Caracterização de linhagens de carcinoma de mama e

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Caracterização de Linhagens de Carcinoma de Mama e Papel do
Fator Tecidual em Células-Tronco do Câncer
ARACI MARIA DA ROCHA RONDON
RIO DE JANEIRO
2012
ii
Araci Maria da Rocha Rondon
Caracterização de Linhagens de Carcinoma de Mama e Papel do
Fator Tecidual em Células-Tronco do Câncer
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade Federal do Rio
de Janeiro como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre
em Ciências Morfológicas.
Orientadora: Profª Maria Isabel Doria Rossi
Laboratório de Biologia Celular Aplicada à Medicina
Instituto de Ciências Morfológicas - UFRJ
Co-Orientador: Profº Robson de Queiroz Monteiro
Laboratório de Trombose e Câncer
Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ
RIO DE JANEIRO
2012
iii
Araci Maria da Rocha Rondon
Caracterização de Linhagens de Carcinoma de Mama e Papel
do Fator Tecidual em Células-Tronco do Câncer
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Maria Isabel Doria Rossi
Co-Orientador:
Prof.ª Dr.ª Robson Queiroz Monteiro
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Morfológicas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de
Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em
Ciências Morfológicas.
Revisão: Prof.ª Dr.ª Valéria de Mello Coelho, ICB/UFRJ
Avaliadores: Prof.ª Dr.ª Tatiana Lobo Coelho de Sampaio, ICB/UFRJ
Prof.ª Dr.ª Vivian Mary Barral Dodd Rumjanek, IBqM/UFRJ
Prof.ª Dr.ª Adriana Cesar Bonomo, IMPPG/UFRJ e Fiocruz
Suplentes: Prof.ª Dr.ª Valéria de Mello Coelho, ICB/UFRJ
Prof.ª Dr.ª Lina Benedeta Zingali, IBqM/UFRJ
MAIO/2012
iv
RONDON, Araci Maria da Rocha
Caracterização de Linhagens de Carcinoma de Mama e Papel do
Fator Tecidual em Células-Tronco do Câncer/Araci Maria da Rocha
Rondon. Rio de Janeiro: UFRJ/ICB/PCM, 2012.
xiii, 59 p. il.
Orientadores: Maria Isabel Doria Rossi e Robson de Queiroz
Monteiro
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de
Janeiro/Instituto de Ciências Biomédicas/ Programa de Pós-Graduação
em Ciências Morfológicas, 2012
1.Câncer de Mama. 2. Células-Tronco do Câncer. 3. Fator Tecidual.
4. Coagulação Sanguínea. 5. Biomarcadores. 6. Biologia Celular –
Tese. I. Rossi, Maria Isabel Doria. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, PCM. III. Título
v
Agradecimentos
Aos meus pais, por me possibilitarem fazer o que realmente gosto. Ao meu
pai, por sempre apoiar minhas decisões. À minha mãe, pelo amor infinito e incentivo
durante minha formação.
Aos meus irmãos, Leonardo, Clarisse e Emanuel, pelo companheirismo desde
sempre.
Aos meus sobrinhos, primos e afilhados por alegrarem meus dias.
Aos meus amigos queridos: Débora, Flavia, Janaína, Stephan e Taíssa.
Ao Thiago, pelos questionamentos, por sempre estar disponível para me ouvir
e ajudar.
Aos meus amigos, também amantes da pesquisa, pelo apoio nas horas
difíceis.
Às minhas companheiras do Laboratório de Biologia Celular Aplicada à
Medicina: Ana Paula, Anneliese, Daiana, Danielle, Mariana, Rhayra e Suzanna. Um
especial agradecimento à Ana Paula e Anneliese, pelo envolvimento com este
trabalho.
Às minhas companheiras do Laboratório de Trombose e Câncer: Ana
Carolina, Andréia Mariano, Andréia Oliveira, Angélica, Daniella, Giana, Jorgeane,
Luize e Tatiana. Especialmente a Andréia Oliveira, Angélica, Giana e Luize pela
ajuda nos experimentos.
Aos meus colegas do Laboratório de Cultura e Criopreservação de Medula
Óssea, pelo apoio e amizade.
Ao Professor Roger Chammas e sua aluna de pós-doutorado Camila
Machado, pela colaboração.
À profª Isabel, pela orientação durante a iniciação científica e mestrado, por
acreditar em mim e por ser um exemplo de comprometimento com a ciência e
educação.
Ao prof. Robson, pela co-orientação, pelo grande incentivo e participação na
minha formação.
À Capes-CNPq pelo suporte financeiro.
vi
Resumo
Apesar da detecção precoce do câncer de mama, algumas pacientes sofrem recaída
no período de cinco anos após o tratamento. A identificação de potenciais
biomarcadores de prognóstico ruim pode orientar a abordagem terapêutica e
melhorar a sobrevida da paciente. O Fator Tecidual (FT), uma proteína que inicia a
coagulação sanguínea ao se ligar ao Fator VIIa (FVIIa), tem sido reconhecido como
um marcador de progressão tumoral e metástase. Em câncer de mama, células com
o fenótipo CD44+CD24-/lo tem sido descritas como célula-tronco do câncer (CTC),
que originam células luminais mais diferenciadas CD24 +. Entretanto, dados recentes
sugerem que a transição epitélio-mesenquimal (TEM) pode gerar células com
característica de CTC. O objetivo deste estudo foi investigar a expressão e função
de FT em linhagens de câncer de mama, correlacionando com a expressão das
moléculas CD44 e CD24 e comportamento invasivo. A linhagem de carcinoma
mamário MDA-MB-231 apresentou fenótipo CD24-, Basal e invasivo. Enquanto a
linhagem MCF-7 apresentou fenótipo CD24+, Luminal e não invasivo. Curiosamente,
na linhagem T-47D, classificada como Luminal, foram identificadas duas
subpopulações, CD44+CD24-/lo e CD44-CD24+. Estas subpopulações foram
selecionadas e verificou-se que mantiveram fenótipo estável in vitro. A análise da
morfologia e da capacidade invasiva das linhagens em modelo tridimensional de
medula óssea do tipo esferoide mostrou uma correlação direta com o fenótipo. Ao
avaliar o potencial pró-coagulante das linhagens, este foi associado à capacidade
invasiva e correlacionou-se a expressão e atividade da proteína FT. Ou seja, as
linhagens com o fenótipo Basal/CTC (MDA-MB-231 e T-47DCD44+CD24-/lo) foram
pró-coagulantes e positivas para FT e as linhagens com fenótipo Luminal (MCF-7 e
T-47DCD44-CD24+) apresentaram baixos ou indetectáveis níveis de FT e não foram
capazes de iniciar a coagulação sanguínea. Como os níveis de FT foram distintos
entre células com maior ou menor agressividade (atividade invasiva e prócoagulante), a regulação do FT pode estar associada a processos de progressão
tumoral, através de eventos como CTC e TEM no câncer de mama.
vii
Abstract
Despite early detection of breast cancer, some patients relapse within five years after
treatment. Identification of potential biomarkers of poor prognosis may guide the
therapeutic approach and improve patient’s survival. Tissue factor (TF), a protein that
initiates blood clotting upon binding to coagulation factor VIIa (FVIIa), has been
recognized as a marker of tumor progression and metastasis. In breast cancer, cells
with the phenotype CD44+CD24-/lo have been described as cancer stem cells (CSC)
that originate the more differentiated luminal CD24+ cells. However, recent data
suggest that epithelial-mesenchymal transition (EMT) generates cells with CSC
characteristics. The aim of this study was to investigate the expression and function
of TF in breast cancer cell lines correlating with the expression of CD44 and CD24
molecules and invasive behavior. MDA-MB-231 cells were CD24- and showed a
Basal and invasive phenotype. MCF-7 cells were CD24+ and showed a Luminal and
noninvasive phenotype. Interestingly, we identified two subpopulations, CD44+CD24/lo
and CD44-CD24+, in T-47D cell line that is classified as Luminal. These
subpopulations were selected and the phenotype remained stable in vitro. Analysis of
morphology and invasive capacity in a three-dimensional culture model of bone
marrow spheroids showed a direct correlation with the phenotype. The procoagulant
potential was evaluated and it was associated with invasiveness, TF expression and
activity. Cell lines with the Basal/CTC phenotype (MDA-MB-231 e T-47DCD44+CD24/lo
) were procoagulant and positives for TF while cells with Luminal phenotype (MCF7 e T-47DCD44-CD24+) exhibited low or undetectable levels of TF and were not able
to initiate blood clotting. Since TF levels were distinct between cells with higher or
lower aggressivity, FT regulation may be associated with tumor progression through
events like CSC and EMT in breast cancer.
