Gustavo Dix Junqueira Pinto AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO

Gustavo Dix Junqueira Pinto
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO BIOMARCADOR PD-L1 EM TECIDO TUMORAL DE
PACIENTES PORTADORES DE CARCINOMA DE PULMÃO E CORRELAÇÃO COM DADOS
CLÍNICOS E DEMOGRÁFICOS
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-graduação da
Fundação PIO XII – Hospital de
Câncer de Barretos para obtenção
do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Oncologia
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Vicente
Serrano
Co-orientador: Prof. Dr. Luciano de
Souza Viana
Barretos, SP
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570
Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos
P659a
Pinto, Gustavo Dix Junqueira.
Avaliação da expressão do biomarcador PDL1 em tecido tumoral de
pacientes portadores de carcinoma de pulmão e correlação com dados
clínicos e demográficos. / Gustavo Dix Junqueira Pinto. - Barretos, SP 2015.
78 f. : il.
Orientador: Dr. Sérgio Vicente Serrano
Co-Orientador: Dr. Luciano de Souza Viana
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII –
Hospital de Câncer de Barretos, 2015.
1. Carcinoma Pulmonar. 2. PD-L1. 3. Microambiente tumoral. 4. Pontos
de checagem imunológico. 5. Biomarcadores. 6. Imuno-histoquímica . I.
Autor. II. Serrano, Sérgio Vicente. III. Vianna, Luciano de Souza. IV. Título.
CDD 616.994
“
“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da PósGraduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento
do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações
e teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este
trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),
não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou
falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas
neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão
da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos.
Embora o Núcleo de apoio ao pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha
realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia
estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade
dos pesquisadores envolvidos”
Agradecimentos
Orientadores
Sérgio Vicente Serrano e Luciano de Souza Viana, pelas informações valiosas
Registro Médico
Allini Mafra
Biblioteca
Martins Fideles dos Santos Neto
Mirlene Girio Marques
SAME (Serviço de Arquivo Médico e Estatística)
Dante Ribeiro da Silva
Guilherme Aleixo dos Santos
Kleber Henrique Carvalho Pires
Leonardo de Almeida Lima
Robson dos Santos Fermiano
Anatomia Patológica
Fabiana Aparecida Oliveira Buzon
Guilherme Gomes Ribeiro
Letícia do Nascimento Braga Pereira
Patrícia Cristina Silva Marconi
Telemedicina
Luige Cesar Salvi
NEB (Núcleo de Epidemiologia e Bioestatística)/NAP (Núcleo de Apoio ao
Pesquisador)
Cleyton Zanardo de Oliveira
Jamile Carolina Zaneti
Marco Antônio de Oliveira
Marcos Alves de Lima
Tamira Cláudia de Souza
Thais Talarico Hosokawa
Secretaria da pós-graduação do Hospital de Câncer de Barretos
Brenda Honda Morais
Silvana Rodrigues Guitarrari
Simone Neves Nogueira
CEP (Comitê de ética e pesquisa)
Bruna Aline Roque Alves
Daniela Ribeiro Girardi
Talitha Jacqueline Marsola
EPIT
Daniela Donadon
CEPOM
Renato José da Silva Oliveira
Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais, Abílio e Maria da Graça, que estão sempre ao meu lado;
à minha família e aos meus amigos, fontes de amor incondicional e eterno;
aos meus colegas de trabalho Pedro e Josiane que souberam me compreender e apoiar;
e aos meus pacientes, que enfrentam suas enfermidades com força e resignação.
“e parecia-lhe que entrava enfim numa existência superiormente interessante, onde
cada hora tinha o seu encanto diferente, cada passo condizia a um êxtase, e a alma se
cobria de um luxo radioso de sensações!”
Eça de Queirós
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
1
1.1
Sinapse imunológica
4
1.2
“Checkpoints” imunes
6
1.3
Imunoterapia e mecanismos inibitórios de "checkpoint”
7
1.4
Expressão de PD-L1 e tipos de microambiente tumoral
10
2
OBJETIVOS
14
2.1
Objetivo geral
14
2.2
Objetivos específicos
14
3
MATERIAIS E MÉTODOS
15
3.1
Considerações éticas
15
3.2
Pacientes
15
3.2. 1 Critérios de inclusão
16
3.2.2 Critérios de exclusão
16
3.3
Variáveis analisadas
16
3.4
Construção dos blocos de TMA e lâminas
16
3.5
Técnica de imuno-histoquímica
17
3.5.1 Anticorpo primário
18
3.5.2 Análise da imuno-coloração
18
3.6 Análise mutacional dos genes EGFR e KRAS
19
3.7 Pesquisa do rearranjo do gene ALK
19
3.8 Análise estatística
20
4
22
RESULTADOS
4.1 Dados clínico-demográficos e moleculares
22
4.1.1 Dados demográficos
22
4.1.2 Dados Clínicos
22
4.1.3 Dados Moleculares
24
4.1.4 Correlação das informações clínico-demográficas e biomarcadores com sobrevida global
25
4.2 Expressão de PD-L1
28
4.2.1 Análise individual da expressão de PD-L1 em corte histológico convencional
29
4.2.2 Análise coletiva da expressão de PD-L1 em TMA ("Tissue microarray").
32
4.3 Análise de concordância da expressão imuno-histoquímica de PD-L1 em análise individual versus análise
coletiva (TMA)
33
4.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e
rearranjo do gene ALK) - análise univariada
34
4.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos. (análise univariada)
35
4.5.1 Expressão de PD-L1 e dados demográficos
35
4.5.2 Expressão de PD-L1 e dados clínicos
37
4.5.3 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos - análise multivariada
38
4.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1
39
5
42
DISCUSSÃO
5.1 Achados clínico-demográficos e moleculares
42
5.2 Achados quanto a expressão de PD-L1
42
5.3 Análise de concordância entre a análise individual e a análise coletiva (TMA) da expressão imunohistoquímica do marcador PD-L1 em tecido tumoral
44
5.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e
rearranjo do gene ALK).
45
5.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos
45
5.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1
46
6
47
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
48
ANEXOS
55
Anexo A. Ficha de coleta
55
Anexo B. Carta de aprovação do CEP
61
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Formação da sinapse imunológica (Fonte: Piragyte et al, 2012)
5
Figura 2 - Checkpoints imunológicos: sinais estimulatórios (verde) e inibitórios (vermelho)
(Fonte: Pardoll et al. 2012)
6
Figura 3 - Células constituintes do microambiente tumoral (Fonte: Sid P.
P. Restifo, 2012)
Kerkar, Nicholas
12
Figura 4 - Tipos de microambiente tumoral (Teng et al. 2015)
13
Figura 5 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 na células
tumoral no câncer de pulmão de células não pequenas (400x). A, Ausência de expressão do
marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das células coradas); C. Marcador PD-L1
positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo
30
Figura 6 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 nas células
apresentadoras de antígenos (APC) no câncer de pulmão de células não pequenas (400x). A.
Ausência de expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das células
coradas); C. Marcador PD-L1 positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo
31
Figura 7 - Sobrevida Global Geral
40
Figura 8 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula Tumoral
41
Figura 9 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula Apresentadora de
Antígeno
41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Critérios de concordância definidos por Landis & Koch (1977) para interpretação
do índice de Kappa
20
Tabela 2 - Dados demográficos
22
Tabela 3 - Dados clínicos
23
Tabela 4 – Biomarcadores
25
Tabela 5 - Estimativa do risco relativo de óbito pela regressão de Cox simplificada
26
Tabela 6 - Regressão de Cox
28
Tabela 7 - Expressão de PD-L1 em corte histológico convencional (análise individual)
29
Tabela 8 - Expressão de PD-L1 em TMA (análise coletiva)
32
Tabela 9 - Análise da concordância da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1
conforme tipo celular considerando as técnicas de análise individual e coletiva (TMA)
33
Tabela 10 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e biomarcadores
34
Tabela 11 - Expressão de PD-L1 em Células Apresentadoras de Antígenos e biomarcadores 34
Tabela 12 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados demográficos
35
Tabela 13 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados
demográficos
36
Tabela 14 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados clínicos
37
Tabela 15 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados clínicos 38
Tabela 16 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células tumorais
39
Tabela 17 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células apresentadoras de
antígenos
39
Tabela 18 - Agrupamento TNM versus história oncológica pregressa (HOP)
42
Tabela 19 - Imunohistoquímica para PD-L1 em estudos Clínicos
43
LISTA DE ABREVIATURAS
APC
CCR
CEP
CRC
CRPC
CTLA-4
DNA
EGFR
EML4/ALK
FISH
INCA
KRAS
MHC
MM
CPCNP
NSCLC
PCR
PD-1
PD-L1
PD-L2
RCC
TCR
TMA
Células Apresentadora de Antígeno
Carcinoma de Células Renais
Comitê de Ética em Pesquisa
Câncer colorretal
Neoplasias de próstata resistentes à castração (Prostatic Neoplasms, castrationResistant)
Antígeno CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen 4)
Ácido Desoxirribonucleico
Receptor do fator de crescimento epiodérmico(Epidermal growth ator receptor
Echinoderm microtubule-associated protein-like 4 / anaplastic lymphoma kinase
Hibridização In Situ Fluorescente (Fluorescence in situ hybridization)
Instituto Nacional do Câncer
Kirsten murine sarcoma vírus
Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major histocompatibility complex)
Melanoma Maligno
Carcinoma Pulmonar de Células não Pequenas (Non small cell lung câncer)
Carcinoma Pulmonar de Células Não Pequenas(Non small cell lung cancer)
Reação em Cadeia da Pilimerase (Polymerase chain reaction)
Receptor de Morte Celular Programada 1 (Programmed Cell Death 1 Receptor )
(Programmed death-ligand 1)
Programmed death-ligand 2)
Câncer Renal
Receptor de célula T (T cell receptor)
Análise Serial de tecidos (Tissue Microarray Assay)
RESUMO
Pinto GDJ. Avaliação da expressão do biomarcador PD-L1 em tecido tumoral de pacientes
portadores de carcinoma de pulmão e correlação com dados clínicos e demográficos.
Dissertação (Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2015.
JUSTIFICATIVA: O câncer de pulmão é mundialmente a principal causa de morte relacionada
a câncer em ambos os gêneros e o tabagismo é o seu principal fator etiológico. A descoberta
dos checkpoints imunológicos corroboram com a hipótese de que ligantes presentes no
tumor modulam os mecanismos de carcinogênese e a atividade imunológica do
microambiente tumoral. Entre as moléculas corregulatórias mais estudadas destacam-se a
PD-1 (programmed cell death 1), e seu ligante PD-L1 (programmed cell death ligand 1). O
presente estudo busca aumentar o entendimento do microambiente tumoral de doentes
operados com câncer de pulmão através da análise da expressão do marcador PD-L1 nas
células tumorais e nas células apresentadoras de antígenos (APC). OBJETIVO: Avaliar a
expressão de PD-L1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma pulmonar de
células não pequenas (CPCNP) e correlacionar as expressões com os dados clínicos e
demográficos. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram selecionados 177 doentes com CPCNP
submetidos a ressecção cirúrgica da lesão primária no Hospital de Câncer de Barretos entre
2003 e 2014. A expressão de PD-L1 foi realizada por imuno-histoquímica tanto por análise
individual quanto por análise coletiva ou TMA (tissue microarray). Os tumores foram
classificados como PD-L1 positivo em células tumorais (≥5% de células coradas) ou PD-L1
negativo em células tumorais (<5% de células coradas) assim como as APC presentes no
microambiente tumoral (APC PD-L1 positivo se ≥5% de células coradas e APC PD-L1 negativo
se <5% de células coradas). RESULTADOS: Em cortes histológicos convencionais, houve
maior expressão de PD-L1 em células tumorais (37,9%) que em APC (24,3%). O mesmo
ocorreu no TMA (análise coletiva) com expressão de 32,8 % em células tumorais e 19,8% em
APC. Não foi possível estabelecer correlação entre expressão de PD-L1 e outros
biomarcadores conhecidos em função do número reduzido de pacientes avaliados. As
técnicas de análise coletiva (TMA) e análise individual apresentaram fraca concordância
durante a avaliação da imunoexpressão de PD-L1 tanto na célula tumoral (Kappa = 0,307 e p
< 0,001) quanto nas APC (Kappa = 0,328 e p < 0,001). Doentes com história passada de
tabagismo (passado versus ausência) e presença de história oncológica pregressa (presença
versus ausência) apresentaram maior chance de expressão de PD-L1 em células tumorais
(OR = 3,356 e p = 0,008; OR = 2,01 e p = 0,042, respectivamente). Doentes com história
passada de tabagismo (passado versus ausência) apresentaram menor chance de expressão
de PD-L1 em APC (OR = 0,383; p = 0,029). Doentes com expressão tumoral positiva de PD-L1
(células tumoral e APC) apresentaram mediana de sobrevida global semelhante aos doentes
cujos tumores não expressaram PD-L1 (p = 0,253 e p = 0,795; respectivamente para tumor e
APC). CONCLUSÃO: Houve maior frequência de expressão de PD-L1 em células tumorais que
em APC. Não foi possível estabelecer correlação entre expressão de PD-L1 e biomarcadores
por limitações no número de doentes da amostra. Não houve reprodutibilidade entre as
técnicas de análise coletiva (TMA) e análise individual para avaliação da expressão de PD-L1
em células tumorais e APC. Doentes com história passada de tabagismo e história oncológica
pregressa apresentaram maior chance de expressão de PD-L1 em células tumorais em
relação aos que nunca fumaram e aos que não apresentavam história oncológica pregressa.
