-Magalhães
Laboratory of Biomarkers for Diagnosis and Monitoring
René Rachou Research Center – FIOCRUZ/MG
Av. Augusto de Lima 1715, Barro Preto - Belo Horizonte – Minas Gerais – Brazil
CEP 30190-002 - e-mail: [email protected]
Tel: +55 31 3349 7764 – Fax: +55 31 3291 3115
42
Conflicts of Interest and Source of Funding: LCLF is currently receiving a grant from
Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas (FAPEAM). OAMF and ATC are
currently receiving grants from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) and Fundação de Amparo à
Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG). JGCDR is currently receiveing fellowship from
FAPEMIG (PMPD). SRB is currently receiveing fellowship from CNPq (PDJ). ATC,
OAMF and AM thank CNPq for fellowships (PQ). For the remaining authors none were
declared.
43
Running head: Immunological networks in HIV and Anal cancer
Text word count: 3,430
Abstract word count: 231
Number of figures: 5
Number of references: 42
ABSTRACT
Backgroud: The incidence of anal cancer has increased over the last 25 years and
HIV/HPV co-infection is the most important risk factor for anal squamous cell
carcinoma. In this study, we demonstrated that the evaluation of systemic and
compartmentalized anal mucosa immune response is relevant to differentiating HIV(+)
patients at risk of anal intraepithelial neoplasia (AIN). Methods: A systems biology
approach was utilized in order to integrate different immunological parameters from anal
mucosal tissue and peripheral blood assessed by phenotypic and intra-cytoplasmic
analysis of lymphocytes and dendritic cell subsets. Results: Our data demonstrated that
anal mucosal mononuclear cells from AIN(+)HIV(+)patients showed a robust capacity in
producing pro-inflammatory/regulatory cytokines, mainly mTNF-α>IL-4>IL-10>IL6=IL-17A. Mucosal TNF-α/IFN-γ/IL-17A are selective HSIL-related biomarkers. Higher
levels of circulating CD11c+CD123Lowcells, and CD1a+ cells along with elevated levels
of
IFN-γ+CD4+
T-cells
are
major
features
associated
with
HSIL
in
AIN(+)HIV(+)patients. Regardless of the presence of AIN, HIV(+) patients presented a
complex biomarker network, rich in negative connections. Among those patients,
however, HSIL+ patients displayed stronger positive links between peripheral blood and
anal mucosa environments, exemplified by the subnet of IL-17A/TNF-α/CD4+IFN-γ+/
CD11c+CD123Low cells. Conclusion: The significant association between HSIL and the
levels of TNF-α/IL-17A/IFN-γ along with the different subsets of DCs present in the anal
mucosa milieu should be studied in more detail as a way to identify and cathegorize
HIV(+) patients vis à vis the high risk of anal cancer outcome.
Key words: immunological biomarkers, HIV, HIV/HPV co-infection, AIN
INTRODUCTION
The incidence of anal cancer has increased over the last 25 years by around 50% in the
general population with current annual incidence rates of between 0.8 and 1.8 cases per
44
100,000
1-7
. Among HIV-infected adults, the incidence of anal cancer is about 30-fold
higher than the general population1. HIV co-infection with the oncogenic Human
Papilloma virus (HPV) infection is a strong risk factor for anal squamous cell carcinoma4,
as well as its severe precursor lesion, the high-grade squamous intraepithelial lesions
(HSIL). Among those, HPV-associated anogenital tumors occur at increasing rates in
persons with HIV/AIDS 2,4.
Cell-mediated immune responses seem to play an important role in controlling
HPV/HIV-associated neoplasia, but lack of data in the anal mucosal milieu due to
difficulties in sampling and handling mucosal tissue obscure the search for conclusive
findings. Some reports have associated increased levels of Langerhans’ cells (CD1a+) and
intraepithelial T lymphocytes in the anal mucosa of HPV-infected patients 8. On the other
hand, CD1a+ cells and DC-SIGN+Dendritic cells+ (CD209+-DC +) are reduced in
HIV/HPV co-infected patients
9-11
. In situ reduction of CD3+ lymphocytes and
CD4+/CD8+ ratio may also be a risk factor for susceptibility to infection and malignancy
in HIV-infected patients at risk of HPV infection 10,12,13.
Dissemination and progressive growth of HPV-induced lesions may be related to escape
from local cytokine-mediated surveillance
14,15
. Type-1 cytokines, such as IL-2 and IFN-
γ, stimulate and enhance cellular and humoral immunity. Patients with HPV-associated
neoplasms presenting a type-1 cytokine profile have displayed a better clinical outcome
compared with others exhibiting a type-2 cytokine profile
14,15
. Other cytokines such as
IL-6 and TNF-α are increased in HPV-infected patients, whereas higher IL-10 and IL-12
levels were found to predict HIV/HPV co-infection
15,16
. HPV-related cervical SIL in
HIV/HPV co-infected patients present increase in HPV-inespecific IFN-γ+CD8+ T cells
when compared with HPV-infected patients14. Regarding the high-grade lesions,
HIV/HPV co-infected-HSIL patients were associated with assembling of a suboptimal
45
type-1 immune response, characterized by decreased IL-2, IFN-γ and TNF-α levels
14,17
.
These findings suggest an important role of cytokines in the development/morbidity of
intraepithelial
lesions,
and
studying
the
interplay
between
the
pro-
inflammatory/regulatory cytokines secreted from immune cells residing at the anal
mucosa site and from peripheric cells would allow for the rational selection of putative
biomarkers of disease progression to AIN. Thus, in the present study, a new systems
biology approach was utilized to reveal potential immunological biomarkers in AIN that
would improve the diagnosis of HPV/HIV-associated disease morbidity.
MATERIAL AND METHODS
Ethical Aspects
The study had approval by the Ethics Committee from the TMFAM (Protocol#
3319/2008). All patients signed an informed written consent form in accordance to the
guidelines established by the 466/2012 resolution of the Brazilian National Health
Council.
Study Population
This study included 85 male patients, with age ranging from 15-60 years. The patients
were invited to participate in the study and were examined at the ambulatory of
coloproctology of the TMFAM. Genotyping of HPV was performed on samples obtained
from biopsy of the anal canal using a nested PCR method as described previously 1. HIV
test was performed by ELISA immunoassay, and indirect immunofluorescence. In
addition, histological analysis was performed to assess the presence of AIN, squamous
cell carcinoma, adenocarcinoma and inflammatory diseases as described by Guimarães et
al., (2011) 1.
46
Supplemental table 1 displays the details of the study population, which was categorized
as follows: i) Group AIN(-)/HIV(-); ii) Group AIN(-)/HIV(+) and iii)
Group
AIN(+)/HIV(+). Group AIN(+) was subcategorized based on the histopathology analysis
of anal mucosa and classified as low-grade (LSIL) or high-
grade squamous
intraepithelial lesion (HSIL).
Clinical Samples
All patients were evaluated by high-resolution anoscopy. The digital rectal examination
was performed, followed by an inspection of the mucosa with the use of a optical
colposcope with 16 to 40-times magnification after introduction of gauze soaked in 3%
acetic acid into the anal canal for two minutes. The anoscope was re-introduced for the
analysis of the anal canal, and rectum examination under image magnification. The
findings were registered, and the predominant acetowhite areas were biopsied. The
samples designated by histopathological analyses were preserved in 10% formalin. For
flow cytometry analysis, blood samples were collected in EDTA, and the biopsy
fragments were maintained in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium.
Immunophenotypic and intracytoplasmic cytokine analysis
Immunophenotypic and intracytoplasmic cytokine staining of peripheral blood
mononuclear cells (PBMC) and anal mucosa mononuclear cells The FlowJo software
version 9.4 was used for data analysis. For analysis of PBMC, the identification of total
lymphocytes was performed, initially by a lymphocyte scatter gate set-up, using FSC
versus SSC contour plot, as illustrated in figure 1 (Figure 1A). Monocyte analysis was
performed by FITC anti-CD14 versus SSC contour plots gated on SSClowCD14high cells
(Figure 1B).
47
Identification of the DC subsets was performed by immunophenotypic analysis using PE
anti-human CD11c and FITC anti-human CD123 monoclonal antibodies. As shown in
figure 1C, the non-overlapping myeloid DC (mDC) and plasmacytoid DC (pDC) subsets
were identified as CD11c+ CD123- and CD123HighCD11c- cells, respectively
overlapping DC subset was characterized as CD11c+CD123Low cells
21,22
19,20
. The
. Subsequently,
The selection of CD1a+ cells was done by anti-FITC-CD1a versus SSC contour plots.
The CD4+ T-cells were determined by anti- PerCP-CD3 versus anti- FITC-CD4 contour
plots. All results were expressed as percentage of cells for each cell subset. Following the
selection of CD4+ T-cells subset, and CD1a+ cells, the frequency of cytokine-producing
cells was determined using quadrant statistics on PE anti-IFN-γ or APC anti-IL-10
contour plots.
A single cell suspension from the anal mucosal tissues was prepared by homogenization
of samples with collagenase. Mononuclear cells were obtained by Ficoll-Hypaque
(Acros, New Jersey, USA) from the cell suspension as well as from blood. Samples were
treated with FACS lysing solution (Becton Dickinson Biosciences) and after erythrocyte
lysis was completed, the samples were washed with PBS containing 0.5% BSA and 0.1%
sodium azide. In vitro short-term cultures of mononuclear cells obtained from blood and
anal mucosal tissues were performed as described by Luiza-Silva et al. 2 and modified as
follows: 1 x 106 cells were incubated for 6 hours at 37°C, 5% CO2, in the presence of
RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY; controlculture) After culturing, cells
were re-incubated in the presence of brefeldin A (BFA; Sigma Chemical Company, St.
Louis, MO) at 10 ng/mL for an additional period of 4 hours at 37oC, 5% CO2, and then
treated with 2 mM final concentration of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA; Sigma
Chemical Company) for 10 minutes at room temperature. Cell suspension was washed
48
with fluorescence-activated cell sorting (FACS) buffer (phosphate buffered saline [PBS],
pH 7.2, supplemented with 0.5% bovine serum albumin and 0.1% sodium azide, all from
Sigma Chemical Company) and aliquots were stained with anti-human cell surface
monoclonal antibodies: PercP-CD45-clone/2D1, FITC-CD4-clone/RPA-T4, FITC-CD1aclone/HI149 and FITC-CD209-clone/DCN56 (Becton Dickinson® Biosciences or
Biolegend®),
PerCP-CD3-clone/SK7,
FITC-CD4-clone/RPA-T4,
FITC-CD14-
clone/M5E2, FITC-CD1a-clone/HI149, PE-CD11c-clone/3.9, FITC- CD123-clone/646;
PE-IFN-γ-clone/2573.11, and APC-IL-10 -clone/JES3-19F1 (Becton Dickinson®
Biosciences and Biolegend®). Samples were then fixed in 200µL of FACS fixing
solution (10g/L paraformaldehyde, 10.2g/L sodium cacodylate and 6.63g/L sodium
chloride, pH 7.2), and stored at 4°C in the dark prior to flow cytometric analysis within
24 hours. A total of 30,000 events/sample were acquired using FACScalibur® flow
cytometer (Becton Dickinson).
Selective analysis of anal mucosa mononuclear cells was achieved by side scatter-SSC
versus anti-CD45/anti-CD4 or anti-CD1a or anti-CD209. Identification of CD4+ T-cells
was performed initially by a lymphocyte scatter gate set-up, using SSC versus anti-PercPCD45 (Figure 1D). After that, intraepithelial CD4+ T-cells were characterized within
CD45high cells. Analysis of DC subsets was performed using SSC versus anti-FITC-CD1a
(Figure 1E) or anti- FITC-CD209 (Figure 1F) contour plots.
Flow cytometric quantitative analysis of cytokines secreted by culture of PBMC and anal
mucosal cells
The cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ and IL-17A were measured
in the culture supernatant of PBMC and anal mucosal mononuclear cells from all patients
by Cytometric Bead Array (BDTM HU TH1, TH2, TH17 CBA Kit - code 560484, BD®
49
Biosciences, San Jose, CA, USA).
The cytokine levels were measured as per
manufacturer’s instructions and modified according to Peruhype-Magalhães et al (2006)
23
. Data acquisition was performed by flow cytometry using a FACSCalibur flow
cytometer (Becton Dickinson, La Jolla, CA, USA). The results were expressed as pg/mL,
as assessed by the standard curve.
Cytokine Signature Analysis
The cytokine signature was assembled as reported previously2. Briefly, the global
median value for each cytokine was calculated using data from all patients (AIN(- )
HIV(-) + AIN(-)HIV(+) + AIN(+)HIV(+)).The global median for each cytokine was
employed as a cut off point to discriminate each individual as “Low” or “High” producer
of the cytokine secreted in the culture supernatant of both PBMC and anal mucosal
mononuclear cells summarized in radar graphs. The relevant differences, considered
when the values were above the 50th percentile were highlighted by underline and bold
format.
Statistical Analysis
The frequency of cells and cytokine-producing PBMC subsets and the frequency of
cytokine-producing anal mucosal mononuclear cell subsets were compared by nonparametric tests based on analysis of variance (anova), Kruskal–Wallis test followed by
Dunn’s multiple comparison test. The Graphpad Prism software version 5.0 (San Diego,
USA) was employed for data analysis. Statistically significant differences were
considered if p<0.05 and are highlighted by connecting lines. Cytokine signature analysis
was performed as described in supplemental material.
Systems biology analysis
To model the complex interactions between the biomarkers evaluated in the study,
networks were assembled by, first, assessing the association within the cytokines secreted
50
in the culture supernatant of either PBMC with/and anal mucosal mononuclear cells for
each clinical group. Spearman’s correlation test was performed to assess the association
between the levels of each cytokine (pg/mL) and the percentage of cell subsets tested.
The positive and negative correlations were significant when the p<0.05. The correlation
index (r) were used to categorize the correlation strength as negative (r<0), moderate
(0.36>r<0.67) and strong (r>0.68) and shown in Figure 5. The Graphpad Prism software
version 5.0 (San Diego, USA) was used for data analysis and the Cytoscape (version 2.8)
was employed for computing the subsystems composed by networks of the
biomolecules24.
RESULTS
Variations in the frequency of circulating IFN-g+ or IL-10+ CD4+ T-cells, IFN-g+ or IL10+ CD1a+ cells, CD11c+CD123Low and pDC are associated with the HIV infection
rather than the presence of AIN
Aiming to identify cell biomarkers associated with AIN, the analysis of
phenotypic/functional features in the peripheral blood of groups AIN(-)/HIV(-), AIN()HIV(+) and AIN(+)HIV(+) were performed (Fig. 2). Data analysis demonstrated that
despite the presence of AIN, all HIV(+) patients presented decreased percentage of
circulating lymphocytes, mainly CD4+ T-cells along with decreased frequency of CD11cCD123+-pDC, and increased levels of circulating CD1a+ cells (Fig 2A). Moreover,
regardless of the presence of AIN, higher frequency of IFN-γ+ or IL-10+ -CD4+ T-cells,
and CD11c+CD123LowDCs as well as lower frequency of IFN-γ+ or IL-10+ CD1a+ cells
was observed in HIV(+) patients with or without AIN (Fig. 2B).
Single quantitative alteration in intraepithelial lymphocyte and DC subsets in anal
mucosa of HIV-infected patients are unrelated to the presence of AIN
51
We have characterized the phenotypic features of anal mucosal intraepithelial
mononuclear cells of the groups: AIN(-)/HIV(-), AIN(-)HIV(+) and AIN(+)HIV(+) (Fig.
2C). Data analysis revealed an increased frequency of intraepithelial CD45High
lymphocytes as well as increased frequency of CD1a+-DCs and CD209+-DCs in all
HIV(+) patients regardless of the presence of AIN (Fig. 2C).
AIN is associated with prominent secretion of pro-inflammatory/regulatory cytokines
from anal mucosal mononuclear cells as opposed to PBMC
Aiming to further characterize the immunological profile associated with AIN during
HIV infection, we have assembled, for each clinical group, the biomarker signature with
the frequency of high producers of each cytokine secreted in the supernatant of anal
mucosa (m) and peripheral blood (pb) mononuclear cells (Fig. 3). Initially, the number of
subjects with “High” cytokine levels was compiled in gray-scale diagrams to determine
the frequency of High producers in each clinical group (Fig. 3A). Our data demonstrated
that whereas AIN(-)HIV(-) subjects presented more relevant cytokine production by
PBMC, AIN(-)HIV(+) presented a balanced contribution of both compartments (Fig. 3A).
Moreover, AIN(+)HIV(+) group presented significantly increased cytokine production in
the anal mucosa compartment (Fig. 3A).
Comparative analysis was also performed after assembling radar graphs of each clinical
group, aiming to identify the most relevant biomarkers. Data analysis showed that AIN()HIV(-) subjects showed an overall IL-10-modulated pro-inflammatory profile (pbIL-6,
pbTNF-α and pbIFN-γ) in peripheral blood with discrete cytokine production in anal
mucosa (Fig. 3B). On the other hand, AIN(-)HIV(+) patients displayed a balanced proinflammatory/regulatory profile in anal mucosa (mIL-6, mIL-2, mIL-10), and peripheral
blood (pbIL-6, pbTNF-α, pbIL-2, pbIFN-γ and pb-IL-17A). Anal mucosal mononuclear
52
cells from AIN(+)HIV(+) patients showed significant capacity to secrete proinflammatory/regulatory cytokines, specifically mTNF-α > mIL-4 > mIL-10 > mIL-6 =
mIL-17A, with minor secretion (pbIL-2) from PBMC (Fig. 3B).
Higher levels of circulating CD11c+CD123Low and CD1a+ DCs along with elevated
levels of IFN-γ-secreting CD4+ T-cells are major features associated with HSIL in
AIN(+)HIV(+) patients
Aiming to further characterize the localized and systemic immune response in
AIN(+)HIV(+)patients, we have sub-categorized these patients based on the
histopathology analysis of anal mucosa, classified as low-grade squamous intraepithelial
lesion (LSIL), and high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) (Fig. 4).
Histological data showed that LSIL displayed anal transition zone with acanthosis,
papillomatosis, and diffuse mononuclear inflammatory infiltrate (Fig. 4A). The presence
of koilocytes, enlarged cells with a cytoplasmic halo surrounding the nucleus was
indicative of active HPV replication (Fig. 4A –left panel highlight). HSIL showed
squamous mucosa with disorders of maturation and polarity across its thickness, and
abnormal basaloid cells with an increased nuclear to cytoplasmic ratio (Fig 4A – right
panel).
Considering the relevance of the histopathological findings of AIN to the disease
outcome, we have further analyzed the phenotypic and functional profile of anal mucosa
mononuclear cells from patients with either LSIL or HSIL. Although HSIL+ patients
showed lower levels of circulating and intraepithelial lymphocytes, these subjects
presented similar levels of CD4+ T-cells, but significantly higher levels of IFN-γ+CD4+ Tcells in peripheral blood as compared to LSIL (Fig. 4B). On the other hand, HSIL+
patients showed higher levels of circulating CD11c+CD123Low and CD1a+ DCs, but lower
53
frequency of IFN-γ or IL-10-secreting CD1a+ DCs in the peripheral blood as compared to
LSIL (Fig. 4B).
Radar graphs displayed that mTNF-α and mIL-4 are AIN-related elements, mIL-6,
mIFN-γ, mIL-10, and mIL-17A are selective HSIL-related features. Also, enhanced
frequency of pbIL-2 and pbIL-10 were observed in HSIL+ patients (Fig 4C).
HIV(+) patients presented a complex biomarkers network rich in negative connections,
regardless of the presence of AIN.
HIV(+) patients presented some preserved interactions among biomarkers as illustrated
for peripheral blood and anal mucosa by the triad TNF-α/IL-10/IL-6 (Fig. 5). However,
regardless the presence of AIN, HIV(+) patients presented more complex and imbricated
biomarker network rich in negative connections, mainly between peripheral blood cells
and anal mucosal cells, as well as soluble cytokines, when compared to the reference
HIV(-) controls (Fig. 5A and B). Noteworthy, AIN was associated with a relevant loss of
connections between anal mucosal CD1a+ DCs with several biomarkers from the
peripheral blood, such as IFN-γ+CD4+ cells and pbIL-2, as well as anal mucosa such as,
mTNF-α and the CD1a+/CD209+/CD45+ triad (Fig. 5B). Mucosal IL-17A (mIL-17A) also
lost negative and positive connections with pDCs (negative), IFN-γ+CD4+ cells (positive)
and CD209+ DCs (negative). Interestingly, mIL-17A gained positive correlation with
mIL-6 in HIV(+)AIN(+), which is absent in HIV(+)AIN(-) and kept the strong mIL10/mTNF-α/mIL-6 triad seen in both groups (Fig. 5B). This strong mIL-10/mTNFα/mIL-6 triad is seen in LSIL, however it is absent in HSIL indicating the regulatory axis
of mucosal IL-10 and IL-6 is important to regulate the effects of mucosal TNF-α.
Regarding the degree of lesion, LSIL+ patients presented a broader set of negative
connections between PBMC and anal mucosal cytokines. On the other hand, although
54
HSIL+ patients presented more concise biomarker subnets, these were composed by
stronger and positive interactions between peripheral blood and anal mucosa
environments, exemplified by the triad of mIL-17A/mTNF-α/IFN-γ+CD4+cells. In HSIL+
patients, IFN-γ+CD4+cells and CD11c+CD123Low DC form a strong direct positive
interaction, which was weak in LSIL+ patients. The pbMON/mIL-10 dyad stands alone
without other connections in HSIL+ patients. The strong mIL-10/mTNF-α/mIL-6 triad
seen in AIN(-) and LSIL+ patients is not formed in HSIL+ patients indicating that this
regulatory subnet is not operating in the higher-grade lesion (Fig. 5C). Also, HSIL+
patients
presented
a
complete
loss
of
connections
within
the
mucosal
CD1a+/CD209+/CD45+ triad, which is observed in AIN(-) and partially seen in LSIL+
patients (Fig. 5C).
DISCUSSION
In the context of local and systemic immune deregulation, a systems biology approach
allowed for a unique analysis in a wider perspective. The frequency of cell subsets taken
alone may not vary during the process of deregulation of the immune system but their
function and interaction with the microenvironment may shift from one stage to another.
The analysis of networks composed of the biomarkers tested, indicated that these might
gain or loose either positive or negative connections with each other in different clinical
settings of the AIN and may indicate the presence of high-grade squamous intraepithelial
lesions (HSIL), which may progress to anal cancer.
Our data regarding the anal mucosa mononuclear cells from AIN(+)HIV(+) patients with
HPV infection showed a prominent capacity in producing pro-inflammatory/regulatory
cytokines, mainly mTNF-α>IL-4>IL-10>IL-6=IL-17A. Mucosal TNF-α/IFN-γ/IL-17A
were selective HSIL-related biomarkers. Regardless the presence of AIN, HIV(+)
55
patients presented a complex biomarker network rich in negative connections. However,
HSIL+ patients display stronger positive links between peripheral blood and anal mucosa
environments, exemplified by the triad mIL-17A/mTNF-α/pbIFN-γ+CD4+. Several
studies have shown that the presence of high-grade cervical intraepithelial neoplasia
(CIN) in HIV/HPV co-infected patients had high statistical significance and correlation
with cytokine deregulation17,25. Indeed, the lack of immune surveillance in tumors has
been associated with increased tissue inflammatory cytokines (IL-12, IL-1, TNF-α and
IL-17)25-28, which was associated with poorer outcomes in some epithelial cancers, when
accompanied by the presence of regulatory T-cells in tumor specimens13,29,30.