viii
Lista de Siglas e Abreviaturas
BSA
Albumina Sérica Bovina (Bovine Serum Albumin)
CD24
Cluster De Diferenciação 24 (Cluster of Differentiation 24)
CD24pos
CD24 positivo ou CD24+
CD44
Cluster De Diferenciação 44 (Cluster of Differentiation 44)
CD44pos
CD44 positivo ou CD44+
CFSE
5-(e 6)- Carboxifluoresceína Diacetato de Succinil Éster
CFU-F
Unidade Formadadora de Colônia Fibroblastoide (Colony Forming Unit Fibroblast)
CTC
Célula-tronco do Câncer (CSC, Cancer Stem Cell)
DMEM
Meio Eagle Modificado Por Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagles Medium)
EDTA
Ácido Etilenodiamino Tetra Acético (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
TEM
Transição Epitélio-Mesenquimal (EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition)
TNM
Classificação Tumor-Nódulo-Metástase
FT
Fator Tecidual (TF, Tissue Factor)
FVII
Fator Sete
FVIIa
Fator VII ativado
FX
Fator Dez
FXa
Fator X ativado
FACS
Separador de Células Ativado por Fluorescência (Fluorescence Activated Cell
Sorter)
ix
GAPDH
Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
HE
Hematoxilina e Eosina
HER2
Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico Humano Tipo 2
IMDM
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (Meio Dulbecco Modificado por Iscove)
MMPs
Metaloproteases
MO
Medula Óssea
MSC
Células Mesenquimais de Estroma Multipotentes (Mesenchymal Stromal Cells)
NOD/SCID
Diabético Não Obeso/Imunodeficiência Combinada Severa (Non-Obese Diabetes/
Severe Combined Immunodeficiency)
PAR
Receptores Ativados por Proteases (Protease-activated receptor)
PE
Phycoerythrin (ficoeritrina)
SFB
Soro Fetal Bovino
PBS
Salina Tamponada Com Fosfato (Phosphate Buffered Saline)
RP
Receptor de Progesterona (Progesterone Receptor)
RE
Receptor de Estrogênio (Estrogen Receptor)
x
Sumário
1.
2.
3.
Introdução........................................................................................................... 1
1.1.
Epidemiologia do Câncer de Mama .............................................................. 1
1.2.
Diagnóstico e Classificações ........................................................................ 2
1.3.
Heterogeneidade Tumoral ............................................................................ 7
1.4.
Metástase ................................................................................................... 11
1.5.
Câncer e Alterações na Coagulação Sanguínea ........................................ 17
1.6.
Fator Tecidual e Sinalização Celular........................................................... 21
1.7.
FT em CTC e Justificativa do Estudo .......................................................... 22
Objetivos ........................................................................................................... 24
2.1.
Objetivo Geral ............................................................................................. 24
2.2.
Objetivos Específicos .................................................................................. 24
Material e Métodos ........................................................................................... 25
3.1.
Células e Amostras ..................................................................................... 25
3.2.
Obtenção de células mesenquimais do estroma da medula óssea ............ 25
3.3.
Cultivo em sistema de cultura tridimensional do tipo Matrigel ..................... 26
3.4.
Diferenciação para linhagem osteogênica das MSC................................... 27
3.5.
Modelo de cultura tridimensional do tipo esferoide .................................... 27
3.6.
Ensaio de invasão ....................................................................................... 27
3.7.
Histologia .................................................................................................... 28
3.8.
Imunofluorescência ..................................................................................... 28
3.9.
Citometria de fluxo ...................................................................................... 29
3.10. Tempo de Recalcificação do Plasma Sanguínea ........................................ 30
3.11. Ensaio de Ativação do Complexo de Tenase Extrínseco ............................ 31
xi
4.
Resultados ........................................................................................................ 32
4.1.
Caracterização fenotípica das linhagens de tumor de mama quanto à
expressão das moléculas CD24 e CD44 ................................................................... 32
4.2.
Caracterização das subpopulações CD24pos e CD24neg da linhagem T47-D
.....................................................................................................................35
4.3.
Análise da invasão de linhagens de carcinoma de mama em modelo de
cultura tridimensional ................................................................................................ 37
4.4.
Indução de atividade pró-coagulante por linhagens de carcinoma de mama .
.....................................................................................................................40
4.5.
Expressão de Fator Tecidual nas linhagens de carcinoma de mama ......... 42
4.6.
Análise da ativação da cascata de coagulação medida pelo FT presente
nas células de carcinoma mamário ........................................................................... 47
5.
Discussão ......................................................................................................... 48
6.
Conclusões ....................................................................................................... 54
7.
Referências Bibliográficas .............................................................................. 55
xii
Lista de Figuras
FIGURA 1. A sobrevida relativa de 10 anos correlaciona com o estadiamento
tumoral.. ...................................................................................................................... 3
FIGURA 2. Unidade lobular dutal terminal (TDLU). ..................................................... 7
FIGURA 3. Modelos de heterogeneidade em tumores sólidos.................................... 9
FIGURA 4. Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM) e plasticidade epitelial. ............. 13
FIGURA 5. Modelos da cascata metastática. ............................................................ 14
FIGURA 6. Curva de sobrevida de pacientes com câncer de mama pós-cirurgia de
acordo com a presença ou não de células tumorais disseminadas nos linfonodos ou
MO. ........................................................................................................................... 16
FIGURA 7. Cascata de coagulação sanguínea. ........................................................ 20
FIGURA 8. Papéis distintos do FT na biologia tumoral. ............................................ 21
FIGURA 9. Expressão fenotípica das moléculas CD24 e CD44 em linhagem de
tumor de mama. ........................................................................................................ 33
FIGURA 10. Seleção por citometria de fluxo das subpopulações da linhagem de
tumor de mama T-47D. ............................................................................................. 34
FIGURA 11. Expressão de CD44 e CD24 nas células T-47D selecionadas por
citometria de fluxo e mantidas em cultura por 3 meses.. .......................................... 34
FIGURA 12. Aspectos morfológicos das subpopulações T-47D CD24neg e T-47D
CD24pos em cultura.................................................................................................... 35
FIGURA 13. Aspectos morfológicos das subpopulações T-47D CD24neg e T-47D
CD24pos em Matrigel.................................................................................................. 36
FIGURA 14. Co-culturas de esferoides de MO com células T-47D CD24neg, T-47D
CD24pos, MDA-MB-231 ou MCF-7. ............................................................................ 38
FIGURA 15. Tempo de coagulação do plasma sanguíneo em contato com linhagens
de câncer de mama.. ................................................................................................. 41
FIGURA 16. Expressão do FT na superfície de células de carcinoma de mama.. .... 43
FIGURA 17. Expressão de FT membranar e intracelular nas linhagens de carcinoma
de mama. .................................................................................................................. 44
FIGURA 18. Atividade dos anticorpos anti-FT (10H10 e 5G9). ................................. 46
FIGURA 19. Ensaio de ativação do FX. .................................................................... 47
xiii
Lista de Tabelas
TABELA 1. Estadiamento de tumores primários correlacionados com a classificação
TNM para câncer de mama. ........................................................................................ 3
TABELA 2. Correlação entre a classificação molecular e a classificação clínicopatológica. ................................................................................................................... 6
TABELA 3. Características dos anticorpos que serão usados para
imunofluorescência e citometria. ............................................................................... 29
.
