IMUNOTERAPIA COM A VACINA HETERÓLOGA DE DNA

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
IMUNOTERAPIA COM A VACINA HETERÓLOGA DE DNAHSP65+PROTEÍNA-HSP65 DE Mycobacterium leprae EM
TUMORES MAMÁRIOS DE CADELAS
Carolina Franchi João
Médica Veterinária
JABOTICABAL-SÃO PAULO-BRASIL
Março de 2012
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
IMUNOTERAPIA COM A VACINA HETERÓLOGA DE DNAHSP65+PROTEÍNA-HSP65 DE Mycobacterium leprae EM
TUMORES MAMÁRIOS DE CADELAS
Carolina Franchi João
Orientadora: Profa. Dra. Mirela Tinucci Costa
Co-orientador: Célio Lopes Silva
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como
parte das exigências para a obtenção do título Doutora
em Medicina Veterinária (Clínica Médica Veterinária)
JABOTICABAL-SÃO PAULO-BRASIL
Março de 2012
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
CAROLINA FRANCHI JOÃO – nascida em 28 de janeiro de 1981, em
Guaranésia, Minas Gerais. Formada em Medicina Veterinária pela Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, câmpus de Jaboticabal em dezembro de
2003. Durante a graduação fez Iniciação Científica no Departamento de Patologia
Veterinária, sob orientação do Prof. Dr. Matias Pablo Juan Szabó, com o projeto
“Comparação das cepas de Rhipicephalus sanguineus do Brasil e da Argentina”. Em 1º
de fevereiro de 2004 ingressou no Programa de Aprimoramento Profissional em
Medicina Veterinária, na área de Clínica Médica de Pequenos Animais junto ao Hospital
Veterinário “Governador Laudo Natel” da Universidade Estadual Paulista – Unesp –
Câmpus de Jaboticabal, concluindo o mesmo em 31 de janeiro de 2006, sob orientação
da Profª. Drª. Mirela Tinucci Costa. Em 1º de março de 2006, após concurso de
seleção, iniciou o Mestrado no programa de pós-graduação em Medicina Veterinária,
área de concentração em Clínica Médica, junto à FCAV, Unesp, campus de Jaboticabal,
sob orientação da Profª. Drª. Mirela Tinucci Costa, o qual concluiu em fevereiro de
2008. Atualmente é doutoranda do programa de pós-graduação em Medicina
Veterinária, área de concentração em Clínica Médica, da mesma instituição sob a
orientação da Profª. Drª. Mirela Tinucci Costa. Em 2009, foi aprovada em concurso
público para o cargo de professora de Clínica Médica de Pequenos Animais na
Universidade Federal do Pará (UFPA), onde desde então é professora assistente.
iii
“Não há pedra em teu caminho. Não há ondas no teu mar.
Não há vento ou tempestade que te impeçam de voar.”
Sá e Guarabyra
iv
DEDICO...
... ao meu pai Jorge e a minha mãe Maria Regina, por serem meus
alicerces, meus exemplos de vida e sempre cuidarem de mim,
... aos meus irmãos Marina e Jorge Filho por estarem presentes em todos
os momentos sempre me apoiando,
... ao meu namorado Diogo pela imensa ajuda no experimento e por ser
meu companheiro sempre,
Amo todos vocês!!!!
v
OFEREÇO...
...ao meu querido avô Ítalo,
que sempre será grande exemplo de força e perseverança na minha vida...
vi
AGRADEÇO...
...à Deus, por permitir tudo isso,
...à minha vó Delfina por todo amor,
...a todos tios, tias e primos pelo apoio,
...a D. Marilza pelo carinho,
...à professora Mirela, por além de ser uma orientadora sempre presente, é uma amiga
para todos os momentos. E por ter me mostrado esse mundo incrível e intrigante da
imunopatologia,
…ao prof. Célio Lopes Silva, pela oportunidade e confiança no nosso trabalho e por
toda a ajuda desde a idealização do experimento,
...aos amigos Thiago, Andréia, Mariana, Fabiana e Caio pela grande ajuda em todas a
etapas do experimento,
…aos amigos do Laboratório de Imunologia da USP de Ribeirão Preto, Patrícia, Iza,
Kaká, Aninha, Wendy, Rodrigo pela grande ajuda,
…à Fabiana pela aquisição e ajuda na análise da citometria,
...à Geórgia e ao Márcio da Patologia por toda paciência e dedicação em me ajudar a
“relembrar” a histopatologia,
…ao Seu Orandi, por me ensinar a confecção dos blocos e lâminas e ser uma pessoa
tão querida e competente no que faz,
…ao Prof. Cláudio da UFMT pelas aulas de estatística,
...aos meus amigos Joice e Wanderson, nossa amizade será para sempre,
…aos meus amigos de Castanhal, Carina, Talita, Leo, Júlio, Luciana, Milton, Amanda,
Alessandra, Gustavo, Kaká, Jader, por tornarem mina vida paraense tão agradável,
...à Unesp de Jaboticabal por ter me acolhido desde 1999,
...a todos os cães, em especial a todas as cadelas que participaram do experimento e
aos meus cães, a Susi, Liz, Baruc (in memorian) e Dorinha por serem o motivo de tudo
isso,
vii
…a todos os proprietários que permitiram a participação de suas cadelas no
experimento e colaboraram para a conclusão deste projeto,
…a todos os colegas da pós-graduação pela boa convivência,
…a todos os professores da FCAV- Jaboticabal pela grande participação em minha
formação profissional,
…à Fapesp, por ter me concedido a bolsa de doutorado, mesmo por pouco tempo.
…a todos que não foram citados, mas de alguma maneira foram importantes para esse
trabalho.
“Comece fazendo o que é necessário, depois o que é possível, e de repente você
estará fazendo o impossível.” São Francisco de Assis
viii
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ................................................................................................................................ 2
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS.............................................................................. 3
1- REVISÃO DE LITERATURA................................................................................................... 5
1.1- Tumores mamários caninos ............................................................................................. 5
1.2 - Sistema imunológico e as proteínas de choque térmico.................................................. 7
2- OBJETIVOS ......................................................................................................................... 14
CAPÍTULO 2 – Avaliação Clínica da Imunoterapia com DNA-HSP65+Proteína-HSP65 em
Tumores Mamários Caninos ..................................................................................................... 15
RESUMO .................................................................................................................................. 15
1- Introdução ............................................................................................................................ 16
2- Material e Métodos ............................................................................................................... 18
2.1- Grupo experimental ....................................................................................................... 18
2.2- Vacinas heterólogas de DNA-HSP65+proteína-HSP65 ................................................. 19
2.3- Protocolo imunoterápico ................................................................................................ 19
2.4- Avaliação do tratamento e toxicidade............................................................................. 19
2.5- Análise dos resultados ................................................................................................... 20
3- Resultados e Discussão ....................................................................................................... 21
4- Conclusões ........................................................................................................................... 32
CAPÍTULO 3 – Avaliação Imunológica de Cadelas com Tumores Mamários Malignos
Submetidas à Imunoterapia com DNA-HSP65+Proteína HSP65 .............................................. 33
RESUMO .................................................................................................................................. 33
1-Introdução ............................................................................................................................. 34
2- Material e Métodos ............................................................................................................... 37
2.1- Grupo experimental ....................................................................................................... 37
2.2- Imunoterapia .................................................................................................................. 37
2.3- Avaliação da imunidade ................................................................................................. 38
2.3.1 - Ensaio Imunoenzimático (ELISA): .............................................................................. 38
2.3.2 - Separação de células mononucleares ....................................................................... 39
2.3.3 - Citometria de fluxo ..................................................................................................... 39
2.3.4 - Teste de proliferação espontânea de células mononucleares do sangue periférico ... 40
2.4- Análises estatística ........................................................................................................ 41
3- Resultados e Discussão ....................................................................................................... 42
4- Conclusões ........................................................................................................................... 52
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 53
REFERÊNCIAS* ....................................................................................................................... 54
ANEXOS................................................................................................................................... 63
Anexo 1- Sistema TNM modificado (Tumor/ Nódulo (Linfonodo)/ Metástase) do proposto pela
OMS (OWEN, 1980). ................................................................................................................ 64
Anexo 2- Protocolo de aprovação pela Comissão de Ética e Bem Estar Animal (CEBEA) da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de Jaboticabal .................... 65
Anexo 3 – Termo de consentimento dos proprietários para a participação das cadelas no
experimento. ............................................................................................................................. 66
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT – Alanina aminotransferase
BPF - Boas práticas de fabricação
BPL – Boas práticas de laboratorio
CFSE – “Carboxyfluorescein Succinidyl Ester”
Con-A – Concanavalina A
CPT - Centro de Pesquisas em Tuberculose
D – direita
DC – Célula dendrítica
E – esquerda
ELISA – “Enzyme Linked Immunosorbent Assay”
FA – Fosfatase alcalina
FMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
HLA-DR – “Human Leukocyte Antigens”
HSP – Proteínas de choque térmico
IFN-γγ – Interferon gama
IgG1 – Imunoglobulina G1
IgG2a – Imunoglobulina G2a
IL – Interleucina
M – mama
MAF – fator ativador de macrófagos
MHC – “Major histocompatibility complex”
NK – “Natural killer”
OMS – Organização Mundial de Saúde
PBS – “Phosphate buffered saline”
PT – Proteína total
R – Reavaliação
RPMI – “Roswelt Park Memorial Institute”
SBF – Soro fetal bovino
Th1 – Células T helper1
TNM – Tumor/ Nódulo (Linfonodo)/ Metástase
TVT – Tumor venéreo transmissível
Unesp – Universidade Estadual Paulista
USP – Universidade de São Paulo
1
Imunoterapia com a vacina heteróloga de DNA-HSP65+proteína-HSP65 de
Mycobacterium leprae em tumores mamários de cadelas
RESUMO
A mastectomia é o procedimento terapêutico mais frequentemente empregado
para tratar tumores mamários de cadelas e o sucesso depende do estádio do tumor no
momento da intervenção. Estudos em modelos animais mostram que as proteínas de
choque térmico (HSP) têm a capacidade de induzir imunidade inata tumor-específica e
resulta na regressão do tumor. Sendo assim, este estudo teve como objetivos avaliar a
eficácia do imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 no tratamento de cadelas
com tumores mamários malignos, seu potencial imunoestimulatório e investigar o
aparecimento de efeitos adversos. Fizeram parte do experimento 21 cadelas com
tumores mamários malignos. Destas 13 foram tratadas com o imunoterápico e oito
submetidas a mastectomia da cadeia mamaria afetada. As cadelas (n= 13) receberam
até três aplicações do imunomodulador, via intratumoral, no tumor de maior volume,
com intervalo médio de 15 dias. O potencial imunoestimulatório do imunomodulador foi
investigado através da citometria de fluxo pela comparação do numero de células
natural killer ativadas, células B e T, CD4 e CD8, monócitos, monócitos ativados,
macrófagos e células dendríticas; da proliferação espontânea de células
mononucleares e da produção de anticorpos anti-HSP65 pelo teste ELISA antes do
tratamento e 15 dias após o termino do mesmo. Seis cadelas (46,1%) apresentaram
regressão em pelo menos um dos tumores da cadeia mamária, e uma (7,7%) no tumor
que recebeu a aplicação do imunoterápico. Quando se consideram todas as mamas
acometidas por tumores (n= 40), nove (22,5%) apresentaram regressão tumoral, 19
(47,5%) progressão e 12 (30%) se mantiveram estáveis. Três cadelas vieram a óbito
durante o experimento; uma mastectomizada e duas tratadas com o imunoterápico. O
imunoterapico não promoveu estímulo imunológico sistêmico significativo. Houve
aumento dos anticorpos anti-HSP65 após o tratamento e a proliferação de leucócitos,
apesar de não significativa, foi maior quando estimulada pela HSP65 em cinco cadelas
15 dias após o tratamento. Nenhum efeito adverso foi associado ao imunoterapico
DNA-HSP65+proteína-HSP65. Um ano e três meses após os tratamentos, 18 cadelas
permanecem vivas e em bom estado geral. A imunoterapia com DNA-HSP65+proteínaHSP65 mostrou-se promissora no tratamento de neoplasia mamária de cadelas,
embora não se detectou uma resposta imunológica consistente com os ensaios
realizados. Esses resultados sugerem que o efeito imune da aplicação da vacina DNAHSP65+proteína HSP65 seja melhor detectado in situ do que sistemicamente.
Palavras-chaves: tumor mamário, carcinoma, cadela, DNA-HSP65, vacina gênica
2
Immunotherapy with vaccine heterologous DNA-HSP65 + HSP65 of proteinMycobacterium leprae in breast tumors of bitches
ABSTRACT
Mastectomy is a therapeutic procedure most often used to treat breast tumors in
bitches and success depends on the tumor stage at the time of intervention. Studies in
animal models show that the heat shock proteins (HSP) have the ability to induce tumorspecific innate immunity and results in tumor regression. Thus, this study aimed to
evaluate the efficacy of immunomodulatory DNA-HSP65 + HSP65 protein in the
treatment of dogs with malignant mammary tumors, and investigate its potential
immunostimulatory the appearance of adverse effects. The experiment consisted of 21
dogs with malignant mammary tumors Of these 13 were treated with immunotherapy
undergo mastectomy and eight of the affected mammary chain. Female dogs (n = 13)
received three applications of the immunomodulator, intratumoral, in the greater volume
tumor, with a mean interval of 15 days between applications. The potential
immunostimulatory was investigated by flow cytometry by comparing the number of
activated natural killer cells, T and B cells, CD4 and CD8 lymphocytes, monocytes,
activated monocytes, macrophages and dendritic cells, the proliferation of mononuclear
cells and spontaneous production anti-HSP65 antibody by ELISA before treatment and
15 days after the end. Six dogs (46.1%) had regression at least in one tumor of the
mammary chain, and one dog (7.7%) in the tumor that received intratumoral application.