Another consequence of HIV infection that predisposes to HPV-related carcinomas is the
impairment of local immunity by reducing the function of cytotoxic and regulatory Tcells, CD1a+ and DC-SIGN+ DCs in anal tissue13,14,31. Particularly, CD1a+ and DC-SIGN+
DCs have a role in protecting anal tissue from malignancy13. The interplay of these cells
with leukocytes in the anal mucosa exemplified by the CD1a+/CD209+/CD45+ triad in
AIN(-) and LSIL+ patients may be important to prevent the development of high-grade
lesions.
Yaghoobi et al. have observed a higher risk of recurrence of anal cancer and HSIL in
patients with low CD4+ T-cells, nonetheless they suggested that the levels of circulating
CD4+ T-cells taken alone does not contribute for predicting HPV-associated neoplasia13.
Our data demonstrated that decreased frequency of circulating CD4+ T-cells, pDC, and
IFN-γ+ or IL-10+-producing CD1a+ DCs as well as increased percentage of CD1a+ cells,
IFN-γ+ or IL-10+ CD4+ T-cells, and CD11c+CD123Low found are associated to HIV
infection rather than the presence of AIN.
Regarding the HIV infection, in agreement with the present results, several reports
demonstrate alteration in the percentages of DC subsets in HIV-infected patients31-36.
56
Myeloid DCs (CD11c+CD123Low) exhibited increase during HIV infection and in HIVinfected patients with AIN, while pDCs had decreased levels in the peripheral blood of
HIV-infected patients, which is in agreement with previous findings32-37.
During HIV infection, plasmacytoid DCs (CD123High) strongly suppress HIV replication
in autologous CD4+ T cells via a mechanism involving IFN-α as well as other antiviral
factors38. Upon exposure to LPS, TNF-α and IL-1β, HIV-1 gp120 was demonstrated to
sensitize cultured DC and blood DC for apoptosis. Binding of HIV-1 gp120 to DC-SIGN
was shown to promote ASK-1-dependent activation-induced apoptosis of human DCs
36,37
. This could be a mechanism by which HIV escapes from its surveillance in vivo. An
alternative hypothesis to explain the lower percentage of pDCs in the peripheral blood of
HIV-infected patients could be that pDCs with a partially-activated phenotype
accumulate in lymphoid tissue during asymptomatic, chronic HIV-1 infection
35
. pDCs
display outstanding capacity on producing IFN type I, and have therefore robust antiviral
activity, which could drive these cells to the mucosal and lymphoid tissues upon
inflammatory signals 36,35,39. The decreased percentage of pDCs in the peripheral blood of
HIV-infected patients with AIN also could be related to their migration to the local
inflammatory site to attempt resolving the mucosal infection.
Regarding the DC myeloid compartment, it has been shown that HIV-1 infection induces
the production of endogenous lipids required for effective viral production. Previous
studies have demonstrated that CD1c and CD1d molecules are down-regulated by HIV-1
in a Vpu-dependent and Nef-independent manner40. Both immature and mature myeloid
DCs optimally present lipid antigens making CD11c+CD123lowDCs and CD1a+DCs
possible lipid presenting cells in the anal mucosa. However, the percentages of IFN-γ+
and IL-10+CD1a+DCs are decreased in HSIL+ patients, which may suggest an immature
profile of CD1a+DCs. In this regard, peripheral tolerance mediated by immature DCs
57
could take place by inducing the proliferation of regulatory T cells or inducing T-cell
anergy41,42. Therefore, a putative hypothesis to explain the altered circulating DC profile
is the compensatory mechanism by which the host tries to recover lipid presentation
systemically in order to halt tumor growth. However, expansion of immature DCs during
this process may induce peripheral tolerance and regulate IFN-γ+CD4+T-cell function.
The increased frequency of these cells may be due to accumulation rather than
proliferation considering that these cells are not able to clear infection or control the
tumor growth. In this context, the increase in mucosal IL-17A/TNF-α/IFN-γ could be an
outcome of the Th1/Th17 cell migration to mucosa, contributing to the inflammatory
process without controlling tumor growth. More studies need to be performed in order to
understand the interplay between the CD1a+ and CD11c+CD123lowDCs with the
remaining CD4+T cells as well as Th1 and Th17 balance in mucosal tissue in vivo.
Moreover, the increased frequency of intraepithelial CD45+ lymphocytes, CD1a+ DCs,
and CD209+-DCs were also not associated with the presence of AIN. Higher levels of
circulating CD11c+CD123Low cells, and CD1a+ DCs along with elevated levels of IFNγ+CD4+ T-cells are associated with HSIL in AIN(+)HIV(+)patients. CD1a+ cells were
found in the stratified epithelium of patients with AIN arranged in an interconnected
network at the suprabasal layer of the anal mucosa and exhibited the characteristics of
dendritic cells11.
However, analysis of biomarker networks show that CD1a+ DCs loose either positive or
negative connections with other subsets of cells when we compare LSIL patients with
HSIL AIN(+)HIV(+)patients. These results are in agreement with previous study that
demonstrates that depletion of CD1a+ cells in the anal mucosa is likely to contribute to
the risk of HPV-related anal cancer in HIV-infected patients13. In previous study of our
group, we demonstrated that an elevation in the percentage of CD1a+ cells and CD209+-
58
DCs reflects a distinct role of these cells in relation to protection and vulnerability of the
patients to infections and tumors9. In the biomarker network analysis, the strong dyad
CD11c+CD123Low DCs and IFN-γ+CD4+ formed in HSIL+ patients may represent an
ineffective attempt to control virus-induced lesion. Our findings suggest that a
quantitative and/or qualitative disturbance of DC subsets might potentially interfere with
the immune surveillance of HIV/HPV-associated neoplastic lesions.
The analysis of the interactions among biomarkers revealed essential connections among
subsets of DCs and cytokines. Considering the novel strategies for controlling HIV
infection via dendritic cells and the importance of these interactions on them, it is
important to take these findings into account when designing and testing the efficacy of
these therapeutic/immunoprophylactic approaches in the mucosal context. It is important
to consider, however, that future studies with proper validation of the immunological
subsets as well as with their implementation for monitoring mucosal tissue in the clinical
setting are still needed in order to support their predictive value, specificity and
applicability as putative biomarkers of progression of AIN in HIV patients.
Acknowledgments
The authors would like to thank Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas
(FAPEAM), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
FIOCRUZ and Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) for
finantial support. The authors also thank PDTIS-FIOCRUZ for the use of its facilities.
ATC, OAMF and AM thank CNPq for fellowships (PQ).
59
References
1.
van Leeuwen MT, Vajdic CM, Middleton MG, et al. Continuing declines in some
but not all HIV-associated cancers in Australia after widespread use of antiretroviral
therapy. AIDS. 2009;23(16):2183-2190.
2.
Yen Moore A, Tong LX, Moore T. Management of human papillomavirus-related
anal and colon cancer. Curr Probl Dermatol. 2014;45:225-235.
3.
van der Zee RP, Richel O, de Vries HJ, Prins JM. The increasing incidence of anal
cancer: can it be explained by trends in risk groups? Neth J Med. 2013;71(8):401-411.
4.
Silverberg MJ, Lau B, Justice AC, et al. Risk of anal cancer in HIV-infected and
HIV-uninfected individuals in North America. Clin Infect Dis. 2012;54(7):1026-1034.
5.
Lee PC, Hu YW, Hung MH, et al. The risk of cancer in patients with benign anal
lesions: a nationwide population-based study. Am J Med. 2013;126(12):1143 e11491118.
6.
Kan M, Wong PH, Press N, Wiseman SM. Colorectal and anal cancer in
HIV/AIDS
patients:
a
comprehensive
review.
Expert
Rev
Anticancer
Ther.
2014;14(4):395-405.
7.
Chen M, Jen I, Chen YH, et al. Cancer incidence in a Nationwide HIV/AIDS
patient cohort in Taiwan in 1998-2009. J Acquir Immune Defic Syndr. 2014;65(4):463472.
8.
Kobayashi A, Weinberg V, Darragh T, Smith-McCune K. Evolving
immunosuppressive microenvironment during human cervical carcinogenesis. Mucosal
Immunol. 2008;1(5):412-420.
9.
Guimaraes AG, Silva Junior RM, Costa OT, et al. Morphometric analysis of
dendritic cells from anal mucosa of HIV-positive patients and the relation to
intraepithelial lesions and cancer seen at a tertiary health institution in Brazil. Acta Cir
Bras. 2011;26(6):521-529.
10.
Muller H, Weier S, Kojouharoff G, et al. Distribution and infection of Langerhans
cells in the skin of HIV-infected healthy subjects and AIDS patients. Res Virol.
1993;144(1):59-67.
11.
Sobhani I, Walker F, Aparicio T, et al. Effect of anal epidermoid cancer-related
viruses on the dendritic (Langerhans') cells of the human anal mucosa. Clin Cancer Res.
2002;8(9):2862-2869.
60
12.
Sobhani I, Walker F, Roudot-Thoraval F, et al. Anal carcinoma: incidence and
effect of cumulative infections. AIDS. 2004;18(11):1561-1569.
13.
Yaghoobi M, Le Gouvello S, Aloulou N, Duprez-Dutreuil C, Walker F, Sobhani I.
FoxP3 overexpression and CD1a+ and CD3+ depletion in anal tissue as possible
mechanisms for increased risk of human papillomavirus-related anal carcinoma in HIV
infection. Colorectal Dis. 2011;13(7):768-773.
14.
Lee BN, Follen M, Tortolero-Luna G, et al. Synthesis of IFN-gamma by CD8(+)
T cells is preserved in HIV-infected women with HPV-related cervical squamous
intraepithelial lesions. Gynecol Oncol. 1999;75(3):379-386.
15.
Crowley-Nowick PA, Ellenberg JH, Vermund SH, Douglas SD, Holland CA,
Moscicki AB. Cytokine profile in genital tract secretions from female adolescents: impact
of human immunodeficiency virus, human papillomavirus, and other sexually transmitted
pathogens. J Infect Dis. 2000;181(3):939-945.
16.
Mbulaiteye SM, Kemp T, Gage JC, et al. Plasma cytokine levels and human
papillomavirus infection at the cervix in rural Nigerian women. Cytokine.
2013;64(1):146-151.
17.
Peghini BC, Abdalla DR, Barcelos AC, Teodoro L, Murta EF, Michelin MA.
Local cytokine profiles of patients with cervical intraepithelial and invasive neoplasia.
Hum Immunol. 2012;73(9):920-926.
18.
Luiza-Silva M, Campi-Azevedo AC, Batista MA, et al. Cytokine signatures of
innate and adaptive immunity in 17DD yellow fever vaccinated children and its
association with the level of neutralizing antibody. J Infect Dis. 2011;204(6):873-883.
19.
Cox K, North M, Burke M, et al. Plasmacytoid dendritic cells (PDC) are the major
DC subset innately producing cytokines in human lymph nodes. J Leukoc Biol.
2005;78(5):1142-1152.
20.
Ueda Y, Hagihara M, Okamoto A, et al. Frequencies of dendritic cells (myeloid
DC and plasmacytoid DC) and their ratio reduced in pregnant women: comparison with
umbilical cord blood and normal healthy adults. Hum Immunol. 2003;64(12):1144-1151.
21.
Robinson SP, Patterson S, English N, Davies D, Knight SC, Reid CD. Human
peripheral blood contains two distinct lineages of dendritic cells. Eur J Immunol.
1999;29(9):2769-2778.
22.
MacDonald KP, Munster DJ, Clark GJ, Dzionek A, Schmitz J, Hart DN.
Characterization of human blood dendritic cell subsets. Blood. 2002;100(13):4512-4520.
61
23.
Peruhype-Magalhaes
V,
Martins-Filho
OA,
Prata
A,
et
al.
Mixed
inflammatory/regulatory cytokine profile marked by simultaneous raise of interferongamma and interleukin-10 and low frequency of tumour necrosis factor-alpha(+)
monocytes are hallmarks of active human visceral Leishmaniasis due to Leishmania
chagasi infection. Clin Exp Immunol. 2006;146(1):124-132.
24.
Shannon P MA, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D. Cytoscape: a software
environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genom Res.
2003;13:2498-2504.
25.
Moscicki AB, Ellenberg JH, Crowley-Nowick P, Darragh TM, Xu J, Fahrat S.
Risk of high-grade squamous intraepithelial lesion in HIV-infected adolescents. J Infect
Dis. 2004;190(8):1413-1421.
26.
Souza JM, Matias BF, Rodrigues CM, Murta EF, Michelin MA. IL-17 and IL-22
serum cytokine levels in patients with squamous intraepithelial lesion and invasive
cervical carcinoma. Eur J Gynaecol Oncol. 2013;34(5):466-468.
27.
Iwata T, Fujii T, Morii K, et al. Cytokine profile in cervical mucosa of Japanese
patients with cervical intraepithelial neoplasia. Int J Clin Oncol. 2014.
28.
Langowski JL, Zhang X, Wu L, et al. IL-23 promotes tumour incidence and
growth. Nature. 2006;442(7101):461-465.
29.
van der Burg SH, Piersma SJ, de Jong A, et al. Association of cervical cancer with
the presence of CD4+ regulatory T cells specific for human papillomavirus antigens.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(29):12087-12092.
30.
Molling JW, de Gruijl TD, Glim J, et al. CD4(+)CD25hi regulatory T-cell
frequency correlates with persistence of human papillomavirus type 16 and T helper cell
responses in patients with cervical intraepithelial neoplasia. Int J Cancer.
2007;121(8):1749-1755.
31.
Grassi F, Hosmalin A, McIlroy D, Calvez V, Debre P, Autran B. Depletion in
blood CD11c-positive dendritic cells from HIV-infected patients. AIDS. 1999;13(7):759766.
32.
Chehimi J, Campbell DE, Azzoni L, et al. Persistent decreases in blood
plasmacytoid dendritic cell number and function despite effective highly active
antiretroviral therapy and increased blood myeloid dendritic cells in HIV-infected
individuals. J Immunol. 2002;168(9):4796-4801.
62
33.
Donaghy H, Pozniak A, Gazzard B, et al. Loss of blood CD11c(+) myeloid and
CD11c(-) plasmacytoid dendritic cells in patients with HIV-1 infection correlates with
HIV-1 RNA virus load. Blood. 2001;98(8):2574-2576.
34.
Sabado RL, O'Brien M, Subedi A, et al. Evidence of dysregulation of dendritic
cells in primary HIV infection. Blood. 2010;116(19):3839-3852.
35.
Dillon SM, Robertson KB, Pan SC, et al. Plasmacytoid and myeloid dendritic
cells with a partial activation phenotype accumulate in lymphoid tissue during
asymptomatic chronic HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 2008;48(1):1-12.
36.
Chen Y, Hwang SL, Chan VS, et al. Binding of HIV-1 gp120 to DC-SIGN
promotes ASK-1-dependent activation-induced apoptosis of human dendritic cells. PLoS
Pathog. 2013;9(1):e1003100.
37.
Laforge M, Campillo-Gimenez L, Monceaux V, et al. HIV/SIV infection primes
monocytes and dendritic cells for apoptosis. PLoS Pathog. 2011;7(6):e1002087.
38.
Meyers JH, Justement JS, Hallahan CW, et al. Impact of HIV on cell survival and
antiviral activity of plasmacytoid dendritic cells. PLoS One. 2007;2(5):e458.
39.
Liang F, Bond E, Sandgren KJ, et al. Dendritic cell recruitment in response to skin
antigen tests in HIV-1-infected individuals correlates with the level of T-cell infiltration.
AIDS. 2013;27(7):1071-1080.
40. Kelly H, Mandraju R, Coelho-dos-Reis JG, et al. Effects of HIV-1-induced CD1c and
CD1d modulation and endogenous lipid presentation on CD1c-restricted T-cell
activation. BMC Immunol. 2013; 14:4.
41. Bonifaz L, Bonnyay D, Mahnke K, et al. Efficient targeting of protein antigen to the
dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major
histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp
Med. 2002;196(12):1627-38.
42. Steinman RM, Nussenzweig MC. Avoiding horror autotoxicus: the importance of
dendritic cells in peripheral T cell tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(1):351-8.
43. Guimaraes AG, Silva Junior RM, Costa OT, et al. Morphometric analysis of dendritic
cells from anal mucosa of HIV-positive patients and the relation to intraepithelial lesions
and cancer seen at a tertiary health institution in Brazil. Acta Cir Bras. Dec
2011;26(6):521-529.
44. Luiza-Silva M, Campi-Azevedo AC, Batista MA, et al. Cytokine signatures of innate
and adaptive immunity in 17DD yellow fever vaccinated children and its association with
63
the level of neutralizing antibody. J Infect Dis. Sep 15 2011;204(6):873-883.
Legend for Figures
Fig. 1. Representative flow cytometric analysis of mononuclear cell subsets. For analysis
of peripheral blood mononuclear cells, the identification of total lymphocytes was
performed by a lymphocyte scatter gate set-up, using FSC versus SSC pseudo-color plot
(A). The selection of the monocyte subset was made after setting the gate on high CD14+
versus SSC pseudo-color plot (B). Peripheral Blood dendritic cell subsets were detected
using specific anti-CD11c versus anti-CD123 dual color contour plot (C). The nonoverlapping myeloid DC (mDC) and plasmacytoid DC (pDC) were identified as
CD11c+CD123- and CD11c-CD123+ cells, respectively. The overlapping DC was
characterized as CD11c+CD123Low DCs. For analysis of anal mucosa mononuclear cells,
the identification of total lymphocytes was performed using anti-CD45 versus SSC
contour plot (D). The selection of CD1a+ DC subset was done using anti-CD1a versus
SSC contour plot (E). Analysis of anal mucosal Langheran’s DC subsets was performed
using anti-CD209 contour plot (F).
Fig. 2. Phenotypic and functional features of peripheral blood and anal mucosal
mononuclear cells from AIN(-)HIV(-) ( ),AIN(-)HIV(+) ( ) and AIN(+)HIV(+) ( )
individuals. (A) Frequency of peripheral blood mononuclear cell subsets (Lymphocytes,
CD4+ T-cells, CD14+-Monocytes, CD1a+ cells, CD11c+CD123--mDC, CD11c-CD123+ pDC, and - CD11c+CD123Low DC); (B) Intracellular cytokine profile (IFN-γ and IL-10)
of circulating CD4+ T-cells and CD1a+ cells; (C) Frequency of anal mucosal mononuclear
cell subsets (CD45High lymphocytes, CD1a+-DC, and -CD209+-DC). The results are
expressed as scattering plots of individual values and median percentage of mononuclear
cells represented as a line. Significant differences (p<0.05) are highlighted by connecting
lines.
64
Fig. 3. In vitro cytokine secretion profile (IL-6, TNF, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10 and IL17A) of anal mucosa (m) and peripheral blood (pb) mononuclear cells from AIN(-)HIV(), AIN(-)HIV(+) and AIN(+)HIV(+) individuals. (A) Black-and-white diagrams
representing Low (
) and High (
) cytokine producers. Each lane represents a cytokine
and each block represents the pattern of cytokine production of each patient. The
numbers bellow each lane represent the frequency of High producers of the cytokine
tested (B) Biomarker radar graphs summarize the percentage of high cytokine producers
from each studied group. When the frequency of high producers was above the 50th
percentile (in a scale of 0-100%), the result was highlighted by underline and bold format
in both diagrams and radar graphs. ND – not determined.
Fig. 4. Histopathology, phenotypic and functional features associated with anal
intraepithelial neoplasia (AIN). (A) Histopathology analysis of anal mucosa from
AIN(+)HIV(+) patients defining low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), and
high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL). LSIL: Anal transition zone (ATZ)
with acanthosis, papillomatosis and diffuse mononuclear inflammatory infiltrate. The
highlight shows the presence of koilocytes, enlarged cells with a cytoplasmic halo
surrounding the nucleus that is indicative of active HPV replication. HSIL: Squamous
mucosa with disorders of maturation and polarity across its thickness and abnormal
basaloid cells with an increased nuclear to cytoplasmic ratio. Left panel: hematoxylin and
eosin 20×; right panel: hematoxylin and eosin 63×. (B) Phenotypic and functional
features of peripheral blood (pb) and anal mucosa (m) mononuclear cells from LSIL+ and
HSIL+ HIV(+) patients. The data are represented in bar charts as median percentage of
mononuclear cells and interquartile range. Significant differences (p<0.05) are
highlighted by connecting lines. (C) Biomarker radar graphs were plotted with the
65
percentage of high cytokine producers (scale 0-100%) in LSIL and HSIL subgroups.
Relevant changes are considered when the frequency of high producers is above the 50th
percentile, and highlighted by underline and bold format.
Fig. 5. Systemic analysis of phenotypic and functional features of peripheral blood and
anal mucosa of HIV(+) patients and controls. Biomarker networks were assembled in
four subnets (each) using the correlations among the selected biomarkers within each
clinical group (AIN(-)HIV(-) – reference biomarker network in blue shades (A); AIN()HIV(+) in orange shades and AIN(+)HIV(+) in dark mustard shades – HIV-related
biomarker network (B); LSIL and HSIL – AIN-related biomarker network in red shades
(C)). Subnets of blood (left) and anal mucosa (right) were sided with each other with
cellular (top) and cytokine (bottom) biomarkers from each of these compartments.
Significant correlations were compiled as described in material and methods. The
Spearman correlation between each pair of biomarkers is illustrated if p<0.05 and is
represented by lines. The strength of the correlation was given by “r” and is illustrated as
negative, (r<0;
), moderate (0.36>r<0.67;
) and strong (r>0.68;
Table 1 – Description of the study population
!
Groups
Sample
size
Age
range
HIV
diagnosis*
AIN(-)/HIV(-)
25
24-60
AIN(-)/HIV(+)
AIN(+)/HIV(+)
HSIL+
AIN(+)
LSIL+
32
28
20-39
15-49
18-55
15-49
8
20
NA
39 months
35 months
Patients
on
HAART
NA
60%
41%
35 months
41%
).