Introdução | 1
1. Introdução
1.1.
Epidemiologia do Câncer de Mama
O câncer é a segunda doença que mais mata no mundo, ficando atrás
somente das cardiopatias (Jemal et al., 2010). Já o câncer de mama é o segundo
tipo de câncer mais frequente no mundo e é o principal entre as mulheres,
representando 16% de todos os cânceres femininos. Foram estimadas para 2008,
aproximadamente 460.000 mortes por câncer de mama no mundo (Jemal el al.,
2011). Em países desenvolvidos a mortalidade das pacientes com câncer de mama
vem diminuindo, o número de pacientes diagnosticadas em estágios iniciais
aumentou. Essa mudança surgiu em grande parte devido ao rastreamento do câncer
de mama, a evolução dos exames com imagem e a maior conscientização da doença
entre as mulheres (Louwman et al., 2008; Corina et al., 2011).
Apesar das melhorias no diagnóstico e tratamento, a incidência do câncer de
mama vem aumentando nas últimas décadas (Louwman et al., 2008), sendo ainda
considerada uma doença devastadora. No Brasil, a estimativa para o ano de 2012 é
de 52.680 novos casos, com 11.735 mortes (Estimativa INCa, 2012).
Um valioso indicador do progresso no controle do câncer é a sobrevida
relativa das pacientes, que geralmente é proporcional ao desenvolvimento
econômico da região. No Brasil a sobrevida relativa após cinco anos da doença é de
58,4% das pacientes de câncer de mama, enquanto nos EUA e Europa estas taxas
são de 83,9% e 73,1%, respectivamente. As reduzidas taxas encontradas no Brasil,
e em outros países em desenvolvimento, são decorrentes de diagnóstico e
tratamento tardios (Coleman et al., 2008; Lee et al. 2012).
Introdução | 2
1.2.
Diagnóstico e Classificações
Diversos fatores clínicos e patológicos são rotineiramente usados para
caracterizar tumores de pacientes com câncer de mama com o objetivo de avaliar o
progresso da doença e determinar a terapia adequada. Atualmente, os principais
fatores utilizados são: a idade da paciente, a presença de metástases nos linfonodos
axilares, o tamanho do tumor, características histológicas, análise da presença de
receptores hormonais (estrogênio e progesterona) e do oncogene HER2 - receptor
do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (Schnitt, 2010). As duas principais
classificações utilizadas no diagnóstico e estadiamento de tumores são: a
classificação TNM (tumor-nódulo-metástase) e a classificação molecular.
O sistema tumor-nódulo-metástase (TNM) baseia-se nos principais atributos
morfológicos de tumores malignos: tamanho do tumor primário, nódulos, ulcerações,
microinvasão e inflamação (T), presença e extensão de metástase linfonodal (N), e
presença de metástases distantes (M). Utilizando o sistema TNM é possível
determinar o estadiamento do câncer de mama (Tab. 1), que é muito útil para
estimar o prognóstico. Pacientes com tumores em estágios iniciais apresentam
sobrevida superior a de pacientes em estágios mais avançados, conforme
apresentado na Fig. 1 (Singletary & Connolly, 2006).
Introdução | 3
TABELA 1. Estadiamento de tumores primários correlacionados com a classificação TNM
para câncer de mama.
Estadiamento
Classificação TNM
Estágio 0
Tis*
N0
Estágio IA
T1
N0
T0
N1mi**
Estágio IB
T1
N1mi
T0
N1
Estágio IIA
T1
N1
T2
N0
T2
N1
Estágio IIB
T3
N0
T0
N2
T1
N2
Estágio IIIA
T2
N2
T3
N1, N2
Estágio IIIB
T4
N0,N1,N2
Estágio IIIC
Tis,T1,T2,T3,T4 N3
Estágio IV
Tis,T1,T2,T3,T4 N0,N1,N2,N3
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M0
M1
Sobrevida relativa de 10 anos
Tabela adaptada de http://www.cancerstaging.org/staging/index.html (último acesso em
20/05/2012). *Tis = Carcinoma in situ. **N1mi = entre 0,2 mm e 2,0 mm.
Estágios TNM
FIGURA 1. A sobrevida relativa de 10 anos correlaciona com o estadiamento tumoral.
1.3 milhões de casos (1985 até 1996) da Base de dados Nacional do Câncer (National
Cancer Data Base). Traduzido de Singletary et al., 2006, apud Bland, et al., 1998.
Introdução | 4
Análises da expressão gênica em carcinomas de mama resultaram na
identificação de cinco principais subtipos, luminal A, luminal B, basal, Erb-B2 e perfil
similar
à
mama
normal,
que
apresentam
diferentes expressões
gênicas,
características clínicas, respostas ao tratamento e prognóstico (Perou et al., 2000;
Sorlie et al., 2001). As principais características desses subtipos estão listadas a
baixo:
Luminais A e Luminal B - apresentam padrões de expressão gênica
semelhantes aos dos componentes luminais da mama, como citoqueratinas 8/18,
receptor de estrogênio (RE) e gênese associados com a ativação de RE. O grupo
luminal representa o subtipo mais frequente entre os tumores de mama. O subtipo
luminal A caracteriza baixo grau histológico, tumores bem diferenciados e pouca
atividade mitótica, além de expressar RE e/ou receptor de progesterona (RP) e ser
negativo para HER2. O subtipo luminal B indica um tumor menos diferenciado, além
de RP. Pode ser HER2 positivo e pode ter altos índices de Ki-67 (marcador de
proliferação). O subtipo luminal B apresenta pior prognóstico e menor tempo de
sobrevida quando comparado ao subtipo luminal A (Sorlie et al., 2001, Brenton et al.,
2005; Schnitt, 2010).
Basal - recebeu esse nome por apresentar um padrão de expressão similar
ao observado em células do epitélio basal. A maioria é “triplo negativo”, ou seja, não
apresenta expressão do RE e do RP, e apresenta baixa expressão de HER2.
Grande parte das mulheres com mutação em BRCA 1 desenvolve câncer de mama
do subtipo basal. Geralmente esse grupo pode ser associado a um prognóstico ruim,
assim como não responde bem a terapias convencionais, como terapia endócrina e
trastuzumabe, que é um anticorpo monoclonal anti-HER2 que mostra benefícios na
Introdução | 5
sobrevida de pacientes em estágios iniciais e avançados com presença de
metástase. Contudo, tumores do subtipo basal podem ser sensíveis a quimioterapias
convencionais. (Brenton et al., 2005; Schnitt & Connolly, 2010).
Erb-B2 - apresenta expressão de genes de epitélio basal, superexpressão de
HER2 e ausência de receptores hormonais. Geralmente apresentam alto grau
histológico e são pouco diferenciados. Os subtipos Erb-B2 e basal estão associados
a uma sobrevida mais curta dentre todos os grupos (Sorlie et al., 2001; Brenton et
al., 2005).
Perfil similar à mama normal (normal-like) - apresenta expressão de muitos
genes tipicamente expressos em tecido adiposo, epitélio basal e em outras células
não epiteliais, além de pequena expressão de genes encontrados em células
epiteliais luminais. Esse subtipo é geralmente negativo para RE, RP, HER2.
Contudo, ainda não foram descritos marcadores para imunohistoquímica que
determinem seu diagnóstico preciso (Perou et al., 2000, Sorlie et al., 2001; Yu et al.,
2009).
Na prática clínica, os tumores são classificados em luminal A, luminal B, basal
e HER2, por imunohistoquímica para RE, do RP, HER2 e Ki-67 (Tab. 2) Essa
correlação permite que os médicos determinem o melhor tipo de abordagem
terapêutica para cada paciente, utilizando uma técnica acessível financeiramente e
amplamente empregada, já que ainda não é viável a utilização de varreduras
genéticas para o diagnóstico das pacientes individualmente (Schnitt, 2010;
Goldhirsch et al., 2011).
Introdução | 6
TABELA 2. Correlação entre a classificação molecular e a classificação clínico-patológica.