When you consider all breast tumors (n = 40), nine (22.5%) had tumor regression, 19
(47.5%) progression and 12 (30%) remained stable. Three dogs died during the
experiment, one after mastectomy and two after immunotherapy. The immunotherapy
did not cause significant systemic immune stimulation. There was an increase of antiHSP65 after treatment and the proliferation of leukocytes, although not statistically
significant, was greater when stimulated by HSP65 in five dogs 15 days after treatment.
No adverse effects were associated with immunotherapy-HSP65 DNA + protein-HSP65.
A year and three months after treatment, 18 dogs are still alive and in good general
condition. Immunotherapy with hsp65 DNA + protein HSP65 has shown to be promising
in treating breast cancer in bitches, but not an immune response was detected
consistent with the tests. These results suggest that the effect of vaccination of immuneDNA + protein HSP65-HSP65 is better detected in situ than systemically.
Keywords: breast tumor, carcinoma, bitch, DNA-HSP65, gene vaccine
3
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
O câncer de mama é a neoplasia mais comum em cadelas, sendo responsável
pela maioria das neoplasias observadas nas fêmeas desta espécie. Apesar dos
inúmeros progressos no tratamento do câncer, como o aprimoramento das cirurgias,
protocolos quimioterápicos e radioterápicos, o sucesso do tratamento, na maior parte
das neoplasias, ainda depende do diagnóstico precoce e da presença ou ausência de
metástase. Assim, novas abordagens terapêuticas são estimuladas e testadas, e dentre
elas a imunoterapia.
O conhecimento sobre os mecanismos imunológicos desencadeados com a
imunoterapia de tumores permite que estas abordagens sejam continuamente
aprimoradas e se traduzam em progressos clínicos contínuos. A modulação do sistema
imune é um método que pode ser usado na tentativa de minimizar as falhas da
imunidade no reconhecimento e destruição de células neoplásicas. Entretanto, mesmo
com este progresso, a imunoterapia de tumores ainda está longe de atingir os
resultados que dela se podem, ao menos teoricamente, esperar. Isto, em síntese,
estimula a continuidade das pesquisas na área. As novas estratégias em
desenvolvimento, e a aplicação clínica delas demonstram, cada vez mais e com maior
ênfase, que a manipulação do sistema imune no combate ao câncer é uma forma de se
conseguir benefícios clínicos consideráveis, com efeitos adversos menores dos que se
observam nas formas usuais de tratamento.
Proteínas de choque térmico demonstraram induzir imunidade contra o câncer, e
entre elas, a HSP65 já se mostrou eficaz no tratamento do câncer em modelos animais.
Neste estudo, a imunomodulação com conseguente redução de tumores foi explorada
através da aplicação do gene codificador da proteína HSP65 associado à proteína
HSP65 pronta aplicadas no sítio tumoral.
As neoplasias que acometem cães e gatos são modelos apropriados e válidos ao
estudo do comportamento biológico desta doença. Além disto, os animais de estimação
têm tumores com apresentação histopatológica e comportamento biológico similares
4
aos tumores que acometem o homem e o resultado da aplicação de novas estratégias
terapêuticas poderia beneficiar os homens, bem como os outros animais.
5
1- REVISÃO DE LITERATURA
1.1- Tumores mamários caninos
O câncer de mama é a neoplasia mais comum em cadelas (GORMAN &
DOBSON, 1995; ZUCCARI, 2001), representando aproximadamente 52% de todas as
neoplasias observadas em fêmeas desta espécie (GORMAN & DOBSON, 1995;
PEREZ-ALENZA, 1998; ZUCCARI, 2001). Em cerca de 25% dos casos de tumores
mamários malignos, as cadelas apresentam metástases no momento do diagnóstico
(KITCHELL, 1995; OGILVIE & MOORE, 1995; MORRISON, 2002).
Para alguns pesquisadores, a maior ocorrência desta doença é registrada entre
seis a sete anos de idade (MOULTON, 1990), enquanto para outros entre 10 a 11 anos,
com baixa incidência nos animais com idade inferior a quatro anos (LANA et al., 2001).
A predisposição racial é variada, figurando entre as mais susceptíveis, poodle, teckel
(MOULTON, 1990; LANA et al., 2001), pointer, retriever, setter inglês, boston terrier
(MOULTON, 1990), pastor alemão e o cocker spaniel, além dos animais sem raça
definida (ZUCCARI, 1999; LANA et al., 2001).
Estudos pioneiros mostraram que cadelas castradas antes do primeiro cio têm
0,05% de chance de desenvolverem tumor de mama, aumentando para 8% depois do
primeiro cio e para 26% depois do segundo cio (SCHNEIDER et al., 1969),
evidenciando a importância dos hormônios sexuais no processo de tumorigênese.
Somando-se a isto, tumores mamários ocorrem quase que exclusivamente em fêmeas,
ocasionalmente em machos, entretanto a gestação não apresenta efeito preventivo
comprovado (MOULTON, 1990). Estrógeno, progesterona e o hormônio do crescimento
são incriminados como agentes carcinogênicos (FONSECA, 1999; MORRISON, 2002),
e isto foi demonstrado por Mac Ewen et al. (1982) e Sartin (1992), quando identificaram
receptores de estrógenos em 40 a 60% dos casos de neoplasias mamárias de cadelas.
Geralmente, os tumores mamários apresentam-se como massas circunscritas, de
dimensões variáveis. Em relação à mobilidade, podem ser móveis ou aderidos, com
6
extenso envolvimento cutâneo e muscular. Ao corte, podem ter aspecto sólido, cístico
ou misto, em cuja superfície observa-se, frequentemente, focos de necrose (BRODEY
et al., 1983; LANA et al., 2001). As mamas caudais são as mais acometidas
(MOULTON, 1990).
O diagnóstico é feito com base em exames citológicos (citologia aspirativa com
agulha fina) e histopatológicos. Uma das classificações adotadas para os tumores
mamários caninos é a estabelecida pela Organização Mundial de Saúde (Tabela 1).
Recentemente, estudiosos brasileiros chegaram a um consenso no diagnóstico,
prognóstico e tratamento dos tumores mamários caninos (CASSALI et al., 2011).
Provavelmente daqui para frente, todos os trabalhos brasileiros relacionados ao tema
seguirão os princípios do consenso, padronizando os trabalhos e facilitando as
comparações entre eles.
A maioria dos tumores mamários malignos é classificada como carcinoma e estes
podem metastatizar para linfonodos inguinais e depois para linfonodos ilíacos internos,
onde podem causar compressão do cólon. Outras áreas comuns de metástases são os
pulmões, fígado, rins e menos frequentemente, os ossos (LANA et al., 2001).
O prognóstico é baseado em vários fatores, como no tamanho do tumor,
envolvimento de linfonodos, presença de metástases à distância, tipo histológico, grau
de malignidade, diferenciação nuclear, invasão de tecidos vizinhos, invasão de vasos
sanguíneos ou linfáticos, entre outros (HARVEY, 1996; LANA et al., 2001). Também, o
estadiamento do tumor fornece subsídios para o prognóstico e se baseia no sistema
TNM (Tumor/Nodo (Linfonodo)/ Metástase) modificado do proposto pela OMS (OWEN,
1980) (Anexo 1), sendo que o T se refere a extensão do tumor primário, o N a ausência
ou presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais, e o M a ausência ou
presença de metástase à distância. O estadiamento do tumor deve ser feito antes do
início do tratamento para avaliar a fase de evolução tumoral, bem como as
possibilidades de progressão no seu sítio de origem e a outros territórios (metástases).
7
Tabela 1 - Classificação dos tumores mamários de cadelas, segundo a
Organização Mundial da Saúde, citada por Misdorp et al. (1999).
Jaboticabal, SP, Brasil, 2011.
TUMORES MALIGNOS
1.1- Carcinoma “in situ”
1.2- Carcinoma complexo
1.3- Carcinoma simples
1.3.1- Carcinoma túbulo-papilífero
1.3.2- Carcinoma sólido
1.3.3- Carcinoma anaplásico
1.4- Tipos especiais de carcinoma
1.4.1- Carcinoma de células fusiformes
1.4.2- Carcinoma de células escamosas
1.4.3- Carcinoma mucinoso
1.4.4- Carcinoma rico em lipídeos
1.5- Sarcoma
1.5.1- Fibrossarcoma
1.5.2- Osteossarcoma
1.5.3- Outros sarcomas
1.6- Carcinossarcoma
1.7- Carcinoma ou sarcoma em tumores
benignos
TUMORES BENIGNOS
2.1- Adenoma
2.1.1- Adenoma simples
2.1.2- Adenoma complexo
2.1.3- Adenoma basalóide
2.2- Fibroadenoma
2.2.1- Fibroadenoma - baixa celularidade
2.2.2- Fibroadenoma - alta celularidade
2.3- Tumor misto benigno
2.4- Papiloma ductal
A remoção cirúrgica completa, com amplas margens de segurança, quando não
existe envolvimento metastático, ainda é o tratamento de escolha para as neoplasias
mamárias, pois os protocolos de quimioterapia antineoplásica e radioterapia
apresentam baixa atividade antitumoral. O tipo de cirurgia pode variar desde a simples
nodulectomia até a mastectomia radical das duas cadeias mamárias, dependendo da
extensão do tumor (LANA et al., 2001; HEDLUNG, 2002).
1.2 - Sistema imunológico e as proteínas de choque térmico
Segundo a teoria de Burnett (1970), o organismo mantém o sistema imunológico
em vigilância contínua contra o aparecimento de células anormais, que são
reconhecidas e destruídas. Assim, o sistema imunológico destruiria os tumores antes
que estes tivessem um significado clínico. Embora essa proteção constitua função
potencialmente importante do sistema imunológico, isso representa uma tarefa difícil e,
provavelmente, destinada ao fracasso na maioria dos casos (GREENBERG, 2004).
8
Apesar dos vários mecanismos imunológicos envolvidos, o tumor é considerado capaz
não só de escapar, como também de desorganizar a resposta imune do hospedeiro
(HOFMANN, 2002; VERGATI, 2010; BERGMAN, 2010). Vários mecanismos estão
envolvidos na evasão da resposta imunológica: células tumorais podem apresentar
baixa regulação da expressão do MHC classe I; 2-microglobulina ou componentes da
maquinaria
de
processamento
de
antígenos,
fazem
que
mesmo
antígenos
potencialmente imunogênicos não sejam apresentados ao sistema imunológico; perda
da expressão de antígenos tumorais, possivelmente pela rápida taxa de mitose,
instabilidade genética, mutações ou deleções em genes codificadores desses
antígenos; deficiência da função coestimulatória ou MHC calsse II, necessária para dar
início às respostas das células T; tolerância do hospedeiro em responder a antígenos
tumorais, processo chamado mascaramento antigênico; supressão do sistema imune
por produtos secretados pelo tumor, alguns tumores expressam a molécula ligante de
Fas, que reconhecem o receptor de morte celular Fas nos leucócitos que tentam atacar
o tumor, causando a apoptose deste, indução de células reguladoras supressivas, tais
como as T CD8, células Th2, macrófagos secretores de IL-10 ou células B; efeitos
associados com a cinética do crescimento tumoral, onde o tumor pode não disparar
uma resposta imune até que atinja um tamanho que não pode ser controlado pelo
hospedeiro; presença de anticorpos bloqueadores, que podem se ligar às células T
citotóxicas, saturando seus receptores antigênicos, bloqueando sua capacidade de se
ligar com as células alvo (ALGARRA et al., 1997; SEGURA et al., 1997; DAVIDSON et
al., 1998; HOFBAUER et al., 1998; LEE et al., 1998; SEUNG et al., 1999; ZAKS et al.,
1999; ZHENG et al., 1999; CABRERA et al., 2000; TIZARD, 2002; KHONG & RESTIFO,
2002; SHEVAC, 2004; GREENBERG, 2004; ABBAS & LICHMAN, 2005; BERGMAN,
2010, VERGATI, 2010).
A imunoterapia contra tumores visa a modulação do sistema imune na tentativa de
restaurar sua capacidade de reconhecimento e destruição de células neoplásicas, de
maneira direta ou indireta (STEINMAN & MELLMAN, 2004; KENNEDY, 2010).
As proteínas de choque térmico (HSPs), um conjunto de proteínas evolutivamente
muito conservadas que exercem funções biológicas amplas, e estão agrupadas em
9
famílias, conforme seus pesos moleculares (Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp110, Hsp14 e
Hsp18) (RUTHERFORD & LINDQUIST, 1998). Elas exercem funções importantes na
homeostasia celular, atuando como chaperonas; participando do dobramento,
desdobramento e montagem de proteínas; prevenindo desnaturação e agregação
protéica; exercendo atividade ATPase e transportando peptídeos, além de terem a
capacidade de sensibilizar o sistema imune dos pacientes (BUKAU & HORWICH,
1998).
Pelo fato das HSPs atuarem como chaperonas moleculares, mostrarem atividade
adjuvante, participarem na apresentação de antígenos (SRIVASTAVA et al., 1998),
assim como mediarem a maturação fenotípica e funcional de células dendríticas
(BINDER et al., 2000), elas são usadas em estratégias na imunoterapia do câncer
(JANETZKI et al., 2000; OKI & YOUNES, 2004, JONASCH et al., 2008, WOOD et al.,
2008).