Doentes com história passada de tabagismo apresentaram menor chance de expressão de
PD-L1 em células apresentadoras de antígeno em relação aos que nunca fumaram. A
expressão imuno-histoquímica de PD-L1 nas células tumorais e APC não se relacionou com a
curva de sobrevida.
PALAVRAS-CHAVE: 1. Carcinoma pulmonar; 2.PD-L1; 3.microambiente tumoral; 4.pontos de
checagem imunológico; 5. biomarcadores; 6.imunohistoquímica.
ABSTRACT
Pinto GDJ . Evaluation of PD -L1 Biomarker expression in tumor tissue of patients with lung
carcinoma and correlation with clinical and demographic data . Dissertation (Master`s
Degree) . Barretos : Barretos Cancer Hospital ; 2016 .
BACKGROUND: Lung cancer is the leading world cause of death regarding cancers, in both
sexes, and smoking is the main etiological factor. The discovery of immune check-points
corroborates the hypothesis that ligands present in the tumors modulate the mechanisms of
carcinogenesis and the immune activity of the tumor microenvironment. Among the most
studied co-regulatory molecules, PD-1 (programmed cell death 1), and its ligand PD-L1
(programmed cell death 1 ligand 1) are noteworthy. The present study aims to enhance the
understanding of the tumor microenvironment of lung cancer patients who underwent
surgery, by means of analysis of PD-L1 expression in tumor cells and antigen presenting cells
(APC). AIM: To evaluate PD-L1 expression in tumor tissue of non small cell lung cancer
patients and correlate it with clinical and demographic data. MATERIALS AND METHODS: A
hundred and seventy seven patients who had underwent surgical resection of primary nonsmall cell lung cancer at Barretos Cancer Hospital between 2003 and 2014 were enrolled.
The PD-L1 expression was carried out by means of immunohistochemistry, using
conventional histological slides (individual analyses) and TMA (tissue microarray) for
collective analyses. Tumors were classified as PD-L1 positive tumor cells (≥5% of dyed cells)
or PD-L1 negative tumor cells (<5% of dyed cells) as well as APC present in the tumor
microenvironment (APC PD-L1 positive if ≥5% of dyed cells and APC PD-L1 negative if <5% of
dyed cells). RESULTS: In conventional histological individual analysis, there was a greater
proportion of PD-L1 expression seen in tumor cells (37,9%) than in APC (24,3%). The same
occurred in the collective analysis by TMA with a 32,8% expression in tumor cells and a
19,8% expression in APC. It was not possible to establish a correlation between PD-L1
expression and biomarkers due to the small number of patients evaluated. The techniques
for collective analysis (TMA ) and individual analysis showed poor agreement for PD-L1
immunoexpression both in tumor cells (Kappa = 0,307 e p < 0,001) as in APC (Kappa = 0,328
e p < 0,001). In this study, patients with past history of smoking (past versus absence) and
presence of previous cancer history (presence versus absence) were more likely to express
PD-L1 in tumor cells (OR = 3,356 e p = 0,008; OR = 2,01 e p = 0,042). Patients with past
history of smoking (past versus absence) were less likely to express PD-L1 in APC (OR =
0,383; p = 0,029). No difference was observed in overall survival between patients with
positive tumor expression of PD-L1 (in tumor cell and APC) and negative expression of PD-L1.
(p = 0,253 e p = 0,795; respectively for tumor cells and APC). CONCLUSIONS: Tumor cells
presented higher expression of PD-L1 than APCs. It was not possible to establish a
correlation between PD-L1 expression and other known biomarkers due to the small number
of patients tested. Collective analysis by TMA for PD-L1 expression in tumor cells and APC
did not reproduce the findings for separate individual analysis of tumor tissues.. Patients
with past history of smoking and previous cancer history were more likely to express PD-L1
in tumor cells than those who never smoked and who had no previous cancer history.
Patients with past history of smoking were less likely to express PD-L1 in APC compared to
those who never smoked. The immunohistochemical expression of PD-L1 in tumor cells and
APC did not correlate with survival.
KEYWORDS : 1. Lung carcinoma; 2. PD-L1; 3. Tumor microenvironment; 4. Immune
checkpoints; 5. Biomarkers; 6.Immunohistochemistry
1
1
INTRODUÇÃO
De acordo com o GLOBOCAN (projeto instituído pela Agência Internacional para
Pesquisa em Câncer – IARC/Organização mundial de Saúde), no ano de 2012, a incidência de
câncer de pulmão no mundo foi de 1.82 milhão de novos casos com 1.6 milhão de mortes no
mesmo ano (a principal causa de morte por câncer)1.
Nos Estados Unidos da América, estima-se para o ano de 2015, 115.610 novos casos
(14%) de câncer de pulmão em homens e 105.590 novos casos (13%) em mulheres. Esperase inclusive que seja a principal causa de morte por câncer tanto em homens (86.380 casos
ou 28%) quanto em mulheres (71.660 casos ou 26%)2.
No Brasil, segundo estimativas do INCA (Instituto Nacional do Câncer) para 2016, a
taxa de incidência para tumores de traquéia, brônquio e pulmão é de 17.330 novos casos
(8,1%) para homens e 10.890 casos (5,3%) para mulheres. O câncer de pulmão em homens é
o segundo mais frequente nas regiões Sul e Centro-Oeste. Nas regiões Sudeste, Nordeste e
Norte é o terceiro mais frequente. Para as mulheres é o terceiro mais frequente nas regiões
Sul. Nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste ocupa a quarta posição. Já na região
Norte é o quinto mais frequente3.
O câncer de pulmão de células não pequenas geralmente é diagnosticado em estádio
avançado. Além da presença de uma variedade histológica bastante complexa, os
mecanismos de carcinogênese são heterogêneo e doentes mesmo com estádio inicial
apresentam altos índices de mortalidade. Fatores etiológicos conhecidos como tabagismo,
predisposição genética e exposição ambiental justificam majoritariamente a incidência desta
malignidade.
O insucesso diante de ações terapêuticas padronizadas por anos, tais como
quimioterapia, radioterapia e cirurgia levou a comunidade científica a investigar
biomarcadores ou alterações genéticas envolvidas também na gênese tumoral sobretudo
em sítios pulmonares. Foram detectadas mutações em genes como EGFR (receptor do fator
de crescimento epidérmico), ALK-EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-like
4/anaplastic lymphoma kinase) e KRAS (Kirsten rat sarcoma vírus), que propiciaram a
descoberta de “drogas alvo” específicas para algumas dessas alterações.
A mutação do gene EGFR promove ativação de vias como MAPK (mitogen-activated
protein kinase) e PI3K (Fosfatidilinositol 3-quinase), através da auto-fosforilação dos
2
receptores de tirosina quinase responsáveis por proliferação celular, invasão e metástases.
As principais drogas inibidoras desses receptores são o Erlotinibe e Gefitinibe 4.
O rearranjo do gene ALK (anaplastic lymphoma Kinase) com o EML4 (echinoderm
microtubule-associated protein-like 4/anaplastic lymphoma kinase) promove a ativação das
vias PI3K, STAT3/5, RAS e PLCy responsáveis pela sobrevivência e proliferação da célula
tumoral. A principal droga nesse caso é o crizotinibe5.
As mutações do gene KRAS regulam o crescimento celular, diferenciação e apoptose
através da interação com múltiplas vias de ativação incluindo MAPK (mitogen-activated
protein kinase), STAT (transdutor do sinal de ativação de transcrição) e PI3K
(Fosfatidilinositol 3-quinase)6. Ainda não há uma droga alvo efetiva para esta mutação.
Todavia, mesmo após a descoberta e aprovação de “drogas-alvo”, um número elevado
de pacientes continuou a falhar aos tratamentos disponíveis. Nos últimos anos cresceu o
entendimento do papel do sistema imunológico na carcinogênese de vários tumores,
incluindo o câncer de pulmão. Publicação recente na revista “Cell” incluiu conceitos de
evasão tumoral e vigilância imunológica como mecanismos principais de carcinogênese7, 8.
A capacidade do sistema imunológico em reconhecer e eliminar células tumorais é
denominada vigilância imunológica. A evasão ou escape tumoral ocorre em 3 fases. Na
primeira, também chamada de fase de eliminação, as células tumorais em potencial são
identificadas e eliminadas. Na fase seguinte, ou de equilíbrio, ocorre o surgimento de
algumas células tumorais variantes mais resistentes, as quais não são eliminadas com
sucesso e então sofrem mutações adaptativas. O sistema imune acaba selecionando estas
células resistentes através de um processo denominado “imunoedição” até que se inicie a
fase final de escape. Nessa fase, as células tumorais acumularam mutações suficientes para
escapar da vigilância imunológica. O tumor passa a crescer até tornar-se clinicamente
detectável9, 10.
Durante a fase de equilíbrio, existem diversos mecanismos tumorais de evasão imune.
Alguns tumores podem perder a expressão de determinadas moléculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I em decorrência de mutações ou
instabilidade genética e então não podem ser removidos por linfócitos T 9, 10.
Outros tumores podem escapar da vigilância imunológica por meio do recrutamento
de células T reguladoras cuja função é imunossupressora. Há ainda tumores que produzem
citocinas imunossupressoras como o TGF-beta (que provoca inibição de linfócitos T e induz o
3
desenvolvimento de células T reguladoras) e a interleucina 10 (que diminui o
desenvolvimento de células dendríticas e a ativação de células T)9, 10.
Outros mecanismos de escape imune são a criação, por alguns tumores, de barreiras
físicas com colágeno e fibrina, ou ainda através do mascaramento antigênico, através do
qual os antígenos de superfície celular tumoral são escondidos do sistema imunológico por
moléculas do glicocálice, como mucopolissacarídeos contendo ácido siálico9, 10.
Os primeiros estudos de imunologia relacionados ao câncer ocorreram no final do
século XIX, quando o cirurgião americano William Coley relatou a diminuição de um sarcoma
após a injeção de resíduos bacterianos em alguns sítios tumorais11. Muitos anos depois, em
1976, Morales e colaboradores realizaram o primeiro grande ensaio clínico com BCG (Bacilo
Calmette-Guérin) intravesical em pacientes com câncer de bexiga em fase inicial, no qual
reações imunoinflamatórias eram bem sucedidas no controle da doença 12.
Em 1983 foi publicado estudo com aplicação de interleucina-2 endovenosa em
pacientes com melanoma com o intuito de estimular a ativação e proliferação de linfócitos
in vivo13.Dois anos mais tarde, em 1985, ocorreu um estudo com interferon alfa endovenoso
e intramuscular para melanoma, com evidente atividade antitumoral14.
O primeiro estudo com fator de necrose tumoral alfa recombinante (rTNF-alfa) em
combinação com interferon recombinante gama (rIFN) e melfalan em pacientes
com
sarcoma e melanoma ocorreu em 1992, com resultados eficientes e mínima toxicidade 15.
Dez anos mais tarde, 2002, foi publicado estudo de transferência de células T reativas em
melanoma, que revelou a regressão tumoral e destruição autoimune dos melanócitos16.
Em 2008 foi utilizado imiquimode (modificador tópico da resposta imune) para
neoplasias intraepiteliais vulvares com respostas parciais em 81% dos pacientes tratados 17
até que em 2009 surgiu a primeira vacina contra as onco-proteínas do HPV-16 também com
resultados satisfatórios para essa enfermidade18.
Em 2010, imunoterapia celular autóloga com sipuleucel T proporcionou aumento de
sobrevida global entre homens com câncer de próstata metastático resistente à castração19.
No mesmo ano, uma nova droga chamada ipilimumabe foi aprovada para doentes com
melanoma metastático também com benefício de sobrevida global. Tratava-se de um
anticorpo específico ao antígeno CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen 4), um receptor
proteico presente na superfície das células T, cuja interação com a proteína CD80 presente
na célula tumoral ou na célula apresentadora de antígeno inibe a resposta imunológica 20.
4
Consequentemente, os estudos passaram a se direcionar para outras estruturas com
repercussão imunológica semelhante, como por exemplo a chamada PD-1 (Programmed Cell
Death 1 Receptor), cuja interação com sua proteína ligante, a PD-L1; também acarreta uma
diminuição da resposta imune.
A suspeita de que a hiperexpressão ou aumento de função de PD-L1 pudesse ser um
mecanismo da evasão do sistema imune do hospedeiro pelas células tumorais passou a ser
aventada em diversos estudos. Em um deles, foram analisadas 196 amostras tumorais de
pacientes com RCC, e observou-se que os pacientes cujos tumores tinham alta expressão de
PD-L1 apresentaram risco 4,5 vezes maior de óbito e tinham doença com comportamento
mais agressivo21. Em outro estudo semelhante observou-se que pacientes com câncer de
ovário com expressão elevada de PD-L1 tiveram sobrevida significativamente menor do que
aqueles com baixa expressão22. Além disso, observou-se redução da contagem de linfócitos
T-CD8 (+), sugerindo um papel supressor de células T-CD8 (+) exercido por PD-L1.
Em 2015 foi aprovada uma medicação chamada nivolumabe para tumores avançados
de pulmão com aumento de sobrevida global. A medicação é um anticorpo humanizado IG4
com ação na proteína PD-1 (Programmed Cell Death 1 Receptor). Consolidava-se então uma
nova etapa na imunoterapia relacionada ao câncer, cujo desenvolvimento tornou-se possível
através do estudo da sinapse imunológica. É inicialmente a formação da sinapse imunológica
que acarreta a resposta imune.
