Manipulação de eucariotas
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Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética Manipulaçãodeeucariotas Carlos Sinogas 2016/17 - Folding - - Pontesdissulfídricas Processamentoproteolítico - splicing,(pre-),pro- Glicosilação EmO- (serina outreonina) - EmN- (asparagina) - Carlos Sinogas Engenharia Genética Eucariotas¹ procariotas - Modificaçãode aminoácidos Fosforilação,acetilação,etc. - Miristilação (C14)ou Palmitilação (C16) - Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética 2016/17 - Levedura,unicelular - Baculovírus Carlos Sinogas Engenharia Genética - Saccharomycescerevisiae - Elevadaprodutividade - Célulasdemamíferos - Proteínashumanas 2016/17 Alteraçãodo fenótipo - Introduçãode DNAem bactériasou leveduras - Alteraçãodas propriedadesde crescimentoem célulasanimais (tumor) Carlos Sinogas Engenharia Genética - TRANSFECÇÃO – IntroduçãodeDNAemcélulasanimais Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética 2016/17 - Carlos Sinogas Engenharia Genética - - Sistemaunicelular Genéticae fisiologicamentebem conhecido MicrorganismoGRAS(General Recognized AsSafe) Crescimentorápido Promotoresfortes disponíveis(e regulados) Processamentopós-tradução eucariótico Célulapouco secretora Mutantesauxotróficos (paraaminoácidos) Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética - Instabilidadeemculturasemlargaescalaoude longaduração 2016/17 Estratégiaidênticaaexpressãodeplasmídiosem procariotas Carlos Sinogas Engenharia Genética - - Reversãodofenótipoauxotrófico Perdadaexpressão(episoma) GOI– geneofinterest Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética Grandesfragmentos(100kb) Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética 2016/17 Carlos Sinogas Engenharia Genética - Leveduraunicelular Elevadadensidade nocrescimento - Nãoproduz etanol - Hiperglicosilação ausente Microrganismometilotrófico - GeneAOX(alcool oxidase) - Induzidopelo metanol(1000x) - Nãoexpresso constitutivamente - Alvopara recombinação - 2016/17 Engenharia Genética Carlos Sinogas AOX – alcool oxidase / HIS – histidina / GOI – “gene of interest” 2016/17 - Infectacélulas de insecto (várias espécies) Cicloviral infeccioso: Vírusgemulados - Corposde inclusão intracelulares (poliedrina) - Carlos Sinogas Engenharia Genética - - Promotorda poliedrina muitoforte Poliedrina dispensável para cicloinfeccioso 2016/17 Engenharia Genética Carlos Sinogas AcMNPV Autographa californica Multiple NuclearPolyhedrosis Virus - Co-transfectar plasmídio eDNAviral 2016/17 Recombinargene no plasmídio bacteriano (vector detransferência) Carlos Sinogas Engenharia Genética - - Duplarecombinação homóloga Seleccionarvírus recombinantes - Célulasinfectadas sem corpos deinclusão Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética 2016/17 Carlos Sinogas Engenharia Genética - Modificaçõespós-traduçãocompletaseadequadas (homem) - Crescimentocelularemaderência SMG– selectable marker gene Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética 2016/17 Carlos Sinogas Engenharia Genética UTR– regiõesnãotraduzidas K– sequênciadeKozak- CC(A/G)CCAUGG S– sequênciadesinal T– “tag”(parapurificação) P– sequênciadeprotease SC– codãostop 2016/17 - Carlos Sinogas Engenharia Genética - Perdadeumdos vectores Diferentenúmerode cópiasdecada plasmídio Þ Sobreproduçãode umadasunidades IRES – internal ribosomal entry site Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética 2016/17 Selecçãopositiva: - Carlos Sinogas Engenharia Genética - - Neomicina Selecçãonegativa: - Ganciclovir Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética Carlos Sinogas 2016/17 Engenharia Genética