Estudos sobre as funções imunológicas das proteínas de choque térmico (HSPs)
surgiram na década de 80, quando foi observado que preparações homogêneas de
HSPs, isoladas de células cancerígenas, eram compostas por um complexo de
natureza peptídica tumoral (HSP-peptídeo). Esses complexos eram capazes de induzir
imunidade contra câncer, enquanto que preparações correspondentes de tecidos
normais não tinham as mesmas propriedades (PRZEPIORKA & SRIVASTAVA, 1998).
Os complexos HSP-peptídeos são formados, preferencialmente, dentro das
células, sendo liberados quando ocorre apoptose das mesmas e, no meio extracelular,
interagem com receptores de células dendríticas (TLR2, TLR4, CD14, LOX1 ou CD40).
Essa interação pode levar a maturação fenotípica e funcional dessas células, com
consequente liberação de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e TNF-alfa),
aumento da expressão de moléculas MHC de classe II e de moléculas coestimulatórias, como CD86 e CD40 (BINDER et al., 2002). Outra via de ativação ocorre
quando os complexos HSPs-peptídeos interagem com o receptor CD91 das células
dendríticas, culminando com o processamento e apresentação do peptídeo conjugado,
tanto em contexto de apresentação cruzada por moléculas MHC classe I, quanto classe
10
II. Como resultado, ocorre a ativação de células T CD8 e CD4, que são específicas para
os peptídeos conjugados (MATSUTAKE & SRIVASTAVA, 2000).
Pesquisadores do Centro de Pesquisas em Tuberculose da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (CPT – FMRP / USP) têm investigado o uso de uma vacina
gênica HSP65 para o controle da tuberculose e de outras doenças. A construção
estudada contém o gene que codifica a proteína de choque térmico de 65 kDa, HSP65,
de Mycobacterium leprae. A HSP65 da micobactéria demonstrou ser bastante
imunogênica (KAUFMANN et al., 1991). Entretanto, a imunização com a proteína,
mesmo com adição de adjuvantes, não se mostrou eficiente para a indução de resposta
imune protetora (BONATO et al.,1999). Alternativamente, quando clonada em vetores
plasmidiais foi capaz de induzir proteção, demonstrada pela produção de IFN-γ e
diminuição significativa do número de bacilos nos pulmões de camundongos
experimentalmente infectados (LOWRIE et al., 1999).
As vacinas contra o câncer baseadas em HSPs compreendem três estratégias
diferentes: (i) vacinas autólogas baseadas na obtenção de complexos HSPs-peptídeos
isolados das próprias células tumorais do paciente; (ii) vacinas contendo complexos
formados in vitro pela associação de HSPs com antígenos tumorais recombinantes para
uso em terapia de tumores específicos (LI et al., 2006; XIE et al, 2010; CHOI et al.,
2011); e (iii) vacinas heterólogas de DNA para transfecção de células tumorais e
obtenção de expressão endógena aumentada das HSPs e formação de complexos
HSPs-peptídeos-antigênicos tumorais (MANGILI et al., 2006).
Nas vacinas autólogas, os complexos HSPs-peptídeos isolados de células
tumorais podem representar todo o repertório antigênico tumoral da célula de origem e,
quando administrados no próprio paciente, podem induzir resposta imune praticamente
contra toda essa coleção antigênica. Teoricamente, esse procedimento reduz a
possibilidade de escape das células tumorais frente à imunoterapia. Ensaios clínicos
demonstraram que a inoculação do complexo HSP-peptídeo isolado induz a ativação de
resposta imune inata e estimulação de células TCD8 específicas para os peptídeos
tumorais (BLACHERE et al., 1997; HARADA et al., 1998).
11
Com o emprego de novas tecnologias, muitos avanços foram observados na
caracterização de antígenos tumorais e, consequentemente, o número deles aumentou
substancialmente. Nas vacinas, as proteínas HSP70 e a gp96 também são as mais
utilizadas como carreadoras de peptídeos ou antígenos tumorais (LI et al., 2006;
MANGILI et al., 2006).
A utilização dos complexos HSPs-peptídeos isolados de células tumorais
autólogas apresenta vantagens para a imunoterapia de tumores, para os quais
antígenos específicos ainda não foram identificados. Na maioria dos casos, onde são
purificados esses complexos, as proteínas HSP70 e gp96 estão presentes nesse tipo
de vacina terapêutica. A desvantagem desse procedimento é a necessidade de
quantidades significativas de massa tumoral para o isolamento dos complexos HSPpeptídeos (MAZZAFERRO et al., 2003; AALAMIAN et al., 2006).
As vacinas, constituídas pela conjugação in vitro das HSPs com antígenos
tumorais recombinantes são de mais fácil manuseio e aplicação, mas têm a
desvantagem de se trabalhar com um único ou poucos antígenos tumorais. Essa
técnica só pode ser aplicada para tumores específicos, onde se conhece o papel
desses antígenos no processo de eliminação dos tumores.
Vacinas de DNA preparadas para transfecção de células tumorais e obtenção de
expressão endógena aumentada de HSPs e formação de complexos HSPs-peptídeos,
são uma estratégia com grande potencial para imunoterapia de tumores (SRIVASTAVA,
1997).
Uma preparação de HSP65 heteróloga (Mycobacterium leprae) pode proporcionar
um aumento da quantidade dos complexos HSPs-peptídeos, e consequentemente
melhor resposta citotóxica. Outra vantagem dessa estratégia é que os complexos
podem contar com peptídeos que representam todo o repertório antigênico do tumor, e
geram estimulação de células citotóxicas peptídeos-específicos mais abrangentes para
um efetivo controle dos tumores. Além disto, essa estratégia imunoterapêutica pode ter
ampla aplicação em qualquer tipo de tumor (DAI et al., 2003; HOOS & LEVEY, 2003).
Neste projeto, uma preparação de HSP65 heteróloga (Mycobacterium leprae) foi
explorada.
12
Várias construções vacinais de DNA estão sendo testadas em estudos clínicos de
Fase I/II em humanos (MICHALUART et al., 2008); uma das mais promissoras é a
vacina de DNA que codifica a proteína HSP65 micobacteriana (DNA-HSP65),
desenvolvida pelo grupo de pesquisa do Prof. Dr. Célio Lopes Silva, da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, USP.
Pesquisas utilizando a HSP65 foram realizadas em modelos experimentais
(camundongos) inoculados com diferentes linhagens de células tumorais. Lukacs et al.
(1993) mostraram que a transfecção de linhagens celulares altamente tumorogênicas
(J774) com o DNA-HSP65, as deixou incapazes de induzir a formação de tumores em
camundongos imunocompetentes, quando injetadas intraperitonealmente. Esses
animais também foram resistentes às células J774 não transfectadas, quando
desafiados posteriormente. Essa proteção conferida mostra que a resposta imune não é
exclusiva à HSP65, mas dirigida também aos antígenos tumorais, sugerindo quebra da
tolerância imunológica aos antígenos tumorais. Além disso, a característica da HSP em
facilitar
a
apresentação
de
antígenos
aos
linfócitos
T,
aumentando
sua
imunogenicidade pode ter contribuído para esse reconhecimento.
O mesmo grupo de pesquisa mostrou que a aplicação de DNA-HSP65 por via
intraperitoneal em camundongos imunocompetentes portadores de tumores provocou a
regressão destes. O mesmo não foi observado em camundongos com imunodeficiência
grave combinada, sugerindo que as células T mediariam a resposta anti-tumoral. Além
disso, linfócitos T derivados de camundongos vacinados com a linhagem singênica
J774-HSP65 (in vitro) eram citotóxicos para células da linhagem original J7744,
confirmando a capacidade do sistema imune em reconhecer antígenos tumorais
(LUKACS et al., 1997).
Em camundongos, o uso da vacina de DNA-HSP65 apresentou efeito profilático e
terapêutico contra a tuberculose, sendo capaz de estimular a resposta imune celular de
padrão Th1, caracterizada por alta produção de IFN-γ pelas células TCD4 e TCD8
antígeno-específicas, por longo período após desafio com M. tuberculosis (SILVA &
LOWRIE, 1994; SILVA et al., 1999). Apesar da semelhança da HSP65 da micobactéria
13
com a HSP60 humana, isto não foi suficiente para estimular uma resposta autoimune
contra a HSP60 humana (VICTORA, 2006).
Em um ensaio clínico com 21 pacientes humanos com carcinoma de células
escamosas de cabeça e pescoço, em estágio avançado, a utilização da vacina DNAHSP65 por via intratumoral apresentou resposta parcial, com a diminuição do volume
tumoral em 28,6% dos pacientes e estabilização em 7,1%. Nos pacientes, nos quais
não houve diminuição do volume tumoral, houve aparente melhora clínica
(MICHALUART et al., 2008).
Esta estratégia imunoterapica ainda não foi empregada no tratamento de tumores
caninos e apoiados nos resultados obtidos em varios experimentos poderia também
trazer benefícios a esta espécie animal.
14
2- OBJETIVOS
O objetivo geral do presente estudo foi testar a eficácia do imunomodulador
heterólogo DNA-HSP65+proteína-HSP65 na terapia de cadelas com tumores mamários
malignos, buscando um método alternativo de tratamento.
Especificamente, buscou-se:
•
Comparar a eficácia do tratamento com o imunomodulador DNA-
HSP65+proteína-HSP65 com o tratamento convencional (mastectomia) em tumores
mamários malignos de cadelas por meio de avaliações clínicas e da sobrevida dos
animais;
Comparar a resposta imune das cadelas portadoras de tumores mamários
antes e 15 dias após a última dose da vacina com DNA-HSP65+proteína-HSP65;
Avaliar a ocorrência de efeitos adversos em cadelas com tumores mamários
tratadas com DNA-HSP65+proteína-HSP65.
15
CAPÍTULO 2 – Avaliação Clínica da Imunoterapia com DNA-HSP65+ProteínaHSP65 em Tumores Mamários Caninos
RESUMO – O câncer de mama é a neoplasia mais comum em cadelas, na
maioria dos casos é maligno e a remoção cirúrgica ainda é o tratamento mais utilizado.
Um dos motivos de insucesso neste tipo de tratamento é o fato de 25% dos animais já
apresentarem metástases no momento do diagnóstico. Muitos progressos ocorreram ao
longo dos anos sobre o conhecimento da imunologia de tumores. A aplicação clínica
destes conhecimentos é a base da imunoterapia contra os tumores. Neste estudo foi
avaliado a eficácia e o surgimento de efeitos adversos do tratamento com o
imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 em cadelas com tumores mamários
malignos. Fizeram parte do experimento 21 cadelas com tumores mamários malignos,
sendo 13 tratadas com o imunoterápico e oito submetidas a mastectomia da cadeia
mamaria afetada. As 13 cadelas receberam até três aplicações do imunomodulador, via
intratumoral, no tumor de maior volume, com intervalo médio de 15 dias entre as
aplicações. Essas cadelas tinham de uma a seis mamas comprometidas, somando-se
40 tumores mamários que foram avaliados. As cadelas foram acompanhadas por um
ano e três meses após os tratamentos. Três cadelas vieram a óbito durante o
experimento; uma mastectomizada e duas tratadas com o imunoterápico. Seis cadelas
(46,1%) apresentaram regressão em pelo menos um dos tumores da cadeia mamária
aplicada, e uma (7,7%) no tumor que recebeu a aplicação do imunoterápico. Dos 40
tumores avaliados, nove deles (22,5%) apresentaram regressão tumoral, 19 (47,5%)
progressão e 12 (30%) se mantiveram estáveis. Nenhum efeito adverso grave foi
associado à imunoterapia com a vacina DNA-HSP65+proteína-HSP65. Um ano e três
meses após os tratamentos, 18 cadelas estão vivas e em bom estado geral. A
imunoterapia com a vacina DNA-HSP65+proteína-HSP65, mostrou-se promissora no
tratamento de neoplasia mamária de cadelas, necessitando se padronizar a melhor
dose/resposta e duração do tratamento.
Palavras-chave: cadela, HSP65, imunoterapia, neoplasia, tumor de mama, vacina
gênica.
16
1- Introdução
O tumor mamário canino representa aproximadamente 52% de todas as
neoplasias observadas em fêmeas desta espécie (GORMAN & DOBSON, 1995;
PEREZ-ALENZA, 1998; ZUCCARI, 2001), e em aproximadamente 25% destes casos,
as cadelas apresentam metástases no momento do diagnóstico (KITCHELL, 1995;
OGILVIE & MOORE, 1995; MORRISON, 2002). A mastectomia ainda é o tratamento
mais empregado (LANA et al., 2001; HEDLUNG, 2002; NOVOSAD, 2003), mas devido
ao alto índice de metástases, alta taxa de recorrência, o tempo livre da doença,
associada a pobre resposta à quimioterapia a sobrevida média é de dois anos (SIMON
et al., 2006). Essas limitações no tratamento e o mau prognóstico, principalmente para
as cadelas que apresentam metástases (PHILIBERT et al., 2003) são estímulos para a
busca de novas estratégias terapeuticas para estes animais.
A imunoterapia pode ser utilizada como tratamento único, ou coadjuvante nas
neoplasias. Vários mecanismos imunológicos estão envolvidos no reconhecimento e
destruição de células tumorais. Apesar disso, as células tumorais apresentam a
capacidade de escapar das ações do sistema imune e se desenvolverem no hospedeiro
(DUNN et al., 2002; ZITVOGEL et al, 2006; SANTOS, 2008).