+
NA
40 (2 a 94 months)
43 (3 a 108 months)
CD4 T-cell
count
(cells/mm3)*
NA
353 (30 - 986)
325 (28 - 756)
43 (3 a 108 months)
325 (28 - 756)
10,911 (0 - 95,196)
Duration of HAART*
Viral Load
(copies/mL)*
Histopathological
status
NA
normal
7,961 (0 – 52,758)
10,911 (0 - 95,196)
normal
altered
HSIL
LSIL
66
A
B
CD123
SSC
D
CD11c
E
F
DC - CD1a+
DC - CD209+
SSC
SSC
CD11c+ CD123low
SSC
SSC
Peripheral blood
C
DC - CD11c+ and CD123+
CD14
Lymphocytes - CD45+
CD45
Figure'1'
Monocytes - CD14+
FSC
Anal Mucosal
Representative Analysis
Lymphocytes - FSC x SSC
CD1a
CD209
67
Phenotypic'and'Func5onal'Features'of'Peripheral'Blood'and'Anal'Mucosa'Mononuclear'cells'
0
0
0
0.0
AIN(-)
HIV(-)
HIV(-)
HIV(+)
1.5
0
0
0.0
HIV(-)
IFNCγ+'CD4+'TCcells'
HIV(-)
HIV(+)
ILC10+'CD4+'TCcells'
HIV(+)
IFNCγ+'C'CD1a+'
ILC10+'CD1a+'
20
10
15
15
0
0
0
0
HIV(+)
HIV(-)
HIV(+)
AIN(+)
AIN(-)
AIN(-)
AIN(-)
AIN(-)
HIV(-)
AIN(+)
30
AIN(-)
30
AIN(+)
20
AIN(-)
40
HIV(-)
HIV(-)
HIV(+)
AIN(+)
HIV(+)
AIN(-)
AIN(-)
HIV(-)
AIN(+)
10
AIN(-)
10
AIN(+)
3.0
AIN(-)
20
AIN(-)
%'of'posi5ve''cells'
20
AIN(+)
CD11c+CD123Low'
AIN(-)
pDC'–'CD123+CD11cC'
HIV(+)
AIN(-)
HIV(+)
AIN(-)
HIV(-)
mDC'–'CD123CCD11c+'
%'of'posi5ve''cells'
AIN(+)
AIN(-)
AIN(+)
AIN(-)
AIN(-)
HIV(+)
AIN(+)
2.5
AIN(+)
25
AIN(-)
30
AIN(-)
50
B'
Peripheral'Blood'
CD1a+'Cells'
5.0
HIV(-)
%'of'posi5ve''cells'
Peripheral'Blood'
A'
Monocytes'–'CD14+'
50
AIN(-)
CD4+'TCcells'
60
AIN(-)
Lymphocytes'
100
HIV(+)
C'
0
0
HIV(-)
AIN(+)
AIN(-)
HIV(+)
HIV(+)
HIV(-)
AIN(+)
0
AIN(-)
8
AIN(-)
10
AIN(-)
25
AIN(+)
16
AIN(-)
DC'–'CD209+'
20
HIV(-)
Figure'2'
DC'–'CD1a+'
50
AIN(-)
%'of'posi5ve''cells'
Anal'Mucosa'
LYM'–'CD45High'
HIV(+)
68
Cytokine'Profiles'Secreted'by'Mononuclear'Cells'
pbIL>6'
pbTNF>α'
pbIL>2'
pbIFN>γ'
pbIL>4'
pbIL>10'
pbIL>17A'
mIL>6'
mTNF>α'
mIL>2'
mIFN>γ'
mIL>4'
mIL>10'
mIL>17A'
HIV(+)AIN(+)'
mIL>6'
mTNF>α'
mIL>2'
mIFN>γ'
mIL>4'
mIL>10'
mIL>17A'
HIV(+)AIN(>)'
pbIL>6'
pbTNF>α'
pbIL>2'
pbIFN>γ'
pbIL>4'
pbIL>10'
pbIL>17A'
mIL>6'
mTNF>α'
mIL>2'
mIFN>γ'
mIL>4'
mIL>10'
mIL>17A'
Subjects'
HIV(>)AIN(>)'
pbIL>6'
pbTNF>α'
pbIL>2'
pbIFN>γ'
pbIL>4'
pbIL>10'
pbIL>17A'
A'
ND
ND
ND
62' 52' 14' 57' 5' 62' 48'
35' 35' 57' 39' 13' 43' 43'
%' 28' 28' 40' 48' 40' 16' 48'
54' 86' 46' 50' 64' 61' 54'
63' 34' 59' 50' 44' 66' 44'
52' 58' 61' 52' 20' 45' 52'
pbIL%6'
mIL>6'
pbTNF%α"
mTNF>α"
pbIL>2'
mIL>2'
B'
%'of'High'Cytokine'Producers'
Scale&
100"
mIFN>γ"
pbIFN%γ"
mIL>4'
50"
pbIL>4'
pbIL%10'
mIL>10'
0"
pbIL>17A"
mIL>17A"
HIV(>)AIN(>)'
pbIL%6'
mIL%6'
pbIL%2'
mIL%2'
mIFN>γ"
pbIFN%γ"
mIL>4'
pbIL>4'
pbIL>10'
mIL%10'
pbIL%17A"
mIL>17A"
Figure'3'
HIV(+)AIN(>)'
pbIL>6'
mIL%6'
pbTNF%α"
mTNF>α"
pbTNF>α"
mTNF%α"
pbIL%2'
mIL>2'
mIFN>γ"
pbIFN>γ"
mIL%4'
pbIL>4'
pbIL>10'
mIL%10'
pbIL>17A"
mIL%17A"
HIV(+)AIN(+)'
69
A'
Anal'Intraepithelial'Neoplasia'(AIN)'Histophatology''
HSIL'
LSIL'
B'
Phenotypic'and'FuncBonal'Features'of'Mononuclear'Cells'
%'of'posiBve''cells'
CD4+'TIcells'
IFNIγ+'CD4+'TIcells'
ILI10+'CD4+'TIcells'
30
30
6
50
15
15
3
LYM'–'CD45High'
0
CD11c+CD123Low'
0
0
CD1a+'Cells'
IFNIγ+'CD1a+'Cells'
ILI10+'CD1a+'Cells'
4
10
4
2
5
2
2
%'of'posiBve''cells'
0
Anal'Mucosa'
30
15
HSIL
LSIL
0
1
HIV(+) AIN(+)
HIV(+) AIN(+)
HIV(+) AIN(+)
HSIL
LSIL
HSIL
0
LSIL
HSIL
LSIL
HIV(+) AIN(+)
0
HSIL
0
0
LSIL
%'of'posiBve''cells'
Peripheral'Blood'
Lymphocytes'
100
HIV(+) AIN(+)
Cytokine'Profile'of'Mononuclear'Cells'
C'
pbIL-6
mIL-6
pbIL-6
mIL-6
pbTNF-α#
mTNF-α#
pbTNF-α#
mTNF-α#
%'of'High'Cytokine'Producers'
Scale&
100#
50#
pbIL-2
mIL-2
mIFN-γ#
pbIFN-γ#
mIL-4
pbIL-4
pbIL-2
mIL-2
mIFN-γ#
pbIFN-γ#
mIL-4
pbIL-4
0#
pbIL-10
mIL-10
pbIL-17A#
mIL-17A#
Figure'4'
LSIL
pbIL-10
mIL-10
pbIL-17A#
mIL-17A#
HSIL
70
MON
LYM
Reference''Biomarkers'Network'
pDC
CD11c+
CD1a+
CD4+
CD123low
CD45+
Peripheral'Blood'
CD209+
mDC
CD4+
IL-10+
CD4+
IFN-γ+
pbIL-2
mIL-2
pbIL-4"
pbIFN-γ"
pbIL-10"
pbIL-6"
pbIL-17A"
Anal'Mucosa'
A'
pTNF-α"
mIFN-γ"
mIL-4"
mIL-10"
mIL-6"
mIL-17A" mTNF-α"
HIV(6)AIN(6)'
MON
B'
HIV6related'Biomarkers'Network'
pDC
MON
LYM
CD11c+
CD123low
CD1a+
CD4+
CD209+
mDC
pDC
CD4+
IL-10+
CD4+
IFN-γ+
CD209+
CD4+
IFN-γ+
mIL-10"
pbTNF-α"
mIL-2
pbIL-2
mIFN-γ"
mIL-4"
pbIL-4"
pbIFN-γ"
pbIL-10"
pbIL-6"
mIL-4"
mIFN-γ"
mIL-10"
mIL-6"
mIL-6"
mIL-17A"
mTNF-α"
mIL-17A" mTNF-α"
pbIL-17A" pbTNF-α"
HIV(+)AIN(6)'
MON
LYM
pDC
CD11c+
CD123low
CD123low
CD209+
CD4+
IFN-γ+
Figure'5'
CD45+
pbIL-2
mIL-2
mIL-4"
pbIFN-γ"
pbIL-6"
CD209+
CD45+
CD4+
IL-10+
pbIL-2
pbIL-10"
CD4+
IFN-γ+
mDC
CD4+
IL-10+
pbIL-4"
CD1a+
CD4+
CD11c+
CD4+
mDC
LYM
pDC
CD1a+
mIL-10"
"
pbIL-17A" pbTNF-α
.
HIV(+)AIN(+)'
MON
HIV/AIN6related'Biomarkers'Network'
C'
CD45+
IL-10+
mIL-2
pbIL-6"
pbIL-17A"
CD1a+
CD4+
CD4+
pbIFN-γ"
pbIL-10"
CD11c+
CD123low
mDC
pbIL-2
pbIL-4"
CD45+
LYM
mIFN-γ"
mIL-6"
mIL-17A" mTNF-α"
LSIL'
pbIL-4"
pbIL-10"
mIL-2
pbIFN-γ"
pbIL-6"
pbIL-17A" pbTNF-α"
mIL-4"
mIL-10"
mIL-17A"
HSIL'
mIFN-γ"
mIL-6"
mTNF-α"
71
4.2 Artigo 2. Coinfection of Epstein-barr Virus, Cytomegalovirus,
Herpes Simplex Virus, Human Papillomavirus and Anal
Intraepithelial Neoplasia in HIV Patients in Amazon, Brazil.
Original Article
Rev bras Coloproct Coinfection of Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, herpes simplex virus, human
Vol. 32 January/March, 2012 papillomavirus and anal intraepithelial neoplasia in HIV patients in Amazon,
Brazil No 1; p:18-25.
Coinfection of Epstein-barr Virus, Cytomegalovirus, Herpes
Simplex Virus, Human Papillomavirus and Anal Intraepithelial
Neoplasia in HIV Patients in Amazon, Brazil.
Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro Guimarães1, José Ribamar de Araujo2, Rosilene Viana de
Andrade3, Carolina Marinho da Costa4, Renata da Silva Galvão4, Aline Lury Hada5, Luiz Carlos de
Lima Ferreira6
1PhD; Adjunct Professor at the Universidade Federal do Amazonas, Department of Surgery –
Manaus (AM), Brazil. 2MsC; Laboratory Manager of the Pathological Anatomy of Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado – Manaus (AM), Brazil. 3MsC; Pathologist of the
Pathological Anatomy Laboratory of Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado –
Manaus (AM), Brazil. 4Postgraduate students of Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado – Manaus (AM), Brazil. 5Graduate Medical Student at Universidade do Amazonas –
Manaus (AM), Brazil. 6PhD; Associate professor at Universidade Federal do Amazonas and the
Laboratory of Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado – Manaus (AM), Brazil.
Guimarães AGDP, Araujo JR, Andrade RV, Costa CM, Galvão RS, Hada AL, Ferreira LCL. Coinfection of
Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, herpes simplex virus, human papillomavirus and anal intraepithelial
neoplasia in HIV patients in Amazon, Brazil. J Coloproct, 2012;32(1): 18-25.
ABSTRACT: Objective: The prevention of anal cancer is a goal of worldwide Aids support centers. Despite
the efforts that have been made and progress in the antiretroviral therapy, effective disease control remains
elusive. Difficulty in preventing anal cancer may result from the ineffectiveness of highly active antiretroviral
therapy on the human papillomavirus (HPV) since the coinfection with HIV and HPV appears to increase the
risk of HPV-infected cells, becoming cancerous. Methods: We evaluated 69 HIV-positive and 30 HIV-negative male patients who underwent cytological evaluation by RT-PCR for the presence of HPV, Epstein-Barr
virus, cytomegalovirus and herpes virus types (HSV) 1 and 2, and histopathology analysis of the anal canal.
results: The prevalence of anal intraepithelial neoplasia was 35% and it was restricted to HIV-positive
patients. Patients infected with high-risk HPV and with fewer than 50 TCD4 cells/µL showed an anal
intraepithelial neoplasia rate of 85.7% compared to those with TCD4 cells >200 cells/µL (p<0.01). The rate
of viral coinfection was 16.9% of the sexual transmitted diseases cases and it was correlated with HIV-1 viral
load of more than 10.001 copies/mL (p=0.017). The rate of AIN in coinfected patients was 36.4% (p=0.047).
Conclusions: In this study, at the main institution for the treatment of HIV/ AIDS in the Amazon region of
Brazil, anal coinfection with HPV, cytomegalovirus, HSV-1, HSV-2 and Epstein-Barr virus occurred only in
HIV-positive patients and it was directly influenced by the viral load of HIV-1. In this study, anal viral
coinfection showed no additional risk for the development of anal intraepithelial neoplasia.
Keywords: sexually transmitted disease; anal coinfection; human papillomavirus; Epstein-Barr virus;
cytomegalovirus; herpes simplex virus; anal intraepithelial neoplasia; anal cancer.
RESUMO: Objetivo: A prevenção do câncer anal tem sido aplicada pelos centros de apoio a pacientes com
Aids em todo o mundo. Apesar dos esforços empregados, o eficaz controle da doença permanece distante.
A dificuldade na prevenção do câncer anal pode resultar, em parte, da ineficácia da ação da terapia
antirretroviral sobre o papilomavírus humano (HPV), pois a coinfecção com HIV e HPV parece aumentar o
risco das células infectadas pelo HPV em tornarem-se cancerosas. Métodos: Foram avaliados 69 HIVpositivos e 30 pacientes HIV-negativos do sexo masculino, que foram submetidos à avaliação citológica
anal por real time-PCR para a presença de HPV, vírus Epstein-Barr, citomegalovírus e herpes vírus tipos
(HSV) 1 e 2 além da análise histopatológica de fragmento de mucosa do canal anal. resultados: A
prevalência de neoplasia intraepitelial anal foi de 35% e foi restrita a pacientes HIV-positivos. Os pacientes
infectados com o HPV de alto risco e com contagem inferior a 50 células TCD4/µL mostraram taxa de
neoplasia intraepitelial anal de 85,7%. A diferença foi significativa quando comparado a pacientes com
células TCD4 >200 células/µL (p<0,01). A taxa de coinfecção viral foi de 16,9% dos casos de doenças
sexualmente transmissíveis e diretamente correlacionada à carga viral HIV-1 superior a 10,001 cópias/mL
(p=0,017). A taxa de neoplasia intraepitelial anal em pacientes coinfectados foi de 36,4% (p=0,047).
Conclusões: Neste estudo, realizado na principal instituição para o tratamento de HIV/Aids na região
amazônica do Brasil, a coinfecção anal com HPV, citomegalovírus, HSV-1, HSV-2 e vírus Epstein-Barr
ocorreu somente em pacientes HIV-positivos e foi influenciada pela carga viral do HIV-1. Neste estudo, a
72
coinfecção viral anal não representou risco adicional ao desenvolvimento da neoplasia intraepitelial anal.
Palavras-chave: doenças sexualmente transmissíveis; coinfecção anal; papilomavírus humano; EpsteinBarr vírus; citomegalovírus; herpes simples vírus; neoplasia intraepitelial anal; câncer anal.
Introduction
The human papillomavirus (HPV) is the most prevalent sexually
transmitted disease (STD) of the perianal region1,2, and it is associated with a
broad spectrum of benign and malignant lesions3. In HIV-positive men, who have
sexual relations with men, there is frequent association between multiple HPV
types3, increasing the risk of anal intraepithelial neoplasia (AIN) and anal cancer
by at least 60.1 times4.
Among immunosuppressed patients, cytomegalovirus (CMV) has been
established as a cause of ano-rectal disorders5, ulcers, vesicles and perianal
warts, which are often associated with herpes simplex virus6. Coinfection by
multiple pathogens is not uncommon among immunocompromised patients.
Davis and Goldstone7 described 86% of STD in patients with proctitis, and three
cases of multiple infections. The association between viral and bacterial
coinfections has also been described8.
The presence of coinfections appears to increase the risk of HPV-infected
cells progressing to malignancy. These pathogens act synergistically to induce
anogenital epithelial lesions, particularly in HIV-posi- tive patients9. The EpsteinBarr virus (EBV) infection has also been studied in genital warts and perianal intraepithelial lesions for which the role of synergism in the etiology of cancer has
also suggested10,11.
Developing a more detailed understanding of the relationship between
viral coinfections and the devel- opment of anal cancer, particularly in HIVpositive patients, is of critical importance. This study aims to assess the
prevalence of viral coinfection with AIN in the main institution for the treatment of
HIV/AIDS in the Amazon region of Brazil.
Methods
Ninety-nine male patients were evaluated from July, 2010 to June, 2011.
Sixty-nine patients were HIV-positive and 30 were HIV-negative, who had no
known risk factors for anal cancer. This study received authorization from the
73
Research Ethics Committee. Volunteer patients, who met the eligibility criteria,
were submitted to the collection of cytological material for the detection of EBV,
HPV, CMV, HSV-1 and HSV-2 as well as anal in- spection, digital rectal
examination, anoscopy mag- nification imaging, and biopsies of the suspected
ar- eas. If there were no injuries or clinical suspicion, a biopsy was performed at
the three o’clock position along the dentate line.
Hybrid capture was used to detect the main types of HPV with either low
or high oncogenic potential12. The samples were processed according to the
manufacturer’s recommended protocols. Levels of HPV 16 ≥1 pg/mL relative
lights unit (RLU) were designated as positive.
Molecular diagnoses of HSV-1, HSV-2, CMV and EBV were performed by
real-time PCR (RT-PCR) using the 7500 Fast Real-Time PCR System, manufactured by Applied Biosystems. The samples were ex- tracted with a QIAamp DNA
Mini Kit according to the manufacturer’s instructions. H1P32/H1M32, H2M40/
H2P4, HSV-GF/CMV-R and HSV-GF/EBV-R prim- ers were purchased from
Invitrogen Life Technologies with Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix
(2X). The cycling conditions were 50°C for two minutes, 95°C for ten minutes, 40
cycles at 95°C for 30 seconds and 60°C for one minute13.
In this study, to calculate rates of coinfection ano- rectal, isolated HPV-HIV
infection was not considered.
RESULTS
Overview
In this study, the mean age of HIV-positive patients was 34.3 years-old;
the mean age in the Control Group (HIV-negative) was 47.4 years-old (p<0.001).
The average duration of HIV infection was 44 months, and the average under
treatment with highly active antiretroviral therapy (HAART) was 34 months. The
prevalence of AIN in HIV-positive patients was 35%, and AIN was absent in the
Control Group (p<0.001) as determined by histopathological analysis. 45.8%
(n=11/24) of patients presented with low-grade AIN (AIN I), and 54.2% of the
patients presented with high-grade AIN (AIN II/III), with p<0.001, (data are not
shown).
74
The impact of STDs
Patients were evaluated for the presence of a STD, either alone (n=65) or
in the form of coinfec- tion (n=11). Twenty-three patients, all HIV-negative, did
not show any STD. The rates of STD infections were as follows: low-risk HPV,
73.8% (n=48); high- risk HPV, 90.8% (n=59); HSV-1, 7.7% (n=5); HSV-2, 16.9%
(n=11); EBV, 7.7% (n=5); CMV, 1.5% (n=1) –data not shown. Of the patients with
at least one type of STD, 57 out of 65 were HIV-positive (p<0.01). The term ‘HPV
total’ was defined as an infection with either high or low oncogenic potential HPV,
which oc- curred in 60.6% (n=60) considering all patients and in 81.2% (n=56) of
HIV-positive patients (RR=26.6; p<0.001). Similar results were found in the
analysis of HPV oncogenic risk (OR=29.5 and 26.2 for the occurrence of HPV
infection, high and low risk in HIV-positive patients, respectively, n=97; p<0.001,
Fisher’s exact test) – data not shown.
The prevalence of AIN in HPV infected patients Patients were evaluated to
assess the influence of HPV infection on the occurrence of AIN. It was found that
86.4% (19/22) of patients diagnosed with AIN were infected with low-risk HPV
(OR=9.81; p<0.001), and 95.8% were infected with high-risk HPV (OR=23.7;
p<0.001), as in Table 1. Patients without HPV infection were not present with AIN
(n=39), as seen in Table 2; all patients with severe AIN (n=13) were infected with
high-risk HPV, and the rate of association between high- and low-risk HPV was
83.3% (p<0.001 for all analyses in Table 1). To assess the potential for a single
infection with low-risk HPV to cause AIN, 39 patients with AIN, who were found to
be negative for high-risk HPV, were analyzed; and only one of these patients was
positive for low-risk HPV and was infected with low-grade squamous intraepithelial lesion – LSIL (data not shown).
Patients with severe AIN (n=13) began the study presenting a median duration of
HIV-1 infection of 54 months (with a range of 3 to 144 months); 76.9% of the
patients (n=10) were using HAART and showed a significant increase in the
average duration of HAART use compared to patients with normal histology or
inflam- matory or mild AIN (p=0.041), as seen in Table 2.
75
The influence of HIV-1 viral load and TCD4 cell concentration
Patients infected with HPV had a significantly higher viral load of HIV-1
than those not infected (41,540 and 17,693 copies/µL, respectively; p=0.03) (data
not shown). We also evaluated the potential of CD4 + T cells of causing AIN in
patients infected with HPV-H. In this analysis, patients infected with high-risk
HPV with TCD4 cell concentrations of <50 cells/µL presented AIN at a rate of
85.7% (n=6), as follows: four cases of AIN III and two of AIN I. Of the patients
with high-risk HPV infection and levels of TCD4 cells >250 cells/µL, 70.3% did
not present AIN (n=22; p<0.01), as seen in Table 3.
Viral coinfection
We evaluated the occurrence of anal viral coinfec- tion, which was
detected in 11 of 65 patients (16.9%) with a STD. Of the 11 coinfected patients, 6
(55%) presented a coinfection of high-risk HPV with HSV-2; 3 (27%) were
coinfected with both low- and high-risk HPV and EBV; 1 (9%) patient presented
with a triple coinfection of low- and high-risk HPV, HSV-2 and EBV; and the last
case was coinfected with all pathogens tested (Figure 4). 100% (n=11) of anal
coinfections occurred in HIV-positive patients (p=0.01) and 60% in man who has
sex with man (MSM).
The average TCD4 cell concentration in coin- fected patients was 141
cells/µL and 35,500 copies/ µL of HIV-1 viral load. There were significant differences found when comparing patients to a viral load of either less than or greater
than 10,000 copies/µL (p=0.01) (data no shown). In patients with viral load lower
than 10,000 copies/µL, there were only simple coinfections; in the group with
higher viral loads, there were eight patients with coinfections: six are cases of
simple coinfection, one case of triple coinfection, and another patient infected
with all four types of investi- gated STDs. There was no difference in the duration
of HAART use in HIV coinfected patients (p=1.0 and p=0.81, respectively) (data
not shown).
AIN and coinfection
Among the 11 coinfected patients, there were four cases of AIN (36.4%),
one of AIN III and three of AIN I. Therefore, no correlation was found between the
incidence of AIN and viral anal coinfection (Table 5). Among coinfected patients,
there were also three condyloma cases and four nonspecific inflammatory
changes in these patients (Table 4).
76
DISCUSSION
In this study, we addressed viral coinfection in HIV-positive patients and its
relationship with AIN and HAART patient and immune status. We began the
analysis with an evaluation of the influence of HIV on HPV infection rates. A 26.6fold greater risk of infection by high and/or low oncogenic HPV types in HIVpositive patients was observed. These findings cor- roborate those of previous
studies14-16. Sobhani et al.17 and Kreuter et al.18 highlighted the greater
multiplicity of high- and low-risk HPV in anal margin carcinomas compared to
carcinomas of the anal canal, which are mostly associated with HPV 16.