Subtipo
Molecular
Luminal A
Luminal B
Definição ClinicoPatológica
“Luminal A”
RE+ e/ou RP+, HER2-, baixo Ki-67 (<14%)
“Luminal B (HER2-)”
RE + e/ou RP+, HER2-, alto Ki-67 (>14%)
“Luminal B (HER2+)”
RE + e/ou RP+, HER2, Ki-67
Marcadores
Erb-B2
“HER2+ (não luminal)”
RE - e/ou RP-, HER2
Basal
“Triplo negativo”
RE - e/ou RP-, HER2-
RE=Receptor de Estrogênio; RP=Receptor de Progesterona; HER2=Receptor 2 do fator de
crescimento epidérrmico humano; Ki-67=marcador de proliferação. Tabela adaptada de
Goldhirsch et al., 2011.
Existe uma correlação entre os diferentes subtipos tumorais e a organização
histofuncional da mama. A glândula mamária é uma glândula composta por um
sistema de dutos, lobos e lóbulos. Os dutos e alvéolos são revestidos por duas
camadas epiteliais, camada interna, luminal, e uma externa mioepitelial que está em
contato com a membrana basal. As células luminais são as secretoras de leite
durante a gestação e lactação, enquanto as células mioepiteliais são contráteis,
favorecendo o transporte de leite ao longo do sistema de dutos. Atualmente,
acredita-se que as células epiteliais e mioepiteliais originam-se de um precursor
comum, derivado da célula-tronco mamária que se localiza predominantemente na
região conhecida como unidade lobular dutal terminal (TDLU, terminal ductal lobular
unit). Essa região parece ser o sítio de origem dos carcinomas dutais de mama, Fig.
2 (Hennighausen & Robinson, 2005; LaBarge et al., 2007).
Introdução | 7
FIGURA 2. Unidade lobular dutal terminal (TDLU). A TDLU é a unidade básica funcional
da mama, onde se acredita estar localizada a célula-tronco do tecido mamário que pode dar
origem a um progenitor bipotente que é capaz de se diferenciar tanto em células
mioepiteliais como em células luminais (Modificado de LaBarge et al., 2007 ).
1.3.
Heterogeneidade Tumoral
Células dentro de um único tumor exibem variações consideráveis de
propriedades, como tamanho, morfologia, expressão de antígenos, composição da
membrana celular, marcadores de superfície, alterações genéticas e epigenéticas,
proliferação, predisposição para metástase e sensibilidade a quimioterápicos. Essa
ampla série de diferentes fenótipos celulares produz a heterogeneidade tumoral
(Heppner, 1984; Dick, 2008). Existem dois principais modelos para explicar a
heterogeneidade tumoral: a evolução clonal e as células-tronco do câncer (CTC),
(Fig. 3).
A evolução clonal, descrita por Peter C. Nowell em 1976, baseia-se no
surgimento do tumor a partir de mudanças em uma única célula que se torna
Introdução | 8
neoplásica e possui a capacidade de crescimento superior a das células normais. De
tempos em tempos, como resultado da instabilidade genética da população tumoral
em expansão, células mutantes são produzidas. A maioria das variedades é
eliminada
devido
a
desvantagens
metabólicas
ou
destruição
metabólica.
Ocasionalmente, uma população apresenta vantagens adicionais tanto em relação
ao tumor original como em relação às células normais, e essa mutação torna-se
precursora de uma nova subpopulação predominante (Nowell, 1976). As terapias
tradicionais seguem este modelo, levando em consideração a possibilidade de todas
as células do tumor serem capazes de proliferar abundantemente e produzir
metástase, desta forma, as terapias buscam a eliminação de toda a população
tumoral (Shackleton et al., 2009).
Por outro lado, o modelo das CTC propõe que os tumores seriam organizados
hierarquicamente, e uma pequena subpopulação das células seria responsável pela
heterogeneidade tumoral. Essas células dariam origem a células com variados
fenótipos, ou seja, células mais diferenciadas, e ainda teriam a capacidade de
realizar a autorrenovação, que consiste na geração de progênie idêntica. O modelo
das CTC pode explicar as altas taxas de recidiva da doença após tratamento, uma
vez que essas células seriam resistentes aos tratamentos convencionais,
produziriam metástase e reconstruiriam a heterogeneidade tumoral. De acordo com
esse modelo, as CTC poderiam ter origem nas próprias células-tronco dos tecidos
adultos, assim como poderiam se originar de células normais, que se tornariam
malignas e adquiririam essas características (Reya et al., 2001; Clevers, 2011). Com
o propósito de desenvolver terapias de maior eficiência com base no modelo das
Introdução | 9
CTC, é necessário entender os mecanismos celulares e moleculares dessa
população em cada tipo de câncer (Dick, 2008).
Em 1997, pela primeira vez foram identificadas células oriundas de pacientes
de leucemia mielóide aguda com propriedades de CTC. Somente uma pequena
população celular com os marcadores, CD34posCD38neg, que também são
marcadores de células-tronco hematopoéticas normais, eram capazes de gerar a
doença, semelhante a do doador, em camundongos imunodeficientes NOD/SCID
(Bonnet e Dick, 1997). CTC também foram identificadas em tumores sólidos, cérebro
e mama, através da mesma estratégia experimental: separação de subpopulações
de tumores, identificação da expressão de marcadores de superfície e transplante
em modelos animais (Singh et al., 2003; Al-Hajj et al., 2003).
FIGURA 3. Modelos de heterogeneidade em tumores sólidos. Em (a) o modelo de
evolução clonal, onde as células tumorais apresentam diferentes fenótipos e em sua maioria
são capazes de proliferar amplamente e formar novos tumores. Em (b) o modelo de célulastronco do câncer, onde as células também apresentam diferentes fenótipos, porém somente
as CTC são capazes de proliferar amplamente e produzir novos tumores (Reya et al., 2001).
Introdução | 10
Em 2003, Al-Hajj e colaboradores utilizaram as moléculas CD44 e CD24 para
identificar populações de acordo com sua capacidade tumorigênica em câncer de
mama humano. A molécula CD44 é uma glicoproteína transmembranar que se liga
ao ácido hialurônico e desencadeia sinalização intracelular e sua presença parece
estar relacionada com a progressão tumoral. Já a molécula CD24 é uma pequena
proteína de membrana altamente glicosilada que se liga a membrana através de
uma âncora glicosilfosfatidilinositol e está presente principalmente em balsas
lipídicas.
Células
provenientes
de
efusões
pleurais
com
o
fenótipo
CD44posCD24neg/low eram capazes de proliferar extensivamente e dar origem a
diversos tipos celulares, gerando um tumor similar ao de origem, em modelo de
camundongos imunodeficientes NOD/SCID. Por outro lado, células com o fenótipo
CD44negCD24pos não eram capazes de produzir a heterogeneidade tumoral.
Levando em consideração os resultados obtidos pelos autores, a fração
CD44posCD24neg/low representaria as CTC do câncer de mama (Al-Hajj et al., 2003).
O potencial tumorigênico da subpopulação de células CD44posCD24neg, proveniente
de
tumores
de
mama
humanos,
foi
confirmada
em
modelo
de
animal
imunodeficiente e essa subpopulação exibiu propriedades de CTC (Ponti et al.
2005).
Mais recentemente, o modelo de CTC foi questionado, uma vez que em
muitos tumores, como o câncer de mama, as diferenças entre as células
identificadas como CTC, tumorigênicas, e não tumorigênicas estão relacionadas a
fenômenos genéticos ou epigenéticos. Exemplificando a identificação de CTC se
baseia
no
fenótipo
associado
ao
potencial
tumorigênico
em
animal
imunocomprometido. No entanto, influências do microambiente, incluindo o grau de
Introdução | 11
imunodeficiência do modelo animal, podem alterar os resultados. Portanto, a
incapacidade de formar um tumor pode estar ligada na verdade ao modelo
experimental utilizado (Quintana et al. 2008; Shackleton et al. 2009)
Contribuindo para a discussão das CTC, já foi descrito que a partir da indução
de transição epitélio-mesenquimal (TEM), que será descrita abaixo, é possível obter
células com o fenótipo CD44+ CD24-/lo, mesmo fenótipo descrito para as CTC. Esses
marcadores determinariam o subtipo celular Basal B ou mesenquimal, levantando
então a hipótese que as células tumorais passariam pelo processo de TEM com a
finalidade de alcançar novos sitos durante o processo de metástase, momento que
adquiririam os marcadores de CTC (Mani et al., 2008).