As proteínas de choque térmico (HSPs) estão entre as proteínas mais
conservadas filogeneticamente. Elas são expressas em células eucarióticas e
procarióticas e produzidas pelas células, em maior quantidade, nas situações de
estresse, tais como, altas temperaturas, hipóxia, isquemia, exposição a metais pesados,
radiação, aumento de cálcio, hipoglicemia, câncer e infecções. A classificação dessas
proteínas é feita por famílias e baseia-se na sua massa molecular (HSP10, HSP27,
HSP40, HSP60, HSP70, HSP90 e HSP110). Elas desempenham funções essenciais na
manutenção da homeostase celular, atuando principalmente como chaperonas
moleculares, moléculas que carreiam e estabilizam outras proteínas em estágios
intermediários de dobramento, montagem e translocação através de membranas. Após
o estresse, as HSPs reparam as proteínas mal formadas ou promovem sua degradação
(BUKAU & HORWICH, 1998). Além disso, as HSPs também podem estimular o sistema
17
imune, funcionando como “sinalizadoras de perigo” que, quando liberadas no meio
extracelular por rompimento da membrana plasmática (MATZINGER, 1994; CHEN et
al., 1999).
A HSP65 é parte da família das Hsp60, encontradas no citoplasma de procariotos
e nas mitocôndrias de eucariotos, e estão envolvidas no redobramento de polipeptídeos
dobrados de forma inadequada (BUKAU & HORWICH, 1998).
A vacina heteróloga de DNA-HSP65+proteína-HSP65 de Mycobacterium leprae,
por sua capacidade de aumentar a formação de complexos HSPs-peptídeos e
consequentemente melhorar a resposta citotóxica dos animais frente aos antígenos
tumorais,
foi
utilizada
como
estimulante
não
específico
do
sistema
imune
(SRIVASTAVA, 2002). Uma vantagem dessa estratégia é que os complexos podem
contar com peptídeos que representam todo o repertório antigênico do tumor, e geram
estimulação de células citotóxicas peptídeos-específicos mais abrangentes para um
efetivo controle dos tumores. Além disto, essa estratégia imunoterapêutica pode ter
ampla aplicação em qualquer tipo de tumor (DAI et al., 2003; HOOS & LEVEY, 2003).
Neste estudo buscou-se avaliar o efeito clínico e possíveis efeitos adversos em
cadelas com tumores mamários malignos submetidas ao tratamento com o
imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65, e comparar a sobrevida dessas
cadelas com outras submetidas a mastectomia da cadeia mamária afetada.
18
2- Material e Métodos
2.1- Grupo experimental
Participaram do estudo 21 fêmeas caninas que atendiam aos seguintes critérios
de inclusão: (I) diagnóstico de tumor mamário maligno primário localizado e/ou
metastático; (II) ausência de doença concomitante, ou de outras neoplasias não
mamárias; (III) último tratamento quimioterápico ou cirúrgico há mais de 30 dias,
quando realizado. O critério de exclusão foi a presença de tumores mamários ulcerados
ou necrosados. Os tumores foram estadiados antes e após o tratamento com a vacina,
de acordo com o TNM modificado (OWEN, 1980) (Anexo 1).
Antes do início do experimento, tas cadelas foram anestesiadas e tiveram o tumor
de maior volume biopsiado para um diagnóstico histopatológico. Todas as cadelas eram
adultas, 13 delas (sete carcinossarcomas, três carcinomas simples e três carcinomas
complexos) receberam a vacina contendo o gene heterólogo DNA-HSP65+proteínaHSP65 (Grupo tratado) e oito (dois carcinossarcomas, quatro carcinomas simples, dois
carcinoma complexo) foram submetidas à mastectomia radical de uma ou das duas
cadeias mamárias (Grupo controle), dependendo do estadiamento do tumor. Todas as
cadelas passaram por avaliação clínica previamente, durante e após o tratamento.
Os tumores de maior volume foram submetidos à biopsia, após anestesia dos
animais, para se obter o diagnóstico histopatológico. O processamento histopatológico
obedeceu às normas do Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de Jaboticabal.
O projeto foi aprovado (protocolo 0020418-08) pela Comissão de Ética e Bem
Estar Animal (CEBEA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP,
campus de Jaboticabal (Anexo 2), e os proprietários de todos os animais assinaram um
termo de livre consentimento da entrada de suas cadelas no experimento (Anexo 3).
19
2.2- Vacina heteróloga de DNA-HSP65+proteína-HSP65
A
vacina
DNA-HSP65+proteína-HSP65
foi
produzida
pela
Farmacore
Biotecnologia Ltda, empresa sediada no campus da USP, em Ribeirão Preto,
obedecendo às normas regulatórias de Boas Práticas de Laboratório (BPL) e de Boas
Práticas de Fabricação (BPF). As vacinas permaneceram conservadas a temperatura
de -20°C até o momento do uso.
2.3- Protocolo imunoterápico
Cada cadela recebeu DNA (2mg por dose) + proteína-HSP65 (200µg por dose) em
um volume fixo de 1,0mL por meio de injeção intratumoral, totalizando três aplicações
com intervalo médio de 15 dias entre elas. A dose empregada foi a recomendada pelo
fabricante.
As cadelas, no momento da aplicação da vacina, foram contidas manualmente em
decúbito lateral, de forma que o tumor a ser tratado ficasse voltado para cima. Todos os
tumores foram medidos com auxílio de um paquímetro digital, antes de cada uma das
etapas do tratamento e aproximadamente 15 dias após o mesmo. Foram tomadas três
medidas em milímetros: largura (L), comprimento (C) e altura (A) dos tumores. O
volume tumoral foi calculado multiplicando-se as medidas obtidas: LxCxA (mm3). A
seguir, as cadelas recebiam a aplicação da vacina no tumor de maior volume, com
auxílio de seringa e agulha hipodérmica (13 x 4,5”).
2.4- Avaliação do tratamento e toxicidade
A avaliação do tratamento foi realizada levando-se em consideração a variação de
volume de todos os tumores, sendo classificados em: redução parcial (redução de 30%
ou mais do volume inicial do tumor), estável (redução de menos de 30% ou aumento de
até 20% do volume inicial do tumor), ou em progressão (aumento de mais de 20% do
volume inicial do tumor) (MICHALUART, 2008). As cadelas do grupo controle foram
avaliadas quanto à recorrência e presença de metástases a distância. Todas as cadelas
foram acompanhadas por um ano e três meses após os tratamentos.
20
Os critérios para avaliação de toxicidade basearam-se em avaliações clínicas, que
observaram os parâmetros semiológicos, o estado geral do paciente, resultados de
hemograma, dosagem sérica de alanina aminotransferase, fosfatase alcalina, proteína
total, albumina, creatinina, uréia e exame de urina, além dos resultados de
eletrocardiografia, ecocardiografia e exames radiográficos e ultrassonográficos.
Também foi avaliado o local de aplicação das vacinas, quanto a indícios de presença
de dor, inflamação, necrose, ou qualquer outra alteração.
2.5- Análise dos resultados
Os resultados dos tratamentos foram avaliados descritivamente comparando-se a
variação de volume dos tumores, as avaliações clínicas das cadelas e os resultados
dos exames laboratoriais antes e após o tratamento. O tempo de sobrevida foi avaliado
comparando-se com o grupo controle e a literatura pertinente.
21
3- Resultados e Discussão
Todas
as
cadelas
estudadas,
embora
apresentassem
tumor
mamário,
encontravam-se em bom estado geral. O estadiamento tumoral do grupo tratado,
segundo o TNM, antes da imunoterapia mostrou quatro tumores em estádio I, oito
estádio II e um em estádio V, este último por apresentar metástase pulmonar.
O número de tumores por cadeia mamária variou entre as cadelas. No grupo
tratado, uma delas apresentava tumor único, outra dois tumores, quatro cadelas três
tumores cada, cinco cadelas apresentavam quatro tumores cada, uma apresentava
cinco e outra seis tumores. Dez cadelas tinham tumores nas duas cadeias mamárias;
uma apenas na cadeia direita e duas cadelas apenas na cadeia esquerda.
O estadiamento dos tumores das cadelas do grupo controle, segundo o TNM,
mostrou cinco em estádio I e três em II. As cadeias mamárias comprometidas foram
retiradas durante a mastectomia.
Das 13 cadelas que iniciaram o tratamento imunoterápico, uma morreu logo após
a primeira dose da vacina, sendo então consideradas 12 cadelas nas análises. Seis
(46,1%) cadelas apresentaram regressão em pelo menos um dos tumores das cadeias
mamárias, não necessariamente naquele que recebeu a aplicação. Considerando-se
apenas o tumor que recebeu a aplicação, um (7,7%) apresentou regressão do tumor,
quatro (30,7%) se mantiveram dentro do limite classificado como estável e sete (53,8%)
apresentaram progressão tumoral. Se considerarmos que as 12 cadelas juntas
apresentavam 40 tumores mamários, a aplicação do imunoterápico produziu regressão
tumoral em nove deles (22,5%), estabilidade em 12 (30%) e progressão em 19 (47,5%).
Dos tumores classificados como estáveis, no intervalo adotado, 10 (25%) apresentaram
redução de volume (reduções de 28%, 25,6%, 16,6%, 27,9%, 18,5%, 25,9%, 11,3%,
22,7%, 9,5% e 15,9%), um (2,5%) não alterou seu volume e outro (2,5%) apresentou
aumento de volume (aumento de 12%). Gráficos mostrando a variação individual dos
volumes tumorais das cadelas estão apresentados na Figura 1. A localização dos
tumores, a variação em seus volumes antes e ao final do tratamento, como também a
classificação final podem ser observados na Tabela 1.
22
Tabela 1 – Localização da mama com tumor, diagnóstico histopatológico, variação percentual
entre volume tumoral inicial e final e a classificação do volume tumoral ao final do
tratamento das cadelas tratadas com o imunoterápico DNA-HSP65+proteína-HSP65.
Jaboticabal, SP, Brasil, 2011.
CADELA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
LOCAL DOS
TUMORES
M2E*
M1D
M4D
M3D
M3D
M4D
M2E
M1D
M1E
M2D
M3E
M4D
M2D
M5D
M4E
M1D
M2E
M2E
M1E
M4E
M5E
M3D
M4D
M3E
M4E
M5E
M2D
M4E
M3E
M5D
M5E
M3E
M3E
M4E
M2E
M5E
M4E
M3E
M4E
M5D
DIAGNÓSTICO
HISTOPATOLÓGICO
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinoma complexo
carcinoma complexo
carcinoma complexo
carcinoma simples
carcinoma simples
carcinoma simples
VARIAÇÃO DO
VOLUME
-28%
+26,2%
+21,5%
+103,6%
+60,1%
-25,6%
-16,6%
-27,9%
+30,5%
-83,7%
+113,8%
+141,5%
-30%
-45,1%
+47%
-55%
-48%
+30,3%
+12%
-18,5%
-65,5%
+180,6%
+109,1%
-25,9%
-65%
-31,8%
0%
-75,1%
+52,4%
-11,3%
+44,7%
+98,8%
-22,7%
+145,3%
+44%
+59,7%
-9,5%
+24,5%
-15,9%
+174,3%
*as linhas em negrito mostram as mamas que receberam a vacina
M = mama; E = esquerda, D = direita. Algarismo arábico = número da mama na cadeia
CLASSIFICAÇÃO
estável
progressão
progressão
progressão
progressão
estável
estável
estável
progressão
regressão
progressão
progressão
regressão
regressão
progressão
regressão
regressão
progressão
estável
estável
regressão
progressão
progressão
estável
regressão
regressão
estável
regressão
progressão
estável
progressão
progressão
estável
progressão
progressão
progressão
estável
progressão
estável
progressão
23
Figura 1 – Variação individual dos volumes tumorais das cadelas na 1ª, 2ª e 3ª aplicações do
imunoterápico DNA-HSP65+proteína-HSP65 e aproximadamente 15 dias após o final do
tratamento (R). As linhas azuis em todos os gráficos correspondem ao tumor que recebeu a
aplicação do imunoterápico. O grafico da cadela 11 mostra o volume do tumor na 1ª, 2ª e 3ª
aplicações. Entre a 3ª aplicação e a reavaliação, houve ulceração da mama aplicada, seguida de
mastectomia unilateral. O grafico da cadela 12 representa um animal que não compareceu à
terceira avaliação.
24
Das doze cadelas que terminaram o tratamento com o imunoterápico (uma veio a
óbito), três que receberam o diagnóstico de carcinoma complexo exibiram
comportamentos tumorais distintos; um tumor foi classificado em regressão, um em
progressão e um estável. Outras três cadelas com carcinoma simples, da mesma
forma, dois apresentaram progressão e um estabilidade. As outras seis cadelas tinham
o diagnóstico histopatológico de carcinossarcoma, um tipo de tumor mamário misto,
composto por células neoplásicas de origem mesenquimal e epitelial. A parte
mesenquimal do tumor pode conter formação de tecido ósseo (MISDORP et al., 1999),
o que dificulta sua completa regressão. Destes, quatro tumores vacinados
apresentaram progressão e dois permaneceram estáveis.
Tumores mamários que apresentam tecidos de diferentes origens, não são
incomuns em cadelas. Em alguns casos, cadelas podem apresentar tumores na mesma
cadeia mamária de diferentes diagnósticos histopatológicos (SORENMO, 2009;
SLEECKX, 2011). Este fato poderia justificar, ao menos em parte, porque os tumores
de uma mesma cadela apresentaram comportamentos diferentes, diante do tratamento.