An increased risk of severe high-grade squamous intraepithelial (HSIL)
has been described in patients infected with oncogenic HPV, particularly HPVs
16 and 18, when associated with low TCD4 cell concentrations before HAART
initiation (OR=14.18)19. These data are similar to those found in the present study
in patients infected with high-risk HPV and a current TCD4 cell count of <50
cells/µL. The risk of AIN in patients with low TCD4 cell counts has also been
previously reported20,21.
A recent study described the possible protective effect of HAART on the
development of severe AIN when HAART was administered for more than four
years, and the analysis was adjusted for TCD4 nadir cells19. According to CrumCianflone22, the beneficial effect of HAART may be less pronounced for
individuals with moderate or severe AIN as a result of the already severe degree
of HIV-related immune depletion. In those cases, either the immune restoration
promoted by HAART was insufficient to restore specific immunity to HPV-infected
cells or, in cases with a more severe degree of AIN, patients may have
accumulated sufficient genetic alterations to lead the failure of HAART22. Other
authors argue that the duration of HIV infection is of primary importance, since
patients infected with more than 15 years had 12 times greater chance of
developing anal cancer (p<0.001)23. The average time of HIV infection in this
study was much higher than that of our patients with HSIL.
Regarding the anal coinfection, we did not detect coinfection in HIVnegative subjects, probably as a result of the strict selection criteria employed for
the Control Group that did not involve MSM. Anal coinfection occurred in 40% of
patients who had not declared themselves adherents of receptive anal sex,
highlighting the potential for the acquisition of STDs regardless of the sexual
77
practice, as previously noted24,25, and emphasizing the importance of prevention
programs that encompass heterosexual patients.
Our rate of anal STDs are similar to the findings of Sobhani et al.26, who
described an 8% rate of EBV coinfection, a 12% rate of CMV anal infection and a
24% rate of HSV anal infection. However, this study found lower prevalence of
EBV (7.7%) and CMV (1.5%) infection compared to the findings of Löwhagen et
al.27 and Rodrigues et al.9, who reported a prev- alence of HSV and EBV of over
30%. Because we used RT-PCR as a means of diagnosis, and the method is
known to be higher than conventional PCR and the culturing of samples28;
therefore, we do not consider our results to be contradictory with previous
findings, but as features of our study population.
The presence of HSV-EBV coinfection as a risk factor for the development
of anal cancer among pa- tients of both sexes coinfected with HPV-HIV has already been described9-11. In the present study, we report five cases of coinfection
with EBV. Three cases had severe AIN, and one patient was coinfected with all
the viruses studied and presented very low levels of peripheral TCD4 cells. In a
study conducted in Rio de Janeiro, Brazil9, HPV-EBV coinfection occurred in 21%
of HIV-positive patients and in 7% of HIV-negative patients (p=0.017). These
data are similar to those from a study conducted in Skovde, Sweden27, which
found HSV rates similar to ours but with significantly higher percentages of EBV.
Regardless of geographical area, a considerably high rate of anal coinfection in
immunocom- promised patients has been found, highlighting the importance of
STD surveillance and the monitoring of clinical progression in terms of AIN
occurrence and anal cancer. In Botswana, Africa, an increase has been seen in
ocular surface squamous neoplasia pathology with significant rates of coinfection
with HPV, HSV, CMV and EBV, particularly in HIV-pos- itive patients, but in
percentages much higher than those reported here29.
Despite the limited number of coinfected evaluated individuals and the
limitations inher- ent in cross-sectional studies, these results show that patients
with anal viral coinfection by HPV, HSV-1, HSV-2, EBV or CMV showed no
addition- al risk for the development of AIN and that coin- fection seems to be
directly related to high HIV-1 viral load. New follow-up studies are needed to
confirm the findings revealed in this study regarding the incidence of AIN and
anal cancer in coinfected individuals.
78
CONCLUSIONS
This study was conducted in the main Institution for the treatment of
HIV/AIDS in the Amazon region of Brazil. The rate of AIN was associated with
severe infection with high and low risk HPV, low levels of TCD4 cells, and a high
HIV-1 viral load. Anal coinfection by HPV, CMV, HSV and EBV occurred only in
HIV-positive patients, it was directly influenced by the HIV-1 viral load. In this
study, viral anal coinfection showed no additional risk for the development of AIN.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors are grateful to the medical students Bruno Queiroz and
Isabelle Gracinda Aguiar; statis- ticians Erico Jander da Silva Lopes and Edson
Lira; pharmacists Andreza Fernandes and Cristiana Lima Laranjeira; pathology
laboratory technicians San- dra Eline, Sandra Caranhas and Carlos Melquiade
Marques; nursing technician Elizabeth Monteiro and all of the hospital support
staff for their expert technical assistance.
REFERENCES
1. Koutsky L, Galloway D, Holmes K. Epidemiology of genital human
papillomavirus infection. Epidemiol Rev 1988;10:122-63.
2. Nadal SR, Manzione CR. Rastreamento e Seguimento dos Portadores das
Lesões Anais Induzidas pelo Papilomavírus Humano como Prevenção do
Carcinoma Anal. Rev Bras Coloproctol. 2009;2(29):250-3.
3. Kreuter A, Brockmeyer NH, Weissenborn SJ, Gambichler T, Stucker M,
Altmeyer P, et al. Penile Intraepithelial Neoplasia Is Frequent in HIV-Positive Men
with Anal Dysplasia. J Invest Dermatol. 2008;128:2316-24.
4. Kreuter A, Brockmeyer NH, Hochdorfer B, Weissenborn SJ, Stücker M,
Swoboda J, et al. Clinical spectrum and virologic characteristics of anal
intraepithelial neoplasia in HIV infection. J Am Acad Dermatol. 2005;4(52):603-8.
5. Lee PK, Wilkins KB. Condyloma and other infections including human
immunodeficieny virus. Surg Clin North Am. 2010;90(1):99-112.
6. Dauden E, Fernández-Buezo G, Fraga J, Cardenoso L, García-Díez A.
Mucocutaneous Presence of Cytomegalovirus Associated With Human
Immunodeficiency Virus Infection Discussion. Arch Dermatol. 2001;137:443-8.
7. Davis TW, Goldstone SE. Sexually transmitted infections as a cause of
proctitis in men who have sex with men. Dis Colon Rectum. 2009;52(3):507-12.
8. Snoek VDEM, Niesters HG, Mulder PG, Doornum VGJ, Osterhaus AD,
Meijden VDWI. Human papillomavirus infection in men who have sex with men
participating in a Dutch gay-cohort study. Sex Transm Dis. 2003;30(8):639-44.
9. Rodrigues FR, Miranda NL, Fonseca EC, Pires ARC, Dias EP. Investigação da
LMP1 do EBV e a coinfecção do HPV em lesões genitais de pacientes
infectados ou não pelo HIV. J Bras Patol Med Lab. 2010;46(50):415-20.
79
10. Santos NBM, Villanova FE, Andrade PM, Ribalta J, Focchi J, Otsuda AY, et
al. Epstein-Barr virus detection in invasive and pre-invasive lesions of the uterine
cervix. Oncol Reports. 2009;21:403-5.
11. Sobhani I, Walker F, Rodout-Thoraval F, Abramowitz L, Johanet H, Hérnin D,
et al. Anal carcinoma: incidence and effect of cumulative infecctions. AIDS.
2004;18:1561-9.
12. Roka F, Roka J, Trost A, Schalk H, Zagler C, Kimbauer R, et al. Anal human
Papillomavirus testing with Digene’s hybrid capture 2 using two different
sampling methods. Dis Colon Rectum. 2008;(51):61-6.
13. Aldea C, Alvarez CP, Folgueira L, Delgado R, Otero JR. Rapid detection of
herpes simplex virus DNA in genital ulcers by Real-time PCR using SYBR Green
I Dye as the detection signal. J Clin Microbiol. 2002;60:1060-2.
14. Palefsky JM, Elizabeth AH, Jimmy TE, Maria C, Naomi J, Teresa MD. Anal
intraepithelial neoplasia in the highly active therapy era among HIV-positive men
who have sex with men. AIDS. 2005;13(19):1407-14.
15. Wong AK, Chan RC, Aggarwal N, Singh MK, Nichols WA, Bose S. Human
Papillomavirus genotypes in anal intraephitelial neoplasia and anal carcinoma as
detected in tissue biopsies. Modern Pathol. 2010;23:144-50.
16. Abramowitz L, Benabderrahmane D, Ravaud P, Walker F, Rioux C, Jestin C,
et al. Anal squamous intraepithelial lesions and condyloma in HIV-infected
heterosexual men, homosexual men and women:prevalence and associated
factors. AIDS. 2007;21:1457-65.
17. Sobahi I, Vuagnat A, Walker F, Vissuzaine C, Mirin B, Hervatin F, et al.
Prevalence of high-grade dysplasia and cancer in the anal canal in human
papillomavirus-infected individuals. Gastroenterology. 2001;120(4):857-66.
18. Kreuter A, Potthoff A, Brockmeyer NH, Gambichler T, Swoboda J, Stücker M,
et al. Anal carcinoma in human immunodeficiency virus-positive men: results of a
prospective study from Germany. Brit J Dermatol. 2010;162:1269-77.
19. Pokomandy A, Rouleau D, Ghattas G, Trottier H, Vezina S, Cote P, et al.
HAART and progression to high-grade anal intraepithelial neoplasia in men who
have sex with men and are infected with HIV. Clin Infect Dis. 2011;52(9):117481.
20. Scott H, Khoury J, Moore BA, Weissman S. Routine anal cytology screening
for anal squamous intraepithelial lesions in a urban HIV clinic. Sexually Trans
Dis. 2008;35(2):197-2002.
21. Palefsky JM, Holly EA. Immunosupression and co-infection with HIV. J Nat
Cancer Inst Monogr. 2003;31:41-6.
22. Bratcher J, Palefsky J. Anogenital human Papillomavirus coinfection and
associated neoplasia in HIV-positive men and women 2008. [Internet] [cited 2011
Sept
25].
Available
in
http://www.prn.org/index.php/coinfections/article/anogenital_hpv_neoplasia_hiv_
positive502/.
23. Crum-Cianflone NF, Hullsiekc KH, Marconia VC, Ganesana A, Weintroba A,
Barthela RV, et al. Agana anal cancer among HIV-infected persons: HAART is
not slowing rising incidence. AIDS. 2010;24:535-43.
24. Piketty C, Darragh TM, Costa M. High prevalence of anal human
Pappilomavirus infection and anal cancer precursors among HIV-infected
persons in the absence of anal intercourse. Ann Intern Med. 2003;6(138):253-9.
80
25. Wilkin TJ, Palmer J, Brudney JK, Chiasson MA, Wright TC. Anal
intraepithelial neoplasia in heterosexual and homosexual HIV-positive men with
acess to antiretroviral therapy. JID. 2004;(190):1685-91.
26. Sobhani I, Walzer F, Aparicio T, Abramowitz L, Henin D, Cremieux AC, et al.
Effect of anal epidermoid cancer-related viruses on the dendritic (Langerhans’)
cells of the human anal mucosa. Clin Cancer Res. 2002;(8):2862-9.
27. Löwhagen GB, Bergbrant IM, Bergström T, Ryd W, Voog E. PCR detection of
Epstein-Barr virus, herpes simplex virus and humn Papillomavirus from the anal
mucosa in HIV-seropositive and HIV-seronegative homosexual men. Int J STD
AIDS. 1999;9(10):615-8.
28. Wald A, Huang ML, Carrell D, Selke S, Corey L. Polymerase chain reaction
for detection of herpes simplex virus (HSV) DNA on mucosal surfaces:
comparison with HSV isolation in cell culture. J infect Dis. 2003;9(188):1345-51.
29. Simbiri OK, Murakami M, Feldman M, Steenhoff AP, Nkomazana O, Bisson
G, Robertson GE. Multiple oncogenic viruses identified in ocular surface
squamous neoplasia in HIV-1 patients. Infectious agents and cancer 2010.
[Internet]
[cited
2010
Sept
25].
Available
in
http://www.infectagentscancer.com/content/5/1/6.
Correspondence to:
Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro Guimarães Avenida Jacira Reis, 549/603 CEP: 69040-270 – Manaus (AM),
Brazil E-mail: [email protected]
Table 1. The association of AIN with oncogenic HPV.
HPV types
No AIN
AIN present
Total
n
%
n
%
n
No
46
61.3
3
13.6
49
Yes
29
38.7
19
86.4
48
Total
75
100
22
100
97
No
38
51.4
1
4.2
39
Yes
36
48.6
23
95.8
59
Total
74
100
24
100
98
No
39
52.0
0
0.0
39
Yes
36
48.0
24
100.0
60
RR
p-value
9.81
<0.001
23.7
<0.001
Low HPV
High HPV
Total HPV
<0.001
81
Total
75
100
24
100
99
HPV
association
No
46
61.3
6
25.0
52
Yes
29
38.7
18
75.0
47
Total
75
100.0
24
100.0
99
4.68
0.001
HPV: human papillomavirus; Total HPV: low-risk HPV or high-risk HPV infection; HPV
association: infection by both low- and high-risk HPVs; data were analyzed using
Fisher's exact test.
82
Table 2. The relationship between AIN severity and the duration of HAART use.
Histopathology
Duration of HAART use
p-value
No AIN
AIN III
(+) AIN I
Average
2.23
5.34
Standard deviation
2.59
6.3
0.041
Median
0.82
2.84
n
27
10
AIN: anal intraepithelial neoplasia; HAART: highly active antiretroviral therapy; data were
analyzed with Mann-Whitney test.
83
Table 3. The occurrence of AIN in relation to the peripheral levels of T CD4 cells in HIVpositive individuals infected with high-risk HPV.
AIN
T CD4
(cells/µL)
No AIN
p-value
<50
1
2
4
7
>250
22
5
4
31
Total
23
7
8
38
AIN I
AIN III
Total
<0.01
AIN: anal intraepithelial neoplasm; HPV: human papillomavirus; data were analyzed
using Fisher's exact test.
Anal viral co-­‐infec3on 9% 27% HPV-­‐H+HSV-­‐2 9% 55% HPV-­‐H+HPV-­‐L+EBV HPV-­‐H+HPV-­‐L+HSV-­‐2+EBV HPV-­‐H+HPV-­‐L
+HSV-­‐1+HSV-­‐2+EBV+CMV Figure 1. Rates of anal viral coinfection
HPV: Human papillomavirus; HSV: Herpes simplex virus; EBV: Epstein-Barr virus; CMV:
cytomegalovirus.
84
Table 4. Histopathological studies of coinfected patients.
Histopathology
Coinfection
0 coinfect
1 coinfect
2 coinfect
4 coinfect
Total
Histo
n
%
n
%
n
%
n
%
Normal
20
23.8
0
0.0
0
0.0
0
0.0
20
Proctitis
34
40.5
4
44.4
0
0.0
0
0.0
38
AIN I
7
8.3
2
22.2
1
100.0
0
0.0
10
AIN III
12
14.3
0
0.0
0
0.0
1
100.0
13
No neo.
9
10.7
3
33.3
0
0.0
0
0.0
12
Metaplasia
2
2.4
0
0.0
0
0.0
0
0.0
2
Total
84
100
9
100
1
100
1
100
95
AIN I: low-grade anal intraepithelial neoplasia; AIN III: anal intraepithelial
neoplasia of moderate or high degree; no neo: other non-neoplastic-specific
processes such as condyloma, herpes or tuberculosis; coinfect: coinfection; 0
coinfection: no coinfection; 1 coinfection: one coinfection occurred; 2
coinfection: two coinfections occurred; 4 coinfection: four coinfections occurred.
85
5 CONCLUSÕES
Os estudos realizados na principal Instituição para o tratamento de
HIV/aids na região amazônica do Brasil, permitiram as seguintes
conclusões:
- A ocorrência de coinfecção anal entre os vírus: HPV, citomegalovírus, HSV-1,
HSV-2 e vírus Epstein-Barr ocorreram apenas em pacientes HIV-positivos.
- A ocorrência de coinfecção anal entre os vírus: HPV, citomegalovírus, HSV-1,
HSV-2 e Epstein-Barr vírus foi influenciada pela carga viral do HIV-1.
- Neste estudo, a ocorrência de coinfecção viral anal não esteve relacionada ao
risco adicional de desenvolvimento da neoplasia intraepitelial anal.
- Na mucosa anal, o número de linfócitos CD45High, DC CD1a+ e DC CD209+
em pacientes HIV+ foi maior do que no grupo controle (HIV-NIA-), independente
da ocorrência da NIA.
- Na análise da rede de biomarcadores do grupo controle (HIV-NIA-),
observamos, tanto na mucosa anal quanto no sangue periférico, a ocorrência de
forte correlação entre IL-10 e IL-6, entre IL-10 e TNF-α e ainda entre IL-6 e o
TNF-α. (r>0.68).
- A diminuição da frequência de células TCD4+ circulantes, pDC e IFN-γ+ ou IL10+CD1a+ DCs, bem como o aumento da porcentagem de células CD1a+, IFNγ+ ou IL-10+TCD4+, e CD11c+CD123Low estiveram associados a infecção por
HIV, independente da ocorrência da NIA.
- O aumento das Dcs Mielóides (CD11c+CD123Low) durante a infecção pelo HIV
e nos infectados pelo HIV com NIA, e a diminuição das DC plasmacitóides
(pDCs) no sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV, sinalizam uma
migração para a mucosa anal inflamada na tentativa de resolver a infecção
apresentada.
- Na análise da rede de biomarcadores tanto o grupo de pacientes (HIV+NIA-)
quanto o (HIV+NIA+), apresentaram forte correlação entre IL-10 e IL-6 e entre
IL-6 e TNF-α no sangue periférico e ainda entre IL-10 e IL-6, IL-10 e TNF-α, e IL6 e TNF-α na mucosa anal (r>0.68).
- Células mononucleares da mucosa anal de pacientes HIV(+)NIA(+)
apresentaram
significativa
capacidade
de
secretar
citocinas
pró-
86
inflamatórias/reguladoras, especificamente mTNF-α> Mil-4> Mil-10> Mil-6 = mIL17A, com menor secreção de pbIL-2 pelas PBMC.
- Pacientes HSIL+ apresentaram diminuição do número de linfócitos, IFN-ϒ+DC
CD1a+ e de IL-10+CD1a+ e aumento das DC CD1a+ e de IFN-γ+TCD4+ no
sangue periférico, associados a diminuição dos linfócitos CD45HIGH na mucosa
anal, quando comparados aos HIV+LSIL+.
- Na rede de biomarcadores de pacientes com HSIL, houve forte correlação
entre
as
Dcs
mielóides
(CD11c+CD123Low)
e
as
células
IFN-γ+CD4+,
demonstrando uma ineficaz tentativa para o controle da lesão induzida por vírus.
- O aumento tecidual de IL-17A/TNF-α/IFN-γ em pacientes com HSIL pode
refletir a migração de células Th1/Th17 para a mucosa, contribuindo com o
processo inflamatório, sem o eficaz controle do desenvolvimento tumoral.
- A associação significativa entre HSIL e os níveis de TNF-α/IL-17A/IFN-γ e os
diferentes subtipos de DC presentes na mucosa anal pode identificar e
categorizar pacientes HIV(+) sob alto risco de desfecho câncer anal.
- Na mucosa anal, TNF-a/IFN-γ/IL-17A comportaram-se como biomarcadores
HSIL seletivos. Esses pacientes exibem ainda fortes ligações positivas entre os
ambientes circulatório periférico e a mucosa anal entre a mIL-17A/mTNFα/pbIFN-γ+CD4+, demonstrando conexões positivas ou negativas em indivíduos
sob forte risco de evolução para o câncer anal.
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abbas AK, Lichtman AH. Mecanismos efetores da imunidade mediada por
células.
In:______. Imunologia celular e molecular. 5ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005c.
Abbas AK, Lichtman AH. Processamento de antígenos e apresentação aos
linfócitos
T. In: ______. Imunologia celular e molecular. 5ed. Rio de Janeiro: Elsevier,
2005d.
Abramowitz L, Benabderrahmane D, Ravaud P, Walker F, Rioux C, Jestin C,
Bouvet E, Soulé JC, Leport C, Duval X. Anal squamous intraepithelial
lesions and condyloma in HIV-infected heterosexual men, homosexual men
and women: prevalence and associated factors. AIDS 2007; 21: 1457-65.
87
Abramowitz L, Mathieu N, Roudot-Thoraval F, Lemarchand N, Bauer P,
Hennequin C, Mitry E, Romelaer C, Aparicio T & Sobhani I. Epidermoid anal
cancer prognosis comparison among HIV+ and HIV patients. Alimentary
Pharmacology & Therapeutics 2009; 30 (4) 414-421.
Allan RS, Smith CM, Belz GT, van Lint AL, Wakim LM, Heath WR, Carbone FR.
Epidermal viral immunity induced by CD8 dendritic cells but not by
Langerhans cells. Science 2003; 301: 1925-1928.
Amsterdam Cohort Studies on HIV infection and AIDS. A summary of the results
2001-2009. 2010
Anzala AO, Simonsen JN, Kimani J, Ball TB, Nagelkerke NJ, Rutherford J, Ngugi
EN, Bwayo JJ, Plummer FA, Acute sexually transmitted infections increase
human immun- odeficiency virus type 1 plasma viremia, increase plasma
type 2 cytokines, and decrease CD4 cell counts. J Infect Dis 2000; 182, 459466.
Apgar BS, Zoschnick L. The 2001 bethesda system therminology. American
family physician 2003; 68 (10): 1992-8.
Arany I, Evans T, Tyring SK. Tissue specificHPV expression and downregulation
of local imune responses in condylomas from HIV seropositive individuals.
Sex Transm Infect 1998; 74: 349-353.
Bandeira, C.B., Limberger, L.F., Damiani, P.A., Rosa, M., Ferraz, R.,
Campo, L.S. Manejo das lesões suspeitas de neoplasia cervical. Revista
Técnico-científica do grupo hospitalar Conceição. v.14, n.1, 2001.
Bazin AR. Manifestações clínicas da infecção pelo vírus da imunodeficiência
humana, capítulo 5. In: Rotinas de Diagnóstico e Tratamento das Doenças
Infecciosas e Parasitárias. São Paulo: Editora Atheneu, 52-64 2005.
Bella D, Gennaro M, Vaccari M, Ferraris C, Nicola S, Riva A, Clerici M, Greco M,
Villa ML. Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with
breast cancer. British Journal of Cancer 2003; 89: 1463-1472.
Berner V, Liu H, Zhou Q, Alderson KL, Sun K, Weiss JM, Back TC, Longo DL,
Blazar BR, Wiltrout RH, Welniak LA, Redel- man D, Murphy WJ. IFN-gamma
mediates CD4+ T-cell loss and impairs secondary antitumor responses after
successful initial immunotherapy. Nat Med 2007; 13(3): 354-360.
Bosnjak LM, Miranda-Saksena DM, Koelle RA, Boadle CA, Cunningham JAL.
Herpes simplex virus infection of human dendritic cells induces apoptosis
and allows cross-presentation via uninfected dendritic cells. J Immunol 2005;
174: 2220-2227.
Brasil. Ministério da Saúde. Boletin epidemiológico aids e DST 2010. Disponível
em:http://www.aids.gov.br/sites/default/files/anexos/publicacao/2010/45974/v
ers_o_final_15923.pdf. Acesso em 22/11/2010 às 13:32h.