1.1
Sinapse imunológica
Denomina-se sinapse imunológica ou agregado de ativação supramolecular (SMAC) a
região de contato físico entre a célula T e a célula apresentadora de antígeno (APC),
semelhante a um alvo. Na região central (c-SMAC) encontram-se o complexo TCR (receptor
da célula T), co-receptores CD4 ou CD8, receptores para co-estimuladores (como o CD28),
enzimas e outras proteínas. Na região periférica (p-SMAC) encontram-se moléculas de
sinalização nas membranas plasmáticas com conteúdo lipídico, chamadas de rafts lipídicos
ou microdomínios ricos em glicolipídeos. A sinalização entre o TCR e co-receptor estimulador
é iniciada neste locais, quando os rafts induzem mudanças no citoesqueleto, coalescem e
formam a sinapse. Externamente à p-SMAC encontra-se uma região distal ou D-SMAC, rica
em actina e proteína CD45, responsáveis por finalizar alterações no citoesqueleto da célula
T9, 10, 23.
5
A formação da sinapse imunológica é o gatilho para a sinalização mediada pelo
receptor da célula T (TCR) acarretando estabilização de adesão, controle de endocitose e
exocitose e liberação de grânulos ou citocinas 9, 10, 23. Em outras palavras, após a formação da
sinapse imunológica originam-se sinais estimulatórios ou inibitórios do sistema imune
decorrentes de moléculas co-estimulatórias, os chamados “checkpoints” imunológicos. (Figura
1)
Figura 1 - Formação da sinapse imunológica (Fonte: Piragyte et al, 2012)
6
1.2
“Checkpoints” imunes
A especificidade das células T em relação aos seus alvos é mediada pela interação de
receptores em sua superfície (TCR) com complexos MHC associados a peptídeos antigênicos
presentes na superfície de células apresentadoras de antígeno (APC) ou células tumorais.
Porém, a resposta ao sinal de apresentação dos antígenos é regulada por uma série de
receptores co-regulatórios (co-receptores) expressos na célula T que reconhecem ligantes
adicionais presentes na superfície das APC ou células tumorais24. Estes co-receptores podem
tanto induzir cascatas de sinalização intracelular positivas (estimulatórias) quanto negativas
(inibitórias), assim modulando a atividade da célula T relacionada à proliferação, secreção de
citocinas e lise celular. Estas moléculas do sistema imune que podem tanto estimular quanto
inibir sinais são conhecidas por “check points imunológicos”. (Figura 2)
Figura 2 - Checkpoints imunológicos: sinais
estimulatórios (verde) e inibitórios (vermelho) (Fonte:
Pardoll et al. 2012)25
7
Dentre as moléculas co-regulatórias da família B7-CD28, estudos recentes demonstram
que as células tumorais e as células apresentadoras de antígenos modificam o
microambiente tumoral através das atividades do receptor PD1 e seus ligantes (ex.: PD-L1)26,
27.
PD-1 é uma proteína de membrana tipo I, de 268 aminoácidos e pertence à família de
moléculas reguladoras de células T, chamada CD28/B728, sendo codificada pelo gene
PDCD129. Possui um domínio extracelular IgV, seguido de uma região transmembrana e uma
cauda intracelular, a qual contém dois sítios de fosforilação30, 31. Esta proteína é expressa na
superfície de células T ativadas, células B e macrófagos, o que sugere que ela é capaz de
inibir a resposta imune celular de maneira mais ampla31.
A função de PD-1 ocorre primariamente em tecidos periféricos, onde as células T
podem entrar em contato com os seus ligantes imunossupressores PD-L1 (B7-H1) e PD-L2
(B7-DC), os quais estão expressos por células tumorais, células do estroma, ou ambas 32-35. Foi
demonstrado que a inibição da interação PD-1/ PD-L1 pode exacerbar a resposta de células T
in vitro e mediar atividade antitumoral em modelos pré-clínicos34, 36.
1.3
Imunoterapia e mecanismos inibitórios de "checkpoint”
Ao se constatar que o receptor das moléculas B7-1 e B7-2, denominado CTLA-4
(cytotoxic T lymphocyte antigen 4), possui atividade inibitória sobre a resposta imune (para
evitar dano colateral a tecidos normais), esta molécula passou a ser vista como um possível
alvo terapêutico37. Dessa forma, dois anticorpos monoclonais anti-CTLA-4, ipilimumabe
(Yervoy, Bristol-Myers Squibb, Princteon, NJ) e tremelimumabe (Pfizer, New York, NY),
demonstraram atividade antitumoral, com taxas de resposta objetiva de 10-15% em
pacientes com melanoma metastático (MM) e carcinoma de células renais (CCR)38-40. Em
março de 2011, o ipilimumabe foi aprovado para o tratamento de primeira linha de pacientes
portadores de melanoma metastático, baseado em estudo fase III, no qual esta droga
demonstrou aumento da sobrevida livre de progressão e global, comparado ao uso de vacina
com o peptídeo gp100 ou de dacarbazina41. Porém, foram observados eventos adversos grau
3-5, relacionados à resposta imune, em 10-35% dos pacientes recebendo tratamento com
bloqueio de CTLA-4, sendo os órgãos mais afetados: cólon, glândulas endócrinas e pele. A
possibilidade da ocorrência destes eventos já era esperada pelos resultados do bloqueio de
CTLA-4 em experimentos animais42.
8
Após a descoberta da PD-1 (programmed cell death 1) em 1992 por Ishida et al.28, e
cinco anos após a descoberta de seus ligantes, PD-L1 e PD-L2 (programmed cell death 1
ligand 1 e 2)32, 43, 44, tornou-se evidente que a PD-1 tem um papel crucial na regulação da
resposta imune. Ocorre uma menor ativação de linfócitos T, ou seja, uma diminuição da
resposta imune quando a PD-1 presente em sua membrana celular se une aos seus ligantes
PD-L1 e PD-L2, presentes nas membranas de células tumorais ou apresentadoras de
antígenos. O mesmo pode ser observado quando a CTLA-4 presentes nos linfócitos se liga às
proteínas B7-1 e B7-2 presentes nas células tumorais ou apresentadoras de antígenos.
Atualmente, vários grupos têm desenvolvido tratamentos antagonistas do complexo PD-1 e
seus ligantes para o tratamento de tumores30, 45-47 e doenças infecciosas e também agonistas
para o tratamento de doenças autoimunes, alergias e rejeição a transplantes48-50.
Em 2010, um estudo piloto com o uso de um anticorpo monoclonal anti-PD-1,
denominado BMS-936558 (Bristol-Myers Squibb, Princteon, NJ), também chamado MDX1106, ONO-4538 ou nivolumabe posteriormente, observou evidência de atividade
antitumoral, com perfil de segurança favorável dentre um total de 39 pacientes portadores
de diversos tumores sólidos avançados51.
Dois anos mais tarde, foram reportados os resultados de estudo fase I/II que analisou a
segurança e a atividade do uso de doses escalonadas do anticorpo BMS-936558 no
tratamento de 296 pacientes portadores de melanoma metastático (MM), câncer de pulmão
de células não pequenas (NSCLC), câncer de próstata avançado resistente à castração (CRPC),
câncer de células renais (RCC) e câncer colorretal (CRC)52. Dos 236 pacientes avaliáveis, foram
observadas respostas objetivas em 14 dos 76 pacientes com NSCLC (18%), 28 dos 94
portadores de MM (28%) e 9 dos 33 pacientes com RCC (27%).
Um dado interessante deste estudo foi obtido pela avaliação da imunoexpressão de
PD-L1 nas amostras de tumores obtidas de 42 pacientes, antes do início do tratamento.
Observou-se que dos 25 pacientes em cujas amostras foi constatada expressão positiva para
PD-L1, 9 apresentaram resposta antitumoral, ao passo que nenhum dos 17 pacientes
portadores de tumores com expressão negativa para PD-L1 tiveram resposta (P=0,006). Estes
dados sugeriam inicialmente uma correlação entre a expressão de PD-L1 em células tumorais
com resposta objetiva ao tratamento com bloqueio de PD-1.
Estas observações estimularam o uso de bloqueadores da PD-L1 como potenciais
agentes terapêuticos antitumorais. Assim, em 2012, foram publicados os resultados parciais
9
de um estudo para avaliação da segurança e atividade do anticorpo anti-PD-L1 denominado
BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb, Princteon, NJ).53 Foram tratados 207 doentes, portadores
de NSCLC (75 doentes), MM (55 doentes), CRC (18 doentes), RCC (17 doentes), câncer de
ovário (17 doentes), câncer de pâncreas (14 doentes), câncer gástrico (7 doentes) e câncer de
mama (4 doentes). Respostas objetivas (regressão tumoral variando de 6% a 17%) foram
observadas em nove de 52 doentes portadores de MM, em dois de 17 casos de RCC, em
cinco de 49 doentes com NSCLC e em um de 17 casos de câncer de ovário. As respostas
tiveram duração de 1 ano ou mais em 8 dos 16 doentes tratados e que foram seguidos por
pelo menos um ano. Eventos adversos grau 3-4, considerados como sendo relacionados ao
tratamento, ocorreram em 9% dos pacientes. Os autores concluíram que o bloqueio de PD-L1
foi capaz de induzir regressão tumoral em 6-17% dos pacientes com MM, NSCLC e RCC.
Adicionalmente, foi observada estabilização da doença, entre 12% e 41% dos pacientes, após
24 semanas.
Em 2013, uma série de estudos analisaram a segurança e atividade de outro anticorpo
anti-PD-L1, denominado MPDL3280A ou atezolizumabe (F. Hoffmann-La Roche Ltd.), o qual
foi desenvolvido por engenharia genética54. Nestes estudos, observou-se uma taxa de
resposta global de 21% (29 de 140 pacientes avaliáveis), com a seguinte distribuição por sítio
tumoral primário: taxa de resposta de 22% em pacientes com NSCLC (09 em 41 pacientes),
29% em casos de MM (11/38 pacientes) e 13% nos pacientes com RCC (6/47), sendo que os
dados referentes aos pacientes com RCC são preliminares, devido ao curto seguimento. Nos
171 pacientes tratados até o momento foi observada uma incidência global de eventos
adversos grau 3/4 de 43% (73/171 pacientes). Os principais eventos relatados foram:
hiperglicemia (5%), fadiga (4%), elevação de ALT (3%), dispnéia (3%) e hipóxia (3%). Foi
possível ainda mensurar a expressão de PD-L1 em 103 dos 140 pacientes avaliados, sendo
observado aumento da expressão em 36 casos (35%) e baixa expressão em 67 casos (65%).
Dos 36 pacientes com expressão positiva de PD-L1, 13 apresentaram resposta objetiva
antitumoral (36%), ao passo que dos 67 casos PD-L1-negativos, houve resposta em somente
nove pacientes (13%). Em comunicado recente, a mesma substância tem mostrado
resultados promissores em câncer de pulmão55.
Em março de 2015, o FDA (Food and Drug Administration; órgão regulatório e
governamental americano para controle de medicamentos, alimentos, cosméticos, materiais
biológicos e produtos derivados do sangue humano) aprovou o nivolumabe para utilização
10
em carcinoma escamoso avançado de pulmão após falha à primeira linha de tratamento. A
aprovação foi decorrente de estudo que constatou melhores resultados de sobrevida global,
sobrevida livre de progressão e taxa de resposta aos doentes que utilizaram nivolumabe em
comparação ao docetaxel, independentemente do status de expressão de PD-L156.
Recentemente, a aprovação foi estendida para carcinomas não escamosos de pulmão após
um estudo ter também demonstrado melhora da sobrevida global57. Atualmente, ficou
evidente que a manipulação de vias co-reguladoras que reprimem a resposta imune
antitumoral é capaz de promover respostas antitumorais, numa variedade de neoplasias,
mesmo quando administradas de forma isolada. O futuro próximo deverá trazer novas
informações sobre a melhor forma de administrar esses novos agentes com menor
toxicidade e melhores resultados, incluindo a combinação com outras formas de terapia.
1.4
Expressão de PD-L1 e tipos de microambiente tumoral
Para o entendimento da expressão de PD-L1 no microambiente tumoral pulmonar, faz-
se necessária inicialmente uma breve descrição dos tipos celulares envolvidos. (Figura 3)
As células apresentadoras de antígenos (APC) capturam microrganismos e antígenos
estranhos ao organismo e os apresentam aos linfócitos estimulando sua proliferação e
diferenciação. As principais células apresentadoras de antígenos são os macrófagos, células
dendríticas e linfócitos B.
As células dendríticas originam-se na medula óssea e tem linhagem monocítica.
Situam-se em órgãos e tecidos de barreira. Capturam antígenos por pinocitose e fagocitose
através de longos prolongamentos citoplasmáticos. Ocorre ativação de sinais intracelulares e
as mesmas se deslocam para os órgãos linfóides periféricos. Nessas estruturas, apresentam
então os peptídeos derivados dos antígenos previamente fagocitados aos linfócitos 9, 10.
Os macrófagos ou fagócitos mononucleares originam-se na medula óssea (progenitor
mielóide) e chegam ao sangue incompletamente diferenciados, quando são chamados de
monócitos. Ao atingirem os tecidos, maturam-se em macrófagos e sofrem diferenciação
originando a micróglia no sistema nervoso central, as células de Küpffer no fígado, os
osteoclastos nos ossos e os macrófagos alveolares no pulmão. Suas funções principais
consistem no recrutamento de células para os locais de infecção e no reconhecimento de
microrganismos, fagocitando-os e destruindo-os. Podem ainda produzir citocinas,
importantes em respostas imunes naturais ou adquiridas9, 10.