Como apenas o tumor vacinado recebeu o laudo histopatológico e isto pode representar
uma limitação de nosso estudo. Outro fator diz respeito ao pequeno número de cadelas
apresentando um mesmo tipo histopatológico de tumor, o que não nos permitiu
estabelecer uma relação entre a resposta ao tratamento e o diagnóstico histopatológico.
Embora a casuística de tumor de mama seja elevada no serviço de oncologia do
Hospital Veterinário da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus
de Jaboticabal, muitos proprietários não concordaram, por motivos variados, em incluir
seus animais no experimento.
Vacinas de DNA geralmente são utilizadas em associação com a técnica de
eletroporação para facilitar a transfecção do DNA heterólogo nas células tumorais,
devido a abertura dos poros na membrana das células (SANTOS, 2008; YU, 2011).
Neste estudo, optou-se pela não utilização da eletroporação, já que houve a associação
do DNA-HSP65 com a proteína-HSP65 para estimular uma resposta mais rápida, até
que o DNA fosse transfectado para a célula tumoral e esta passasse a produzir a
proteína HSP65.
25
Em relação à regressão tumoral obtida, nosso estudo apresentou resultados mais
promissores, se compararmos com o ensaio clínico com 14 pacientes humanos com
carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço em estágio avançado, também
tratados com a vacina DNA-HSP65 por via intratumoral. Nesse estudo, 28,6% dos
pacientes tiveram redução do volume tumoral, 7,1% estabilização e 64,3% progressão
(MICHALUART et al., 2008). Além dos pacientes humanos se encontrarem em estágio
mais avançado da doença, outra possibilidade poderia recair nas diferentes
quantidades de DNA-HSP65 utilizadas e, no nosso estudo da associação com a
proteína (DNA-HSP65+proteína-HSP65).
Um estudo com as proteínas de choque térmico em cães avaliou a HSP70
derivada de galinhas, como agente profilático ou imunomodulador no tratamento de
cães com tumor venéreo transmissível (TVT). Cães receberam duas doses da vacina
com 100µg de HSP70 antes da inoculação das células de TVT e uma terceira dose,
seguida de eletroporação, após a inoculação. O outro grupo recebeu três doses da
vacina (100µg), após a inoculação das células tumorais. Foi observado que o grupo que
recebeu a vacinação de forma profilática apresentou regressão parcial ou completa do
tumor, enquanto no outro grupo o tumor não regrediu apesar de o crescimento tumoral
ter sido menor, quando comparado ao grupo sem nenhum tipo de tratamento (YU,
2011).
Em relação à dose do DNA utilizada, enquanto Michaluart et al. (2008) utilizaram
400µg, em nosso estudo foram 2000µg. Os autores ressaltam que 400µg foi a
quantidade máxima tolerada pelos pacientes humanos, pois quando empregaram
600µg, esta quantidade de DNA produziu efeitos adversos intoleráveis, como edema e
dor mais pronunciados do que quando empregaram 400µg, de modo a gerar uma
contra-indicação para a dosagem mais elevada.
Apesar de mais brandas e aceitáveis, Michaluart et al. (2008) também observou
dor, edema e infecção no local da aplicação em pacientes humanos com a dose de
400µg. Outros estudos em pacientes com carcinoma renal e linfoma não-Hodgkin que
utilizaram Vitespen®, HSP-96 autóloga complexada a um peptídeo tumoral (HSPPC-96),
aplicada via intradérmica, apresentaram eritema e endurecimento da região aplicada
26
(WOOD et al., 2008), e eritema e prurido (OKI et al., 2006), respectivamente. Neste
último caso, os sinais desapareceram em até 24 horas depois, sem tratamento. Em
nosso estudo, a aplicação intra-tumoral também resultou em dor e inflamação no local,
que se resolveu em menos de 24 horas sem intervenção, como descrito por Oki et al.,
(2006). Apesar de a dose empregada ser cinco vezes maior no presente estudo do que
em outro (MICHALUART et al., 2008), esta dose não gerou efeitos adversos que
comprometessem sua utilização. Um ponto a ser considerado diz respeito à
subjetividade em se mensurar a dor. Respostas individuais entre e interespécies
animais, além do possível maior limiar de dor dos animais podem dificultar ainda mais
essa comparação. A quantidade maior de DNA e ainda associada à proteína
recombinante HSP65, foi utilizada somente em nosso estudo, e esta formulação
também pode ter influenciado nos resultados. Todavia, não existem outros estudos com
essa formulação feitos por esse grupo de pesquisa, o que dificulta comparação de
efeitos e eficácia.
O edema e a dor no local da aplicação podem ser devidos à inflamação causada
pela própria inoculação da vacina no sítio tumoral. Estes sinais foram considerados
como efeitos adversos mínimos do tratamento, que podem ter sido desencadeados pela
aplicação do DNA associado à proteína, ambos heterológos. A aplicação per se pode
quebrar o estado de equilíbrio entre o tumor e o hospedeiro, provocar o recrutamento
de células inflamatórias, que se ativam no sitio tumoral, produzindo uma resposta
antitumoral. A infiltração do tumor por células inflamatórias em decorrência da aplicação
do HSP65 intratumoral já foi demonstrada nos estudos de Santos (2008) em
camundongos com melanoma.
Uma cadela do grupo tratado, a única cadela que apresentava metástase
pulmonar antes do início do tratamento, três dias após a primeira aplicação intratumoral
da
vacina
DNA-HSP65+proteína-HSP65
desenvolveu,
localmente,
severa
edemaciação, com hiperemia e sensibilidade dolorosa da mama vacinada, em parte da
cadeia mamária e na face interna da coxa ipsilateral, acompanhada por prostração,
hiporexia e febre (40ºC). Cinco dias após a manifestação desses sintomas, mesmo
sendo tratada com antibióticos, antiinflamatório, antitérmico e analgésico, veio a óbito. A
27
cadela foi submetida à necropsia, que revelou como causa da morte, hemorragia no rim
esquerdo, além de apresentar abscesso na mama que recebeu a vacina. A causa da
hemorragia não foi elucidada. Diante disso, não foi possível relacionar a morte do
animal com a aplicação da vacina, ou mesmo como consequência da progressão
neoplásica, ou ainda a somatória dos dois fatores. Entretanto, Michaluart et al. (2008)
também observaram infecção no local da aplicação, seguida de morte por hemorragia,
devido a progressão tumoral em pacientes humanos com carcinoma de cabeça e
pescoço.
Apesar desse acontecimento, nenhum efeito adverso sistêmico pode ser
comprovado por meio de exames laboratoriais e clínicos, pois estes sempre se
mantiveram dentro dos limites de normalidade para a espécie, antes e após o
tratamento. Não houve comprovação de que o imunoterápico tivesse implicação direta
com o quadro clínico do animal que morreu após a aplicação.
Em relação ao estadiamento dos tumores, apenas uma cadela do grupo tratado
apresentou alteração do TNM após o tratamento, passando de II para V. Isto se deveu
ao aparecimento de metástase pulmonar na última avaliação. Além da metástase, esta
mesma cadela apresentou ulceração do tumor da mama cinco (M5) direita, detectada
entre a 3ª aplicação e a reavaliação. Ressalta-se aqui que o imunoterápico foi aplicado
na M5 esquerda. A progressão da neoplasia fez com que esta cadela fosse submetida
à mastectomia da cadeia mamária correspondente. Um mês após o tratamento, o
quadro do animal se agravou, com aumento das metástases pulmonares, que evoluiu
para insuficiência respiratória e óbito.
Das onze cadelas que permaneceram vivas, oito delas foram submetidas à
mastectomia da cadeia mamária afetada em torno de seis meses após da última
avaliação, devido a não regressão completa dos tumores (observar momento R na
Figura 1). As outras três cadelas, por opção dos proprietários, não foram submetidas ao
procedimento cirúrgico, embora ainda apresentassem tumores (Tabela 1). Um ano e
três meses após o final do tratamento, as oito cadelas submetidas ao tratamento
imunoterápico e subsequente mastectomia se mantém saudáveis, sem recidivas ou
sinais de metástases a distância. As três cadelas que não fizeram a cirurgia estão em
28
bom estado geral e as neoplasias mamárias se mantêm estáveis, e não há sinais de
metástases a distância detectados por exame radiográfico ou ultrassonográfico.
Sete das oito cadelas do grupo controle (submetidas apenas ao procedimento
cirúrgico), também após um ano e três meses estão em boas condições de saúde e
sem evidências de metástases pelos estudos radiográficos e ultrassonográficos. Uma
das cadelas, após a mastectomia unilateral, apresentou evolução rápida dos tumores
da cadeia remanescente, com infiltração para região inguinal e membro pélvico
correspondente, passando do TNM II para III. Este animal foi encaminhado para
quimioterapia, recebendo doxorrubicina e ciclofosfamida, mas não respondeu ao
tratamento sendo submetido à eutanásia.
O tumor de mama, apesar de ser a neoplasia mais comum nas fêmeas caninas
(GORMAN & DOBSON, 1995; ZUCCARI, 2001) ainda é uma doença de difícil controle
e cura, tendo em vista que 58% das cadelas que são submetidas à mastectomia
regional apresentam recidiva tumoral na cadeia ipsilateral (STRATMANN, 2008). Uma
das causas pode ser a presença de micrometástases na cadeia linfática da mama e em
linfonodos de drenagem e a imunomarcação por anticorpos anti-citoqueratina pode ser
requerida para identificação das micrometástases, não reveladas com a coloração de
rotina (BUSCH & RUDOLPH, 1995).
A sobrevida de cadelas submetidas a mastectomia regional ou radical varia de
acordo com as experiências de pesquisadores. Bostock (1975) acompanhou, por dois
anos, 323 cadelas com neoplasias mamárias após a mastectomia regional ou radical e
observou que o tempo médio de vida daquelas com neoplasias mamárias malignas foi
de 70 semanas (aproximadamente um ano e quatro meses). Por sua vez, MacEwen et
al. (1985) não observaram diferença significativa entre a sobrevida e o tempo livre da
doença de cadelas submetidas à mastectomia radical ou parcial. Os resultados de Sarli
et al. (2002) mostraram que 23,3% de 60 cadelas com neoplasias mamárias malignas,
morreram em até dois anos após a mastectomia. Outro estudo mostrou a sobrevida
média para cadelas com adenocarcinoma e carcinoma sólido de mama foi de um ano e
nove meses e de um ano e quatro meses, respectivamente (PHILIBERT et al., 2003).
Outros pesquisadores observaram sobrevida média de 390 dias (um ano e um mês) em
29
cadelas após mastectomia e mostraram não haver variação significativa entre o grupo
que foi submetido apenas à mastectomia e outro grupo que recebeu no pós operatório
quimioterapia com doxorrubicina ou docetaxel (SIMON et al., 2006). Já Lavalle et al.
(2009) observaram sobrevida de 907 dias (aproximadamente 2,5 anos) em 46 cadelas
que fizeram parte dos estudos. Em nosso estudo, as cadelas foram acompanhadas por
um ano e três meses. Duas das cadelas do grupo tratado, uma pela progressão do
tumor e outra por hemorragia renal, e uma do grupo controle, por progressão do tumor,
vieram a óbito. Todos esses resultados expõem muitos outros fatores que podem estar
envolvidos na patogênese dos tumores mamários das cadelas, não a simples adoção
de um procedimento em detrimento ao outro tenha, isoladamente, o potencial de mudar
o curso da doença.
Vários são os estudos que abordam a sobrevida de cadelas com tumores de
mama após o diagnóstico e tratamento e os resultados são variáveis. Muitos aspectos
devem ser considerados para se projetar a sobrevida de uma cadela com tumor
mamário. Um deles diz respeito ao tempo de doença, agressividade do tumor, idade da
cadela e presença de metástases. Outro ponto a ser considerado refere-se a
sensibilidade
das
técnicas
diagnósticas
frequentemente
empregadas.
Exames
radiográficos e ultrassonograficos apresentam baixa sensibilidade e muitos tumores
podem ter micrometastases não detectáveis por esses métodos. Para Philibert et al.
(2003), animais que apresentam metástases no momento do diagnóstico têm sobrevida
média de cinco meses, o que também foi acompanhado em duas cadelas do nosso
estudo; uma que já apresentava metástase pulmonar no momento do diagnóstico e veio
a óbito dias depois do início do tratamento, e outra que apresentou metástase após o
tratamento.
Tratamentos imunoterápicos em diversos tipos de neoplasias de cães apresentam
resultados semelhantes ao nosso. BCG intratumoral em um fibrossarcoma nasal
provocou redução do volume tumoral (PLIEGO et al., 2007), por via intravenosa em
cadelas após mastectomia, propiciou sobrevida de 100 semanas (1 ano e 11 meses),
em contraste ao grupo controle, submetido apenas à mastectomia, no qual a sobrevida
foi de 24 semanas (5 meses e meio) (BOSTOCK & GORMAN, 1978).
30
Diferentemente do observado por Bostock e Gorman (1978), o grupo controle em
nosso estudo não mostrou comprometimento de saúde um ano e três meses após a
mastectomia radical. Estas discordâncias podem estar relacionadas às técnicas
cirúrgicas e diagnósticas empregadas pelos outros autores. Houve uma acentuada
evolução nas técnicas operatórias e nos meios e métodos de diagnóstico na Medicina
Veterinária. É possível que se o experimento de BOSTOCK e GORMAN (1978) fosse
repetido nos dias de hoje, a sobrevida dessas cadelas seria maior.