88
Bronte V et al. Unopposed production of granulocyte-macrophage colonystimulating factor by tumors inhibits CD8+ T cell responses by dysregulating
antigen-presenting cell maturation. J Immunol 1999; 162: 5728-5737.
Burchill MA, Yang J, Vogtenhuber C, Blazar BR, Farrar MA. IL-2 Receptor βDependent STAT5 Activation Is Required for the Development of Foxp3+
Regulatory T Cells. J Immunol 2007; 178: 280-290
Burg SH, Piersma SJ, Jong A, Hulst JM, Kwappenberg KMC, Hende M, Welters
MJP, Rood JJ, Fleuren GJ, Melief CJM, Kenter GG, Offringa R. Association
of cervical cancer with the presence of CD4+ regulatory T cells specific for
human papillomavirus antigens. PNAS 2007; 104 (29): 12087-12092.
Caux, C. et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood
differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus tumor necrosis factor
alpha: II. Functional analysis. Blood 1997; 90: 1458-1470.
CDC (World Health Organization). Interim WHO Clinical Staging of HIV/AIDS and
HIV/AIDS Case Definitions for Surveillance. 2005. Accessed March 23, 2011.
Available online at
www.who.int/hiv/pub/guidelines/casedefinitions/en/index.html
Chin-Hong PV, Vittinghohh E, Cranston RD, Browne L, Buchbinder S, Colfax G,
Da Costa M, Darragh T, Benet DJ, Judson F, Koblin B, Mayer KH, Palefsky
JM. Age-related prevalence of anal cancer precursors in homosexual men:
The explore study. JNCI 2005; 97(12): 896-905.
Choudhary SKN, Vrisekoop CA, Jansen SA, Otto H, Miedema SF, Camerini D.
Low immune activation despite high levels of pathogenic human
immunodeficiency virus type 1 results in long-term asymptomatic disease. J
Virol 2007; 81: 8838-8842.
Cong Y, Konrad A, Iqbal N, Hatton RD, Weaver CT, Élson CO. Generation of
antigen-specific, Foxp3-Expressing CD4+ Regulatory T cells by innibition of
APC proteosome function. J Immunol 2005; 174(5): 2787-2795.
Critchlow CW, Surawick CM, Holmes KK. et al. Prospective study of high grade
anal squamous intraepithelial neoplasia in a cohort oh homosexual men:
influence of HIV infeccion, immunosupression and human pappilomavirus
infeccion. AIDS 1995; 9: 1255-1262.
Daling JR, Weiss NS, Hislop G, Maden C, Coates RJ, Sherman KJ, Ashley RL,
Beagrie M, Ryan JA, Corey L. Sexual practices, sexually transmitted
diseases, and the incidence of anal cancer. The New England Journal of
Medicine 1987; 317(16): 973-977.
Daling JR, Madeleine MM, Johnson LG, Schwartz SM, Shera KA, Wurscher MA,
Carter JJ, Porter PL, Galloway DA, McDougall JK. Human papillomavirus,
89
smoking, and sexual practices in the etiology of anal cancer. Cancer 2004;
101: 270–280.
Daumas ADPG, Junior RMS, Costa OTF, Tramujas, ICS, Gimenez FS, Araujo
JR, Andrade RV, Lopes EJS, Pinheiro JP, Ferreira JRD, Malheiro A, Ferreira
LCL. Análise morfométrica das células dendríticas da mucosa anal de
pacientes HIV-positivos e relação com as lesões intraepiteliais e o câncer
numa instituição de saúde terciária no Brasil. Acta Cirúrgica Brasileira 2011;
26(6): 521-529.
Diniz FF. Anatomia Cirúrgica. 1.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
Divito S, Cherpes TL, Hendricks RL: A triple entente: virus, neu- rons, and CD8+
T cells maintain HSV-1 latency. Immunol Res 2006; 36: 119-126.
Donaghy H, Pozniak A, Gazzard B, Qazi N, Gilmour J, Gotch F, et al. Loss of
blood CD11c(+) myeloid and CD11c(−) plasmacytoid dendritic cells in
patients with HIV-1 infection correlates with HIV- 1 RNA virus load. Blood
2001;98:2574–6.
Doorbar, J. The papillomavirus life cycle. Journal of Clinical Virology 2005; 32: 715.
Ferrari S, Malugani F, Rovati B, Porta C, Riccardi A, Danova M. Flow cytometric
analysis of circulating dendritic cell subsets and intracellular cytokine
production in advanced breast cancer patients. Oncol Rep. 2005 Jul; 14(1):
113-120.
Fernandez NJ. Data Review. 2003 - Cancer in HIV-infected population.
Disponível em: http://goliath.ecnext.com/coms2/browse_R_R042. Acessado
em 03 de Setembro de 2007.
Frank I, Stossel H, Gettie A, Turville SG, Bess JWJ, Lifson JD, Sivin I, Romani N,
Robbiani M. A fusion inhibitor prevents spread of immunodeficiency viruses,
but not activation of virus-specific t cells, by dendritic cells. Journal of
Virology. 2008; 82(11): 5329-5339.
Friedman HB, Saah AJ, Sherman ME, Busseniers AE, Blackwelder WC, Kaslow
RA. Human pappilomaviruses, anal squamous intraephitelial lesions, and
human immunodeficiency virus in a cohort of gay men. J Infect Dis 1998;
178: 45-52.
Fundação Centro de Oncologia do Estado do Amazonas-FCECON. Incidência
de tumores malignos. Departamento de Estatística Médica. In: informação
diretamente coletada no setor, Manaus. 23 Novembro de 2011.
Gabrilovich DI, Corak J, Ciernik IF et al. Decreased antigen presentation by
dendritic cells in patients with breast cancer. Clin Cancer Res 1997; 3:483490.
90
Gabrilovich DI, Ishida T, Nadaf S, Ohm J & Carbone DP. Antibodies to vascular
endothelial growth factor enhance the efficacy of cancer immunotherapy by
improving endogenous dendritic cell function. Clin Cancer Res 1999; 5:
2963-2970.
Gabrilovich D. Mechanisms and Functional Significance of Tumour- Induced
Dendritic-Cell Defects. Nat Rev Immunol 2004; 4: 941-952.
Gabrilovich DI & Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the
immune system. Nat Rev Immunol 2009; 9: 162-174.
Gajewski TF, Fitch FW. Anti-proliferative effect of IFN-gamma in immune
regulation. I. IFN-gamma inhibits the proliferation of Th2 but not Th1 murine
helper T lymphocyte clones. J Immunol 1988; 140(12): 4245-4252.
Garbe C, Krasagakis K, Zouboulis CC, Schroder K, Kruger S, Stadler R, Orfanos
CE. Antitumor activities of interferon alpha, beta, and gamma and their
combinations on human melanoma cells in vitro: changes of proliferation,
melanin synthesis, and immunophenotype. J Invest Dermatol 1990; 95(6)
231-237.
Geijtenbeek TBH, Kwon DS, Torensma-Ruurd T, Vliet SJV, Duijnhoven GCFV,
Middel J, Cornelissen ILMHA, Nottet HSLM. DC-SIGN, a dendritic cellspecific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T. Cells
2000; 100: 587-597.
Grosskurth H, Mosha F, Todd J, Mwijarubi E, Klokke A, Senkoro K, et al. Impact
of improved treatment of sexually transmitted diseases on HIV infection in
rural Tanzania: randomised con- trolled trial. Lancet 1995; 346: 530-536.
Hazenberg MDSA, Otto BH, van Benthem MT, Roos RA, Coutinho JM, Lange D,
Hamann MP, Miedema F. Persistent immune activation in HIV-1 infection is
associated with progression to AIDS. AIDS 2003; 17: 1881-1888.
Hessol NA, Pipkin S, Schwarcz S, Cress RD, Bacchetti P, Scheer S. The impact
of highly active antiretroviral therapy on non- AIDS-defining cancers among
adults with AIDS. Am J Epidemiol 2007; 165: 1143-1153.
Hu J, Gardner MB, Miller CJ. Simian Immunodeficiency Virus Rapidly Penetrates
the Cervicovaginal Mucosa after Intravaginal Inoculation and Infects
Intraepithelial Dendritic Cells. Journal of Virology 2000; 74(13) 6087-6095.
Huang B et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the
development of tumor- induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumorbearing host. Cancer Res 2006; 66: 1123-1131.
Jameson B, Baribaud F, Pohlmann S, Ghavimi D, Mortari F, Doms RW, Iwasaki
A. Expression of DC-SIGN by dendritic cells of intestinal and genital
mucosae in humans and Rhesus macaques. Journal of Virology 2002; 76(4):
1866-1875.
91
Kaul R, Pettengell C, Sheth PM, Sunderji S, Biringer A, MacDonald K, Walmsley
S, Rebbapragada A. The genital tract immune milieu: an important
determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. Journal of
Reproductive Immunology 2008; 77: 32–40.
Kawamura T, Kurtz SE, Blauvelt A, Shimada S. The role of Langerhans cells in
the sexual transmission of HIV. Journal of Dermatological Sciense 2005; 40:
147-155.
Kelly JP, Bancroft GJ. Administration of interleukin-10 abolishes innate
resistance to Listeria monocytogenes. Eur J Immunol 1996; 26(2): 356-364
Klencke BJ, Palefsky JM. Anal cancer: an HIV-associated
Hematology Oncology Clinics of North America 2003; 17: 859-872.
Cancer.
Kreuter A, Brockmeyer NH, Hochdorfer B, Weissenborn SJ, Stücker M, Swoboda
J et al. Clinical spectrum and virologic characteristics of anal intraepithelial
neoplasia in HIV infection. Journal of the American Academy of Dermatology
2005; 4 (52): 603-608.
Kobayash A, Greenblatt RM, Anastos K, Minkoff H, Massad LS, Young M, et al.
Functional attributes of mucosal immunity in cervical intraepithelial neoplasia
and effectes of HIV infection. Cancer Research 2004; 64: 6766-6774.
Kondo A, Yamashita T, Tamura H, Zhao W, Tsuji T, Shimizu M, Shinya E,
Takahashi H, Tamada K, Chen L, Dan K, Ogata K. Interferon-gamma and
tumor necrosis factor-alpha induce an immunoinhibitory molecule, B7-H1, via
nuclear factor-kappa B activation in blasts in myelodysplastic syndromes.
Blood 2010; 116(7): 1124-1131.
Kryczek I, Wei S, Gong W, Shu X, Szeliga W, Vatan L, Chen L, Wang G, Zou W.
IFN-gamma enables APC to promote memory Th17 and abate Th1 cell
development. J Immunol 2008; 181(9): 5842-5846.
Kurte M, Lopez M, Aguirre A, Escobar A, Aguillon JC, Charo J, Larsen CG,
Kiessling R, Salazar-Onfray F. A synthetic peptide homologous to functional
domain of human IL-10 down-regulates expression of MHC class I and
transporter associated with antigen processing 1/2 in human melanoma cells.
J Immunol 2004; 173(3): 1731-1737.
Kusmartsev S & Gabrilovich DI. STAT1 signaling regulates tumor-associated
macrophage-mediated T cell deletion. J Immunol 2005; 174: 4880-4891.
Levy JA, Scott I, Mackewicz C. Protection from HIV/AIDS: the importance of
innate immunity. Clin Immunol 2003;108:167–74.
Loré K, Sönnerborg A, Broström C, Goh L, Perrin L, Mcdade H, Stellbrink H,
Gazzard B, Weber R, Napolitano LA, Kooyk Y, Andersson J. Accumulation of
DC-SIGN+CD40+dendritic cells with reduced CD80 and CD86 expression in
lymphoid tissue during acute HIV-1 infection. AIDS 2002; 16: 683-692.
92
Loiola, A. Câncer anal, disponível em:
http://www.medstudents.com.br/content/resumos/resumo_medstudents20070629
_01.doc. Acessado em 31 de Agosto de 2007.
Lutz MB, Dohler A, Azukizawa H. Revisiting the tolerogenicity of epidermal
Langerhans cells. Immunology and Cell Biology 2010; 88: 381-386.
Marchetti B, Ashrafi GH, Tsirimonaki E, O'brien PM, Campo MS. The bovine
papillomavirus oncoprotein E5 retains MHC class I molecules in the
Golgi apparatus and prevents their transport to the cell surface.
Oncogene 2002; 21(51): 7808-7816.
Martins C. HPV-induced anal displasia: what do we know and what can we do
about
it?.
Disponível
em:
http://www.hopkinsaids.edu/publications/report/may01_3.html. Acessado em 10 de Janeiro de
2005.
Melbye M, Sprogel P. Aetiological parallel between anal cancer and cervical
cancer. Lancet 1991; 338: 657-659.
Melbye M, Coté TR, Kesser L, Gail M, Biggar RJ. High incidence of anal cancer
among AIDS pacients. Lancet 1994; 343: 636-639.
Mellor AL, Munn DH. Creating immune privilege: active local suppression that
benefits friends, but protects foes. Nat Rev Immunol 2008; 8(1): 74-80.
Menetrier-Caux C, Thomachot MC, Alberti L, Montmain G & Blay JY. IL-4
prevents the blockade of dendritic cell differentiation induced by tumor cells.
Cancer Res 2001; 61: 3096-3104.
Min WP, Zhou D, ICHIM TE, Strejan GH, Xia X, Yang Y,Huang G, Garcia B,
White D, Dutartre P, Jevnikar AM, Zhong R. Innibitory feedback loop
between tolerogenic, dendritic cells and regulatory T cells in transplant
tolerance. J Immunol 2003; 170(3): 1304-1312.
Munoz N, Bosch FX, Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV.
Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with
cervical cancer. New England Journal of Medicine 2003; 348(6): 518-527.
Nadal, SR, Calore EE, Cruz SHA, Horta SHC, Manzione CR, Bin FC,
Capelhuchnik P, Klug WA. Comparison of Langerhans Cells Counts from
Tissues Containing Anal Carcinoma of Patients With and Without HIV
Infection. Rev bras Coloproct 2006; 26(3): 269-274.
Nefedova Y et al. Hyperactivation of STAT3 is involved in abnormal
differentiation of dendritic cells in cancer. J Immunol 2004; 172: 464-474.
Pachiadakis L, Pollara G, Chain MB, Naumov N. Is hepatitis c virus infection of
dendritics cells a mechanism facilitating viral persistence? Lancet 2005; 5:
296-304.
93
Palefsky JM, Holly EA, Gonzales J, Berline J, Ahn DK, Greesnpan JS. Detection
of human papillomavirus DNA in anal Intraepithelial neoplasia and anal
cancer. Cancer Research 1991; 51: 1014-1019.
Palefsky JM, Holly EA. Molecular virology and epidemiology of human
papilomavirus and cervical cancer. Cancer Epidemiol Biomarks Prev
1995; 4(4): 415-428.
Palefsky JM, Holly EA, Berry JM, Jay N, Darragh TM. Anal cytology as a
screening tool for anal squamous intraepithelial lesions. J. Acquir Immune
deficient Syndrome Humam retroviral 1997; 14: 415-422.
Palefsky JM, Holly E, Ralston ML, Jay N, Berryz JM, Darragh TM. High incidence
of anal high-grade squamous intra-epithelial lesions among HIV-positive and
HIV-negative homossexual and bisexual men. AIDS 1998b; 12(5): 495-503.
Palefsky JM, Goldstone SE, Neefe J. HspE7 treatment of high-grade anal
dysplasia: final results of an open-label trial and interim long-term
follow-up. In: 20TH INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE,
Paris, 2002.
Peguet-Navarro J et al. Gangliosides from human melanoma tumors impair
dendritic cell differentiation from monocytes and induce their apoptosis. J.
Immunol 2003; 170: 3488-3494.
Piketty C, Darragh TM, Costa M. High prevalence of anal human Pappilomavirus
infection and anal cancer precursors among HIV-infected persons in the
absence of anal intercourse. Ann intern Med 2003; 6 (138): 253-259.
Pinzon-Charry A, Maxwell T, McGuckin MA, Schmidt C, Furnival C, López JA.
Spontaneous apoptosis of blood dendritic cells in patients with breast cancer.
Breast Cancer Research 2005; 8(1): 1-10.
Ramos-Filho CF. Rotinas de diagnósticos e Tratamento das Doenças
Infecciosas e Parasitárias. São Paulo: Editora Atheneu; 85-92. 2005
Ratta M et al. Dendritic cells are functionally defective in multiple myeloma: the
role of interleukin-6. Blood 2002; 100: 230-237.
Reis e Sousa C. Dendritic cells in a maturage age. Nat Rev Immunol 2006; 6(6):
476-483.
Retamozo-Palacios M, Sousa JB, Santos JB. Lesões anorretais em pacientes
HIV positivos usuários de terapia anti-retroviral de alta efetividade. Revista
da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 2007; 40(3): 286-289.
Roka F, Roka J, Trost A, Schalk H, Zagler C, Kimbauer R, Salat A. Anal human
Papillomavirus testing with Digene’s hybrid capture 2 using two different
sampling methods. Dis Colon Rectum 2008; (51): 61-66.
94
Schieferdecker HL, Ullrich R, Hirseland H, Zeitz M. T cell differentiation antigens
on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. J. Immunol 1992;
149: 2816-2822.
Segura E, Nicco C, Lombard B, Véron P, Raposo G, Batteux F, Amigorena S,
Théry C. ICAM-1 on exosomes from mature dendritics cells is critical for
efficient naive T-cell priming. Blood 2005; 106 (1): 216-223.
Sheth PM, Danesh A, Shahabi K, Rebbapragada A, Kovacs C, Dimayuga R,
Halpenny R, MacDonald KS, Mazzulli T, Kelvin D, Ostrowski M & Kaul R.
HIV-Specific CD8+ Lymphocytes in Semen Are Not Associated with Reduced
HIV Shedding. J Immunol 2005; 175: 4789-4796.
Sobhani I, Vuagnat A, Walker F, Vissuzaine C, Mirin B, Hervatin F, Marmuse J,
Crémieux A, Carbon C, Henin D, Lehy T, Mignon, M. Prevalence of highgrade dysplasia and cancer in the anal canal in human papillomavirusinfected individuals. Gastroenterology 2001; 120: 857-866.
Sobhani I, Walker F, Aparicio T, Abramowitz L, Henin D, Cremieux AC, Soule JC.
Effect of Anal Epidermoid Cancer-related Viruses on the Dendritic
(Langerhans’) Cells of the Human Anal Mucosa. Clinical Cancer Research
2002; 8: 2862-2869.
Sobhani I, Walker F, Rodout-Thoraval F, Abramowitz L, Johanet H, Hérnin D, et
al. Anal carcinoma: incidence and effect of cumulative infecctions. AIDS
2004; 18: 1561-1569.
Soilleux EJ, Morris LS, Leslie G. Constitutive and induced expression of DCSIGN on dendritic cells and macrofhage subpopulations in situ and in vitro. J
Leucocyte Biol 2002; 71: 445-457.
Sprecher E, Becker Y. Skin Langerhans cells play an essential role in the
defense against HSV-1 infection Arch Virol 1986; 91: 341-349.
Steenbergen-Renske DM, Wilde J, Wilting SM, Brink AATP, Snijders PJF, Meijer
CJLM. HPV-mediated transformation of the genital tract. Journal of
Clinical Virology 2005; 32: 25-33.
Steinbrink K, Wolf lM, Jonuleit H, Knop J, En kAH. Inductionof tolerance by
interleukin-10-treated dendritic cells. J Immunol 1997; 159(10): 4772-4780.
Steinbrink K, Jonuleit H, Muller G, Schuler G, Knop J, Enk AH. Interleukin-10Treated Human Dendritic Cells Induce a Melanoma-Antigen–Specific Anergy
in CD8+ T Cells Resulting in a Failure to Lyse Tumor Cells. Blood 1999;
93(5): 1634-1642.
Steinbrink K, Graulich E, Kubsch S, Knop J & Enk A. CD4+ and CD8+ anergic T
cells induced by interleukin-10- treated human dendritic cells display antigen
specific suppressor activity. Blood 2002; 99: 2468-2476.
95
Stoitzner P. The Langerhans cell controversy: are they immunostimulatory or
immunoregulatory cells of the skin immune system? Immunology and Cell
Biology 2010; 88: 348-350.
Svensson M, Marrof A, Ato M, Kaye PM. Stromal cells direct local differentiation
of regulatory dendritic cells. Immunity 2004; 21(6): 805-816.
Tay SK, Jenkins D, Maddox P, Campion M, Singer A. Subpopulation of
Langerhans cells in cervical neoplasia. British Journal of Obstetrics and
Gynaecology 1987; 94(1): 10-15.
Tramujas, ICS, , Araujo JR, Andrade RV, Cabral CRB, Gimenez FS, Daumas
ADPG, Martins TC, Lopes LR, Ferreira LCL. Anal cancer precursor lesions in
HIV-positive and HIV-negative patients seen at a tertiary health institution in
Brazil. Acta Cirúrgica Brasileira 2011; 26(1): 64-71.
Turville S, Santos JJ, Frank I, Cameron PU, Wilkinson J, Miranda-Saksena M.
Immunodeficient virus uptake, turnover, and 2-phase transfer in human
dendritic cells. Blood 2003; 103: 2170-2179.
Ueno H, Schmitt N, Palucka K, Banchereau J. Dendritic cells and humoral
immunity in humans. Immunology and Cell Biology 2010; 88: 376-380.
Vernon SD, Hart CE, Reeves WC, Icenogle JP. The HIV-1 tat protein enhances
E2-dependent human pappilomavirus 16. Virus Res 1993; 27: 133-145.
Voeler B. AIDS and heterosexual anal intercurse. Arch Sex Beha 1991; 20: 233276.
Volberding P. Looking Behind: time for anal cancer screening. The American
Journal of Medicine 2000; 108: 674-675.
Wang T et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3
signaling in tumor cells. Nature Med 2004; 10: 48-54.
Welters MJ, Van der Logt P, Kwappenberg KM, Drijfhout JW, Fleuren GJ, Kenter
GG, Melief CJ, Van der burg SH, Offringa R. Int J Cancer. 2006; 118: 950956.
Wilke CM, Wei S, Wang L, Kryczek I, Kao J, Zou W. Dual biological effects of the
cytokines interleukin-10 and interferon-c. Cancer Immunol Immunother 2011;
60: 1529-1541.
Wilkin TJ, Palmer J, Brudney JK, Chiasson MA, Wright TC. Anal intraepithelial
neoplasia in heterosexual and homosexual HIV-positive men with acess to
antiretroviral therapy. JID 2004; (190): 1685-1691.
Wu L, Kewalramani VN. Dendritic-cell interactions with HIV: infection and viral
dissemination. Nature Reviews 2006; 6.
96
Yaghoobi M, Gouvello SL, Aloulou N, Duprez-Dutreuil C, Walker F, Sobhani I.
FoxP3 overexpression and CD1a+ and CD3+ depletion in anal tissue as
possible mechanisms for increased risk of human papillomavirus-related anal
carcinoma in HIV infection. Colorectal Disease 2010; 13(7): 768-773
Yanagawa Y, Matsumoto M, Togashi H. Adrenoceptor-mediated enhancement of
interleukin-33 production by dendritic cells. Brain Behav Immun 2011; 25(7):
1427-1433.