11
Os linfócitos B ou células B são um tipo de linfócito originados na medula óssea
(progenitor linfóide). Inicialmente, as células B progenitoras rearranjam seus genes de
imunoglobulinas e geram receptores. Trata-se de uma fase independente de antígenos, mas
dependente do contato com células do estroma medular. Ocorre então uma seleção
negativa na qual células B que se ligam aos próprios antígenos (auto-reativas) são
eliminadas. As células B já maduras que não reagem contra os próprios antígenos migram
para os órgãos linfóides periféricos e são ativadas após encontro com antígenos estranhos.
As células B ativadas então se proliferam e podem diferenciar-se em células plasmáticas
secretoras de anticorpo e células B de memória de vida longa9, 10.
Os linfócitos T originam-se na medula óssea (progenitor linfoide). São células da
imunidade celular e portanto não produzem anticorpos. Reconhecem antígenos de
microrganismos ou células infectadas, destruindo-os através de receptores de antígenos em
suas membranas com especificidade restrita. Esse reconhecimento antigênico aplica-se
apenas a peptídeos ligados a proteínas do hospedeiro que são codificadas pelos genes do
complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e que se expressam nas superfícies de
outras células. Os principais tipos de linfócitos T são os auxiliares (T Helper ou CD4), os
citotóxicos (T citolíticos ou CD8) e os reguladores (Treg)9, 10.
Os linfócitos T auxiliares secretam citocinas (proteínas) que estimulam a proliferação e
diferenciação de células T, células B, macrófagos e outros leucócitos9, 10. Já os linfócitos T
citotóxicos destroem células com antígenos estranhos como células infectadas por exemplo
e microrganismos9, 10.
Os linfócitos T reguladores são células T auxiliares diferenciadas que estão aumentadas
no microambiente tumoral, inibem a função dos linfócitos T CD4, T CD8, e células
dendríticas. São responsáveis pela vigilância e tolerância imunológica (inibição de respostas
imunológicas a antígenos próprios)9, 10.
As células supressoras de origem mielóide ou MSDC (myeloid derived supressor cells)
originam-se na medula óssea (progenitor mielóide) e se expandem em infecções crônicas e
câncer. Inibem a resposta imune pelo uso competitivo de substratos necessários para a
ativação da célula T tais como: arginina, cisteína e óxido nítrico favorecendo então a
angiogênese, vasculogênese e metástase. Suas funções ainda não foram completamente
elucidadas pela comunidade científica58, 59.
12
Figura 3 - Células constituintes do microambiente tumoral (Fonte: Sid P.
Nicholas P. Restifo, 2012)60
Kerkar,
O microambiente tumoral pode também ser classificado conforme o tipo de expressão
de PD-L1 e a presença dos linfócitos intra-tumorais (TIL) em quatro tipos.
61.
(Figura 4). O
microambiente tipo I, denominado resistência imunológica adaptativa, ocorre quando existe
expressão tanto de PD-L1 quanto de linfócitos intra-tumorais. Há evidências de que estes
linfócitos sejam pré-existentes à expressão de PD-L1 e que foram desativados por ela. Esse
padrão de resistência imunológica adaptativa está presente em
38% dos casos de
melanoma avançado. .
O microambiente tipo II, denominado ignorância imunológica ou pouca resposta
imune detectável, ocorre quando há ausência de expressão de PD-L1 e de linfócitos intratumorais . Quarenta e um por cento dos pacientes com melanoma apresentam esse padrão
de microambiente e esses tumores têm pior prognóstico.
O microambiente tipo III, denominado indução intrínseca, apresenta o biomarcador
PD-L1 constitutivamente expresso nas células tumorais apesar da sinalização oncogênica,
sem a presença de linfócitos intra-tumorais. Tal fato impede de se considerar a expressão de
13
PD-L1 como fator preditivo de resposta a terapias imunes. Este tipo de microambiente
tumoral está presente em apenas 1% dos casos de melanoma e em outros tumores como
carcinoma de pulmão não pequenas células.
O microambiente tipo IV, denominado tolerância imune, caracteriza-se pela presença
de linfócitos intra-tumorais sem expressão de PD-L1 pois apresenta outras vias supressoras
dominantes devido à heterogeneidade proporcional de células mielóides e linfóides.
Figura 4 - Tipos de microambiente tumoral (Teng et al. 2015)61
O presente estudo busca aumentar o entendimento do microambiente tumoral em
pacientes submetidos a ressecção pulmonar para o tratamento de câncer de pulmão de
células não pequenas através da análise da expressão do marcador PDL-1 nas células
tumorais e nas células apresentadoras de antígenos por imuno-histoquímica e da avaliação
da possível relação dessa expressão com dados clínicos e demográficos.
14
2
OBJETIVOS
2.1
Objetivo geral
Avaliar a expressão de PDL-1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma
pulmonar de células não pequenas, submetidos a tratamento cirúrgico e correlacionar
os achados com dados clínicos, demográficos e moleculares.
2.2
Objetivos específicos
2.2.1. Analisar os dados clínicos, demográficos e moleculares de uma população de
pacientes brasileiros submetidos a ressecção pulmonar para o tratamento de câncer de
pulmão de células não pequenas.
2.2.2. Avaliar a expressão de PD-L1 nas células tumorais e nas células apresentadoras
de antígenos de doentes com câncer de pulmão de células não pequenas.
2.2.3. Avaliar o grau de concordância entre a expressão de PD-L1 na células tumorais e
nas células apresentadoras de antígenos de pacientes portadores de carcinoma
pulmonar de células não pequenas, através de imuno-histoquímica por TMA ("Tissue
microarray") ou análise coletiva e corte histológico convencional (análise individual).
2.2.4. Correlacionar a expressão de PD-L1 em tecido tumoral de pacientes portadores
de carcinoma pulmonar com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e
rearranjo do gene ALK), quando disponíveis nos arquivos médicos do hospital.
2.2.5. Correlacionar a expressão de PD-L1 em tecido tumoral de pacientes portadores
de carcinoma pulmonar de células não pequenas com dados clínico-demográficos.
2.2.6. Avaliar comparativamente as curvas de sobrevida conforme a expressão de PDL1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma pulmonar de células não
pequenas.
15
3
MATERIAIS E MÉTODOS
 Desenho do estudo: Estudo de coorte com coleta de dados retrospectivo.
 Número total de centros: 1 (Hospital de Câncer de Barretos).
 Cronologia:
-
Consulta aos arquivos da cirurgia torácica, patologia e sistema de informática
do hospital para identificação dos pacientes submetidos a procedimentos
cirúrgicos pulmonares entre 2003 e 2014.
-
Seleção dos casos com câncer primário de pulmão com histologia de células
não pequenas submetidos a ressecção cirúrgica da lesão primária.
-
Seleção dos blocos adequados para confecção do TMA ("Tissue microarray") e
lâminas para reações de imuno-histoquímica.
-
Leitura da lâmina de TMA (análise coletiva) e lâmina de corte histológico
convencional (análise individual) com posterior análise dos resultados e
correlações estatísticas.
3.1
Considerações éticas
O estudo foi aprovado Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital de Câncer de
Barretos em 15/05/2014 sob o número 799/2014 (Anexo A). O delineamento deste estudo
seguiu os princípios da declaração de Helsinki e sua condução obedeceu aos princípios das
boas práticas clínicas.
3.2
Pacientes
Foram obtidos dados e amostras de tecido tumoral de 177 casos (total de doentes
maiores de 18 anos com câncer primário de pulmão de células não pequenas
submetidos a ressecção cirúrgica da lesão primária entre os anos 2003 e 2014, com
material disponível no arquivo do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital de
Câncer de Barretos).
Entre 2003 e 2014 foram realizadas 1056 intervenções cirúrgicas. Foram excluídos da
amostra pacientes submetidos a metastasectomias, ressecção de tumores do mediastino
(timomas, teratomas e tumores germinativos por exemplo), ressecção de tumores de parede
16
torácica, ressecção de tumores pleurais (mesoteliomas), ressecção de tumores pulmonares
com tipo histológico neuroendócrino e pacientes com idade inferior a 18 anos.
3.2. 1 Critérios de inclusão
Foram incluídas amostras tumorais de doentes com idade igual ou superior a 18 anos,
e ambos os sexos, com carcinoma pulmonar de células não pequenas (adenocarcinoma,
carcinoma adenoescamoso, carcinoma epidermóide, carcinoma indiferenciado) submetidos
a pneumectomia, lobectomia, segmentectomia ou nodulectomia no Hospital do Câncer de
Barretos, no período de 2003 a 2014 com disponibilidade de lâminas e blocos de parafina
para análise histopatológica.
3.2.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos os casos em que o material disponível (lâminas e blocos) não
apresentavam qualidade adequada para os testes propostos. Foram excluídos pacientes com
histologia de células pequenas ou componente neuroendócrino.
3.3
Variáveis analisadas
Foi utilizado um formulário para coleta de dados clínicos, demográficos e anatomo-
patológicos (Anexo A). Os dados de expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 foram
transcritos diretamente pelo patologista envolvido com o estudo para uma planilha de Excel.
Foi criado um banco de dados em Software SPSS (v.21.0) com as características dos doentes,
incluindo-se os dados do formulário e planilha.
3.4
Construção dos blocos de TMA e lâminas
Os blocos de TMA foram confeccionados com uso de aparelho Beecher™ (Beecher
Instruments, Silver Spring, MD, USA), conforme especificações do fabricante, seguindo-se as
seguintes etapas:

marcação da área selecionada no respectivo bloco de parafina;

utilização do aparelho para criar espaço vazado (“casela”) no bloco receptor;

extração de dois cilindros ou “punchs” teciduais por bloco doador com 1mm
de diâmetro da respectiva área de interesse previamente selecionada;
17

transferência do cilindro tecidual obtido do bloco doador para a “casela”
previamente criada no bloco receptor;

progressão, em frações de milímetros, a novas posições dentro do bloco
receptor, de modo a criar coletânea de amostras teciduais seguindo disposição
matricial;

avaliação da qualidade do bloco final para armazenamento.
Para adesão dos cortes dos blocos de TMA nas lâminas foi utilizado sistema de fitas
adesivas (Instrumedics Inc, Hackensak, NJ, USA). As amostras foram cortadas com espessura
de 4 µm, sendo usado pequeno rolo para pressionar o corte na fita. A fita com o corte
histológico aderido foi então colocada sobre lâmina revestida por resina (parte do kit do
sistema de fita adesiva), e pressionada com o mesmo rolo, para melhor aderência do corte.
Em seguida, as lâminas com os cortes histológicos aderidos às fitas foram colocadas em luz
ultravioleta por 20 minutos, passando após por solução solvente TPC por mais 20 minutos.
As lâminas foram secadas e as fitas adesivas retiradas. As lâminas sofreram banho de
parafina, e então foram encaminhadas para estocagem em condições ideais de refrigeração.
Durante a construção do bloco de TMA foi preparado mapa em planilha Excel com a
localização e identificação das amostras de tecidos objetivando orientar a leitura posterior
das reações imuno-histoquímicas. Tais dados foram transcritos para o banco de dados.
Foram obtidas lâminas a partir de cortes dos blocos de parafina das amostras
histológicas originais (cortes histológicos convencionais) e do bloco de TMA confeccionado
acima com
(tissue microarray) para que cada paciente pudesse ser avaliado imuno-
histoquimicamente pelas duas técnicas. Para a construção das lâminas , após separação dos
blocos e lâminas originais, foram obtidos cortes histológicos com 4 µm de espessura de cada
bloco. Estes cortes foram corados pela técnica da hematoxilina-eosina, revisados para a
confirmação do diagnóstico e os achados histopatológicos foram reavaliados por um
patologista do Hospital de Câncer de Barretos.
3.5
Técnica de imuno-histoquímica
Cortes dos blocos foram montados em lâminas de vidro revestidas com silano (3-
Aminopropiltrietoxisilano) e secados por 30 minutos a 37°C. O corte foi desparafinizado em
xilol e reidratado através de uma série de alcoóis graduados. A atividade da peroxidase
endógena foi bloqueada pela incubação dos cortes em banho de metanol contendo peróxido
18
de hidrogênio a 3% por 20 minutos, seguida de lavagem em água destilada. O corte foi
inicialmente submetido ao epítopo recuperado pelo calor induzido, usando tampão citrato
(pH 9,0) em panela de pressão (Eterna®, Nigro) destampada. As lâminas foram mergulhadas
e então lacrada a panela com a válvula de segurança aberta. Após a saída do vapor saturado,
a válvula de segurança foi abaixada e aguardou-se a pressurização total. Após 4 minutos
desse sinal, a panela ainda fechada foi deixada sob água corrente, destampada, e as lâminas
foram lavadas em água corrente e destilada.
Em seguida, foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 3% (água
oxigenada 10 vol.) com 3 trocas de 10 minutos cada. As lâminas foram novamente lavadas
com água corrente e destilada, seguida de solução salina tamponada com fosfatos (PBS)
10mM ph 7,4 por 5 minutos.
Posteriormente, o anticorpo primário foi aplicado e as lâminas foram incubadas
durante a noite a 8°C.
3.5.1 Anticorpo primário
O anticorpo primário foi importado do fabricante ABCM INC (Cambridge, MA, USA):
anticorpo primário anti-PD-L1 (CD274), isotipo IgG de coelho, policlonal, 1:400 (referência:
ab58810).