O uso da imunoterapia vem ganhando importância devido aos resultados
promissores que produz, se mostrando atrativa por sua potencial eficiência contra o
câncer. A estratégia utilizada neste estudo foi baseada na capacidade da HSP65 formar
complexos com os antígenos tumorais do tumor que recebeu a aplicação e assim,
quebrar a tolerância imunológica e facilitar a apresentação de antígenos tumorais para
o sistema imune, gerando uma resposta imunológica eficaz contra as células tumorais
(LIU et al., 2002; MICHALUART et al., 2008). O conceito de vigilância imunológica,
onde o sistema imune seria capaz de reconhecer e destruir células que sofreram
mutação, antes de se transformarem em neoplasias, é apoiado pelo fato de indivíduos
imunodeprimidos apresentarem uma maior incidência de tumores. Apesar disso, as
células tumorais são capazes de driblar essa vigilância e se instalarem no organismo
(DUNN et al., 2002; BERGMAN, 2009; BERGMAN, 2010), pois uma das formas do
tumor não ser atacado pelo sistema imune é o não reconhecimento dos seus antígenos
tumorais (ABBAS & LICHMAN, 2005; BERGMAN, 2010). As vacinas contra o câncer
representam um dos meios mais desafiadores e multidisciplinares para o tratamento
dos pacientes. Teoricamente, pacientes que recebem este tipo de vacina adquirem a
capacidade de montar uma resposta imune contra o câncer, mantendo-o sob controle,
retardando sua recorrência e prolongando a sobrevivência. Vacinas compostas por
proteínas são capazes de gerar respostas por células CD4 (restritas ao MHC-II), com
menor indução de células citotóxicas (KALINSKI el al., 2009).
Diante da necessidade da formação de complexos com os antígenos tumorais
para atingir o sucesso do estímulo imunológico, podemos sugerir que alguns animais
apresentaram uma melhor transfecção do DNA, melhor complexação com antígenos
31
tumorais e consequentemente melhor estímulo imunológico, o que poderia explicar as
diferentes respostas individuais do tratamento. A dose e volume utilizados e a forma de
aplicação merecem estudos posteriores e, possivelmente, se individualizadas, podem
gerar respostas mais eficazes.
32
4- Conclusões
Os resultados obtidos nesta pesquisa, de acordo com o protocolo experimental
empregado permitem concluir:
1. O imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 não foi capaz de provocar
regressão total dos tumores mamários que receberam a aplicação, nem
tampouco de outros que as cadelas apresentavam;
2. O imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 produziu efeitos sistêmicos
uma vez que provocou regressão parcial de tumores não aplicados;
3. O imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 produz mínimos efeitos
adversos, os quais não comprometem a saúde do animal tratado;
4. O prognóstico das cadelas portadoras de tumores mamários malignos tratados
com o imunomodulador DNA-HSP65+proteína-HSP65 se assemelhou ao obtido
com a mastectomia radical, até onde pode ser acompanhado.
33
CAPÍTULO 3 – Avaliação Imunológica de Cadelas com Tumores Mamários
Malignos Submetidas à Imunoterapia com DNA-HSP65+Proteína HSP65
RESUMO – A procura de novas estratégias de tratamento para o câncer de mama
em cadelas, associado ao crescente avanço da imunoterapia motivaram o
desenvolvimento deste estudo, tendo em vista que a quimioterapia nestes tumores não
apresenta os efeitos desejados. A HSP-65 é uma proteína de choque térmico com
grande potencial imunoestimulante, tanto da resposta imune inata quanto da adaptativa.
Baseado nesta característica, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia e o
potencial imunoestimulatório do imunoterápico DNA-HSP65+proteína-HSP65 em
cadelas 12 portadoras de tumores mamários malignos. As cadelas receberam um total
de três doses do imunoterápico via intratumoral, com intervalo médio de 15 dias entre
as aplicações. O potencial imunoestimulante foi avaliado antes do início do tratamento e
aproximadamente 15 dias após a última aplicação do imunoterápico DNAHSP65+proteína-HSP65. A citometria de fluxo foi utilizada para identificação de células
natural killers (NK) ativadas, células B e T, CD4 e CD8, monócitos, monócitos ativados,
macrófagos e células dendríticas, além da avaliação da proliferação espontânea de
células mononucleares. A produção de anticorpos anti-HSP65 foi conduzida pelo teste
ELISA. A imunoterapia não promoveu estímulo imunológico sistêmico significativo
detectado, apesar de ter provocado regressão parcial em nove (22,5%) dos 40 tumores
presentes nas cadeias mamárias das cadelas. Todas as cadelas apresentaram
anticorpos anti-HSP65 antes do tratamento e aumento dessa resposta após. A
proliferação leucocitária, apesar de não significativa, foi maior quando estimulada pela
HSP65 após o tratamento em cinco cadelas. Apesar dos indícios clínicos do efeito
sistêmico do tratamento, as cadelas não foram capazes de apresentar uma reposta
imunológica sistêmica efetiva que pudesse ser comprovada pelos testes realizados. É
possível que o efeito imune da aplicação da vacina DNA-HSP65+proteína HSP65 seja
melhor detectado in situ do que sistemicamente.
Palavras-chave: cadela, HSP65, imunoterapia, neoplasia, tumor de mama, vacina
gênica, sistema imune.
34
1-Introdução
O câncer de mama é a neoplasia mais comum em cadelas (GORMAN &
DOBSON, 1995; ZUCCARI, 2001), representando aproximadamente 52% de todas as
neoplasias observadas em fêmeas desta espécie (GORMAN & DOBSON, 1995;
PEREZ-ALENZA, 1998; ZUCCARI, 2001). Aproximadamente em 25% dos casos de
tumores mamários malignos, as cadelas apresentam metástases no momento do
diagnóstico (KITCHELL, 1995; OGILVIE & MOORE, 1995; MORRISON, 2002). A
grande incidência dessa doença e a preocupação cada vez maior com os animais de
estimação estimulam a investigação de novos e mais efetivos protocolos de tratamento.
Teoricamente, o sistema imune teria a capacidade de tão logo um agente
agressor penetrasse no organismo, ou antígenos “nonself” fossem detectados, estes
seriam reconhecidos por macrófagos, células NK e linfócitos e eliminados por meio da
ação de uma bateria de substâncias líticas ou por apoptose. Embora o sistema imune
seja constituído por um arsenal de células, citocinas, interleucinas e quimiocinas,
liberadas durante um processo imune, nem sempre a resposta imune é desencadeada
em sua totalidade, ou mesmo se torna efetiva (GREENBERG, 2004, ABBAS &
LICHMAN, 2005; BERGMAN, 2010, VERGATI, 2010).
A imunidade inata e imunidade adquirida são responsáveis pelas respostas
antitumorais.
A
imunidade
inata
reconhece
rapidamente
antígenos
“nonself”,
desencadeando uma resposta protetora mediada por células e fatores humorais
direcionados. As principais células envolvidas neste tipo de imunidade são os
neutrófilos, macrófagos, monócitos, células dendríticas, células NK, basófilos,
eosinófilos e o sistema complemento. As células dendríticas apresentam antígenos
tumorais aos linfócitos T, além de serem grandes produtoras de IFN-γ. Por sua vez, as
células NK, além de produzirem citocinas, podem lisar células tumorais quando se ligam
a receptores e a moléculas de MHC (complexo de histocompatibilidade) de outras
células apresentadoras de antígenos. A imunidade adquirida é responsável pela
resposta adaptativa, específica contra a célula transformada. As células responsáveis
por este tipo de resposta são os linfócitos B e T, produzindo anticorpos antígenoespecíficos que se ligam a célula do tumor e desempenham atividade tumoricida, ou
35
ativando células citotóxicas (CD8) e helper (CD4), respectivamente. A ativação das
células citotóxicas e helper desencadeiam uma serie de eventos, com produção de
citocinas que visam destruir a célula transformada (DUNN et al., 2002; ZITVOGEL et al,
2006; SANTOS, 2008; BERGMAN, 2010, VERGATI, 2010). A indução de células CD8+
ativadas depende de sua interação com outras células, particularmente as CD4+ e as
células apresentadoras de antígenos. Todavia, a maioria das imunoterapias buscar
estimular a resposta imume mediada por células contra antígenos tumorais
(ROSENBERG et al., 2004).
As HSPs atuam como chaperonas moleculares e mostram atividade adjuvante,
participam na apresentação de antígenos (SRIVASTAVA et al., 1998), assim como
medeiam a maturação fenotípica e funcional de células dendríticas (BINDER et al.,
2000). Por todas essas potencialidades, elas são usadas em várias estratégias na
imunoterapia do câncer (JANETZKI et al., 2000; OKI & YOUNES, 2004).
Os complexos HSP-peptídeos são formados, preferencialmente, dentro das
células, sendo liberados quando ocorre apoptose das mesmas e, no meio extracelular,
interagem com receptores de células dendríticas, como TLR2, TLR4, CD14, LOX1 ou
CD40. Essa interação pode levar a maturação fenotípica e funcional dessas células,
com consequente liberação de quimiocinas e citocinas pró-inflamatórias (IL-12 e TNFalfa), aumento da expressão de moléculas MHC de classe II e moléculas coestimulatórias como CD86 e CD40 (BINDER et al., 2002). Outra via de ativação ocorre
quando os complexos HSPs-peptídeos interagem com o receptor CD91 das células
dendríticas, culminando com o processamento e apresentação do peptídeo conjugado,
tanto em contexto de apresentação cruzada por moléculas MHC classe I, quanto classe
II. Como resultado, ocorre ativação de células CD8 e CD4, que são específicas para os
peptídeos conjugados (MATSUTAKE & SRIVASTAVA, 2000).
Associado às características da HSP65 em estimular o sistema imune com a
vantagem desta molécula em poder se associar ao repertório de antígenos do tumor
tratado, mesmo que estes não estejam bem caracterizados, a imunoterapia com a
HSP65 se torna promissora para o tratamento de diversos tipos de câncer.
36
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito e a estimulação da resposta imune em
cadelas com tumores mamários malignos tratados com a vacina DNA-HSP65+proteína
HSP65.
37
2- Material e Métodos
2.1- Grupo experimental
Participaram do estudo fêmeas caninas que obedecessem os seguintes critérios
de inclusão: (I) diagnóstico de tumor mamário maligno localizado ou metastático; (II)
ausência de doença concomitante, ou de outras neoplasias não mamárias; (III) último
tratamento quimioterápico ou cirúrgico há mais de 30 dias, quando realizado. O critério
de exclusão foi a presença de tumores mamários ulcerados ou necrosados.
Os tumores de maior volume foram submetidos à biopsia, após anestesia das
cadelas, para se obter o diagnóstico histopatológico. O processamento histopatológico
obedeceu as normas de fixação, inclusão e coloração do Departamento de Patologia
Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de
Jaboticabal.
Participaram do estudo 12 cadelas adultas portadoras de tumores mamários (seis
carcinossarcomas, três carcinomas simples e três carcinomas complexos) que
receberam
tratamento
com
a
vacina
contendo
o
gene
heterólogo
DNA-
HSP65+proteína-HSP65. Todas as cadelas passaram por avaliação clínica previa,
durante e após o tratamento. Os tumores foram estadiados antes e após o tratamento,
de acordo com o TNM modificado (OWEN, 1980) (Anexo 1).
O projeto foi aprovado (protocolo 0020418-08) pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de
Jaboticabal (Anexo 2), e os proprietários de todos as cadelas assinaram um termo de
livre consentimento autorizando a entrada das mesmas no experimento.
2.2- Imunoterapia
Cada cadela recebeu DNA (2mg por dose) + proteína-HSP65 (200µg por dose) em
um volume fixo de 1,0mL por meio de aplicações intratumorais, totalizando três
aplicações com intervalo médio de 15 dias entre elas. As cadelas foram acompanhadas
clinicamente por um ano e três meses após o tratamento.
As cadelas, no momento da aplicação da vacina, foram contidas manualmente em
decúbito lateral, de forma que o tumor a ser tratado ficasse voltado para cima. Após
38
posicionamento adequado, todos os tumores foram medidos com auxílio de um
paquímetro digital, antes de cada uma das etapas do tratamento e aproximadamente 15
dias após o mesmo. Foram tomadas três medidas em milímetros da largura (L),
comprimento (C) e altura (A) dos tumores. O volume tumoral foi calculado multiplicandose as medidas obtidas: LxCxA (mm3). A seguir, as cadelas recebiam a aplicação da
vacina com auxilio de seringa hipodérmica no tumor de maior tamanho, selecionado no
início do tratamento.
A avaliação clínica do tratamento foi realizada levando-se em consideração o
volume inicial e final de todos os tumores, sendo classificados em: redução (redução de
30% ou mais do volume inicial do tumor), estável (redução de menos de 30% ou
aumento de até 20% do volume inicial do tumor), e progressão (aumento de mais de
20% do volume inicial do tumor).
2.3- Avaliação da imunidade
Todas as técnicas laboratoriais utilizadas nos experimento foram conduzidas no
laboratório de pesquisa do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de
Medicina da USP, Ribeirão Preto, sob responsabilidade do Prof. Dr. Célio Lopes Silva.
2.3.1 - Ensaio Imunoenzimático (ELISA): A resposta de anticorpos específicos antiHSP65 foi avaliada pelo teste ELISA, pela detecção de anticorpos das classes IgG1
(cat. E40-120, ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories) e IgG2a (cat. E40-121,
ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories) nas amostras de soro das cadelas préimunes (dia zero) e depois, ao final dos tratamentos (em média 17 dias da última
imunização). A cobertura da placa foi feita com 100µL/poço de proteína HSP65 diluída
em tampão de ligação na concentração 5µL/mL. As reações inespecíficas foram
bloqueadas com 200µL/poço de tampão de bloqueio com incubação de uma hora a
37ºC. As placas foram protegidas da luz e incubadas por duas horas a 37ºC com 100µL
das amostras de soro nas diluições pretendidas. A placa foi incubada com o anticorpo
biotinilado diluído a 1:1000 (100µL/poço) em tampão de bloqueio por 1 hora a 37ºC.