Zaki SR, Judd R, Coffield LM, Greer P, Rolston F, Evatt BL. Human
Papillomavirus infeccion and anal carcinoma. Retrospective analysis by in
situ hybridization and the polymerase chain reaction. American Journal of
pathology 1992; 140: 1345-1355.
Zheng LM, Ojcus DM, Garaud F, Roth C, Maxwell E, Li Z, Rong H, Chen J,
Wang XY, Catino JJ, King I. Interleukin-10 inhibits tumor metastasis through
an NK cell-dependent mechanism. J Exp Med. 1996; 184(2): 579-584.
Zimmer MI, Larregina AT, Castillo CM, Capuano IS, Falo Jr LD, Murphey-Corb
ML, Reinhart TA, Barratt-Boyes SM. Disrupted homeostasis of Langerhans
cells and interdigitating dendritic cells in monkeys with AIDS. Blood
2002; 99(8): 2859-2868.
97
7 ANEXOS
7.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
.PERFIL IMUNOLÓGICO ANAL DE PACIENTES HIV POSITIVOS E
RELAÇÃO COM A LESÃO INTRA-EPITELIAL EO CÂNCER
DESCRIÇÃO E OBJETIVO DO ESTUDO
O câncer anal, é uma doença grave que ocorre mais em pessoas que fazem sexo
anal (via) sem camisinha, mulheres que já tiveram inflamação grave ou câncer de útero,
transplantados, fumantes, nos que têm ou tiveram “doenças do sexo” e verrugas próximas
ao ânus (via) e os portadores de HIV/aids.
Estamos lhe convidando para participar da pesquisa ANALISE DO PERFIL
IMUNOLÓGICO DE PACIENTES HIV POSITIVOS COM A LESÃO INTRAEPITELIAL ANAL.
Você foi escolhido por ter interesse em saber se têm doenças no ânus (via) ou por ter o
vírus do HIV/AIDS. Na consulta veremos se as células dendríticas e outras células de
defesa do seu ânus (via) estão normais em você, as coletaremos durante o exame no ânus
(via) com um aparelho descartável (que se joga fora após o uso) para olhar por dentro e
faremos biópsia( retirada de um pequenino pedaço) no local suspeito de doença, isso
geralmente causa discreta dor, mas faremos uma pequena anestesia no local, que poderá
arder levemente, acelerar o coração ou dar um mal estar, caso aconteça você ficará em
observação conosco até que a “sensação ruim” passe. Um pequeno sangramento também
poderá ocorrer na primeira vez que for defecar( obrar), não é preciso se preocupar. Uma
amostra de seu sangue será necessária para testar o HIV/aids, sua quantidade e o número
de células de defesa que você tem no sangue (se você apresentar sorologia positiva para o
HIV).
Gostaríamos, com o trabalho, de conhecer quantas pessoas tem a inflamação grave
no ânus (via) que pode virar câncer, e se as células de defesa do ânus (via) e do sangue
estão diminuídas facilitando a doença, com isso podemos criar um programa para
descobrir a doença no início, antes que ela vire câncer. Você precisará responder
perguntas íntimas sobre a sua doença, tipo de sexo, doenças do sexo e o quanto estudou.
Não existem outros exames melhores ou com menos riscos. O material será examinado
no laboratório da Fundação de Medicina Tropical e no FHEMOAM, e você receberá os
resultados em seu prontuário. Caso você passe mal, ou tenha algum problema devido aos
exames ou dúvidas quanto à pesquisa, procure a Dra. Adriana Daumas pelo telefone
(92)2127-3432 ou no endereço Av. Pedro Teixeira, 25 Dom Pedro.
98
Você tem a liberdade e o direito de negar sua participação ou retirar seu
consentimento (autorização) em qualquer momento, podendo mesmo assim
continuar a ser atendido. Em caso de ocorrer algum dano eventual à sua saúde durante
o período de estudo, provocado pela coleta dos exames, a responsabilidade recairá
inteiramente sobre o pesquisador e a Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira
Dourado (FMT-HVD), conforme prevê a Resolução 196/96 – CNS.
Sua identidade (nome e rosto) será mantida em segredo pelo pesquisador e pela
Fundação. Os resultados da pesquisa serão analisados e colocado em tabelas, figuras,
fotos ou gráficos e mostrados em palestras, conferências, periódico científico ou outra
forma que leve o conhecimento à sociedade e autoridades da área da saúde nacionais ou
internacionais, de acordo com as normas (leis) de proteção nacional ou internacional.
Os custos dos exames, das consultas e do tratamento serão de responsabilidade da
Fundação de Medicina Tropical e do FHEMOAM, você só precisará se deslocar, por
meios próprios, até o local da consulta ou para o tratamento conforme a orientação que
receberá durante a pesquisa. Você receberá uma cópia deste termo, e caso concorde com
sue conteúdo, assiná-lo e pedir que o pesquisador(médico) assine também.
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO:
Eu, .................................................................................................................,
participante do estudo acima descrito, recebi a explicação de que serei um(a) dos(as)
participantes desta pesquisa. Se eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de minha
confiança lerá este documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome.
E por estar devidamente informado (a) e esclarecido (a) sobre o conteúdo deste
termo, livremente e sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso(dou)
meu consentimento de inclusão nesta pesquisa.
.................................................................
ASSINATURA DO PACIENTE OU REPRESENTANTE LEGAL
IMPRESSÃO DO POLEGAR DIREITO DO PACIENTE,
CASO ESTE NÃO SAIBA ESCREVER SEU NOME
.................................................................
LOCAL E DATA
PESQUISADOR RESPONSÁVEL PELO ACOMPANHAMENTO E INFORMAÇÕES AO
PACIENTE:
NOME LEGIVEL: ADRIANA DAUMAS PINHEIRO GUIMARÃES
FONE: (92)2127-3432
99
7.2 Cronograma de Execução Física
ANO 2008
ITEM
ATIVIDADES
MESES
JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ
01
Revisão bibliográfica
X
02
X
04
Definição do modelo de estudo e amostra
Cumprimento dos Créditos obrigatórios e
facultativos
Qualificação do Projeto de Tese
05
Coleta da amostra
03
X
X
X
X
X
X
ANO 2009
01
Revisão bibliográfica
02
Testes de padronização da citometria
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
ANO 2010
01
Revisão de Literatura
X
X
X
X
X
X
X
X
02
Execução do método histológico
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
03
Execução do método citométrico
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
04
Revisao dados artigo imunohistoquímica
X
X
X
X
05
Submissão do artigo científico
X
ANO 2011
01
Execução do método histológico
X
X
X
X
X
X
X
02
Execução do método citométrico
X
X
X
X
X
X
X
03
Execução do CBA
X
X
04
Elaboração do segundo artigo científico
X
X
05
Redação da Tese
X
X
X
100
7. 3 Orçamento –PPSUS-FAPEAM
Tipo
Item
Especificação do Item
Qtd Valor Unit. Valor Total
GRADUADOS/ACADÊMICO DO ÚLTIMO PERÍODO DOS
Bolsa --CURSOS DE BIOLOGIA, QUÍMICA, FARMÁCIA OU
24 R$ 1.234,00 R$ 29.616,00
BIOMEDICINA- TIPO DE BOLSA: DCTA/C
AGITADOR MAGNÉTICO MOD:752A COM PLACA DE
AGITAÇÃO EM ALUMÍNIO INJETADO INCLUINDO
RESISTÊNCIA TUBULAR; TEMPERATURA
CONTROLADA POR TERMOSTATO CAPILAR DE 50 Material
320ºC; LÂMPADA PILOTO; CORPO EM CHAPA DE AÇO
Capital Permanente e REVESTIDO EM EPÓXI; CONTROLE DE ROTAÇÃO
1 R$ 984,00 R$ 984,00
Equipamentos ELETRÔNICO DE 80-1.500 RPM; AGITA ATÉ 4 LITROS;
PLACA Ø DE 14 CM E ALTURA DE 10 CM; 60 HZ, 650
WATTS; ACOMPANHA BARRA MAGNÉTICA Ø 9 X 25
MM.
Material
Capital Permanente e
Equipamentos
Material
Capital Permanente e
Equipamentos
Material
Capital Permanente e
Equipamentos
Material
Capital Permanente e
Equipamentos
Material de
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Custeio
Custeio
Material de
Consumo
Material de
Consumo
Custeio Material de
Custeio
EQUIPAMENTO PORTÁTIL PARA BANHO MARIA CUBA EM AÇO INOX AISI 304; TERMOSTATO
ELETROMECÂNICO 40ºC ATÉ 100ºC; DIÂMETRO DA
CUBA DE 220 MM. VOLUME TOTAL DA CUBA DE 3
LITROS; NÃO ACOMPANHA TAMPA; CONSUMO 750
WATTS; MAIS INDICADO PARA USO EM
TEMPERATURAS ACIMA DE 50ºC. 110 VOLTS
HOMOGEINIZADOR PORTÁTIL DE TECIDOS COM
SISTEMA DE ROTOR E ESTATOR, MARCA ULTRA
STIRRER, MODELO ULTRA 80-I. ( HASTE DE 5 MM X 50
MM ). POTÊNCIA DE ENTRADA 130 WATTS; POTÊNCIA
DE SAÍDA 80 WATTS; COM VELOCIDADE VARIÁVEL DE
8.000 A 30.000 RPM; VOLTAGEM 220 VOLTS, 50/60 HZ;
MOTOR CONSTRUÍDO COM ESTRUTURA
macbook 4G, monitor de 17 polegadas, dual core, HD320,
wireless, placa de vídeo integrado, gravador de dvd, sistema
operacional incluso
PHGÂMETRO PHMETRO DIGITAL DE BANCADA
ESTRUTURA MOLDADA EM PLÁSTICO ABS
RESISTENTE A PROVA DE RESPINGOS; DISPLAY
DIGITAL DE FÁCIL LEITURA; AJUSTE DE “SLOPE”
PARA CALIBRAÇÃO; COMPENSAÇÃO AUTOMÁTICA E
MANUAL DE TEMPERATURA (0 A 100ºC); FAIXA DE
MEDIÇÃO: PH: 0,0 A 14 PH MV: -1999 A +1999 MV ,
TEMPERATURA: 0 A 100ºC , EXATIDÃO: PH: ± 0,001 PH
MV: ± 0.1% MV , TEMPERATURA: ± 0.5ºC , DIMENSÕES:
290 X 210 X 95MM . PESO: 1.5 KG. CONJUNTO É
COMPOSTO POR: 01 UNIDADE PRINCIPAL. MOD. PHS3B, 01 ELETRODO C
1
R$ 593,00
R$ 593,00
1 R$ 4.031,00 R$ 4.031,00
1 R$ 2500,00 R$ 2500,00
1
R$ 750,00
R$ 750,00
5
R$ 5,00
R$ 25,00
Rack tipo estante em polipropileno, para acomodar 20 tubos tipo
3
falcon de 25 ml. Embalagem com 01 pç.
R$ 25,00
R$ 75,00
ÁCIDO ACÉTICO GLACIAL – 1 LITRO
1
R$ 35,00
R$ 35,00
ÁLCOOL ABSOLUTO – 1 LITRO
2
R$ 20,00
R$ 40,00
ÁLCOOL 95% - 1 LITRO
6
R$ 5,00
R$ 30,00
110
R$ 2,50
R$ 275,00
1
R$ 710,00
R$ 710,00
2
R$ 25,00
R$ 50,00
1
R$ 40,00
R$ 40,00
DISCO DE DVD
ANUSCÓPIOS DESCARTÁVEIS ABERTOS. embalagem
individual
BSA, ALBUMINA BOVINA, FRAÇÃO V, MÍNIMO DE 96%,
FRASCO 50 GRAMAS, PRODUZIDO POR SIGMA (USA) E
REEMBALADO POR EASYPATH MARCA : SIGMA
REFERÊNCIA : A-9647 (50G)
CAIXA C/ 50 TUBETES DE LIDOSTESIN 3% COM
VASOCONSTRITOR
CAIXA DE AGULHAS GENGIVAIS LONGAS – CAIXA
101
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Custeio
Material de
Consumo
Material de
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Custeio Material de
Custeio
COM 100 UNIDADES
CANETA PARA RETROPROJETOR PONTA FINA
3
R$ 6,00
R$ 18,00
CARTUCHO PARA IMPRESSORA HP1350
4
R$ 93,00
R$ 372,00
CORANTE GIEMSA – 500ML
3
R$ 60,00
R$ 180,00
DIMETHYL SULFOXIDE- DMSO. FRASCO COM 100 ML
1
R$ 108,00
R$ 108,00
EDTA FRASCO COM 500G
2
R$ 62,00
R$ 124,00
R$ 508,30
R$ 508,30
FICOLL MOLECULAR BIOLOGY REAGENT. FRASCO
1
COM 10GR.
FILTRO PARA UTILIZAÇÃO EM CONJUNTO COM
SERINGAS, PARA A FILTRAÇÃO ESTÉRIL E
ULTRAPURIFICAÇÃO DE SOLUÇÕES AQUOSAS
(POROSIDADE 0,22UM), DO TIPO CELL STRAINNER ,
PARA SEPARAÇÃO DE PARTICULAS DOS LIQUIDOS,
14
REDUÇÃO DOS MICROORGANISMOS (FILTRAÇÃO
DESGERMINANTE), MEDIDA; DIÂMETRO DE 30MM E
ALTURA DE 25MM, CAIXA COM 30 UNIDADES. MARCA
: EASYPATH REFERÊNCIA : EP-51-25232
R$ 137,60 R$ 1.926,40
GAZE – COMPRESSAS – PACOTES COM 500 UNIDADES
2
R$ 26,00
R$ 52,00
GENTAMICINA 80 MG/DL 15710064 GENTAMICIN 10ML
INVITROGEN
5
R$ 49,88
R$ 249,40
GLUTAMINA L PCT COM 25G
1
R$ 13,06
R$ 13,06
HEMATOXILINA - 500ML
3
R$ 105,00
R$ 315,00
HEMATOXILINA AUTOMATION 500ML
1
R$ 481,61
R$ 481,61
LÂMINAS DE VIDRO C/ EXTR. FOSCA FINA – CX COM
50 U
6
R$ 2,45
R$ 14,70
LAMÍNULAS DE VIDRO 24 X 50 MM – CX C/ 100 U
6
R$ 5,40
R$ 32,40
LIVRO DE PROTOCOLO
2
R$ 7,00
R$ 14,00
LUVAS DE LÁTEX DESCARTÁVEIS – PROCEDIMENTO –
4
CAIXA COM 50 PARES
R$ 23,00
R$ 92,00
1
R$ 152,32
R$ 152,32
1
R$ 40,00
R$ 40,00
4
R$ 40,00
R$ 160,00
NAVALHAS DESCARTAVEIS PARA MICROTROMO
1
R$ 445,00
R$ 445,00
PAPEL A4 RESMA COM 500 U
5
R$ 15,00
R$ 75,00
PARAFILM “M” ROLO ESTÉRIL DE COM 10,2CM X 38,1M 2
R$ 107,70
R$ 215,40
MEIO DE MONTAGEM ENTHELLAN – FRA 100 ML
MICRO-TUBOS TIPO EPPENDORF – 2 ML, PCT COM 500
U
MICRO-TUBOS TIPO EPPENDORF – 2 ML, PCT COM 500
U 40,00 04
PASTAS PORTA-ARQIVO COM ALÇA EM PAPELÃO
REFORÇADO
3
R$ 48,00
R$ 144,00
PENDRIVE DE 8G
2
R$ 79,00
R$ 158,00
PENSTREP® 1X SOLN., 100ML
2
R$ 45,00
R$ 90,00
POLY-LYSINE ( anterior era 490,00- ajuste)
1
R$ 363,15
R$ 363,15
RPMI 1640- CONTAIN L-GLUTAMINE. 500ML GIBCO
3
R$ 83,52
R$ 250,56
5
R$ 50,00
R$ 250,00
2
R$ 377,67
R$ 755,34
SOLUÇÃO DE FORMALDEÍDO 10% TAMPONADA –
FRASCOS DE 1 LITRO
SOLUÇÂO DE SAL BALANCEADA HANK’S DE CÁLCIO
102
Consumo
Material de
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Custeio
Custeio
Material de
Consumo
Custeio
Material de
Consumo
Material de
Consumo
Material de
Custeio
Consumo
Totais
Bolsa
Capital
Custeio
Geral
Custeio
LIVRE DE MAGNÉSIO (GIBCO INVITROGEN,
PAISLEY,UK)- 1L
SOLUÇÃO DE TRYPAN BLUE, FRASCO COM 1000ML
1
R$ 100,00
R$ 100,00
SOLUÇÃO FIXADORA MACS FACS FIX (MFF). 200ml
1
R$ 87,00
R$ 87,00
SORO FETAL BOVINO 500ML INVITROGEN
1
R$ 207,34
R$ 207,34
R$ 7,50
R$ 300,00
R$ 69,30
R$ 485,10
R$ 23,30
R$ 233,00
TELA DE AÇO TIPO STAINLESS STEEL GAUZE. MALHA
40
DE 0,11MM
TUBO DE POLIETILENO DE 25ML ESTÉRIL PARA
CULTURA CELULAR COM TAMPA (COM AO MENOS 2
7
ESTÁGIOS DE FECHAMENTO). Embalagem com 30U
TUBOS DE POLIPROPILENO PARA CENTRÍFUGA TIPO
FALCON DE 25 ML COM TAMPA, ESTÉRIL. PCT COM 40 10
U
XILENO - 1 L
3
R$ 30,00
R$ 90,00
XILOCAÍNA GELÉIA 2%
30
R$ 21,00
R$ 630,00
R$ 29.616,00
R$ 8.858,00
R$ 11.138,93
R$ 49.612,93
103
7.4 Equipe Científica
FORMAÇÃO
(TITULAÇÃO)
INSTITUIÇÃO DE
TRABALHO
ATIVIDADES NO
PLANO DE DISSERTAÇÃO
Médica-Aluna de
doutorado
UFAM
Coleta, citometria, tratamento dos
dados, bibliografia, redação final.
Enfermeiro-Alundo de
Mestrado
HEMOAM
Rosilene Viana de Andrade
Médico-Mestre
FMT-HVD
Laudos histopatológicos
José de Araújo
Médico-Mestre
FMTAM
Laudos histopatológicos
Farmacêutico-Mestre
HEMOAM
Bióloga
FAPEAM
Aquisição e análise dos dados
Acadêmica de
Biomedicina
HEMOAM
Auxiliar de citometria de fluxo
Bióloga- Doutor
HEMOAM
Co-orientação
Médico-Doutor
UFAM
Orientação
NOME
Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro
Guimarães
2
Allysson Guimarães da Costa
João Paulo Diniz Pimentel
Paula Emmanuele Hargraves Vasco
6
Josilene da Silva Abranches
Adriana Malheiro
Luiz Carlos de Lima Ferreira
citometria, CBA, tratamento dos dados
e redação final.
Aquisicão e nálise das amostras de
citometria
104
7.5 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisas (CEP)
105
7.6 Certificado de edição na língua inglesa referente ao artigo 4.1
106
7.7 Artigo suplementar - IHQ CD1a e DCSIGN
Morphometric analysis of dendritic cells from anal mucosa of HIV-positive patients
and the relation to intraepithelial lesions and cancer seen at a tertiary health
institution in Brazil1
Análise morfométrica das células dendríticas da mucosa anal de pacientes HIV- positivos
e relação com as lesões intraepiteliais e o câncer numa instituição de saúde terciária no
Brasil
MD Adriana Gonçalves Daumas Pinheiro GuimarãesI,; MD Roberto Moreira da Silva JuniorII; PhD Oscar Tadeu
Ferreira da CostaIII, MD Ivan Tramujas da Costa e SilvaIV ; MD Felicidad Santos GimenezV; MD José Ribamar de
AraujoVI,1; MD Rosilene Viana de AndradeVI; Erico Jander da Silva Lopes VII; Jacqueline Pereira PinheiroVIII; MD
Junia Raquel D. FerreiraIX; PhD Adriana MalheiroX. PhD Luiz Carlos de Lima FerreiraXI
I
Research performed at the Outpatient Clinic of Coloproctology and the Division of Pathology of the Tropical
Medicine Foundation Dr Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus-AM, Brazil. Part of a master’s dissertation in
Tropical Pathology of the Post-Graduation Program of the Federal University of Amazonas (UFAM). Tutor: Luiz
Carlos de Lima Ferreira.
1
MD, Fellow PhD degree, Post-Graduation Program of FMT-HVD and State University of Amazonas (UEA).
Associate Professor of Surgery, Federal University of Amazonas, Manaus-AM, Brazil. Contribution: main author;
study concept and design; acquisition of data; analysis and interpretation of data; drafting of the manuscript; critical
revision of the manuscript for important intellectual content; study supervision; technical support.
II
Master in Biology; Fellow PhD degree, Post-Graduation Program of National Institute of Amazonian Research(
INPA). Participated in immunohistochemical method; technical support.
III
PhD. Associate Professor, Institute of Biological Sciences, UFAM; Participated in study concept and design;
analysis and interpretation of morphometric data.
IV
MD, PhD. Associate Professor of Surgery, UFAM, Manaus-AM, Brazil. Participated in acquisition of data;
technical support.
V
MD, Master, Volunteer Faculty, Department of Surgery, UFAM, Manaus-AM, Brazil. Participated in acquisition of
data; technical support.
VI
MD, Master, Division of Pathology, FMT-HVD. 1Assistant Professor of Pathology, UEA, Manaus-AM, Brazil.
Participated in study concept and design; acquisition of data; critical revision of the manuscript for important
intellectual content; technical support.
VII
Volunteer Faculty, Department of Statistics, UFAM, Manaus-AM, Brazil. Participated in study concept and design;
analysis and interpretation of data; statistical analysis.
VIII
Volunteer biomedical, FMT-HVD, Manaus-AM, Brazil. Participated in review and acquisition of data; technical
support.
IX
Master, Assistant Professor of pharmacy, Federal University of Amazonas (UFAM), Manaus-AM, Brazil.
Participated in molecular biology method; analysis and interpretation of data.
X
MD, PhD, Associate Professor, UFAM; Foundation of Hematology of the Amazon, ManausAM, Brazil. Co-Tutor. Study concept and design; critical revision of the manuscript for important intellectual content;
study supervision; technical support.
XI
MD, PhD, Department of Research and Division of Pathology, FMT-HVD. Associate Professor of Pathology,
UFAM, Manaus-AM, Brazil. Tutor. Study concept and design; critical revision of the manuscript for important
intellectual content; obtained funding; study supervision; technical support
____________________________________________________________________________________________
ABSTRACT
Objectives: To morphometrically quantify CD1a+ dentritic cells and DC-SIGN+ dendritic cells
in HIV-positive patients with anal squamous intraepithelial neoplasia and to evaluate the effects
of HIV infection, antiretroviral therapy and HPV infection on epithelial and subepithelial
dendritic cells. Design: A prospective study was performed to morphometrically analyze the relative volume
of the dendritic cells and the relationship between anal intraepithelial neoplasia and cancer in HIV-positive
patients from the Tropical Medicine Foundation of Amazonas, Brazil. Methods: All patients were
submitted to biopsies of anorectal mucosa to perform a classic histopathological and immunohistochemical
analysis, employing antibodies against CD1a and DC-SIGN for the morphometric quantification of dendritic
cells. Results: HIV-negative patients displayed a CD1a DC density significantly higher than that
of HIV-positives patients (3.75 versus 2.54) (p=0.018), and in patients with severe anal
107
intraepithelial neoplasia had correlated between DC CD1a density with levels of CD4 + cells (p:
0.04) as well as the viral load of HIV-1 (p: 0.035). A not significant rise in the median density of
CD1a+ DC was observed in the HIV positive/ HAART positive subgroup compared to the HIV
positive/ HAART negative subgroup. The CD1a+ DC were also significantly increased in HIVnegative patients with anorectal condyloma (2.33 to 3.53; p=0.05), with an opposite effect in
HIV-positive patients. Conclusions: Our data support an enhancement of the synergistic action
caused by HIV-HPV co-infection on the anal epithelium, weakening the DC for its major role in
immune surveillance. Notoriously in patients with severe anal intraepithelial neoplasia, the
density of CD1a+ epithelial dendritic cells was influenced by the viral load of HIV-1. Our study
describes for the first time the density of subepithelial DC-SIGN+ dendritic cells in patients with
anal severe anal intraepithelial neoplasia and points to the possibility that a specific therapy for
HIV induces the recovery of the density of epithelial DC.