3.5.2 Análise da imuno-coloração
Como ponto de partida, um teste preliminar foi realizado para identificar a melhor
concentração de anticorpos e para escolher os controles positivos utilizando os dados de
diluição fornecidos pelo fabricante. Depois de lavar o anticorpo primário com solução salina
tamponada com fosfatos (PBS), as lâminas serão incubadas com polímero livre de biotina em
sistema de visualização Advance™ (DAKO, Glostrup, Dinamarca) por 30 minutos. Uma
solução recém-preparada de 1 gota de 3,30-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB,
Sigma, D-5637, EUA) com 1 ml de substrato (DAKO™, Glostrup, Dinamarca) foi aplicada por 5
minutos em cada lâmina. A solução DAB foi removida por lavagem com água destilada. As
lâminas foram contra-coradas com hematoxilina, desidratadas em etanol, apuradas em xilol
e montadas usando Entelan ™.62, 63
A expressão tecidual do marcador PD-L1 foi categorizada dicotomicamente em
negativa (quando menos de 5% das células expressavam PD-L1) ou positiva (quando mais de
19
5% das células expressavam PD-L1)64 e também em grupos quanto à porcentagem de células
coradas e a intensidade dessa coloração, para melhor descrever a amostra.
3.6 Análise mutacional dos genes EGFR e KRAS
Os dados referentes a pesquisa de mutações nos genes de EGFR e KRAS foram
agrupados conforme presença e ausência de mutação quando disponíveis nos registros
hospitalares do Hospital de Câncer de Barretos. A técnica utilizada para realizar esses testes
no laboratório de diagnóstico molecular consistiu em extrair o DNA das amostras de tecido
parafinado utilizando lâminas com três cortes de 10 µm, com a área tumoral previamente
demarcada pelo patologista com o kit QIAmp DNA micro (Qiagen, Hilden, Germany)
seguindo o protocolo do fabricante65.
A análise das mutações foi feita usando primers específicos para as regiões dos éxons
18, 19, 20 e 21 do gene EGFR e éxon 2 (códons 12 e 13) do gene KRAS66, 67 com a reação em
cadeia da polimerase (PCR) realizada com os seguintes parâmetros de ciclagem: 96°C por 15
minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturação de 96°C por 45 segundos, anelamento de
56,5°C por 45 segundos, extensão de 72°C por 45 segundos e extensão final de 72°C por 10
minutos realizados em termociclador Veriti (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Após a PCR
os produtos amplificados foram purificados com EXOSAP-IT (Affymetrix, USB) e submetidos a
sequenciamento direto com
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems)66. A reação de sequenciamento foi purificada com BigDye XTerminator
purification kit (Applied Biosystems) e aplicada no sequenciador ABI 3500 xL Genetic
Analyzer (Applied Biosystems) seguindo as orientações do fabricante. A análise foi efetuada
no software Genetic Analyzer ABI PRISM 3500 e SeqScape version 2.7 (Applied Biosystems).
3.7
Pesquisa do rearranjo do gene ALK
Os dados referentes à pesquisa de rearranjo do gene ALK (2p23) foram agrupados
conforme presença e ausência de rearranjo quando disponíveis nos registros hospitalares do
Hospital de Câncer de Barretos. A técnica utilizada para realizar esses testes no laboratório
de diagnóstico molecular foi a de hibridização in situ (FISH) a partir de material biopsiado ou
de ressecção cirúrgica (5µm), com região tumoral previamente marcada, seguida de fixação
em estufa a 60°C e posterior desparafinização a 80°C.
20
O protocolo de hibridização in situ fluorescente contou com uma etapa prévia à
hibridização, seguida da hibridização (18-24 horas) propriamente dita com Vysis ALK Break
Apart Fish Probe Kit, marcando-se em Spectrum Orange (LSI 3’) e Spectrum Green (LSI 5’)
seguida de uma pós-hibridização para remoção de marcações inespecíficas. Posteriormente,
realizou-se análise com software Apllied Spectral Imaging FISH View 7.0 em microscópio
Nikon ECLIPSE 50i. Foram elegíveis para análise núcleos interfásicos íntegros e livres de
sobreposição, sendo classificados como positivos para presença do rearranjo ALK os casos
com frequência (cutoff) ≥ 15%68, 69.
3.8
Análise estatística
Os dados foram descritos em função da média, desvio padrão, mínima, máxima e
quartis para as variáveis quantitativas e tabelas de frequência para as variáveis qualitativas.
A concordância entre a técnica de análise coletiva ou TMA (tissue microarray) e análise
individual foi feita utilizando-se o coeficiente Kappa para avaliar a reprodutibilidade e os
critérios de Landis & Koch para interpretação deste índice.(Tabela 1)
Tabela 1- Critérios de concordância definidos por Landis & Koch (1977) para interpretação do índice de Kappa
Índice de Kappa
<0,00
0,00 - 0,20
0,21 - 0,40
0,41 - 0,60
0,61 - 0,80
0,81 - 1,00
Grau de concordância
Pobre
Muito leve
Leve
Moderado
Substancial
Quase perfeito
A correlação entre as características clínicas e demográficas e a expressão do
marcador PD-L1 na célula tumoral e nas APC foi determinada utilizando-se o teste de QuiQuadrado (ou Exato de Fisher) para as características qualitativas. Para verificar a associação
conjunta entre co-variáveis e o marcador PD-L1 foram selecionadas as que obtiveram p-valor
menor que 0,2 no teste anterior, e posteriormente, ajustadas no modelo de Regressão
Logística Múltiplo. Para modelagem, foi retirada uma característica (variável) por vez
priorizando a que possuía maior p-valor, até atingir um conjunto de variáveis significativas.
Para a sobrevida global, foi considerado o tempo entre a data de diagnóstico até a
data do óbito por qualquer motivo (sendo este o evento de interesse) ou a última
21
informação objetiva para indivíduos que não foram a óbito. Para comparar cada
característica e verificar a relação das características com a sobrevivência de forma simples
(apenas uma por vez), foi utilizada a regressão de Cox Simples. Para a relação conjunta entre
as variáveis, foram selecionadas as que que obtiveram p-valor menor que 0,2 na análise
simples, e ajustadas no modelo de Regressão de Cox Múltiplo. E prosseguiu-se com a
modelagem conforme a mesma descrição na regressão logística. Para se estimar a curva de
sobrevida global para a expressão de PD-L1, foi utilizada também a técnica de Kaplan-Meier.
Para análise de sobrevida foi considerada apenas a sobrevida global, por se tratar de
um estudo retrospectivo e de não ter havido uma padronização no tempo de seguimento
destes doentes no passado.
Neste estudo considerou-se a significância estatística de 0,05 e o software SPSS 21.0
foi utilizado para as análises estatísticas.
22
4
RESULTADOS
4.1
Dados clínico-demográficos e moleculares
4.1.1 Dados demográficos
Em relação às características demográficas, observa-se na Tabela 2, que a maior parte
dos doentes selecionados tinha mais de 60 anos (96 casos; 54,2%), era do sexo masculino
(111 casos; 62,7%), de raça branca (140 casos; 79,1%), com ECOG 0 (86 casos; 48,6%),
relatava passado de tabagismo (79 casos; 44,6%) e sem relato de etilismo (96 casos; 54,2%).
Tabela 2 - Dados demográficos
Variável
Idade
Categoria
< 60 anos
> 60 anos
N
81
96
(%)
45,8
54,2
Sexo
Feminino
Masculino
66
111
37,3
62,7
Raça
Branco
Não Branco
Ignorado
140
32
5
79,1
18,1
2,8
ECOG
0
1
Outros
Ignorado
86
46
6
45
48,6
26
3,38
25,4
Tabagismo
Ausente
Ativo
Passado
Ignorado
39
57
79
2
22
32,2
44,6
1,1
Etilismo
Ausente
Ativo
Passado
Ignorado
96
45
18
18
54,2
25,4
10,2
10,2
4.1.2 Dados Clínicos
O tipo histológico mais frequente foi o adenocarcinoma (115 casos; 65%) com grau
de diferenciação II (81 casos; 45,8%). Em sua maior parte, os tumores apresentaram
agrupamento TNM menor que III, sendo, respectivamente, estádio I e II observados em 62
23
doentes (35,0%) e 53 doentes (29,9%). O tipo de cirurgia mais realizada foi lobectomia (147
casos; 83,1%). Quimioterapia adjuvante foi realizada em 34 casos (19,2%). Quanto ao
seguimento, 56 casos (31,6%) apresentaram recidiva, 36 casos (20,3%) foram submetidos a
tratamento quimioterápico paliativo e 32 casos (18,1%) foram submetidos à radioterapia
paliativa. No momento da coleta dos dados, 77 doentes (43,5%) encontravam-se vivos sem
doença.
Tabela 3 - Dados clínicos
Variável
História oncológica pregressa
Categoria
Ausente
Presente
Ignorado
n
112
64
16
10
16
4
9
16
1
(%)
63,3
36,1
9
5,6
9
2,3
5,1
9
0,6
Tipo histológico
Adenocarcinoma
Carcinoma escamoso
Outros
115
57
5
65
32,2
2,8
Grau de diferenciação
Grau I
Grau II
Grau III
Ignorado
5
81
50
41
2,8
45,8
28,2
23,2
Agrupamento TNM
I
II
III
IV
62
53
43
19
35
29.9
24,3
10,7
Tipo de Cirurgia
Nodulectomia
Segmentectomia
Lobectomia
Pneumectomia
4
12
147
14
2,3
6,8
83,1
7,9
Tratamento sistêmico
Não
Sim
Ignorado
121
55
21
34
3
1
68,4
31
11,9
19,2
1,7
0,6
Sim
Nao
23
154
Mama e ginecologia
Urologia
Digestivo
Pulmão
Pele
Outros
QT* neoadjuvante
QT* adjuvante
QT* + RxT**
Radioterapia adjuvante
13
87
continua
24
Variável
continuação
Categoria
N
(%)
Recidiva
Ausente
Presente
120
56
18
38
1
67,8
31,6
14,1
20,9
0,6
Ignorado
134
36
16
8
12
7
75,7
20,3
9
4,5
6,8
4
Radioterapia paliativa
Sim
Não
Ignorado
32
138
7
18,1
77,9
3,9
Status
Vivo sem doença
Vivo com doença
Óbito por câncer
Óbito por outras causas
Perda de seguimento
77
13
39
36
12
43,5
7,3
22
20,3
6,8
Local
Distância
Ignorado
Quimioterapia paliativa
Não
Sim
Uma linha
Duas linhas
Três linhas
(*)Quimioterapia
(**)Radioterapia
4.1.3 Dados Moleculares
Três biomarcadores foram analisados de acordo com a disponibilidade dos resultados
no banco de dados da instituição. O biomarcador mais testado foi o gene EGFR (56 casos;
31,6%) e a sua forma selvagem (wild type) foi a mais comumente encontrada (45 casos;
25,4%). Sua mutação esteve presente em 11 casos (6,2%), em sua maior parte nos éxons 19
e 21 (4 casos; 2,3%). O rearranjo do gene ALK foi pesquisado em 9 doentes (5,1%) e foi
positivo em 4 casos (2,3%). A mutação do gene KRAS foi pesquisada 24 pacientes (13,5%) e
esteve presente em 11 casos (6,2%) exclusivamente no códon 12.(Tabela 4)
25
Tabela 4 - Biomarcadores
Variável
Rearranjo do gene ALK
Categoria
Ausente
Presente
Não realizado
N
5
4
168
(%)
2,8
2,3
94,9
Mutação do gene EGFR
Ausente
Presente
Éxon 18
Éxon 19
Éxon 20
Éxon 21
45
11
2
4
3
4
5
116
25,4
6,2
1,1
2,3
1,7
2,3
2,8
65,5
Códon 12
Códon 13
13
11
11
0
3
150
7,3
6,2
6,2
0
1,7
84,7
Inconclusivo
Não realizado
Mutação do gene KRAS
Ausente
Presente
Inconclusivo
Não realizado
4.1.4 Correlação das informações clínico-demográficas e biomarcadores com sobrevida
global
As seguintes variáveis demonstraram diferenças de risco relativo de óbito, com
significância estatística: sexo (feminino versus masculino), p = 0,018 (HR = 1,877; IC 95%
1,113 a 3,166); história oncológica pregressa (não versus sim), p = 0,001 (HR = 0,379; IC 95%
0,212 a 0,679); agrupamento TNM (I/II/ III/IV), p = 0,004; quimioterapia adjuvante (não
versus sim), p = 0,046 (HR = 0,473; IC 95% 0,227 a 0,985); quimioterapia neoadjuvante (não
versus sim), p = 0,027 (HR = 1,868; IC 95% 1,074 a 3,248); radioterapia paliativa (não versus
sim), p = 0,011 (HR 1,806; IC 95% 1,143 – 2,852).(Tabela 5)
26
Tabela 5 - Estimativa do risco relativo de óbito pela regressão de Cox simplificada
Variáveis
Categorias
HR
Idade
<60 anos
1
>60 anos
1,477
Sexo
Raça
ECOG
Tabagismo
Etilismo
História oncológica prévia
Tipo Histológico
Grau Histológico categorizado
Agrupamento TNM Simplificado Categorizado
I.C. 95%
0,931
2,344
Valor de P
0,098
Feminino
Masculino
1
1,877
1,113
3,166
Não Branco
Branco
1
1,373
0,738
0,738
0
1
1
1,001
0,575
1,744
Nunca
Ativo
Passado
1
1,954
1,674
0,984
0,869
3,878
3,228
0,155
0,056
0,124
Nunca
Ativo
Passado
1
1,022
0,82
0,579
0,323
1,804
2,084
0,906
0,941
0,677
Não
Sim
1
0,379
0,212
0,679
Adenocarcinoma
Carcinoma Escamoso
Outros
1
1,031
2,54
0,634
0,782
1,679
8,25
Grau I e II
Grau III
1
1,339
0,806
2,226
I
II
III
IV
1
1,489
2,517
3,357
0,797
1
1,59
2,779
4,753
7,085
0,018
0,318
0,997
0,001
0,299
0,901
0,121
0,26
0,004
0,212
0,004
0,001
continua
27
Variáveis
continuação
Categorias
Tratamento Sistêmico Adjuvante
Não
Sim
1
0,473
0,227
0,985
Não
Sim
1
1,868
1,074
3,248
Não
Sim
1
1,575
0,483
5,138
Não
Sim
1
1,317
0,808
2,146
Não
Sim
1
0,753
0,394
1,441
Não
Sim
1
0,638
0,275
1,477
Não
Sim
Ausente
Presente
1
1,806
1
0,5
1,143
2,852
0,041
6,135
Ausente
Presente
1
0,854
0,236
3,086
Ausente
Presente
1
0,671
0,188
2,4
Tratamento Sistêmico Neoadjuvante
Tratamento Sistêmico Concomitante à Radioterapia
Tratamento Sistêmico Paliativo 1ª Linha
Tratamento Sistêmico Paliativo 2ª Linha
Tratamento Sistêmico Paliativo 3ª Linha
Radioterapia Paliativa
Rearranjo do gene ALK
Mutação do gene EGFR
Mutação do gene KRAS
HR
I.C. 95%
Valor de P
0,046
0,027
0,451
0,269
0,391
0,294
0,011
0,588
0,809
0,539
Após a regressão de Cox, finalizou-se com as seguintes variáveis: sexo, idade, história
oncológica pregressa, agrupamento TNM, quimioterapia adjuvante. (Tabela 6)
Doentes do sexo masculino têm 2,237 vezes a chance de óbito dos doentes do sexo
feminino (p=0,007). Doentes com mais de 60 anos têm 2,39 vezes a chance de óbito dos
doentes com menos de 60 anos (p=0,003). Doentes com história oncológica pregressa têm
0,352 vezes a chance de óbito dos doentes sem história oncológica pregressa (p=0,001).