Após a lavagem com PBS, a reação foi marcada com Strep AB HRP (DAKO®) e
revelada com 100µL/poço de solução de OPD (Sigma®), protegida da luz, por
39
aproximadamente 15 minutos. A reação foi interrompida com 50µL/poço de H2SO4 a
16% e lida em leitor de ELISA a 490nm.
2.3.2 - Separação de células mononucleares: as células mononucleares foram isoladas
a partir de 20-40mL de sangue periférico, coletados em tubos heparinizados, por meio
de punção venosa. Amostras de sangue foram diluídas (1:1) em solução salina
isotônica e separadas em gradiente de Ficoll-Hypaque, com densidade 1.077g/L (FicollPaque PLUS, Amersham Biosciences, Suécia). Após centrifugação a 720xg por 30
minutos, o anel de células mononucleares foi coletado e ressuspenso em salina e
centrifugado a 720xg por 10 minutos. As células foram lavadas em salina e
centrifugadas a 180xg duas vezes para a remoção de plaquetas.
2.3.3 - Citometria de fluxo: A citometria de fluxo foi utilizada para identificação de
células NK ativadas, células B e T, CD4 e CD8, monócitos ativados, monócitos
expressando MHC II, macrófagos e células dendríticas, de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1- Relação dos anticorpos produzidos pela Becton Dickinson e utilizados na
citometria de fluxo, com número de catálogo e volume empregado, Jaboticabal,
SP, Brasil, 2011.
TUBO
tubo 1
tubo 2
tubo 3
tubo 4
tubo 5
tubo 6
tubo 7
ANTICORPO
CD94 APC
CD58 PE
CD81 APC
CD80 PE
CD14 PECy7
HLA-DR PE
CD14 PE Cy7
CD95 PE Cy5
CD14 PECy7
CD11c PE
CD95 PE Cy5
CD14 PE Cy7
CD11b PE
COCKTAIL A (APC,
FITC,
PE)
COCKTAIL B (APC,
PE,
FITC)
MARCAÇÃO
células NK
monócitos
coestimulados
monócitos
expressando MHCII
células
dendríticas
macrófagos
Pan T
CD4
CD8
Pan T
Célula B
T ativada
CATALOGO e VOLUME
559876
10µL
555921
10µL
551112
10µL
553769
10µL
557742
2µL
555812
10µL
557742
2µL
559773
10µL
557742
2µL
555392
10µL
559773
10µL
557742
2µL
555388
10µL
558699
10µL
558704
10µL
40
As amostras de sangue foram distribuídas em tubos FACS em um volume de
100mL por tubo (1 x 106 células), e incubadas durante 30 minutos, a 4ºC, com anticorpo
anti-CD16/CD32 (Fc BlockTM- PharMingen), na concentração de 0,5 µg/106 células.
Posteriormente, essas células foram incubadas por 30min a 4ºC, protegida da luz, com
os anticorpos monoclonais de interesse. Após esse período de incubação, as células
foram centrifugadas e ressuspensas em 200µL de PBS contendo 1% formol para a
fixação das células. As preparações celulares foram adquiridas em FACSortTM (Becton
& Dickinson, San Diego, CA, USA). As células diferenciadas e estimuladas in vitro
foram selecionadas inicialmente considerando os parâmetros de tamanho e
granularidade. Em seguida, as células foram analisadas quanto à expressão dos
receptores de interesse. Os estudos citofluorométricos foram realizados num prazo
máximo de 24 horas após a coleta do sangue.
2.3.4 - Teste de proliferação espontânea de células mononucleares do sangue
periférico: as células foram transferidas para um tubo cônico de 15mL (BD Bioscience,
Franklin Lakes, NJ, USA), contendo 10mL de PBS estéril (livre de endotoxinas). A
suspensão foi centrifugada a 453xg por 10 minutos. Em seguida, as células foram
ressuspensas em 1mL de PBS, contadas em câmara de Neubauer, novamente
centrifugadas e ressuspensas de forma a terem concentração de 5-10 x 106/mL. Na
sequência, um volume igual de solução 5mM de CFSE (carboxyfluorescein succinidyl
ester) diluída 1:2000 foi adicionada ao tubo. A incubação foi feita em temperatura
ambiente por cinco minutos com agitação periódica. Decorrido o tempo de incubação,
foi adicionado SBF (soro fetal bovino, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) em cada tubo (5%
do volume total) para interromper o processo de marcação. Novamente, foram
adicionados 10mL de PBS estéril (livre de endotoxinas) e a solução foi centrifugada
duas vezes a 453xg por 10 minutos. As células foram ressuspensas em RPMI contendo
10% de SBF, contadas e sua concentração acertada para realização do ensaio de
proliferação. As células foram então plaqueadas em três poços, respeitando-se que um
contivesse apenas o meio de cultura, um segundo acrescido de Con-A e um terceiro
HSP65. As células, depois de plaqueadas, foram mantidas em cultivo por três dias e
41
após este período, foram coletadas e lavadas. A proliferação celular foi avaliada por
citometria de fluxo, tendo em vista que as células que se proliferam perdem a marcação
para CFSE.
2.4- Análises estatística
Foi realizada uma análise não paramétrica, o teste de Wilcoxon para comparação
dos valores pré e pós-tratamento de células NK ativadas, células B e T, CD4 e CD8,
monócitos, monócitos ativados, macrófagos e células dendríticas, produção de IgG1 e
IgG2 e proliferação leucocitária, através do programa GraphPad Prism 5. Um valor de
p<0,05 foi considerado significativo para todos os parâmetros.
42
3- Resultados e Discussão
Foram incluídas no estudo 12 cadelas portadoras de tumores mamários malignos,
de acordo com os critérios de inclusão e exclusão descritos previamente. Os
diagnósticos
histopatológicos
dos
tumores
que
receberam
a
aplicação
do
imunoterápico, o TNM e o número de tumores na cadeia mamária de cada cadela estão
apresentados na Tabela 2.
Se considerarmos somente o tumor que recebeu a aplicação, um animal (8,3%)
apresentou regressão parcial do tumor, quatro animais (33,3%) apresentaram
estabilidade e sete (58,3%) progressão tumoral (Tabela 2). Considerando a avaliação
de todos os tumores da cadeia mamária, seis cadelas (50%) apresentaram regressão
parcial de pelo menos um dos tumores. Somando-se todos os tumores de todas as
cadelas, encontramos 40 tumores mamários. Quando avaliados os 40 tumores, a
aplicação do imunoterápico produziu regressão tumoral em nove deles (22,5%),
estabilidade em 12 (30%) e progressão em 19 (47,5%).
Apesar de resposta clínica parcial ao tratamento ter sido identificada em 50% das
cadelas, os parâmetros imunológicos estudados (células NK ativadas, células B e T,
CD4 e CD8, monócitos, monócitos ativados, macrófagos e células dendríticas,
produção de IgG1 e IgG2 e proliferação leucocitária) não apresentaram diferenças
significativas pelo teste de Wilcoxon nos momentos antes e após os tratamentos
(p<0,05).
Resultado de outro estudo com a aplicação de DNA de proteína de choque
térmico (HSP70) de galinhas em cães mostrou que o tratamento apresentou apenas
efeito profilático e não terapêutico após a instalação do tumor, e o efeito profilático
efetivo somente após um reforço da vacina aplicado com eletroporação. Os animais
recebiam duas aplicações intradérmicas da vacina de DNA-HSP70 e depois eram
desafiados com células de TVT e 15 dias mais tarde recebiam um reforço da mesma
vacina com eletroporação. Este tratamento garantia a inibição do crescimento tumoral.
Quando era seguido o mesmo protocolo descrito, mas recebiam o reforço sem
eletroporação, ou quando os animais recebiam três doses da vacina depois da
43
inoculação das células tumorais, o tratamento não era eficaz na inibição do crescimento
tumoral (YU, 2011).
Tabela 2- Relação das cadelas participantes do experimento com respectivos
diagnósticos, TNM, evolução e variação do volume do tumor aplicado, em
porcentagem, após tratamento com DNA-HSP65+proteína HSP65,
Jaboticabal, SP, Brasil, 2011.
Cadelas
Diagnóstico
TNM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinossarcoma
carcinoma complexo
carcinoma complexo
carcinoma complexo
carcinoma simples
carcinoma simples
carcinoma simples
II
I
I
I
I
II
II
II
II
II
II
II
evolução do
tumor aplicado
estável
progressão
estável
progressão
progressão
progressão
estável
redução
progressão
estável
progressão
progressão
% de alteração do
volume tumoral
- 28%
+ 60,1%
- 27,9%
+ 141,5%
+ 47%
+ 30,3%
- 25,9%
- 75,1%
+ 98,8%
- 22,7%
+ 59,7%
+ 24,5%
Embora não se tenha conseguido detectar por meio dos testes empregados a
ativação imune pela vacinação, a maioria das cadelas responderam à aplicação do
imunoterápico, e isso pode ser observado pelo aumento da produção de anticorpos das
classes IgG1 e IgG2 após o tratamento imunoterápico (Figura 1).
Figura 1 – Representação gráfica de IgG1 e IgG2 pelo ensaio ELISA, na diluição de
1:100, DO 490nm, antes e 15 dias após o tratamento imunoterápico com DNAHSP65+proteína-HSP65. Jaboticabal, SP, Brasil, 2011.
44
Todos as cadelas do estudo tinham anticorpos anti-HSP65 antes do tratamento,
isso possivelmente se deve ao contato desses animais com Mycobacterium sp. no
ambiente, levando a reação cruzada e a produção de anticorpos (FINE, 1995). Apesar
de não haver diferença significativa na produção de anticorpos antes e depois do
tratamento, observamos que a produção tendeu ao aumento após o tratamento. As
cadelas tiveram respostas individuais muito variadas, o que pode ter interferido na
significância do teste estatístico. Este aumento na produção de anticorpos mostra que,
apesar da vacina ser aplicada por via intratumoral, houve absorção e efeito sistêmico
do produto. Todavia, não podemos afirmar se houve a transfecção do DNA para as
células do tumor e consequente produção da proteína, responsável pelo estímulo
antigênico necessário para a produção de anticorpos (investigação em curso). Este
estímulo poderia ter sido desencadeado pela resposta a aplicação da proteína pronta
de HSP65, que faz parte da formulação da vacina. No estudo de Santos (2008), após a
aplicação de DNA-HSP65 via intratumoral, a proteína recombinante HSP65 de
melanoma de camundongos foi recuperada. Contrariamente, Smith (2006) não pode
comprovar a transcrição do DNA injetado via intratumoral em pacientes humanos com
carcinoma de cabeça e pescoço, empregando Rt-PCR, devido a ocorrência de um
resultado falso positivo.
Embora as respostas imunológicas sistêmicas das cadelas não terem sofrido
alterações significativas após as vacinações, os tumores responderam diferentemente
frente ao tratamento. Num mesmo animal houve tumores que progrediram, outros que
ficaram estáveis e ainda outros que regrediram, mostrando a complexidade da
interação do tumor com seu hospedeiro. As Figuras 2 e 3 mostram os gráficos dos
parâmetros imunológicos antes e após o tratamento.
45
Figura 2 – Representação gráfica dos linfócitos T, T ativados, CD4 e CD8, obtidos por
citometria de fluxo nos tempos pré e 15 dias após o tratamento com o
imunoterápico DNA-HSP65+proteínaHSP65 de cadelas com tumores mamários
malignos. Jaboticabal, SP, Brasil, 2011.
46
Figura 3 – Representação gráfica dos monócitos, células dendríticas, macrófagos,
células NK e linfócitos B nos tempos pré e 15 dias após o tratamento com o
imunoterápico DNA-HSP65+proteínaHSP65 de cadelas com tumores
mamários malignos, obtidos por citometria de fluxo. Jaboticabal, SP, Brasil,
2011.
47
Não foi possível estabelecer uma relação entre as células imunes (linfócitos T e B,
células T ativadas, linfócitos CD4 e CD8, células dendríticas, macrófagos, monócitos,
monócitos ativados e células NK) e a resposta clínica em nenhum dos animais. As
pequenas variações registradas nos momentos pré e pós-tratamento não foram
consistentes, não apresentando nenhum padrão de resposta.
A aplicação do imunoterápico intratumoral pode não ter ativado efetivamente as
células apresentadoras de antígenos para uma resposta imune sistêmica efetiva. Houve
uma resposta imune humoral detectada, contudo estudos apontam que a redução de
um tumor estabelecido é conduzida, com sucesso, quando se consegue uma adequada
resposta imune celular (KLIMP et al., 2002; BANCHEREAU & PALUCKA, 2005).
Para se ter sucesso no reconhecimento e destruição das células tumorais, uma
cascata de eventos deve ser iniciada. As células NK podem destruir muitos tipos de
células tumorais, especialmente as que expressam moléculas MHC de classe I reduzida
e conseguem evadir-se da destruição por célula T. A capacidade tumoricida das células
NK é aumentada por algumas citocinas, incluindo interferons e interleucinas (IL-2 e IL12), e os efeitos antitumorais dessas citocinas são parcialmente atribuídos à
estimulação da atividade das células NK. As células dendríticas (DCs) são potentes
células apresentadoras de antígenos e podem iniciar uma resposta imune através da
fagocitose ou pelo processamento de antígenos derivados do tumor (ABBAS &
LICHMAN, 2005; BERGMAN, 2010).