1.4.
Metástase
A metástase tem origem na disseminação de células de um tumor primário
que dão origem a tumores em órgãos distantes. É um processo extremamente
complexo no qual, apesar de diversas células migrarem a partir dos tumores
primários para outros sítios, somente uma pequena minoria será capaz de se
estabelecer e proliferar em um órgão distante (Chambers, et al., 2002; Gupta &
Massagué, 2006; Fidler, 2003). Muitas etapas sequenciais são necessárias para que
ocorra a metástase, sendo que as principais etapas são: iniciação, intravasação e
extravasação (Chambers, et al., 2002).
A primeira etapa, a iniciação, é o momento que uma fração das células
tumorais passa por uma série de modificações que são atribuídas a um mecanismo
semelhante ao que ocorre durante a fase de gastrulação da embriogênese: a TEM.
Esse mecanismo se caracteriza pela perda da polaridade e de junções celulares,
com diminuição da expressão de moléculas do tipo E-caderina e aquisição de
Introdução | 12
propriedades de células mesenquimais, como expressão de vimentina e de
moléculas que promovem mobilidade e capacidade de invadir a matriz extracelular
(Fig. 4) (Chambers, et al., 2002; Micalizzi et al., 2010).
A segunda etapa é a intravasação, quando as células tumorais penetram o
sistema circulatório sanguíneo. Este processo pode ocorrer através do sistema
linfático ou diretamente pelos vasos sanguíneos (Fig. 5). As plaquetas e a deposição
de fibrina sobre as células tumorais circulantes apresentam um papel importante
nesse processo, já que podem promover a entrada dessas células nos vasos e a
saída para sítios distantes do tumor primário (Pantel & Brakenhoff, 2004; Palumbo,
2008; Gay & Felding-Habermann, 2011).
A terceira etapa é o extravasamento, momento que as células saem dos
capilares e alcançam sítios distantes. Uma vez neste novo sítio, as células terão um
novo desafio, iniciar e manter o crescimento tumoral (Chambers, et al., 2002; Fidler,
2003).
Introdução | 13
Perda da polaridade
Ganho de proteínas
apical-basal
mesenquimais
FIGURA 4. Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM) e plasticidade epitelial. Durante a TEM as células epiteliais perdem sua polaridade
apico-basal devido a perda de junções ocludentes, permitindo a mistura das proteínas de membrana das regiões apical e baso-lateral. Junções
mediadas por E-caderina e integrinas epiteliais (em verde) são perdidas e são substituídas por junções mesenquimais como N-caderina e
integrinas específicas (em azul). O citoesqueleto de actina se remodela formando fibras de estresse e protrusões contrátreis. Os filamentos
intermediários epiteliais como citoqueratinas passam a ser menos expressos e dão lugar a expressão de vimentina. Esse processo é
acompanhado pela secreção de metaloproteases (MMPs) que degradam a membrana basal (fibras em vermelho) permitindo a invasão do
estroma adjacente (Micalizzi et al., 2010).
Introdução | 14
Metástase
linfonodal
Tumor primário
Disseminação
linfática
Disseminação
hematogênica
Metástases secundárias
distantes
Metástases
primárias
distantes
FIGURA 5. Modelos da cascata metastática. As células tumorais podem disseminar do
sítio primário através da via linfática (setas vermelhas) ou pela via hematogênica (setas
azuis). No primeiro modelo (disseminação linfática), as células tumorais disseminadas
proliferam nos linfonodos e formam metástases sólidas. Em estágios mais avançados, estas
células tumorais saem dos linfonodos e estabelecem metástases secundárias distantes. No
segundo modelo, as células tumorais disseminam primeiramente pela via hematogênica e
estabelecem metástases distantes. Isto ocorre em pacientes que desenvolvem metástases
distantes, mas nos quais os linfonodos não apresentam células tumorais, como nas
pacientes com câncer de mama. A disseminação hematogênica parece se iniciar em
estágios iniciais da progressão tumoral (Pantel & Brakenhoff, 2004).
Introdução | 15
Como citado, a presença de metástase nos linfonodos é utilizada
rotineiramente no estadiamento de tumores de mama. Além disso, tem sido proposta
a avaliação de células tumorais disseminadas para medula óssea (MO) como uma
forma de prognóstico independente. Entre 24-43% das pacientes com câncer de
mama apresentam micrometástases na MO, que pode ser justificado como um
evento de disseminação precoce no desenvolvimento tumoral (Pantel & Otte, 2001).
Ao se observar os índices de mortalidade das pacientes com nódulos negativos e
com micrometástase para a MO, verifica-se que 14% destas morrem por causas
relacionadas ao câncer, bastante diferente do 1% encontrado em pacientes com
nódulo negativo e sem micrometástase (Fig. 6, Braun et al., 2000).
Apesar de todas as evidências da importância da avaliação de células
tumorais disseminadas para a MO em pacientes com câncer de mama, a avaliação
não é utilizada na rotina clínica devido ao grande desconforto causado na obtenção
de aspirados da medula óssea. O monitoramento de micrometástase medular é feito
indiretamente através da análise de células tumorais no sangue periférico
(Criscitiello et al., 2010; Muller et al., 2005) e na caracterização, no tumor primário,
de células com potencial de disseminação precoce (Falck et al., 2010; TarangerCharpin et al., 2009; Woelfle et al., 2003).
Introdução | 16
Nódulo negativo,
sem micrometástase para MO
Probabilidade de sobrevivência
Nódulo positivo,
sem micrometástase para MO
Nódulo negativo,
Micrometástase para MO
Nódulo positivo,
Micrometástase para MO
Meses depois da cirurgia
FIGURA 6. Curva de sobrevida de pacientes com câncer de mama pós-cirurgia de
acordo com a presença ou não de células tumorais disseminadas nos linfonodos ou
MO. Pacientes em que não se encontrou células tumorais disseminadas apresentaram a
curva de sobrevida mais favorável, em contraste com aqueles em que as células tumorais
disseminadas foram encontradas em ambos os órgãos. As curva de sobrevida de pacientes
que apresentaram células metastáticas ou nos linfonodos ou na MO foi semelhante (Braun
et al., 2000).
Introdução | 17
1.5.
Câncer e Alterações na Coagulação Sanguínea
A relação entre o câncer e desordens da coagulação sanguínea foi descrita
pela primeira vez pelo médico francês Armand Trousseau em 1865 ao observar a
alta incidência de eventos inexplicáveis de trombose em pacientes que
posteriormente seriam diagnosticados com câncer (Trousseau, 1865). Atualmente,
inúmeras evidências demostraram que distúrbios da coagulação sanguínea estão
associados com neoplasias malignas (Furie & Furie, 2006). Posteriormente a
descoberta da correlação entre câncer e distúrbios da coagulação, verificou-se que a
ativação da coagulação poderia favorecer o processo de metástase (Nieswandt et
al., 1999; Bambace & Holmes, 2011). Mais de 50% dos pacientes de câncer
apresentam alterações da coagulação sanguínea, situação ainda mais grave em
pacientes com metástase, entre os quais aproximadamente 90% possuem essas
alterações (De Cicco, 2003). Dentre as diversas coagulopatias, o tromboembolismo
pode ser a primeira manifestação clínica do câncer e é a segunda maior causa de
morte em pacientes de câncer (Hoffman & Brenner, 2001; Mandalà, 2003).