Pacientes com estádio IV têm 4,355 vezes a chance de óbito dos pacientes com
agrupamento TNM I (p=0,001). Pacientes submetidos a quimioterapia adjuvante têm 0,351
vezes a chance de óbito dos pacientes que não receberam quimioterapia adjuvante
(p=0,014), ou seja, possuem menor risco de evento, com significância estatística.
28
Tabela 6 - Regressão de Cox
Variável
Sexo
Idade
História oncológica pregressa
Agrupamento TNM
Tratamento sistêmico adjuvante
4.2
Categoria
Feminino
Masculino
HR
1
2,237
I.C. 95%
1,252
3,996
<60 anos
>60 anos
1
2,39
1,339
4,264
Não
Sim
1
0,352
0,188
0,659
I
II
III
IV
1
1,035
3,898
4,355
0,519
1,941
1,866
2,066
7,828
10,166
Não
Sim
1
0,351
0,153
0,807
P
0,007
0,003
0,001
0,922
<0,001
0,001
0,014
Expressão de PD-L1
Após a confecção da lâmina de TMA (análise coletiva) e dos cortes histológicos
convencionais (análise individual), seguida das reações imuno-histoquímicas, constatou-se a
marcação de PD-L1 em dois tipos celulares principais, morfologicamente distintos: células
tumorais e células apresentadoras de antígeno. As células tumorais apresentavam cromatina
grosseira, núcleos aumentados com cariotecas irregulares e citoplasmas amplos com bordos
mal-definidos. Já as células apresentadoras de antígenos apresentavam cromatina frouxa,
núcleos menores com dobras; sem atipias e citoplasma com morfologias variadas por vezes
exibindo prolongamentos dendríticos. A expressão foi considerada positiva quando 5% ou
mais das células apresentavam cora e negativa quando menos de 5% das células
apresentavam cora, independente da intensidade64. Problemas na cora impedindo a
classificação com negativo ou positivo foram considerados inconclusivos.
29
4.2.1 Análise individual da expressão de PD-L1 em corte histológico convencional
A tabela 7 contém os resultados das expressões do marcador PD-L1 por imunohistoquímica, em corte histológico convencional (análise individual). Observa-se expressão
positiva em 67 casos (37,9%) nas células tumorais e em 43 casos (24,3%) nas células
apresentadoras de antígenos, ou seja, maior expressão em células tumorais.
Tabela 7 - Expressão de PD-L1 em corte histológico convencional (análise individual)
Tipo celular
Célula tumoral
Tipo de avaliação
Intensidade
Porcentagem
(3 categorias)
Porcentagem
(2 categorias)
Intensidade
Célula apresentadora de antígeno
Porcentagem
(3 categorias)
Porcentagem
(2 categorias)
Graduação
Ausência de células coradas
n
%
97
54,8
Fraco
52
29,3
Moderado
16
9
Forte
1
0,6
Ignorado***
11
6,2
Ausência de células coradas
97
54,8
Até 10%
6
3,4
Entre 11% e 50%
33
18,6
Mais de 50%
30
16,9
Ignorado***
11
6,2
Positivo*
67
37,9
Negativo**
99
55,9
Ignorado***
11
6,2
Ausência de células coradas
123
69,5
Fraco
25
14,1
Moderado
15
8,5
Forte
3
1,7
Ignorado***
11
6,2
Ausência de células coradas
123
69,5
Até 10%
3
1,7
Entre 11% e 50%
15
8,5
Mais de 50%
25
14,1
Ignorado**
11
6,2
Positivo*
43
24,3
Negativo**
123
69,5
Ignorado***
11
6,2
(*) Mais de 5% de células coradas
(**) Menos de 5% de células coradas
(***) Problemas na cora impedindo a classificação com negativo ou positivo
30
Nas figuras 5 e 6, observam-se fotomicrografias da expressão imunohistoquímica de
PD-L1 de cortes histológicos convencionais (individuais) em células tumorais e células
apresentadoras de antígenos respectivamente.
A
B
C
D
Figura 5 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 na
células tumoral no câncer de pulmão de células não pequenas (400x). A, Ausência de
expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das células coradas); C.
Marcador PD-L1 positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo.
31
A
B
C
D
Figura 6 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 nas
células apresentadoras de antígenos (APC) no câncer de pulmão de células não pequenas
(400x). A. Ausência de expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das
células coradas); C. Marcador PD-L1 positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo.
32
4.2.2 Análise coletiva da expressão de PD-L1 em TMA ("Tissue microarray").
A tabela 8 contém os resultados das expressões do marcador PD-L1 por imunohistoquímica, em TMA (análise coletiva). Observa-se expressão positiva em 58 casos (32,8%)
nas células tumorais e em 35 casos (19,8%) nas células apresentadoras de antígenos, ou seja,
maior expressão em células tumorais
Tabela 8 - Expressão de PD-L1 em TMA (análise coletiva)
Tipo celular
Célula tumoral
Tipo de avaliação
Intensidade
Porcentagem
(3 categorias)
Porcentagem
(2 categorias)
Intensidade
Célula apresentadora de antígeno
Porcentagem
(3 categorias)
Porcentagem
(2 categorias)
Graduação
Ausência de células coradas
Fraco
Moderado
Forte
Ignorado***
Ausência de células coradas
Até 10%
Entre 11% e 50%
Mais de 50%
Ignorado***
Positivo*
Negativo**
Ignorado***
Ausência de células coradas
Fraco
Moderado
Forte
Ignorado***
Ausência de células coradas
Até 10%
Entre 11% e 50%
Mais de 50%
Ignorado***
Positivo*
Negativo**
Ignorado***
(*) Mais de 5% de células coradas
(**) Menos de 5% de células coradas
(***) Problemas na cora impedindo a classificação com negativo ou positivo
n
99
38
16
4
20
99
0
1
57
20
58
99
20
122
24
6
5
20
122
4
5
26
20
35
122
20
%
55,9
21,5
9
2,3
11,3
55,9
0
0,6
32,2
11,3
32,8
55,9
11,3
68,9
13,6
3,4
2,8
11,3
68,9
2,3
2,8
14,7
11,3
19,8
68,9
11,3
33
4.3 Análise de concordância da expressão imuno-histoquímica de PD-L1 em análise
individual versus análise coletiva (TMA)
A análise da concordância da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1
considerando os dois métodos imuno-histoquímicos empregados (análise individual e
coletiva ou TMA) conforme o tipo celular está detalhada na Tabela 9.
Conforme observado, encontrou-se grau leve de concordância entre os métodos com
índice de Kappa de 0,307 (p < 0,001) quando se avaliou a expressão imuno-histoquímica de
PD-L1 em células tumorais em cortes histológicos convencionais (análise individual) e de
TMA (análise coletiva). Resultado semelhante foi observado durante a análise da
concordância da expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos (APC)
conforme os métodos de cortes histológicos convencionais (análise individual) e de TMA
(análise coletiva) com índice de Kappa de 0,328 (p < 0,001).
Tabela 9 - Análise da concordância da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 conforme tipo celular
considerando as técnicas de análise individual e coletiva (TMA)
Tipo celular
Kappa
Erro padrão assintóticoa
p valor Sig. Aprox.
Célula apresentadora de antígeno
0,328
0,089
<0,001
Célula tumoral
0,307
0,079
<0,001
Uma vez que os métodos de avaliação da expressão imuno-histoquímica de PD-L1
(análise individual versus coletiva ou TMA) não foram reprodutíveis, para todas as análises
(univariadas e multivariadas) adiante, para a correlação da expressão PD-L1 e co-variáveis
(dados clínicos, demográficos e com outros biomarcadores), utilizou-se a expressão do
biomarcador PD-L1 em corte histológico convencional separadmente (análise individual).
34
4.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes
KRAS, EGFR e rearranjo do gene ALK) - análise univariada
Dos vinte e quatro doentes com tumores que expressaram positivamente o marcador
PD-L1 submetidos a pesquisa de mutação no gene do EGFR, 23 casos (95,8%) resultaram em
ausência de mutação e a mutação foi detectada em apenas um tumor classificado como PDL1 positivo (4,2%) (p = 0,014).
Tabela 10 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e biomarcadores
Variável
Rearranjo do gene ALK
Mutação do gene EGFR
Mutação do gene KRAS
Negativo
Categorias
Positivo
n
(%)
N
(%)
Ausente
1
33,3
4
80
Presente
2
66,7
1
20
Ausente
19
67,9
23
95,8
Presente
9
32,1
1
4,2
Ausente
8
57,1
5
50
Presente
6
42,9
5
50
P
0,464
0,014
0,999
Conforme observado na tabela 11, a correlação entre a expressão de PD-L1 pela
célula apresentadora de antígeno e biomarcadores não foi estatisticamente significativa.
Tabela 11 - Expressão de PD-L1 em Células Apresentadoras de Antígenos e biomarcadores
Variável
Negativo
Positivo
Categorias
n
(%)
n
(%)
Rearranjo do gene ALK
Ausente
4
80
1
33,3
Mutação do gene EGFR
Mutação do gene KRAS
Presente
1
20
2
66,7
Ausente
32
84,2
10
71,4
Presente
6
15,8
4
28,6
Ausente
11
50
2
100
Presente
11
50
0
0
P
0,464
0,428
0,482
35
4.5
Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos. (análise
univariada)
4.5.1
Expressão de PD-L1 e dados demográficos
Conforme observado na tabela 12 , doentes cujos tumores apresentaram expressão
positiva de PD-L1 em células tumorais eram ex-tabagistas em sua maior parte (36 casos,
55,4%) ou tabagistas ativos (20 casos, 30,8%) com valor de p de 0,044.
Tabela 12 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados demográficos
Variável
Idade
Sexo
Raça
ECOG
Tabagismo
Etilismo
Categorias
Negativo
Positivo
n
(%)
n
(%)
< 60
43
43,4
30
44,8
> 60
56
56,6
37
55,2
Feminino
39
39,4
21
31,3
Masculino
60
60,6
46
68,7
Não branco
18
18,8
11
16,7
Branco
78
81,2
55
83,3
0
48
62,3
31
70,5
1
29
37,7
13
29,5
Nunca
29
29,3
9
13,8
Ativo
31
31,3
20
30,8
Passado
39
39,4
36
55,4
Nunca
57
63,3
34
58,6
Ativo
25
27,8
14
24,1
Passado
8
8,9
10
17,2
P
0,864
0,289
0,734
0,367
0,044
0,312
36
Conforme observado na tabela 13, a correlação entre a expressão de PD-L1 pela célula
apresentadora de antígeno e dados demográficos não foi estatisticamente significativa.
Tabela 13 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados demográficos
Variável
Negativo
Positivo
Categorias
n
(%)
n
(%)
Idade
< 60
50
40,7
23
53,5
> 60
73
59,3
20
46,5
P
0,144
Sexo
Feminino
Masculino
41
82
33,3
66,7
19
24
44,2
55,8
0,202
Raça
Não branco
Branco
21
98
17,6
82,4
8
35
18,6
81,4
0,888
ECOG
0
1
57
31
64,8
35,2
22
11
66,7
33,3
0,845
Tabagismo
Nunca
Ativo
Passado
23
38
60
19
31,4
49,6
15
13
15
34,9
30,2
34,9
0,084
Nunca
Ativo
Passado
67
29
14
60,9
26,4
12,7
24
10
4
63,2
26,3
10,5
0,934
Etilismo
37
4.5.2 Expressão de PD-L1 e dados clínicos
Conforme observado na tabela 14, a correlação entre a expressão de PD-L1 pela célula
tumoral e dados clínicos não foi estatisticamente significativa.