Key words: Dendritic cells, HIV, Highly active antiretroviral therapy. Anal dysplasia, anal
intraephitelial neoplasm. Anus neoplasms.
_____________________________________________________________________
RESUMO
Objetivos: Quantificar morfometricamente as células dendríticas DC CD1a+ e DC DC-SIGN+
em pacientes HIV positivos portadores de neoplasia escamosa intraepithelial anal e avaliar os
efeitos da infecção pelo HIV, da terapia antirretroviral e da infecção pelo HPV sobre as células
dendríticas epiteliais e subepiteliais. Design: Um estudo prospectivo foi realizado para analisar
morfometricamente o volume relativo das células dendríticas e as relações entre neoplasia
intraepitelial anal e o câncer em pacientes HIV positivos da Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas, Brasil. Métodos: Todos os pacientes foram submetidos a biópsia da mucosa retal para
realizar uma análise clássica histopatológica e imunohistoquímica utilizando anticorpos contra
anti-CD1a e anti-DC-SIGN, para a quantificação morfométrica das células dendríticas.
Resultados: Os pacientes HIV negativos apresentaram densidade das DC CD1a+
significativamente maior do que a dos pacientes HIV positivos (3.75 versus 2.54) (p:0.018), e os
pacientes com grave apresentaram correlação das DC CD1a com os níveis de células T
CD4(p:0.04) assim como a carga viral do HIV-1 (p:0.035). Observamos no subgrupo HIVpositivo/ HAART positivo elevação não significativa na mediana da densidade das DC CD1a+
em relação ao grupo HIV-positivo/HAART negativo. As DC CD1a+ também se elevaram nos
pacientes HIV negativo portadores de condiloma anorretal (2.33 para 3.53; p:0.05), com efeito
inverso nos pacientes HIV positivos. Conclusões: Nossos dados confirmam a potencialização da
ação sinérgica representada pela coinfecção HIV-HPV sobre o epitélio anal, fragilizando as DC
em sua função primordial de vigilância imune. Notoriamente nos pacientes com neoplasia
intraepithelial anal grave, a densidade das DC CD1a+ epiteliais sofreu influência da carga viral do
HIV-1. Nosso estudo descreveu pela primeira vez a densidade das DC subepiteliais DC-SIGN+
em pacientes com neoplasia intraepithelial anal grave e apontamos para a possibilidade de que a
terapia específica para o HIV induza a recuperação da densidade das DC epiteliais.
Palavras-chave: Células dendríticas, HIV, Terapia antiretroviral de alta potência, Displasia anal,
Neoplasia intraepitelial anal, Neoplasias de ânus.
___________________________________________________________________________
Introduction
Anal cancer is a rare pathology among the population in general. The incidence of this cancer has
been increasing in the last few decades and has risen by thirty times in patients who are practitioners
of receptive anal sex; with incidence of 70/100,000 in HIV positive (+) men who have sex with men
(MSM)1,2.
Among the factors causing anal cancer in immunodeficient patients is a compromised cell
immunity, particularly to the dendritic cells (DC)3,4 These cells are strategically located at the
108
interaction sites between the individual and the environment; because of their characteristic function
of capturing and presenting antigens to the CD4+ T cells (i.e., to trigger the specific immune
response), DC carry viral particles to the lymphatic stations, favoring CD4+ T cells infection and the
deregulation of the immune system by the virus5.
The infection of DC by HIV seems to hinder the capacity of the DC to stimulate T cells due to
the inhibition of cytokine secretion (chiefly IL-12), loss of maturation capacity (through a decrease in
the expression of a co-stimulating molecule) and MHC deficiency, which delays the immune
response5,6. In high degree anal intraepithelial neoplasia (AIN), patients have a decrease in the
inflammatory response, TH1 type, characterized by a decrease in IL-2, IFN-γ and TNF-α7.
The mechanism by which anal cancer is established has not yet been elucidated, but HPVHIV interactions and the performance of dendritic cells in immune surveillance are known to be
crucial in the development of this cancer.
We therefore conducted a comparative study of the density of dendritic cells in HIV-positive
patients with anal squamous intraepithelial neoplasia with or without HPV infection. The anal
samples were analyzed by histopathology and immunohistochemistry to perform morphometric
analysis of the density of CD1a+ DC and DC-SIGN+ DC in the anorectal epithelium. Statistical
analysis was used to evaluate the effects of HIV infection, antiretroviral therapy and HPV infection
on DC in different groups.
Methods
Study and Patients
A nonparametric prospective observational analytic study was performed to assess the relationship
between dendritic cells and AIN or anal mucosa cancer of patients at the main institution for the
treatment of HIV/AIDS in the Amazon region, Tropical Medicine Foundation Dr Heitor Vieira
Dourado (FMT-HVD), Brazil. The participants were divided into two groups: 1) the case group
(n=59), which was comprised of HIV-positive patients of both sexes whom were under specialized
medical monitoring in the institution and 2) the control group (n=55), which was comprised of HIVnegative patients referred to the service due to proctologic complaints.
All of the patients were given information regarding the objectives of the project as well as the
benefits and risks of the research. Those who agreed to participate were asked to sign a consent form.
This study was initiated only following approval by the FMT-HVD ethical research committee
(n:3137105).
Statistical analysis
To assess the association between the categorical variables, the HIV result and the AIN
occurrence, a Pearson chi-square statistical test and Fisher exact test were used for 2x2 tables, as
109
indicated. The variance analysis test was used in the comparison of the averages, and when the normality
hypothesis was not accepted; the Kruskal-Wallis test was used, depending on the number of
comparisons9, 10. Epi-Info 3.3.2 software was used in the analysis, and the level of significance used
in the tests was 0.05.
Definition of groups based to the classification of the Center for Disease Control (CDC)
Control patients- patients who were negative for HIV, as determined by performing immunoassayELISA and indirect immunofluorescence test; HIV-positive patients without AIDS- defined as
patients with a serologic diagnosis of HIV, but whom did not show any of the defining illnesses
suggestive of AIDS or have a CD4+ T cells count greater than 201 mm3 (i.e., classified as A1, B1,
A2 or B2); and AIDS patients-patients who displayed one or more aids defining illness with CD4+
T counts below 200 and/or were being treated with HAART.
We analyzed the antiretroviral drugs taken by patients with AIDS and noted the large number
of drug combinations. For the purposes of analysis, the most frequent associations were studied as
outcome variables. ZDV or AZT: zidovudine, 3TC: Lamivudine, EFV: Efavirenz, NVP: Nevirapine,
TDF: Tenofovir, LOP/R or LPV/R: Lopinavir / Ritonavir.
Anal examination
All of the patients were submitted to high resolution anoscopy. The digital rectal examination
was performed and was followed by an inspection of the mucosa with the use of a 16 to 40 times
magnification optical colposcope after gauze soaked in 3% acetic acid was introduced for two
minutes. The anoscope was reintroduced for the performance of the anal canal and rectum
examination under image magnification. The findings were registered and the predominant
acetowhite areas were biopsied.
Histological Analysis
The samples were submitted to a pre-fixation with zinc (IHC Zinc fixative, ref 550523, BD
Pharmingen®) and prepared for histological analysis, followed by processing for inclusion in paraffin
blocks. Histological sections of 4 µm were stained with Hematoxylin-Eosin and examined under a
light microscope11.
The purpose of the histological exam was to assess the presence of AIN I, AIN II/III, squamous cell carcinoma,
adenocarcinoma and inflammatory diseases 12, 13.
HPV typing
Genotyping of HPV present in the samples of the anal canal was performed using a nested PCR
technique. Amplification of HPV-specific DNA was first performed using the consensus primer
MY09/MY11 and was sequentially performed from the amplicons of positive reactions using a mix
110
containing the consensus primer GP5/GP6. DNA sequencing of amplicons from positive reactions was
performed with 5 µL of primer MY09 or MY11 or GP5 or GP6 mixed with 4 µL of premix DYEnamic
ET Terminator Kit (Amersham Bio- sciences, Piscataway, New Jersey). The product of this reaction was
sequenced by electrophoresis, aligned (CLUSTAL W; Bio- Edit, Carlsbad. California) and the nucleotide
sequences were compared to the GenBank sequences by the BLAST program. A known sequenced HPVpositive sample served as a positive control and water as a negative control.
Immunohistochemical Analysis
The anti-CD1a (IgG1, κ, MTB1, ref. 235-L-CE, Novocastra®) and the anti-DC-SIGN (CD209, mouse IgG2b, κ, ref. 551249, BD Pharmingen®) primary antibodies (diluted in PBS in the
validated proportions of 1:30 and 1:50, respectively) were used on distinct slides from the same
patient and incubated overnight in a humidified chamber at 4oC. The sections were incubated with
the ready-to-use biotinylated secondary antibody (Novocastra®, ref. 103) or a biotinylated goat antimouse polyclonal Ig (ref. 550337, BD Pharmingen®) at a 1:150 dilution for 60 minutes, followed by
application of streptavidin (Novocastra®, ref 104) for 30 minutes. Diaminobenzidine (DAB) 60%
was used to reveal the stages the light shelter. The specificity of the immunoreaction was
investigated by omitting the primary antibody.
Determination of the volume density (Vv) of the dendritic cells
The volume density, or relative volume, of the dendritic cells was determined using Delesse’s
Principle, which estimates the volume fraction of a phase of interest (dendritic cells) within a
reference volume (epithelial or subepithelial region) of an anal biopsy (Howard and Reed, 1998)14. A
test system (point grid) that combines two sets of points of different densities in the same grid was
used for this propose. The fine points (crosses and circled crosses) were used for counting the CD1a+
DC and DC-SIGN+ DC cells, while the coarse points (circled crosses only) were used for counting
the reference space (epithelial and subepithelial regions of the biopsy)14.
The cellular points which touched the test system, fine points hitting dendritic cells, were quantified
as having a maximum of 7 consecutive fields and a minimum of 4 fields when 200 cells of interest
were counted14 at an optical magnification of 100 x (Figures 1 and 2). To avoid confusion with the
melanocytes of the basal layer, the marked cells in this region were computed separately.
Results
The study included 114 patients; 59 patients were male and 51.7% were seropositive for HIV.
The characteristics of the group and the main behavioral factors implicated in anal carcinogenesis
111
were analyzed. The mean age was 38.3 years (range of 14-78) and 77.5% (31/40) of patients said that
they were HIV-positive homosexual / bisexual men (OR=0.18; p <0.001). Among these patients
81.8% reported having had more than 10 partners in the last 5 years (p <0.001).
Analysis of co-infection with HIV-HPV
PCR was performed to genotype for HPV in 91 samples, and no significant difference
between the HIV-positive and -negative group was shown (p=0.09; n=47). The most prevalent type
was HPV type 6, which was detected in 18 patients; 10 of these patients had AIN I and 2 had AIN
II/ III. We identified the highly oncogenic HPV serotypes 53, 58 and 16; the latter serotype was
detected in five patients, among whom four were HIV + / HAART + and three had AIN. Many
other less prevalent HPV types were found, including the serotypes 11 (n=4), 70 (n=4), 61 (n=3), 58
(n=3) and 33 (n=3). Types 31, 66, 85, 82, 71, 18 and 72 were each found in only one sample.
The analysis of anal intraepithelial neoplasia revealed a high rate of severe AIN in HIVpositive patients
The histopathological analysis of both groups indicated that 49/114 patients had AIN; of these
patients with AIN, 71.9% showed AIN I and 22% showed AIN II/III. Fifty-nine (51.8%)
examinations were normal. HIV-positive patients are admittedly more susceptible to anal cancer and
its precursor lesion (AIN), but this study showed no difference in the prevalence of AIN among
HIV-positive and HIV-negative individuals. AIN was present in 40% of HIV-negative cases
(22/55), with 77.2% and 22.7% AIN I and AIN II/III, respectively. In the 53.8% (28/53) of cases
representing the HIV-positive group with AIN, 71.4% (20/28) showed low AIN and 28.6% (8/28)
showed severe AIN (p=0.09). The prevalence of AIN differed significantly in relation to the
practice of receptive anal sex (p <0.006) and the occurrence of STDs (p <0.001). Only one case of
anal squamous cell carcinoma was described in an HIV-negative elderly woman.
Influence of antiretroviral therapy on CD4+ T cells
The average duration of HAART was 25 months (range 2-103 months) in this study. No
difference was observed in the incidence rates of HPV and AIN when comparing groups with a
treatment time of 18 months, 19-36 months and more than 37 months. A comparison of the CD4+ T
levels demonstrated a significant difference, pointing to the efficacy of prolonged treatment (p=
0.001, data not shown). The AZT + 3TC + EFV/NVP treatment regimen was used by 18 patients
and 4T3C + DDI + NVP/RTV was used by 14 patients. Patients who received the first drug
combination had a median CD4 + T cell count that was 50% lower than those using TDF +3 TC +
LOP / R (p= 0.041) (data not shown).
The mean CD4+ T count was 369.6 x 106 cells/liter (l) in HIV-positive patients and the viral
load of HIV-1 was 40,152 copies/mm (n=41). No difference was present in the time of use of
112
HAART or the occurrence of AIN in patients on HAART (p=0.08, p= 0.52); only the log of viral
load of HIV-1 levels and CD4+ T cells were different (p=0.012, r=-0.40, n=38; data not shown).
Analysis of CD1a+ dendritic cells and DC-SIGN+DC anorectal mucosa
We analyzed the CD1a+ and DC-SIGN+ dendritic cells of anorectal mucosa. The analyses of
the division and the sum of the median density of these cells constituted the main objectives of this
study. Analysis of CD1a+ DC showed a median density of 2.91 in the HIV-negative without AIN
samples (n=33) (the control group), 1.74 in the HIV+/HAART- subgroup (n=6) and 2.54 in the
HIV+/ HAART+ subgroup (n=51) (p=0.371).
The study of the distribution of DC-SIGN in DC anal or rectal mucosa has previously been
performed by other authors15,16,17. In our study, differences between the median DC-SIGN+ DC
(p=0.481), sum of the cells (CD1a+ DC plus DC-SIGN+ DC) (p=0.605) and the cell ratio (CD1a+
DC/DC-SIGN+ DC) (p=0.605) among HIV-positive and negative groups were not significant.
However, among those with severe AIN (n= 8), only one patient had a DC-SIGN+ DC density
below 3.0, which was the opposite of the result in patients with AIN I. These data demonstrate the
relationship between the accumulation of DC-SIGN+ DC and the occurrence of severe AIN.
Several factors influenced the density of DC
Significant analyses involving dendritic cells are briefly shown in Table 1, in which there is
variability in the median CD1a+ DC in relation to the occurrence of STD and HIV status in patients
with condyloma (p= 0.005 and p= 0.04, respectively). Patients with a median of CD1a + DC above
the average of the control patients showed a variation in the CD4+ T cells greater than 50%. The
CD4+ T cells negatively correlated with the DC-SIGN DC in patients on HAART+ (p= 0.018) and
in HIV+ patients with severe AIN. The median of CD1a+ DC (p= 0.035) too was significantly
correlated with the viral load of HIV-1 (p= 0.035).
Partial recovery of CD1a + DC and DC-SIGN + DC in patients on HAART
The analysis of the relationship between DC and the degrees of severity of AIN indicated that in the
group with severe AIN (n=8), a strong negative correlation (r=-0.74; p=0.035) was observed
between the density of CD1a + DC and CD4+ T cells (FIGURE 4).
In the HIV+/HAART+ subgroup, an increase in the median density of DC subsets in relation
to the HIV+/HAART- subgroup was observed, which, although not significant, can be seen in the
main variables (Table 2).
113
Elevation of the density of CD1a+ DC in HIV-negative patients with condyloma and the
opposite effect in co-infected patients
The impact of STDs in DC of the anal mucosa was confirmed in patients with HIV-STD.
Variations in the density of CD1a+ DC of 2.33 (n=53) to 3.53 (n=50) (p=0.05) in CD1a+/DC-SIGN+
DC (p=0.03) were observed among patients infected by HPV in the groups of HIV-positive and negative patients with anal or perianal warts. In HIV-HPV co-infected patients, we found clear
effects on the density of CD1a+ DC compared to HIV-negative patients with condyloma (Table 3).
Discussion
In this study of 114 patients, the variation in the density of dendritic cells in patients with AIN
was examined. We found that the incidence of STD was significantly concentrated in the HIV + /
HAART + subgroup. No significant difference in the prevalence of HPV was present between the
HIV-positive and HIV-negative groups (p= 0.09), probably due to the practice of anal intercourse by
HIV-negative gay men (MSM) in this study, which is discordant with studies by Palefsky et al.
(1998)18. However, Roka et al. (2008)19 have described a high prevalence of HPV DNA of low
(58.6%) and high oncogenic potential (51.4%) in samples from MSM regardless of HIV status.
In 2003, Palefsky and Holly described HPV-induced genomic instability as essential for the
progression of AIN to cancer in HIV patients20. In our study, the prevalence of AIN in HIV-positive
patients (53.8%) was slightly higher than in the studies by Abramowitz et al. (2007)21, Gimenez et al.
(2005)22 and less than 81% among HIV-positive MSM described by Palefsky et al. (2002)23 and
Manzione el al. (2003)24. The authors are unanimous in asserting the importance of the presence of
HIV infection in the occurrence of AIN18, 3, 4, 21. In our study, the difference in the rates of AIN in
HIV-positive and HIV-negative patients was not significant, this can be attributed to the presence of
HIV-negative patients adherents of the practice of receptive anal intercourse, since the prevalence of
AIN in this study was different in these patients (p <0.006) and patients with sexually transmitted
diseases (p <0.001). Regarding severe AIN, our prevalence (28.6%) was similar to studies by
Manzione et al. (2003)24 (30%) and was greater than that reported by others 23, 4, 22, including a study
at the same institution with a reported 7.1% II/III AIN and 35.7% I AIN.
The relationship between the occurrence of AIN and peripheral levels of CD4+ T cells has
been described by Palefsky et al. (1998)18 in pre-HAART patients and more recently20, we have
found a strong negative correlation (r= -0.74) between the density of CD1a+ DC and the number of T
CD4+ cells in patients with severe AIN. Sobhani et al. (2002)3 and Abramowitz et al. (2007)21 have
described the association of low levels count of CD4+ T cells only with the occurrence of
condyloma. Yaghoobi et al. (2010)25 have observed a higher risk of recurrence of anal cancer and
AIN III in patients with low CD4+ T cells, but they suggested that the levels of peripheral CD4+ T
cells are not an adequate tool for predicting cancer associated with HPV.
114
The mean peripheral HIV-1 viral load of our patients was high but was close to that described
by Abramowitz et al. (2007)21. In patients with severe AIN, viral load had a negative influence on the
median CD1a+ DC, which has been described by Sobhany et al.4, showing the pressure of viral
association with cellular immunity in these patients. However, Palefsky and Holly (2003)20 have
reported the occurrence of AIN and cervical intraephitelial neoplasm (CIN) in these patients as more
closely related to the levels of CD4+ T cells than to the HIV viral load.
Upon measuring the density of dendritic cells, we observed a decrease in the median CD1a+
DC from the HIV-positive group. These data are in agreement with data from Nadal et al.26, which
reported an odds ratio (OR) of 6 for the presence of HIV as a factor for the reduction of CD1a+ DC.
In 1997, Steinbrink et al.27 described, in HIV-positive patients, the immune changes with decreased
migration of dendritic cells for activation of the immune dysfunction of cellular maturation, where,
according to Blauvelt et al. (2000)28, HIV would subvert the primary function of Langerhan cells.
Yaghoobi et al. (2010)25 have shown an increased occurrence of III AIN and anal cancer that is
associated with decreased tissue presence of CD1a+ Langerhan cells and CD3 T lymphocytes and
increased expression of FoxP3, IL-23 and IL-8; these changes allow a regulatory T response that
facilitates tumor outcome.
In HIV-negative patients with condyloma, an increase in the median CD1a+ DC and CD1a+
DC/ DC-SIGN+ DC was observed, which differs from the HIV-positive group with condyloma
(which showed a decrease in these cells). These findings are corroborated by Uchimura (2004)29,
who have described a similar effect on S100+ DC in patients with squamous neoplasia, severe AIN
and immunosuppressive therapy, and by Sobhani et al.3,4 in the HIV-positive group, revealing a
potentiation of the effects on the anal epithelium.
Here, we describe for the first time the density of subepithelial DC-SIGN+ DC in patients with
AIN and the relationship between the accumulation of DC-SIGN+ DC and the occurrence of severe
AIN. According to Gurney et al. (2005)15, in patients with viral and tumor diseases related to AIDS,
the increase in DC-SIGN associated with the blockade of CD83 and CD86 co-stimulatory molecules
is related to a regulatory DC response that is mediated by IL-10; these responses facilitate the spread
of disease in these patients.
In the analysis of HIV-positive patients, we observed no significant persistent increase in the
median CD1a+ DC, DC-SIGN+ DC or CD1a+ DC + DC-SIGN+ DC in patients on HAART
compared to the control group (despite recognizing that the significance of this finding may have
been affected by the small number of HIV+ HAART- patients). Although previous studies have
pointed to the not restructuring of cellular immune response to HPV in patients on antiretroviralspecific therapy20 (i.e., identifying these changes as additional risk factors for the development of
severe AIN and anal cancer21), this study suggests that these patients could be recover the density of
skin anal DC, especially of CD1a+ DC. Recent studies have reported similar rates of survival among
patients on HAART and HIV-negative patients with anal cancer30, a pointing that change in patients'
prognosis for some diseases associated with HIV31 would be encouraged by the reduction of pro-
115
inflammatory cytokines induced by HAART32 and translated by a favorable response and tolerance
to chemotherapy30. Therefore, we hypothesize that HAART could allow the CD1a+ DC in the anal
mucosa to recover. However, in a scenario in which the cellular maturation is ineffective, the
formation of DC regulators15 and high survival afforded by HAART33 could further substantiate the
high incidence of anal cancer in these patients, but with a better prognosis30,31.
In this study, the elevation in the density of CD1a+ DC and DC-SIGN+ DC reflects the
disparate role of these cells in relation to protection and vulnerability of the body to infections and
tumors. Nagorsen et al.34 have shown that S100+ DC infiltrate colorectal cancer, with a positive
correlation between regulatory T cells and better survival. However, studies by Witte et al.35 have
demonstrated that DC-SIGN+ DC are associated with the facilitation of HIV infection in the body,
while the langerin+ DC are effective in killing the virus, showing disparate functions performed by
strategically positioned mucosal DC.