As alterações na coagulação são bastante complexas e surgem como
resultados de diversos fatores pelos quais os pacientes de câncer são submetidos. A
hipercoagulação pode resultar de fatores relacionados indiretamente à doença ou
tratamento, como imobilização, cirurgias e uso de cateteres, mas podem também ser
causados por fatores diretamente relacionados à doença, como a existência de
células metastáticas na circulação, terapias e vasos rompidos. Além de todos esses
fatores, mudanças oncogênicas podem levar ao aumento do fator tecidual (FT), que
vem sendo apontada como principal responsável pela hiperativação da coagulação
vista em pacientes de câncer (Rao, 1992; Zwicker at al., 2007), sendo possível
Introdução | 18
observar sua elevada expressão tanto nas células tumorais, como no nicho vascular
tumoral (Contrino et al., 1996). Especificamente no câncer de mama, a presença do
FT no tumor e o aumento da sua concentração plasmática tem sido correlacionados
com a ocorrência de metástase e pior prognóstico (Ueno et al., 2000).
O FT é uma glicoproteína de membrana presente em diversos tecidos,
exibindo altos níveis de expressão em órgãos vascularizados como pulmão, cérebro
e placenta. Também é encontrado em níveis intermediários no coração, rins,
intestino, testículos e útero, e em baixos níveis no baço, timo e fígado. (Osterud &
Bjorklid, 2006). Acredita-se que apenas uma pequena fração do FT presente na
membrana esteja ativo, ou seja, capaz de ativar a coagulação sanguínea. Então, a
maior parte do FT na membrana estaria criptado, forma incapaz de ativar a
coagulação. Ainda não estão claros quais mecanismos estão envolvidos na
modificação entre as diferentes conformações do FT e quais seriam as diferenças
conformacionais. Contudo, já se sabe que o aumento da fosfatidilserina (PS) está
correlacionado com a decriptação do FT (revisado em Rao et al., 2012).
Adicionalmente, estudos mais recentes vêm apontando a importância da proteína
dissulfeto isomerase na decriptação do FT através de sua atividade de oxirredução
na ponte dissulfeto Cys186-Cys209 no domínio extracelular do FT e também através
da regulação do equilíbrio de PS na membrana plasmática (Ahamed et al., 2006).
Em 1954, Eiseman e Stefanini mostraram que o FT poderia estar presente na
superfície de células tumorais, evidenciado pela atividade pró-coagulante de células
leucêmicas (Zwicker et al., 2007). Em células tumorais, o FT pode estar aumentado
em até 1000 vezes quando comparado ao tecido normal (Mueller, et al., 1992).
Introdução | 19
Adicionalmente o FT também pode ser expresso de forma aumentada no estroma
adjacente ao tumor (vasos sanguíneos, fibroblastos, células inflamatórias).
Durante o processo de coagulação sanguínea (Fig. 7), o rompimento de
vasos sanguíneos promove o contato de células de tecidos extravasculares (que
expressam FT) com o sangue. Este fenômeno leva à formação do complexo
FT/FVIIa (Fator VII ativo), que atua então como o principal iniciador da cascata de
coagulação. Este complexo promove a conversão dos fatores X (FX) e IX (FIX) nas
suas formas ativas, FXa e FIXa. O FXa ativa a protrombina (FII) em trombina (FIIa).
A trombina, por ação proteolítica, ativa as plaquetas e leva à formação dos fatores
Va, VIIIa e XIa, além de promover a conversão de fibrinogênio solúvel em fibrina
insolúvel. O recrutamento de plaquetas e a geração de fibrina levam à rápida
formação do coágulo (Colman, 2008).
Introdução | 20
Injúria
Vascular
FIGURA 7. Cascata de coagulação sanguínea. A partir do rompimento dos vasos, o FT
presente em células extravasculares desencadeia a ativação de diversos fatores que
resultam na formação do coágulo sanguíneo.
Introdução | 21
1.6.
Fator Tecidual e Sinalização Celular
Além da sua contribuição na ativação da coagulação sanguínea em pacientes
com câncer, mediando processos trombóticos e metastáticos (Hoffman & Brenner,
2001), o FT também influencia a biologia tumoral através da sua sinalização celular
(Fig. 8). A atividade sinalizadora do FT é dependente de receptores ativados por
proteases (PAR), que são componentes da superfamília dos receptores acoplados à
proteína G e apresentam sete domínios transmembranares. Estes receptores
participam de processos fisiológicos em diversos tecidos saudáveis e tem sido
demonstrado que também são importantes em processos inflamatórios e na
progressão tumoral (Belting et al., 2005; Adams et al., 2011). O papel desses
receptores, principalmente PAR1 e PAR2, vem sendo estudado no câncer, inclusive
no câncer de mama, implicando na produção de fatores angiogênicos, reguladores
imunes, crescimento tumoral, invasão e metástase (Boire et al., 2005; Morris et al.,
2006; Ruf et al., 2010).
FIGURA 8. Papéis distintos do FT na biologia tumoral. No esquema superior, o FT
presente na membrana de células tumorais está ativando a cascata de coagulação. No
esquema inferior mostra-se a sinalização do FT mediada pelos receptores PAR (Modificado
de Mackman & Taubman, 2009).
Introdução | 22
Diversas funções vêm sendo descritas para os receptores PAR na progressão
tumoral. Alta expressão e sinalização de PAR1 e PAR2 são descritas em tumores de
pulmão, colorretal, próstata, mama e ovário (Adams et al., 2011). Como citado, na
metástase, plaquetas e a deposição de fibrina são essenciais para a proteção e
manutenção das células tumorais circulantes. Adicionalmente, a sinalização de
PAR1 induz proliferação de células tumorais metastáticas, sobrevivência de células
tumorais na presença de pequenas quantidades de trombina e aumento da
motilidade de células tumorais. E, PAR 2 induz a produção de fatores próangiogênicos, crescimento tumoral e metástase (Belting et al., 2005; Versteeg et al.,
2008). Contudo, novos estudos são necessários para entender os mecanismos que
promovem a progressão tumoral mediados pela sinalização do FT in vivo.
1.7.
FT em CTC e Justificativa do Estudo
Recentemente foi levantada a hipótese de haver uma correlação entre a
sinalização TF/PAR e as CTC (Milsom et al., 2007), o que parece ser bastante
razoável, já que há uma convergência entre diversos mecanismos moleculares. A
sinalização TF/PAR pode levar ao crescimento tumoral, interrupção da dormência
tumoral, migração e invasão tumoral, angiogênese e especialmente a metástase,
que é profundamente influenciada pelo FT e pela coagulação sanguínea (Milsom et
al., 2009). O único estudo que comprovou uma correlação entre o fenótipo de CTC e
a expressão de FT foi realizado com a linhagem A431 de carcinoma epidermóide.
Células CD133pos apresentaram elevada expressão de FT, acentuada atividade prócoagulante e potencial tumorigênico mais precoce, quando comparadas com as
células CD133neg (Milsom et al., 2007; Milsom et al., 2009).
Introdução | 23
As linhagens celulares tumorais, apesar de representarem células que
sobreviveram a seleção in vitro, constituem um modelo amplamente utilizado, já
tendo sendo especificamente demonstrado no câncer de mama que existe grande
similaridade molecular e biológica entre linhagens e tumores primários. Diversas
linhagens de câncer de mama representam diferentes subtipos tumorais. Desta
forma, linhagens com tendências mesenquimais e com propriedades invasivas foram
classificadas como Basal B/mesenquimal; linhagens mais diferenciadas, com
fenótipo epitelial e não invasivas foram classificadas como Luminal; e linhagens com
características intermediárias entre os dois subgrupos citados foram denominadas
como Basal A. A análise molecular das linhagens ditas luminais mostrou que elas
expressam transcrito de CD24, enquanto as denominadas como Basal B mostram
uma regulação negativa de CD24. O contrário se observou em relação à expressão
de CD44 (Blick et al., 2010; Neve et al.2006). Desta forma, as linhagens basais
apresentam um fenótipo semelhante ao descrito para as CTC do câncer de mama.
Tendo em vista a descrição de marcadores de CTC em tumores de mama e
metástases e a correlação entre o fenótipo das linhagens de tumor de mama e os
subtipos tumorais, estas podem ajudar a elucidar os mecanismos celulares
envolvidos na biologia das CTC. Neste trabalho, nos propomos a estudar a
correlação entre o fenótipo CTC de mama e a expressão de FT em linhagem
celulares.