Para a ativação de células T, as DCs enviam um “sinal de perigo”, como as
proteínas de choque térmico ou o interferon- , que são hábeis em reconhecer células
transformadas. Isto leva a expressão de moléculas co-estimulatórias, como CD80 e
CD40 na superfície das DCs, que migram para o linfonodo drenante do tumor e
apresentam o antígeno, ativando os linfócitos T. Os macrófagos são células importantes
na ativação da resposta imune humoral e como células efetoras, mediando a lise
tumoral. Para isso, precisam ser ativados, por meio do fator ativador de macrófagos
(MAF). Os MAF são secretados pelas células T após estimulação antigênica específica.
As linfocinas das células T com atividade de MAF são o interferon-γ, o TNF, e o fator de
estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos.
48
Os macrófagos ativados produzem fatores citotóxicos que medeiam a destruição
celular, como o fator de necrose tumoral, que induz trombose nos vasos sanguíneos
tumorais, bem como sua ligação às células transformadas e sua lise. Vários
mecanismos líticos distintos podem ser ativados, dependendo do MAF responsável pela
ativação do macrófago, como a liberação de enzimas lisossomais, de intermediários
reativos a oxigênio, óxido nítrico, liberação de proteinases neutras e secreção do TNF
(LANA et al., 2001; GREENBERG, 2004; ABBAS & LICHMAN, 2005; BERGMAN,
2010).
Uma das hipóteses para explicar a resposta clínica parcial obtida, com alteração
do volume tumoral seria a alteração do “status” imunitário dentro do ambiente tumoral
(NEESON & PATERSON, 2005), que poderia ser mais significativa do que a resposta
imune sistêmica, a qual foi avaliada neste estudo. A resposta imune “in situ” no estudo
em tela não foi investigada para se conjecturar apropriadamente sobre esse possível
mecanismo de ação da vacina DNA-HSP65+proteína-HSP65. Esta mudança do
ambiente tumoral já foi comprovada por Santos (2008), que observou aumento de
células CD8 ativadas no estroma tumoral, uma tendência ao aumento de CD4 e
aumento de células dendríticas que expressam CD86. Além disso, mostrou que as
células CD8 provocavam lise específica de células tumorais. Este mesmo pesquisador
também observou aumento da expressão de caspase 3, um marcador de apoptose, nos
tumores que foram inoculados com a HSP65.
Outra hipótese seria a presença de células T regulatórias prejudicando a eficiência
do imunoterápico. Aumento de células T regulatórias e da expressão de IL-10 em cães
com câncer já foi observado por Biller et al. (2007). Recentemente, Kim et al. (2011)
observaram a presença de célula T regulatórias em carcinomas mamários de cadelas,
relacionando seu aumento com pior prognóstico. A presença de células T regulatórias
no ambiente tumoral e no sangue periférico dos pacientes poderia ter prejudicado a
eficácia da vacina, visto que a presença destas células interfere com a resposta imune
de pacientes oncológicos por produzir citocinas como a IL-10 e outros fatores imunes
reguladores, além de inibirem a ativação de células T, prejudicando a resposta imune
(BAECHER-ALLAN &
ANDERSON,
2006;
PIERSMA
et al.,
2008).
Achados
49
semelhantes em tumores de mama de mulheres foram descritos (LIYANAGE et al.,
2002; BATES et al., 2006).
No presente estudo, não avaliamos as mudanças que possam ter ocorrido no
ambiente tumoral, nem a presença de células T regulatórias no sangue.
A resposta imunológica sistêmica frente ao uso da HSP65 já foi demonstrada em
diversos
experimentos.
Células
esplênicas
CD4
e
CD8
de
camundongos
imunocompetentes com tumor induzido, tratados intraperitonealmente com células
tumorais transfectadas com o DNA-HSP65, mostraram citotoxidade contra as células
tumorais in vitro (LUKACS, 1993). Wells et al. (1997) num estudo com camundongos
que receberam aplicação de células de melanoma demonstraram in vitro aumento de
MHC II em células tumorais transfectadas com HSP65 de Mycobacterium tuberculosis,
sendo que estas células foram eficientemente lisadas por linfócitos T citotóxicos. Outro
estudo de Li et al. (2006) utilizando camundongos com melanoma tratados com HSP65, mostrou inibição do crescimento tumoral.
Victora et al. (2009) em um estudo da imunidade sistêmica, não observou a
produção de IFN-γ por células mononucleares de sangue periférico, em resposta a
aplicação do HSP65 em pacientes humanos com carcinoma de cabeça e pescoço.
Mas, estes autores observaram aumento de interleucina-10 em quatro de 13 pacientes
analisados. Frente a estes resultados, outra possibilidade para os pacientes caninos
deste estudo, assim como os pacientes humanos estudados por Victora et al. (2009),
que não responderem completamente ao tratamento e não apresentarem respostas
imunológicas sistêmicas significativas, poderia ser a imunocompetência, já que ambos
os estudos foram realizados com pacientes portadores de tumores de ocorrência
natural.
Diferente de animais laboratoriais singênicos e com tumores induzidos, a presença
de tumores espontâneos pode significar uma prévia imuno incompetência do
hospedeiro, com falhas na imunovigilância e prevenção de tumores, além de fatores
produzidos pelo tumor após sua instalação no hospedeiro, provocando tolerância. Os
estudos de TAN (2001) ilustram este debate, pois o autor relata falha no crescimento
tumoral e resposta ao desafio com células tumorais, em camundongos utilizando
50
células tumorais 3LL (Lewis lung carcinoma) transfectadas com o HSP de
Mycobacterium bovis. Contudo, camundongos com imunodeficiência severa combinada
não foram capazes de impedir a progressão tumoral.
A proliferação leucocitária, conduzida com leucócitos extraídos de sete cadelas
tratadas, não diferiu entre os momentos pré e pós tratamentos com nenhum dos
estímulos utilizados (Figura 4). Interessante ressaltar que nos ensaios de proliferação
conduzidos somente com meio e com HSP65, houve uma tendência acentuada de
proliferação após o tratamento, exibindo inclusive curvas muito semelhantes.
Surpreendentemente, no caso do estímulo com a concanavalina-A (Con-A), um potente
estimulante de proliferação leucocitária, em três animais houve resposta proliferativa
após o tratamento, enquanto quatro apresentaram uma menor taxa de proliferação.
Figura 4 – Representação gráfica da proliferação leucocitária apenas com meio, com
concanavalina-A (Con-A), HSP65, nos tempos pré e 15 dias após o tratamento
com o imunoterápico DNA-HSP65+proteína-HSP65 de cadelas com tumores
mamários malignos, marcados com CFSE e lidos por citometria de fluxo.
Jaboticabal, SP, Brasil, 2011.
Das quatro cadelas que apresentaram aumento na proliferação leucocitária
quando estimulados pela HSP65, três delas tiveram seus tumores aplicados
classificados como estáveis, muito embora tenha havido diminuição do volume tumoral
(diminuições de 28%, 27,9% e 22,7%, dentro da faixa considerada estável). O outro
animal que respondeu ao estímulo apresentou progressão tumoral, com aumento de
47% do volume tumoral. Apesar da progressão do tumor aplicado, esta cadela tinha
mais dois tumores na cadeia mamária, que sofreram regressão de 55% e 48%. As três
cadelas que não responderam ao estímulo da HSP65, com redução na proliferação
51
leucocitária após o tratamento, apresentaram progressão tumoral (aumento de 141,5%,
98,8% e 59,7%). Diferente dos nossos resultados, dos pacientes com carcinoma de
cabeça e pescoço avaliadas por Victora et al. (2009), apenas um apresentou
proliferação leucocitária em resposta ao estímulo com HSP65. Este paciente também
tinha quadro de estabilidade tumoral, com redução de 2% do volume.
A resposta de linfoproliferação frente ao estímulo com a HSP65 e mesmo sem
estímulo (meio) demonstra que as cadelas não se encontravam em estado de anergia,
pois mantiveram a capacidade de resposta leucocitária quando estimuladas. Isto sugere
que mediadores químicos liberados pelo tumor ou células T regulatórias possam estar
atuando no sitio tumoral impedindo o reconhecimento dos antígenos tumorais pelo
sistema imune, e impedindo uma ação efetiva da HSP65, como já descrito em muitos
tumores (LIYANAGE et al., 2002; GREENBERG, 2004; ABBAS & LICHMAN, 2005,
BATES et al., 2006). Além disto, esse resultado pode indicar que a vacinação com o
HSP65 pode potencialmente romper este estado de anergia imposto pelo ambiente
tumoral. A vacinação com DNA-HSP65+proteína-HSP65 em posologia mais longa, ou
até em outra concentração deve ser encorajada.
De todos os parâmetros imunológicos sistêmicos avaliados nenhum deles se
mostrou significativo entre os tempos pré e pós tratamentos, apesar disso, observamos
respostas que merecem ser avaliadas individualmente. Avaliar as mudanças ocorridas
no ambiente tumoral e a presença de células T regulatórias, tanto sistêmicas como no
estroma tumoral e relacioná-los com a resposta clínica das cadelas pode auxiliar a
compreender os efeitos da vacinação a proporcionar alternativas de tratamento mais
adequadas e eficazes.
52
4- Conclusões
Os resultados obtidos nesta pesquisa, de acordo com o protocolo experimental
empregado permitem concluir:
1. A vacinação intratumoral com DNA-HSP65+proteína-HSP65 em cadelas com
tumores mamários malignos não foi capaz de causar regressão completa dos tumores;
2. O tratamento com DNA-HSP65+proteína-HSP65 em cadelas com tumores
mamários malignos não foi eficaz em causar estimulação imunológica sistêmica;
3. A regressão, mesmo que parcial, de tumores não aplicados sugere que o
imunoterapico DNA-HSP65+proteína-HSP65 tenha provocado efeito sistêmico;
4. As cadelas com neoplasias de mama malignas deste estudo foram capazes de
responder, mesmo que fracamente, a estímulos imunológicos, não se mostrando
anérgicas.
53
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS
Este é um trabalho pioneiro com o uso de uma vacina gênica codificadora da
proteína de choque térmico HSP65 no tratamento do tumor de mama de cadelas. Como
em todo trabalho pioneiro, existem várias questões que ainda devem ser pesquisadas e
respondidas, o que motiva a continuidade dos estudos sobre o tema, buscando elucidar
perguntas não respondidas. Para tanto, algumas perspectivas serão listadas:
•
Classificar histologicamente o tumor, levando em consideração o grau histológico
antes e após o tratamento, na tentativa de relacionar com o comportamento tumoral
observado;
•
Estudar o microambiente tumoral antes e após o tratamento, avaliando a
presença de células inflamatórias, da expressão de MHC I, MHC II, determinação da
população de células CD4, CD8, linfócitos B, monócitos, células dendríticas e células
NK, Foxp3 no ambiente tumoral. Após essa determinação, buscar comparar a resposta
in situ com a resposta sistêmica individual de cada cadela;
•
Determinar citocinas envolvidas no ambiente tumoral, através de RT-PCR antes
e após o tratamento, juntamente com a identificação das células presentes, para melhor
entender o ambiente tumoral;
•
Comprovar se a vacina gênica foi eficaz na transfecção do DNA aplicado no DNA
da célula tumoral, através de RT-PCR do tecido tumoral antes e após o tratamento;
Relacionar os dados clínicos individuais associando aos resultados de todas essas
propostas buscando-se subsídios para melhor alicerçarem o tratamento de cada animal.
54
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Estadual Paulista, Jaboticabal, 2001.
63
ANEXOS
64
Anexo 1- Sistema TNM modificado (Tumor/ Nódulo (Linfonodo)/ Metástase) do
proposto pela OMS (OWEN, 1980).
T - tumor primário
< 3 cm de diâmetro máximo
T1
3-5 cm de diâmetro máximo
T2
> 5 cm de diâmetro máximo
T3
N – linfonodos regionais
histologia ou citologia – sem metástases
N0
histologia ou citologia – presença de metástases
N1
M – metástases distantes
metástases distantes não detectadas
M0
metástases distantes detectadas
M1
I
II
III
IV
V
CLASSIFICAÇÃO TNM
T1
N0
T2
N0
T3
N0
qualquer T
N1
qualquer T
qualquer N
MO
M0
M0
M0
M1
65
Anexo 2- Protocolo de aprovação pela Comissão de Ética e Bem Estar Animal
(CEBEA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de
Jaboticabal
66
Anexo 3 – Termo de consentimento dos proprietários para a participação das
cadelas no experimento.
TERMO DE CONSENTIMENTO
Eu, __________________________________________________, portador do RG
_________________,
autorizo
que
minha
cadela
_________________,
raça
________________, idade __________, cor______ participe do projeto de pesquisa
“IMUNOTERAPIA COM A VACINA HETERÓLOGA DE DNA-HSP65+PROTEÍNAHSP65 DE Mycobacterium leprae EM TUMORES MAMÁRIOS DE CADELAS”,
desenvolvido na UNESP de Jaboticabal em conjunto com a Faculdade de Medicina de
USP de Ribeirão Preto, sob responsabilidade de Carolina Franchi João e Mirela Tinucci
Costa.
Me comprometo a comparecer nos horários marcados e permitir que meu animal
faça todos os exames necessários para o andamento do projeto e não submeter meu
animal a cirurgia sem o conhecimento dos responsáveis pelo projeto.
Estou ciente que se trata de um projeto experimental e recebi um folheto explicativo
sobre o projeto.
Jaboticabal, ___________________.
_________________________________________