Tabela 14 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados clínicos
Negativo
Positivo
n
(%)
n
(%)
Não
68
68,7
36
54,5
Sim
31
31,3
30
45,5
Adenocarcinoma
68
68,7
40
59,7
Carcinoma escamoso
28
28,3
25
37,3
Outros
3
3
2
3
I e II
50
62,5
31
64,6
III
30
37,5
17
35,4
I
36
36,4
23
34,3
II
27
27,3
23
34,3
III
26
26,3
14
20,9
IV
10
10,1
7
10,4
Não
86
86,9
61
91
Sim
13
13,1
6
9
Não
63
64,9
48
72,7
Sim
34
35,1
18
27,3
Vivo sem doença
39
39,4
34
50,7
Vivo com doença
8
8,1
3
4,5
Óbito por câncer
24
24,2
14
20,9
Óbito por outras causas
22
22,2
11
16,4
Perda de seguimento
6
6,1
5
7,5
Variável
História oncológica pregressa
Tipo histológico
Grau de diferenciação
Agrupamento TNM
Tratamento sistêmico neoadjuvante
Recidiva
Status
Categorias
P
0.065
0,412
0,813
0,756
0,407
0,296
0,567
Conforme a tabela 15, dentre os doentes cujos tumores tiveram expressão positiva de
PD-L1 pela célula apresentadora de antígeno, a maior parte apresentou adenocarcinoma
como tipo histológico (35 casos, 81,4%) com significância estatística (p=0,022)
38
Tabela 15 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados clínicos
Variável
Negativo
Categorias
n
(%)
História oncológica pregressa
Não
79 64,8
Tipo histológico
Grau de diferenciação
Agrupamento TNM simplificado categorizado
Tratamento sistêmico neoadjuvante
Recidiva
Status
Positivo
n
(%)
25
58,1
Sim
43
35,2
18
41,9
Adenocarcinoma
73
59,3
35
81,4
Carcinoma escamoso
46
37,4
7
16,3
Outros
4
3,3
1
2,3
I e II
61
59,8
20
76,9
III
41
40,2
6
23,1
I
42
34,1
17
39,5
II
41
33,3
9
20,9
III
27
22
13
30,2
IV
Não
13
10,6
4
9,3
111
90,2
36
83,7
Sim
12
9,8
7
16,3
Não
80
66,1
31
73,8
Sim
41
33,9
11
26,2
Vivo sem doença
51
41,5
22
51,2
Vivo com doença
9
7,3
2
4,7
Óbito por câncer
28
22,8
10
23,3
Óbito SOE
25
20,3
8
18,6
Perda de seguimento
10
8,1
1
2,3
P
0,440
0,022
0,106
0,416
0,270
0,357
0,610
4.5.3 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos - análise
multivariada
Doentes com passado de tabagismo tiveram maior chance de terem tumores com
expressão positiva do marcador PD-L1 nas células tumorais quando comparados com os
tumores dos doentes que nunca fumaram (OR = 3,356; IC 95% 1,368 a 8,230; p = 0,008).
A chance de expressão positiva de PD-L1 em células tumorais, de doentes com história
oncológica pregressa foi 2,01 vezes o valor da mesma que em doentes sem história
oncológica pregressa (OR = 2,01; IC 95% 1,025 a 3,944; p = 0,042).(Tabela 16)
39
Tabela 16 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células tumorais
I.C. 95%
Variável
Tabagismo
Categoria
História oncológica pregressa
OR
LI
LS
P
Nunca
1
Ativo
2,236
0,864
5,79
0,097
0,03
Passado
3,356
1,368
8,23
0,008
1,025
3,944
Não
1
Sim
2,01
Constante
0,22
0,042
<0,001
Após a regressão logística, a variável tabagismo foi a única variável que manteve
significância estatística quanto a diferença de expressão do marcador PD-L1 nas células
apresentadoras de antígeno.
Doentes com passado de tabagismo tiveram menor chance de terem tumores com
expressão positiva do marcador PD-L1 nas células apresentadoras de antígeno quando
comparados com os tumores dos doentes que nunca fumaram (OR = 0,383; IC 95% 0,162 a
0,908; p = 0,029).
A chance de expressão positiva do marcador PD-L1 nas células
apresentadoras de antígeno também foi menor para os doentes com tabagismo ativo
comparativamente com doentes que nunca fumaram, mas sem significância estatística (OR =
0,525; IC 95% 0,212 a 1,297; p = 0,169). (Tabela 17)
Tabela 17 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos
Variável
Categoria
Tabagismo
Nunca
1
Ativo
0,525
0,212 - 1,297
0,162
Passado
0,383
0,162 - 0,908
0,029
Constante
0,652
OR
I.C. 95%
P
0,090
0,198
4.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1
A mediana de sobrevida global dos doentes incluídos nesse estudo foi de 45,0 meses
(IC 95% 33,23 a 56,83). Considerando as expressões do marcador PD-L1 na célula tumoral,
em cortes histológicos convencionais (análise individual) observou-se maior mediana de
sobrevida global para os doentes com tumores positivos para PD-L1, entretanto essa
diferença não foi estatisticamente significante (98,75 meses versus 41,51 meses, com valor
40
de p de 0,254). Também não foi observado diferença estatisticamente significante entre as
medianas de sobrevida global quando se comparou a expressão do marcador PD-L1 nas
células apresentadoras de antígenos, cortes histológicos convencionais (análise individual)
(49,50 meses para os doentes com APC PD-L1 positivo versus 41,51 meses nos doentes com
APC PD-L1 negativo, valor de p de 0,795). (Figuras 7,8 e 9)
Figura 7 - Sobrevida Global Geral
41
Figura 8 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula Tumoral
Figura 9 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula
Apresentadora de Antígeno.
42
5
DISCUSSÃO
5.1
Achados clínico-demográficos e moleculares
Observou-se no estudo a presença de 64 pacientes (36,1%) com história oncológica
pregressa, número superior ao esperado. Foram excluídos inicialmente pacientes cujos
tumores torácicos se mostraram metastáticos por exames anátomo-patológicos. Quando
isso não era possível, considerou-se a evolução e o julgamento médico, que
inadvertidamente, pode ter considerado um tumor metastático como segundo primário de
pulmão.
Pela regressão de Cox, observou-se que doentes com história oncológica prévia
apresentavam menor chance de óbito em relação aos que não a apresentavam.
Possivelmente, esses doentes foram submetidos a exames de seguimento, o que aumentou
a chance de detecção de outros tumores primários em fase inicial e sua chance de cura.
Sessenta e quatro doentes (36,4%) incluídos nesse estudo apresentavam história oncológica
pregressa. Na Tabela observa-se que doentes com passado oncológico apresentaram uma
tendência para maior proporção de estadiamento mais precoce (agrupamento 0, I ou II)
quando comparado com doentes sem passado oncológico, mas sem significância estatística
(71,9% versus 60,7%, respectivamente; p = 0,144).(Tabela 18)
Tabela 18 - Agrupamento TNM versus história oncológica pregressa (HOP)
Agrupamento TNM
0-I-II
III-IV
N
68
44
Não
(%)
60,7%
39,3%
Outros Tumores
46
18
N
Sim
(%)
71,9%
28,1%
114
62
N
Total
64,8%
35,2%
(%)
Total
112
100,0%
64
100,0%
176
100,0%
5.2 Achados quanto a expressão de PD-L1
De acordo com o presente estudo, a positividade na expressão de PD-L1 em células
tumorais foi de 37,9% dos casos, um pouco inferior a estudo publicado recentemente que
foi de 53,1% de positividade70. Há um viés ao se comparar positividades entre estudos
diferentes. Existem diferentes plataformas (DAKO, ROCHE, VENTANA) para avaliação da
expressão de PD-L1 com diferentes anticorpos (28-8, 22C3, SP263, SP142 e MIH1, dentre
outros).
43
Essa avaliação pode ocorrer de maneiras distintas: por distribuição e proporção contínua de
células PD-L1 positivas em qualquer intensidade71, por porcentagem de expressão
(immunohistochemistry score) de qualquer intensidade (mais de 1% de células coradas:
Score 1, mais de 5% de células coradas: Score 2, mais de 10% células coradas: score 3)56,
por score combinado exibindo uma porcentagem para cada intensidade 72, por graduação na
cora de membrana e/ou citoplasma (ex: Aqua Fluorescent Techniques) e concentração de
proteínas no TMA73.
Não há uma padronização quanto a um cutoff para positividade. Alguns estudos
utilizaram 1%, 5%, 50% ou mais para considerar a expressão de PD-L1 positiva74.
Percebe-se então a extrema dificuldade em se padronizar critérios de positividade para PDL1, o que envolve desde a maquinaria para as reações químicas até a diluição dos reagentes
bem como a interpretação das leituras o que dificulta o estabelecimento de qualquer
relação entre os estudos. Conforme a Tabela 19, podemos observar diferentes estudos com
diferentes cutoffs para positividade de PD-L1.
Tabela 19 - Imunohistoquímica para PD-L1 em estudos Clínicos
CUTOFF para positividade
Porcentagem de
Anticorpo Anti-PD-L1
de expressão em
amostras tumorais
superfície tumoral
expressando PD-L1
28/ago
5%
49%
Referência
R&D B7-H1
NR
52%
MIH1
> 10%
> 1% vs > 5% vs High
Score
50%
Grosso et al. J.C.O., 2013
Gatalica et al. C.E.B.P.,
2014
Konish et al. C.C.R., 2014
21% (somente CEC)
Marti et al. C.C.R., 2014
5H1
SP142
5%
60%
NR
1%
50%
22C3
≥ 50%
25%
28/ago
≥ 1%, ≥5%, ≥10%
SP142
≥ 1%, ≥5%, ≥10%
53%, 36%, 25% (somente
CEC)
68%, 37%, 16%
SP142
≥ 1%, ≥5%, ≥10%
56%, 28%, 13%
Gettinger et al.J.C.O.,
2014
Sun et al.J.C.O.,2014
Garon et al. N.E.J.M.,
2015
Brahmer et al. N.E.J.M.,
2015
Spira et al. J.C.O. , 2015
Herbest et al. Nature,
2014
Outra questão importante a ser discutida é a viabilidade do biomarcador para
mensuração e análise no tecido. Garon EB, et al, observaram que ocorre deterioração de
PD-L1 em amostras tumorais cortadas há mais de 6 meses antes da cora 71. No presente
estudo, a cora foi feita menos de um mês depois dos cortes.
44
Estudo recente evidenciou que as células do microambiente tumoral, incluindo células do
tumor, linfócitos e células apresentadoras de antígeno expressam PD-L1 de forma não
uniforme.74
Smyth, et al. (2015) afirmam que um tratamento bem sucedido deve se
basear justamente na estratificação do microambiente tumoral na medida que não deve se
restringir unicamente aos checkpoints imunes mas também a abordagens adjuvantes
relacionadas a potenciais tipos celulares envolvidos84.
O microambiente tumoral apresenta uma gama variada de tipos celulares distintos
representados principalmente por células supressoras de origem mielóide, macrófagos,
células dendríticas, linfócitos T além das células cancerosas60. Há claramente um consenso
de que o microambiente tumoral é uma estrutura complexa e dinâmica na medida que sua
apresentação pode variar para um dado intervalo de tempo. O surgimento de células
tumorais acarreta mudanças imunológicas drásticas que se iniciam cronologicamente com
uma indução intrínseca à expressão de PD-L1 seguida de tolerância e resistência imune
adaptativa com variações quantitativas dos diversos tipos celulares anteriormente
descritos61.
5.3 Análise de concordância entre a análise individual e a análise coletiva (TMA) da
expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 em tecido tumoral
As análises do presente estudo mostraram uma concordância leve pobre entre as duas
metodologias de imuno-histoquímica (individual e coletiva), para a avaliação da expressão
de PD-L1 em tumores pulmonares. A literatura médica já apontou para a relevância que a
heterogeneidade tumoral pulmonar possa ter quanto à expressão do biomarcadores em
pequenas biópsias quando comparadas a peças cirúrgicas75.
Amostras pequenas e isoladas de uma determinada região tumoral, colhidas por biópsias ou
punchs para confecção de TMA por exemplo, podem não representar a expressão de PD-L1
para a totalidade de um tumor. Tal expressão não pode ser generalizada, em decorrência de
sua intrínseca variabilidade regional. A possibilidade de que essa avaliação seja feita através
de uma lâmina de imuno-histoquímica que englobe um tumor em sua maior área possível,
oriunda dos maiores diâmetros assim representados, parece nos fornecer uma descrição
mais representativa da real expressão de PD-L1 em tumores de pulmão.
45
5.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes
KRAS, EGFR e rearranjo do gene ALK).
Há indícios de que mutações nos genes EGFR e rearranjo do gene ALK possam
influenciar a expressão de PD-L170, 76, 77.
D`Incecco et al. (2015), Ota et al. (2015), Azuka et al. (2014) e Abkay et al. (2013)
demonstraram correlação entre expressão de PD-L1 e a mutação do gene EGFR.