Objetivos | 24
2. Objetivos
2.1.
Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho é investigar a expressão e função do FT em
linhagens humanas de carcinoma de mama, correlacionando com o fenótipo e
propriedades biológicas de células iniciadoras do câncer.
2.2.
Objetivos Específicos
-Caracterizar fenotipicamente e funcionalmente linhagens humanas de
carcinoma de mama MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 e T-47D quanto à
expressão das moléculas CD44 e CD24.
- Determinar o potencial de coagulação das linhagens de câncer de mama.
- Avaliar a expressão de FT e sua atividade nas linhagens de câncer de
mama e nas subpopulações da linhagem T-47D, correlacionando-os com o fenótipo
e propriedades invasivas.
Material e Métodos | 25
3. Material e Métodos
3.1.
Células e Amostras
As linhagens humanas de carcinoma de mama MCF-7 e MDA-MB-468 foram
fornecidas pelo Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ, RJ, Brasil).
As
linhagens humanas de câncer de mama T-47D e MDA-MB-231 foram cedidas pelo
Professor Roger Chammas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (USP).
As linhagens de câncer de mama foram cultivadas em meio de cultura IMDM
(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, LGC), suplementado com 10% de soro fetal
bovino (SFB, Cultilab) e antibióticos (penicilina G sódica 100 U/mL e estreptomicina
100 µg/mL, Sigma-Aldrich). Todas as culturas foram mantidas em estufa com 5% de
CO2 à 37º C. Após atingirem 70% de confluência, as linhagens tumorais foram
dissociadas com 2 mM de ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA) em PBS.
Amostras de medula óssea foram obtidas a partir de aspirados da crista ilíaca
de doadores voluntários da Unidade de Transplante de Medula Óssea, afiliada ao
Serviço de Hematologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFFUFRJ), como descrito (de Barros et al., 2010). A utilização das amostras foi
aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HUCFF-UFRJ, estando o
projeto cadastrado sob as seguintes numerações: CIC: 066/02 e CEP: 022/02. Uma
exceção à necessidade do termo de consentimento foi aprovada pela Comissão de
Investigação Científica (CIC) do HUCFF, uma vez que os dados foram analisados de
forma anônima e foram derivados de amostras descartadas.
3.2.
Obtenção de células mesenquimais do estroma da medula óssea
A obtenção foi feita mediante a lavagem com solução salina tamponada de
fosfato (PBS, phosphate buffered saline) das bolsas de coleta de medula óssea,
Material e Métodos | 26
após a transferência dos aspirados para as bolsas de infusão. As células
mesenquimais de estroma de medula óssea humana (MSC) foram obtidas seguindose o protocolo descrito de unidade formadora de colônia fibroblastóide (CFU-F,
Colony Forming Unit - Fibroblast) (Fridenstein et al., 1976). Resumidamente, após
hemossedimentação com Hespan® (hidroxietil de amido, McGaiy Inc.), um
polissacarídeo que acelera a sedimentação de hemácias, as células foram
quantificadas em hemocitômetro usando o líquido de Turk. As células foram
distribuídas na concentração de 1 x 106 células/mL em frascos de cultura de 25 cm 2
em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium- Low Glucose, LGC, São
Paulo, SP, Brasil) suplementado com 10% SFB e antibióticos e incubadas a 37ºC
com 5% de CO2 por 3 a 4 dias. Após este período, o sobrenadante foi removido
juntamente com células não aderentes através de lavagem com PBS, o meio de
cultura foi trocado e as células aderentes foram novamente incubadas a 37ºC com
5% de CO2 até atingirem pré-confluencia (aproximadamente 70% da superfície
plástica coberta por células), quando foram dissociada enzimaticamente com
solução de tripsina 0,125% EDTA 0,78 mM e expandidas até a terceira ou quarta
passagem para a realização dos experimentos.
3.3.
Cultivo em sistema de cultura tridimensional do tipo Matrigel
Os poços de placas de 48 poços foram recobertos com 100 l de Matrigel (BD
MatrigelTM Basement Membrane Matrix, BD Biosciences). A placa foi mantida a 37ºC
com 5% de CO2 por 30 minutos para a polimerização do Matrigel. As células
tumorais foram ressuspensas em meio IMDM suplementado com 20% SFB e 2% de
Matrigel, na concentração de 2,5 x 104 células em 200 l que foram aplicados sobre
a camada de Matrigel polimerizada. A cultura foi mantida a 37ºC com 5% de CO 2
durante 4 dias. Uma troca de meio foi realizada no segundo dia.
Material e Métodos | 27
3.4.
Diferenciação para linhagem osteogênica das MSC
As MSC foram induzidas para a linhagem osteogênica com meio de cultura
osteoindutor constituído por DMEM suplementado com 10% de SFB, 10 mM de βglicerofosfato, 50 μM de ácido ascórbico e 10 -7 M de dexametasona (todos da
Sigma-Aldrich) e antibióticos (Pittenger et al., 1999; de Barros et al., 2010). As
células foram mantidas em cultura por sete dias, realizando uma troca de meio de
cultura no terceiro ou quarto dia.
3.5.
Modelo de cultura tridimensional do tipo esferoide
O modelo de esferoide de medula óssea, desenvolvido pelo grupo, (de Barros
et al., 2010), foi realizado para avaliar o potencial invasivo das linhagens humanas
de câncer de mama. Resumidamente, poços de placa de 96 com fundo em “U”
foram revestidos com uma fina camada de agarose a 1 %, que impede a aderência
das células ao plástico. Esferoides de MO foram desenvolvidos em duas etapas,
primeiro esferoides de osteoblastos foram formados distribuindo-se 1,25 x 104
células osteoinduzidas por poço e, após sua formação, 1,25 x 10 4 células
mesenquimais não induzidas foram distribuídas sobre os esferoides de células
osteoinduzidas. A formação dos esferoides ocorre em três dias a 37º C com 5 % de
CO2.
3.6.
Ensaio de invasão
As células tumorais, após serem removidas dos frascos de cultura, foram
ressuspensas em IMDM com 20% SFB e antibióticos e foram quantificadas em
hemocitômetro. Foram adicionadas aos esferoides já formados 3 x 103 células
tumorais. As co-culturas foram mantidas a 37ºC com 5% de CO2 por 72h. Após este
período, os esferoides foram coletados para avaliação do potencial invasivo por
histologia. Para análises morfológicas, os esferoides foram mantidos íntegros,
Material e Métodos | 28
lavados com PBS e fixados com paraformaldeído tamponado a 4%. Cada ponto do
experimento foi feito em duplicata, sendo cada duplicata o pool de três esferoides.
3.7.
Histologia
Os esferoides íntegros foram fixados paraformaldeído 4% por no mínimo 6h.
Os esferoides foram processados para inclusão em parafina, procedendo-se a
desidratação com banho de álcool 70% por 20 min e dois banhos de álcool absoluto
por 20 min cada. Em seguida, dois banhos de xilol por 20 min cada e dois banhos de
parafina por 20 min foram realizados e os esferoides foram incluídos em parafina.
Posteriormente, os blocos foram cortados em micrótomo manual (Lupe “820”
Spencer, São Carlos) com 5 m de espessura e coletados em lâminas de vidro, que,
para imunohistoquímica foram cobertas por silano 2% em acetona. As lâminas
passaram por 3 banhos de desparafinização, cada um de 3 min em xilol, 3 banhos
de álcool em concentração decrescente, absoluto, 90% e 70% por 3 min cada e um
banho em água destilada por 5 min. As lâminas foram coradas com hematoxilina de
Harris e eosina (HE), desidratas e montadas com entellan.
3.8.