Conclusions
In this study, we confirmed the synergistic action between the HIV and HPV viruses on anal
epithelium in weakening the major role of DC in immune surveillance. Furthermore, we
demonstrated the immunosuppressive effect of HIV-1 viral load on epithelial DC, particularly in
patients with severe AIN.
References
1. Piketty C, Selinger-Leneman H, Grabar S, Dudivier C, Bonmarchandf M, Abramowitz L,
Costagliolab D, Mary-Krause M. Marked increase in the incidence of invasive anal cancer among HIVinfected patients despite treatment with combination antirretroviral therapy. AIDS. 2008;22:1203–11.
2. Chaturvedi AK, Madeleine MM, Biggar RJ, Engels EA. Risk of human papillomavirus-associated
cancers among persons with AIDS. J Natl Cancer Inst. 2009;101:1120–30.
3. Sobhani I, Walzer F, Aparicio T, Abramowitz L, Henin D, Cremieux AC, Soule JC. Effect of anal
epidermoid cancer-related viruses on the dendritic (Langerhans’) cells of the human anal mucosa. Clin
Cancer Res. 2002;8:2862-9.
4. Sobhani I, Walzer F, Roudot-Thoraval F, Abramowitz L, Johanet H, Hénin D, Delchier J, Soule JC.
Anal Carcinoma: incidence and effect of cumulative infeccions. AIDS. 2004;18:1561-9.
5. Pachiadakis L, Pollara G, Chain BM, Naumov N. Is hepatitis c virus infection of dendritics cells a
mechanism facilitating viral persistence? Lancet. 2005;5:296-304.
7. Wu L, Kewalramani VN. Dendritic-cell interactions with HIV: infection and viral dissemination.
Nature Reviews. 2006; 6:859-68.
8. Macatonia SE, Lau R, Patterson S, Pinching AJ, Knight SC. Dentritic cells infection, depletion and
dysfunction in HIV-infect individuals. Immunology.1990; 71: 38-45.
9. Vieira S. Bioestatística, tópicos avançados. 2.ed. Rio de Janeiro: Elservier; 2004.
10. Berquó ES, Souza JMP, Gotlieb SLD. Bioestatística. São Paulo: EPU, 1981.
11. Behmer AO, Tolosa EMCN, Neto AGF. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. São
Paulo: EDART, 1976.
14. Howard CV, Reed MG. Unbiased stereology: Three-dimensional measurements in microscopy. New
York: Springer Verlag & Bios Scientific Publishers; 1998.
116
15. Gurney KB, Elliott J, Nassanian H, Song C, Soilleux E, Mcgowan I, Anton PA, Lee B. Binding and
Transfer of Human Immunodeficiency Virus by DC-SIGNჼCells in Human Rectal Mucosa. Journal of
Virology. 2005; 79(9):5762-73.
16. Jameson B, Baribaud F, Pöhlmann S, Ghavimi D, Mortari F, Doms RW, Iwasaki A. Expression of
DC-SIGN by dendritic cells of intestinal and genital mucosae in humans and Rhesus macaques
Journal of virology. 2002;76(4):1866–75.
17. Geijtenbeek TBH, Kwon DS, Torensma R, Vliet SJV, Van Duijnhoven GCF, Middel J, Cornelissen
ILMHA, Nottet HSLM, KewalRamani VN, Littman DR, Figdor CG, Van Kooyk Y. DC-SIGN, a
dendritic cell–specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 2000;
100(3):587–97.
18. Palefsky JM, Holly EA, Ralston ML, Jay N. Prevalence and Risk Factors for Human Papillomavirus
Infection of the anal canal in Human Immunodeficiency Virus (HIV)-Positive and HIV-Negative
Homosexual Men. J Infect Dis.1998;177:361-7.
19. Roka F, Roka J, Trost A, Schalk H, Zagler C, Kirnbauer R, Salat A. Anal Human Papillomavirus
Testing with Digene’s Hybrid Capture 2 Using Two Different Sampling Methods. ASCRS. Dis Colon
Rectum. 2008;51:62-6.
20. Palefsky JM, Holly EA. Immunosupression and co-infection with HIV. J Nat Cancer Inst Monogr,
2003; 31: 41-46.
21. Abramowitz L, Benabderrahmane D Ravaud P, Walker F, Rioux C, Jestin C, Bouvet E, Soulé JC,
Leport C, Duval X. Anal squamous intraepithelial lesions and condyloma in HIV-infected heterosexual
men, homosexual men and women: prevalence and associated factors. AIDS. 2007; 21:1457-65.
22. Gimenez FS, Costa e Silva IT, Daumas APG, Ferreira LCL, Araújo JR, Talhari S. Prevalência de
lesões precursoras do câncer anal em indivíduos HIV positivos atendidos na Fundação de Medicina
Tropical do Estado do Amazonas. In: PBIC-CNPQ, 2005. Apresentação oral. Manaus: Universidade
Federal do Amazonas; 2005.
23. Palefsky JM, Goldstone SE, Neefe J. HspE7 treatment of high-grade anal dysplasia: final results of
an open-label trial and interim long-term follow-up. In: 20th International papillomavirus conference;
2002; Oct., 4-9; Paris, France.
24. Manzione CR, Nadal SR, Calore EE. Postoperative follow-up of anal condyloma acuminata in HIVpositive patients. Dis Colon Rectum, 2003; 46:1358-65.
25. Yaghoobi M, Gouvello S, Aloulou N, Duprez-Dutreuil C, Walker F, Sobhani I. FoxP3
overexpression and CD1a+ and CD3+ depletion in anal tissue as possible mechanisms for increased risk
of human papillomavirus-related anal carcinoma in HIV infection. Accepted article in colorectal disease
doi: 10.1111/j.1463-1318.2010.02283.x.
26. Nadal RS, Calore EE, Cruz SHA, Horta SHC, Manzione CR, BIN FC. Comparação das contagens
das células de Langerhans de tecidos contendo carcinoma anal em doentes com e sem infecção pelo
HIV. Rev Bras Coloproct.2006;26:269-74.
27. Steinbrink K, Jonuleit H, Müller G, Schuler G, Knop J, Enk AH. Interleukin-10-treated human
dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific anergy in CD8 + T cells. Resulting in a failure to
lyse tumor cells. Blood.1999; 93:1634-42.
28. Blauvelt A, Glushakovaa S, Margolisa LB. HIV-infected human Langerhans cells transmit infection
to human lymphoid tissue ex vivo. AIDS. 2000; 14:647-51.
29. Uchimura NS, Ribalta JCL, Focchi J, Baracat EC, Uchimura TT. Fatores biocomportamentais e as
alterações no número das células de Langerhans. RBGO. 2004; 26:289-94.
30. Abramowitz L, Mathieu N, Roudot-Thoraval F, Lemarchand N, Bauer P, Hennequin C, Mitry E,
Romelaer C, Aparicio T, Sobhani I. Epidermoid anal cancer prognosis comparison among HIV+ and
HIV- patients. Aliment Pharmacol Ther. 2009;30:414–21.
31. Hessol NA, Pipkin S, Schwarcz S, Cress RD, Bacchetti P, Scheer S. The impact of highly active
antiretroviral therapy on non-AIDS-defining cancers among adults with AIDS. Am J Epidemiol. 2007;
165:1143–53.
32. Berretta M, Cinelli R, Martellotta F, Spina M, Vaccher E, Tirelli U. Therapeutic approaches to
AIDS-related malignancies. Oncogene. 2003; 22:6646–59.
33. Palefsky JM, Holly EA, Ralston ML, Da Costa M, Bonner H, Jay N, Berry JM, Darragh TM. Effect
of highly active antirretroviral therapy on the natural history of anal squamous intraepithelial lesions and
anal human papillomavirus infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 2001;28:422– 28.
34. Nagorsen D, Voigt S, Berg E, Stein H, Thiel E, Loddenkemper C. Tumor-infiltrating macrophages
and dendritic cells in human colorectal cancer: relation to local regulatory T cells, systemic T-cell
response against tumor-associated antigens and survival. Journal of Translational Medicine.
2007;5(62):1-8.
35. De Witte L, Nabatov A, Pion M, Fluitsma D, Jong MAWP, Gruijl T, Piguet V, Van Kooyk Y,
Geijtenbeek TBH. Langerin is a natural barrier to HIV-1 transmission by Langerhans cells. Nat. Med.
2007; 13(3):367-71.
117
Acknowledgments
The authors are grateful to Doctors Ianaçara Machado and Bruno Meireles, Biologist Paula
Emanuelle Hargreaves, Pharmaceutical Andreza Fernandes, Pathology Laboratory Technicians
Sandra Eline, Sandra Caranhas, Carlos Melqiade Marques, Nursing technician Elizabeth
Monteiro and to Administrative Technician Agustinho Monteiro for their expert technical
assistance.
118
___________________________________________________________________________
Conflict of interest: none
Financial source: costs absorbed by the Tropical Medicine Foundation of Amazonas
Responsible for the English version:
Shirley M. by America Journal Experts
Correspondence:
Tropical Medicine Foundation of Amazonas
Laboratory of Pathology
Av. Pedro Teixeira, 25. Manaus-AM- Brazil. CEP: 69000-000.
Fax: 0055 (92) 2127-3432
Email: [email protected]
119
TABLE 1: SIGNIFICANT FINDINGS INVOLVING DENDRITIC CELLS
GROUP/
DC (density)
Variable 1(n)
Variable 2(n)
p-value/n
Pat. HIV+ and HIV-:
CD1a+ DC (median)
HIV+= 2.54(51)
HIV-: 3.75(n=46)
0.018 (n=97)
Pat. HIV+ and HIV-:
CD1a+ DC (median)
No STD:
2.33 (n=53)
STD:
3.53 (n=50)
0.05(n=103)
Pat. with condyloma:
CD1a+ DC (median)
HIV5.3
HIV+
1.9
0.04
Pat. HIV+:
T CD4+(x106 cell/l)
CD1a+ DC <3.14:
498
CD1a+ DC >3.14
218
Pat. HIV+:
CD1a+ DC (median)
Viral load of HIV-1 < 30,000 viral copies/mm
Between 30,001 and 50,000
> 50,000
0.035
Pat. HIV+/AIN III:
CD1a+ DC (median)
T CD4+(x106 cell/l)
R= -0.74
0.035 (n=8)
(FIGURE 4)
0.02 (n=18)
Pat. HIV+/HAART+:
T CD4+(x106 cell/l)
0.018 (n=46)
DC-SIGN+ (median)
R=-0.28
Pat= patients; DC= dendritic cells; HAART= highly active antiretroviral therapy; CD1a= Cluster of
differentiation type 1a; DC-SIGN+ = dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 -grabbing
non-integrin.
120
TABLE 2- MEDIAN OF DENDRITIC CELLS IN THE STUDY OF SUBGROUPS
Groups
HIV-/Histo
Normal
HIV + /
HAART-
HIV+ /
HAART+
CD1a+ DC
Mean±SD
Median
N
3.11 ± 1721
2.91
9
1.81 ± 1.24
1.74
6
3.3 ± 2.78
2.54 ↑↑
DC-SIGN+ DC
Mean ± SD
Median
N
5.84 ± 1.4
5.78
10
4.7 ± 2.7
3.62
5
7.02 ± 4.72
6.41 ↑↑
49
0.495
CD1a+ DC/
DC-SIGN+ DC
Mean ± SD
Median
N
0.50 ± 0.22
0.52
8
0.51 ± 0.43
0.56
5
0.65 ± 0.59
0.49
48
0.939
CD1a+ DC+
DC-SIGN+ DC
Mean ± SD
7.61 ± 2.99
6.51 ± 3.35
10.63 ± 6.10
Median
7.54
5.55
10.09 ↑↑
N
45
5
48
51
P-value*
0.371
0.130
Kruskal-Wallis Test. SD= standard deviation; Histo = histopathology analysis; DC = dendritic cells; HAART = highly
active antiretroviral therapy; CD1a= cluster of differentiation type 1a; DC-SIGN = dendritic cell-specific intercellular
adhesion molecule-3-grabbing non-integrin.
121
TABLE 3- MEDIAN CD1a+ DENDRITIC CELLS IN RELATION TO THE
OCCURRENCE OF CONDYLOMA AND SEROLOGY FOR HIV
HIV/CONDYLOMA N
Mean
DP
Median
p-value
4.48
4.66
2.79
3.14
3.18
3.63
2.27
2.94
3.71
5.3
2.37
1.92
0.04
CD1a+ DC
HIV-/condHIV-/cond+
HIV+/condHIV+/cond+
35
10
36
18
N = number of subjects, SD= Standard Deviation; DC = dendritic cells, HIV = human immunodeficiency
virus; cond= condyloma; CD1a: Cluster of Differentiation type 1a.
122
FIGURE 1 - Immunohistochemical staining of a serial section of positive
skin control.
1= CD1a+ DC, 2= anal squamous epithelium, 3 = cells of lamina propria;
4 = Melanocyte or CD1a+ DC in basal layer; DC= dendritic cells;
Magnification= 100X.
123
FIGURE 2- Immunohistochemical staining of a serial section of rectum.
3= cells of lamina propria; 5= columnar epithelium; 6= rectal glands;
7= DC-SIGN+ DC ; DC= dendritic cells; Magnification=400 X.
124
6
5
CD1a
4
3
2
1
0
200
400
600
TCD4+
800
1000
1200
FIGURE 4- Correlation between CD1a+ DC and the levels of CD4+ T
(106 cells/l) in patients with AIN II/III. N= 8; l= liter; DC= dendritic
cells; CD1a: cluster of differentiation type1a.
125
7.8 Outras produções científicas ocorridas durante o doutoramento
126
127
128
Rev bras Coloproct
Janeiro/Março, 2008
Prevalência de Lesões Precursoras do Câncer Anal em Indivíduos HIV Positivos, Atendidos
na Fundaçào de Medicina Tropical do Amazonas, Experiência Inicial em Manaus
Felicidad Santos Gimenez e Cols.
Vol. 28
Nº 1
Prevalência de Lesões Precursoras do Câncer Anal em Indivíduos
HIV Positivos, Atendidos na Fundaçào de Medicina Tropical do
Amazonas, Experiência Inicial em Manaus
Prevalence of Precursory Lesions of Cancer in HIV positive, Individuals Assisted
at Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Initial Experience in Manaus
FELICIDAD SANTOS GIMENEZ1; IVAN TRAMUJAS DA COSTA E SILVA2; ADRIANA GONÇALVES DAUMAS
PINHEIRO GUIMARÃES3; LUIZ CARLOS DE LIMA FERREIRA4; JOSÉ DE RIBAMAR ARAÚJO5; RENATA PINA
ROCHA6; LARISSA DE SOUZA ATALA7; SABRINA VELOSO AVI8; SINÉSIO TALHARI9
1
Mestranda em Patologia Tropical pela Universidade Federal do Amazonas; 2 Prof. Assistente do Departamento de
Clínica Cirúrgica da Universidade Federal do Amazonas; 3 Profa. Auxiliar I do Departamento de Clínica Cirúrgica da
Universidade Federal do Amazonas; 4 Prof. do Departamento de Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal
do Amazonas; 5 Gerente de Anatomia Patológica da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas; 6 Acadêmica de
medicina da Universidade Federal do Amazonas; 7 Acadêmica de medicina da Universidade Federal do Amazonas; 8
Acadêmica de medicina da Universidade Federal do Amazonas; 9 Diretor Presidente da Fundação de Medicina Tropical
do Amazonas.
Rev bras Coloproct
Prevalência de Lesões Precursoras do Câncer Anal em Indivíduos HIV Positivos, Atendidos
Vol. 28
GIMENEZ FS; 2008
SILVA ITC;naGUIMARÃES
FERREIRA
LCL;
ARAÚJO
JR; ROCHA
RP;em
ATALA
LS; AVI SV; TALHARI S.Nº 1
Janeiro/Março,
Fundaçào de AGDP;
Medicina
Tropical do
Amazonas,
Experiência
Inicial
Manaus
Prevalência de Lesões Precursoras do Câncer Anal emFelicidad
Indivíduos
HIV Positivos,
na Fundaçào de Medicina Tropical do AmazoSantos
Gimenez eAtendidos
Cols.
nas, Experiência Inicial em Manaus. Rev bras Coloproct, 2008;28(1): 072-076.
imunossupressão
taxa deaproximadamente
linfócitos T CD4)¹,
No presente
trabalho,
são avaliados,
através
RESUMO: O câncer(menor
anal representa
2% dos cânceres colorretais.
Nos últimos
anos observa-se
o aumento
da da
apresentam-se
mais suscetíveis
aosEste
efeitos
infecAMI,
a associação
entre
a presença
de lesões
precurincidência nos indivíduos
HIV positivos.
estudoda
teve
como objetivo
avaliar
a prevalência
de lesões
intra-epiteliais
escamosas
ção
continuada
HPV, HIV+
estando
sob riscode77%
mai- Foramsoras
do câncer
anal e HIV+
do câncer
anal propriamente
anais
(ASIL) empelo
pacientes
procedentes
Manaus.
estudados
45 doentes
encontrando-se
no examedito
orhistopatológico,
do que a população
de evoluir
para
câncer
e o estado
imunodepressão
de pacientes
HIV+,
os seguintesgeral
resultados:
15(35,7%)
lesões
de baixo grau,
3(7,1%)de
lesões
de alto grau e 24(57,2%)
negativos
paracom
anal.
tiverem
hábitos
estes
paciende de
seASIL
estimar
ASIL em
ASIL.Se
Houve,
portanto,
alta anorreceptivos,
prevalência de ASIL,
42,8%.
Concluímosos
queobjetivos
a prevalência
entreaosprevalência
pacientes HIVde
positivos,
tes
terão esta
chance
aumentada
para
93% 12. a implantação
grupo
populacional
HIV positivo dee detecção
Manaus;precoce,
avaliar a
da amostra
estudada,
é muito
importante,
justificando-se
de um
programa de acompanhamento
O comportamento
câncer
anal é similar
ao
influência
imunodepressão
e dedo
hábitos
destas lesões;
pois os pacientes do
HIV+
representam
um importante
grupo
de riscodapara
o desenvolvimento
cânceranorreceptivos
anal.
do câncer de colo uterino por apresentarem muitas caem relação a chance de apresentação de ASIL, e veriracterísticas
em comum:
ambos
estão associados à inficar possíveis diferenças entre os gêneros e a chance
Descritores: Prevalência,
câncer
anal, HIV.
fecção crônica pelo vírus do papiloma humano (HPV);
destes, anorreceptivos ou não, apresentarem ASIL.
são precedidos por lesões precursoras não malignas, a
lesão escamosa intra-epitelial cervical (CSIL) e a lePACIENTES E MÉTODOS
INTRODUÇÃO
mente transmissíveis, tais como: gonorréia, sífilis, hersão escamosa intra-epitelial
anal (ASIL); demonstram
pes simples
tipo II, infecção
pelo HIV,
HPV, Chlamydia
predileção pela zona de transição celular de células
Trata-se
de um estudo
observacional,
transverescamosas
para glandulares;
e ambos
caracsal, em que4,5,6
foram
estudados
pacientes
distriA incidência
do câncer
anal napossuem
população
em
trachomatis
; portadores
de45
lesões
anais HIV+
crônicas
terísticas
biológicas comuns,
incluindo
os aspectos
buídos
em 4 grupos:
6 HIV+ não
anorreceptivos
e não
geral é relativamente
pouco freqüente,
representando
que
evoluam
com inflamação
(fístulas,
fissuras,
13
7
histopatológicos.
imunodeprimidos
(HIV+); 7 HIV+(transplantados)
anorreceptivos e8;não
apenas, aproximadamente 2% de todos os cânceres
hemorróidas)
; os imunodeprimidos
Diante desses aspectos, a mesma abordagem
imunodeprimidos
(HIV+AR); 4 HIV+ não
9
colorretais¹.
Contudo, observa-se o aumento da incitabagistas
e doentes portadores
de câncer anal relacidiagnóstica feita em relação às lesões precursoras do
anorreceptivos imunodeprimidos
(HIV+D); e 7 HIV+
10
dência
desse
tumor
em
alguns
grupos
populacionais,
onado
a
fatores
genéticos
.
câncer cervical tem sido empregada para as lesões
anorreceptivos imunodeprimidos (HIV+ARD).
denominadosdo“de
risco”;anal:
são indivíduos
anorreceptivos,
Dentre
estescom
grupos,
destacam-se
osCD4
indivíprecursoras
câncer
a citologia
oncótica14, a
Pacientes
contagem
de células
< 350
.
de
ambos
os
sexos
²
³;
portadores
de
doenças
sexualduos
infectados
pelo
vírus
HIV,
que,
face
anoscopia com magnificação de imagem (AMI), e a
células/ml e/ou carga viral acima de 10.000 cópias,à fobiópsia dirigida.15
ram considerados imunodeprimidos.
benefícios
dadedetecção
realizada
pelo - Manaus - Amazonas
Todos
os pacientes foram submetidos à
Trabalho Os
realizado
na Fundação
Medicina Tropical
do Amazonas
- Brasil.
Papanicolaou cervical, com o desenvolvimento de proanoscopia com magnificação de imagem e biópsia, com
Recebidode
emtratamento
13/11/2007 do câncer cervical, já foram bem
tocolos
anestesia local, dirigida a eventuais lesões acetobrancas
Aceito para publicação em 01/02/2008
comprovados:
a
incidência
deste
câncer
foi
reduzida
encontradas. Na ausência delas, biópsia de mucosa anal
Fonte de auxilio à pesquisa: FMT-AM
de
40/100.000
mulheres
paranenhum
8/100.000 mulheres nos
justapectínea proximal foram realizadas, às 7h. A biópsia
Potenciais
de conflito
de interesse:
países que adotaram esta abordagem.16
foi encaminhada para estudo histopatológico no LaboSendo o câncer anal uma doença de instalação
ratório de Patologia da Fundação de Medicina Tropical
insidiosa, são necessários alguns anos para que uma le- 72 do Amazonas (FMT-AM). As lâminas foram coradas
são de baixo grau evolua para lesão de alto grau e desta
pela hematoxilina-eosina, e foi utilizada técnica de
para câncer. Portanto, se detectadas e tratadas precoimunoistoquímica para a proteína p16INK4a para concemente, pode-se prevenir a transformação maligna 17.
firmação diagnóstica de casos duvidosos, nos quais se
Assim, a detecção de neoplasias intra-epiteliais
verificou indícios de integração do genoma do HPV de
anais, utilizando o método do Papanicolaou-anal (Papalto risco aos das células infectadas.
a) e da AMI poderá identificar precocemente aqueles
Os dados obtidos foram analisados sob a forindivíduos sob maior risco de desenvolvimento do cânma de intervalos de confiança, tabelas de contingêncicer anal e oferecer condições de abordagem terapêuas ou classificação cruzada e razão de chances. Para
tica eficiente naqueles casos em que forem detectadas
comparar a prevalência total de ASIL nos 4 grupos foi
lesões com maiores alterações celulares18.
usado o teste exato de Fisher.
Apesar da alta sensibilidade (98%), a citologia
Significância estatística foi considerada para
anal apresenta baixa especificidade (50%) para prevalores de p < 0,05.
ver a gravidade da lesão, daí a importância da AMI