D`Incecco et al. (2015) e Ota et al. (2015) ainda identificaram correlação da expressão
de PD-L1 com rearranjo do gene ALK. Todavia, Zhang et al. (2014) não demonstraram
correlação entre expressão de PD-L1 e mutação de EGFR ou rearranjo do gene ALK.
Não foi demonstrada associação entre mutação do gene KRAS e expressão de PD-L1
nos estudos de Zhang et al. (2014) e D`Incecco et al. (2015).
No presente estudo, na análise univariada, dentre os doentes cujos tumores
apresentavam expressão positiva para PD-L1, a maior parte não apresenta a mutação do
gene EGFR, com significância estatística. Tal resultado não foi confirmado pela análise
multivariada.
Devido ao número reduzido de pacientes testados para mutação do genes KRAS e
rearranjo do gene ALK, não foi possível estabelecer uma relação entre estes genes e a
expressão de PD-L1.
A pesquisa de mutação do gene EGFR se iniciou em 2012 no Hospital de Câncer de
Barretos para casos isolados, passando a fazer parte da rotina no ano de 2013. Já a pesquisa
de mutação do gene KRAS foi realizada apenas para alguns casos no ano de 2012 e a partir
de então deixou de ser realizada. A pesquisa de rearranjo do gene ALK se iniciou no segundo
semestre de 2013 para casos isolados por FISH e passou a fazer parte da rotina para doentes
portadores de adenocarcinoma sem mutação de EGFR em 2015 por imuno-histoquímica.
5.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos
No presente estudo, tumores de doentes com passado de tabagismo apresentaram
maior chance de expressar positivamente o marcador PD-L1 nas células tumorais e maior
chance de expressar negativamente esse marcador nas células apresentadoras de antígenos.
Apesar de já ser descrito a influência do tabagismo na expressão de PD-L1 na célula
tumoral78. Essa é a primeira vez que se demonstra a possível influência do tabagismo na
expressão de PD-L1 na células apresentadora de antígeno. Foram comparados tabagistas
46
ativos e ex-tabagistas com não tabagistas (categoria de referência após a regressão
logística).
Observou-se na regressão logística que doentes com história oncológica pregressa
apresentaram maior expressão de PD-L1 em células tumorais. Não há relatos na literatura
associando expressão de PD-L1 e história oncológica pregressa.
Vale a pena ressaltar que alterações da expressão do marcador PD-L1 também podem
ocorrer relacionadas à exposição prévia a quimioterápicos, fato já demonstrado em
carcinomas uroteliais ou mesmo pulmonares.79, 80 O número restrito de doentes submetidos
à quimioterapia neoadjuvante impediu esse tipo de analise no presente estudo.
5.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1
Não foi verificada significância estatística quanto à expressão de PD-L1 e sobrevida
global conforme previamente descrita. Outros estudos revelam não haver aparentemente
um valor preditivo nem prognóstico quanto à expressão de PD-L171, 81, 82. Porém, em metaanálise publicada recentemente, após analisarem 5 estudos com 877 pacientes
portadores de carcinoma de pulmão de células não pequenas, Zhou et al. (2015)
concluíram que a expressão de PD-L1 pode estar relacionada a um pior prognóstico83.
Primeiramente, apenas um dos estudos incluiu pacientes ocidentais sendo os demais de
origem chinesa. Variações quanto a escolha de cutoffs distintos para positividade de
expressão e o tipo de amostra tecidual podem ter contribuído para resultados
discrepantes.
47
6
CONCLUSÃO
Neste estudo observa-se que, numa população brasileira de pacientes portadores de
câncer de pulmão de células não pequenas, o padrão de expressão de PD-L1 foi
heterogêneo, representado por dois tipos celulares distintos: celula tumoral (maior
frequência) e célula apresentadora de antígenos (menor frequência).
Devido ao baixo número de casos para os quais a pesquisa de mutação dos genes do
EGFR, KRAS, e rearranjo do gene ALK havia sido realizada, a interpretação da correlação
entre a expressão desses biomarcadores e a expressão de PD-L1 foi prejudicada.
As técnicas de TMA (análise coletiva) e cortes histológicos convencionais (análise
individual) apresentaram baixo grau de concordância quando se avaliou a imuno-expressão
do marcador PD-L1 nas células tumorais e nas células apresentadoras de antígeno em
doentes com câncer de pulmão de células não pequenas.
Tumores de pacientes ex-tabagistas apresentaram maior expressão de PD-L1 nas
células tumorais quando comparados aos que nunca fumaram. Contrariamente, extabagistas apresentaram menor expressão de PD-L1 nas APC quando comparados aos que
nunca fumaram. Doentes com história oncológica pregressa apresentaram maior chance de
expressão de PD-L1 em relação aos que não apresentavam história oncológica pregressa.
Também não foi observada correlação entre o padrão de expressão de PD-L1 e a
sobrevida nesta população.
48
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55
ANEXOS
Anexo A. Ficha de coleta
Avaliação da expressão dos biomarcadores PD-1 e PDL-1 em tecido tumoral de pacientes portadores de
carcinoma de pulmão e correlação com dados clínicos, demográficos e outros biomarcadores
Pesquisador: Gustavo Dix Junqueira Pinto
Ficha 1: Dados clínicos, demográficos e outros biomarcadores
DADOS PESSOAIS E HISTÓRIA MÉDICA
Nº de identificação
1
1
2
3
4
5
6
7
Registro hospitalar
2
Iniciais
3
Sexo
1- Feminino; 2- Masculino; 99- Ignorado
Data de nascimento
DD/MM/AAAA
Naturalidade
Cidade-Estado; 99- Ignorado
Procedência
Cidade-Estado; 99- Ignorado
4
5
6
7
Estado civil
8
1- Solteiro; 2- Casado; 3- Divorciado; 4- Viúvo; 5- Amasiado; 99- Ignorado
Raça
9
9
1- Branco; 2- Pardo;3- Negro; 4- Indígena; 5- Oriental; 99- Ignorado
Escolaridade
1- Analfabeto; 2- Fundamental incompleto; 3- Fundamental completo; 4-Ensino
10
10
médio incompleto; 5- Ensino médio completo; 6- Superior incompleto; 7Superior completo; 8- Pós graduado; 99- Ignorado
Profissão
8
11
12
13
14
15
16
11
Descrever; 99-Ignorado
Comorbidades
0- Não; 1- Diabetes; 2- HAS; 3- Cardiopatia; 4- AVE; 5- Outra(s); 99- Ignorado
Se outra comorbidade, detalhar:
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Outros tumores
0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado
Se sim, sítio:
1- Mama e gineco; 2- SNC; 3- TGI; 4- Uro; 5- Pele; 6- Outros; 88- Não se aplica;
99- Ignorado
Se outra, qual?
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
12
13
14
15
16
___/___/_____
56
HÁBITOS PESSOAIS
17
18
19
20
21
22
23
24
25
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
Tabagismo?
0- Não; 1- Presente; 2- Passado; 99- Ignorado
Se tabagismo (passado ou presente), qual a quantidade?
Em maços/ano; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Se ex-tabagista, quanto tempo abstinente?
Em anos; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Etilismo?
0- Não; 1- Presente; 2- Passado; 99- Ignorado
Se ex-etilista, quanto tempo abstinente?
Em anos; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
DADOS CLÍNICOS
Data do diagnóstico
DD/MM/AAAA
ECOG
0 a 4; 99- Ignorado
Tipo histológico
0- Adenocarcinoma; 1- Carcinoma escamoso; 2- Carcinoma adenoescamoso;
99- Ignorado
Grau histológico
1- GI (diferenciado); 2- GII (moderadamente diferenciado); 3- GIII (pouco
diferenciado);99- Ignorado
Estadiamento T (AJCC 2010)
0- Tx; 1- T0; 2- Tis; 3- T1a; 4- T1b; 5- T2a; 6- T2b; 7- T3; 8- T4; 99- Ignorado
Estadiamento N (AJCC 2010)
0- N0; 1- N1; 2- N2; 3- N3; 4- Nx; 99- Ignorado
Estadiamento M (AJCC 2010)
0- M0; 1- M1a; 2- M1b; 99- Ignorado
Agrupamento TNM simplificado
0- Carcinoma oculto; 1- TNM 0; 2- IA; 3- IB; 4- IIa; 5- IIB; 6- IIIA; 7- IIIB; 8- IV; 99Ignorado
Procedimento cirúrgico
0- Não; 1- Biópsia; 2- Nodulectomia; 3- Lobectomia; 4- Pneumectomia; 5Segmentectomia; 99- Ignorado
Registro da peça cirúrgica
Número; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data do procedimento cirúrgico
DD/MM/AAAA
MUTAÇÃO ENCONTRADA
ALK
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
EGFR EXON 18
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
EGFR EXON 19
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
17
18
19
20
21
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___/___/_____
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___/___/_____
57
37
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39
40
41
EGFR EXON 20
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
EGFR EXON 21
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
KRAS CODON 12
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
KRAS CODON 13
0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado
TRATAMENTO SISTÊMICO ADJUVANTE
Tratamento sistêmico adjuvante
0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 7Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo
de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado
Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:
42
37
38
39
40
41
42
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
43
Data de início
43
___/___/_____
44
DD/MM/AAAA
TRATAMENTO SISTÊMICO NEOADJUVANTE
Tratamento sistêmico neoadjuvante
0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 545
Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 745
Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo
de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado
Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:
46
46
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data de início
47
47
DD/MM/AAAA
Data de término
48
48
DD/MM/AAAA
TRATAMENTO SISTÊMICO CONCOMITANTE À RADIOTERAPIA
Tratamento sistêmico concomitante à radioterapia
0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 549
Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 749
Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo
de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado
50 Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:
50
___/___/_____
44
DD/MM/AAAA
Data de término
___/___/_____
___/___/_____
58
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
51
52
53
54
55
56
57
Data de início
51
___/___/_____
52
DD/MM/AAAA
TRATAMENTO SISTÊMICO PALIATIVO DE PRIMEIRA LINHA
Tratamento sistêmico paliativo de 1ª linha
0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 753
Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo
de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado
Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:
54
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data de início
55
DD/MM/AAAA
Data de término
56
DD/MM/AAAA
TRATAMENTO SISTÊMICO PALIATIVO DE SEGUNDA LINHA
Tratamento sistêmico paliativo de 2ª linha
0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 757
Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo
de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado
Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:
___/___/_____
DD/MM/AAAA
Data de término
58
___/___/_____
___/___/_____
58
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
59
Data de início
59
___/___/_____
60
DD/MM/AAAA
TRATAMENTO SISTÊMICO PALIATIVO DE TERCEIRA LINHA
Tratamento sistêmico paliativo de 3ª linha
0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 561
Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 761
Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo
de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado
Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:
62
62
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
___/___/_____
60
DD/MM/AAAA
Data de término
59
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
Data de início
DD/MM/AAAA
Data de término
DD/MM/AAAA
RADIOTERAPIA DE 1ªSÉRIE
Radioterapia 1ª série
0- Não; 1- Tu primário+linfonodos; 2- Osso; 3- SNC; 4- Tórax (adjuvância); 5Outro; 99- Ignorado
Radioterapia 1ª série - se outro
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data do início radioterapia 1ª série
DD/MM/AAAA
Data de término radioterapia 1ª série
DD/MM/AAAA
RADIOTERAPIA DE 2ªSÉRIE
Radioterapia 2ª série
0- Não; 1- Tu primário+linfonodos; 2- Osso; 3- SNC; 4- Outro; 99- Ignorado
Radioterapia 2ª série - se outro
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data do início radioterapia 2ª série
DD/MM/AAAA
Data de término radioterapia 2ª série
DD/MM/AAAA
RADIOTERAPIA DE 3ªSÉRIE
Radioterapia 3ª série
0- Não; 1- Tu primário+linfonodos; 2- Osso; 3- SNC; 4- Outro; 99- Ignorado
Radioterapia 3ª série - se outro
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data do início radioterapia 3ª série
DD/MM/AAAA
Data de término radioterapia 3ª série
DD/MM/AAAA
DADOS DO DESFECHO
1ª recidiva ou progressão
1ª recidiva
0- Não; 1- Local/regional; 2- Pulmão contra-lateral; 3- Osso; 4- SNC; 5- Fígado;
6- Outro; 99- Ignorado
Se outro local, detalhar:
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data da 1ª recidiva
DD/MM/AAAA
2ª recidiva ou progressão
2ª recidiva
0- Não; 1- Local/regional; 2- Pulmão contra-lateral; 3- Osso; 4- SNC; 5- Fígado;
6- Outro; 99- Ignorado
Se outro local, detalhar:
63
___/___/_____
64
___/___/_____
65
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67
___/___/_____
68
___/___/_____
69
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___/___/_____
72
___/___/_____
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___/___/_____
76
___/___/_____
77
78
79
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81
___/___/_____
60
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
82
83
84
85
86
87
88
Data da 2ª recidiva
DD/MM/AAAA
3ª recidiva ou progressão
3ª recidiva
0- Não; 1- Local/regional; 2- Pulmão contra-lateral; 3- Osso; 4- SNC; 5- Fígado;
6- Outro; 99- Ignorado
Se outro local, detalhar:
Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado
Data da 3ª recidiva
DD/MM/AAAA
Status
Status
1- Vivo sem doença; 2- Vivo com doença; 3- Óbito por CA; 4- Óbito SOE; 5Perda de seguimento 80
Data do último status
DD/MM/AAAA
Data do óbito
DD/MM/AAAA
82
___/___/_____
83
84
85
___/___/_____
86
87
___/___/_____
88
___/___/_____
61
Anexo B. Carta de aprovação do CEP
62
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