Imunofluorescência
As células foram cultivadas em placas de 24 poços, contendo lamínula
circular no fundo do poço. Após atingir 70% de confluência as células foram lavadas
três vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído tamponado a 4%. As células
foram lavadas quatro vezes com PBS e permeabilizadas, quando a marcação era
intracelular, com 0,2% de Triton em PBS por 15 min. As células foram novamente
lavadas com PBS e, em seguida, incubadas com 4% de BSA em PBS por 30 a 60
min a temperatura ambiente, para bloquear sítios inespecíficos. O anticorpo primário
anti-FT humano (Tab. 3) foi diluído para uma concentração de 1:100 (5 µg/ mL) em
1% BSA em PBS e foi incubado durante a noite a 4º C. As células foram novamente
Material e Métodos | 29
lavadas com PBS e incubadas com o anticorpo secundário anti-camundongo
conjugado a Alexa 546 (Tab. 3) diluído a 1:500 em 0,3% de BSA em PBS por 1h a
temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas com PBS e marcadas
com DAPI. Após lavagem, as lamínulas foram montadas em uma lâmina com Npropilgalato e seladas com esmalte para observação em microscópio confocal (LSM
510 Meta, Carl Zeiss).
TABELA 3. Características dos anticorpos que serão usados para imunofluorescência
e citometria.
Anticorpos primários
Fabricante
Diluição
FACS
IF
Camundongo FT anti-humano
American Diagnostica
1:5
1:100
Camundongo anti-CD24 humano - PE
Caltag Lab, Invitrogen
1:40
Rato anti-CD44 humano/camundongo - APC
eBioscience
1:40
Camundongo anti-humano FT (5G9)
*
0,5µg/106
Camundongo anti-humano FT (10H10)
*
0,5µg/106
Anticorpo secundário
Fabricante
Rato anti-camundongo IgG conjugado a Alexa 546
Invitrogen
1:500
1:500
* Anticorpos gentilmente cedidos pelo professor Wolfram Ruf (The Scripps Research Institute,
CA, EUA).
3.9.
Citometria de fluxo
As suspensões celulares obtidas como descrito acima e foram lavadas com
tampão de FACS. As células foram incubadas por 30 min, no gelo, com os
anticorpos primários ou diretamente conjugados ao fluorocromo (Tab. 3). Em
seguida as células foram lavadas com tampão de FACS e, quando necessário, o
anticorpo secundário foi incubado por 30 min no gelo. A suspensão celular foi
novamente lavada com tampão de FACs e as amostras foram analisadas em
citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences). Para marcação intracelular, após
a marcação de superfície, as células foram fixadas em paraformaldeído 1% por 40
min a temperatura ambiente ou na geladeira durante a noite. A suspensão celular foi
lavada duas vezes com tampão de FACS e permeabilizada com 1 mL de etanol 70%
Material e Métodos | 30
a -20º C por pelo menos 1 hora. As células foram lavadas três vezes com tampão de
FACS e a marcação foi feita como descrito anteriormente. As análises foi realizadas
com o programa livre WinMDI 2.9 (http://en.bio-soft.net/other/WinMDI.html) (Obtido
em 20/05/2010).
Recentemente foram desenvolvidos anticorpos que podem ajudar distinguir
efeitos resultantes da sinalização e da ativação da coagulação, mediados por FT em
modelos de xenoenxerto. O anticorpo monoclonal 5G9 liga-se a uma grande porção
do sitio de ligação do FT ao FX, impedindo a formação do complexo ternário
FT/FVIIa/Xa, sinalização e coagulação. Por outro lado, o anticorpo monoclonal
10H10 inibe a sinalização do complexo binário FT/FVIIa, não possuindo potencial
anticoagulativo (Ruf et al., 2011).
3.10. Tempo de Recalcificação do Plasma Sanguínea
O tempo de coagulação, induzido pelas diferentes linhagens, MDA-MB-231,
MCF7, T-47D CD24neg e T-47D CD24pos, foi determinado utilizando o coagulômetro
Amelung KC4 (Labcon, Heppenheim). Amostras de sangue humano foram coletadas
de pacientes saudáveis em 3,8% de Citrato Trissódico (9:1, v/v) e o plasma pobre
em plaquetas foi obtido através de centrifugação a 2.000 g por 10 min. As células
foram diluídas em PBS nas concentrações de: 10 6, 105 e 104 células/mL. Foram
adicionados 50 μL de plasma humano que foi incubado por um minuto à 37º C na
cubeta do coagulômetro e, em seguida, foram adicionados 50 μL de células nas
diferentes concentrações, ou PBS como controle. Por fim, a reação foi disparada
com 100 μL de 12,5 mM de Cloreto de Cálcio (CaCl2). O tempo de formação do
coágulo foi cronometrado. As amostras foram feitas em triplicata, e o experimento foi
repetido três vezes.
Material e Métodos | 31
3.11. Ensaio de Ativação do Complexo de Tenase Extrínseco
Este ensaio avalia a formação do complexo FT/FVIIa/FX através da
quantificação do FXa liberado no sobrenadante. Como fonte de FT e superfície para
a formação do complexo, utilizamos células de linhagens de carcinoma de mama,
MDA-MB-231, T-47D CD24neg e T-47D CD24pos, na concentração de 5 x 104/mL, que
foram incubadas por 10 min com 1 nM de Fator VIIa (Protein Purification, Novo
Nordisk A/S). Para iniciar a reação foram adicionados 100 nM de FX (Haematologic
Technologies, EUA). Após 5 min de reação, 25 µL da mistura da primeira linha da
microplaca de 96 poços foram adicionados a segunda linha contendo 50 µL de
tampão de parada (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 1 mg/mL
de polietilenoglicol 6000, ajustado para pH 7,5) e assim sucessivamente nos 30 min
seguintes. Em seguida, foram adicionados 50 µL do peptídeo sintético S-2765
(concentração final de 200 µM) em tampão de parada, que é um substrato
cromogênico específico para o FXa. A absorbância foi avaliada a 405 nm por 30 min
a 37ºC através do leitor de microplacas Spectramax (Molecular Devices). Foram
utilizados dois controles, o primeiro na ausência de Fator VIIa e o segundo na
ausência de células. As amostras foram feitas em duplicata ou triplicata, e o
experimento foi repetido três vezes.
Resultados | 32
4. Resultados
4.1.
Caracterização fenotípica das linhagens de tumor de mama quanto
à expressão das moléculas CD24 e CD44
A presença da molécula de adesão CD44, descrita como marcador de
células-tronco mamárias tem sido utilizada para identificar células-tronco do câncer
de mama. O fenótipo CD24low/negCD44pos foi descrito em subpopulações com alta
capacidade de tumorigênese em modelo de camundongos imunodeficientes (Al-Hajj
et al, 2003). Nesse sentido, nosso grupo investigou a presença das moléculas de
adesão CD44 e CD24 por citometria de fluxo (FACS) nas linhagens de câncer de
mama humano MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468 e T-47D, Fig.9. A linhagem
agressiva, MDA-MB-231 é descrita como basal B; a linhagem MDA-MB-468 é
descrita como basal A, tendo um perfil intermediário entre basal B e luminal; já as
linhagens MCF-7 e T47-D são descritas como luminais (Neve et al., 2006). Notar que
a linhagem basal B, MDA-MB-231 é negativa para CD24 e apresenta alta expressão
de
CD44
(CD44Hi),
enquanto
a
linhagem
MCF-7,
pouco
agressiva,
é
majoritariamente CD24posCD44pos, não apresentando células CD44Hi. Embora a
maioria das células da linhagem T-47D seja CD24posCD44pos, compatível com a
classificação de subtipo luminal, um pequeno percentual das células tem fenótipo
basal (CD24negCD44Hi). Inicialmente esta população representava menos de 1% da
população total, contudo ao ser mantida por 21 dias em cultura, usando IMDM
suplementado com 20% de SFB, foi capaz de aumenta sua proporção, chegando até
a 22,9% da população total.
Resultados | 33
FIGURA 9. Expressão fenotípica das moléculas CD24 e CD44 em linhagem de tumor
de mama. As linhagens de câncer de mama humano foram analisadas por citometria de
fluxo. Painel A mostra a expressão de CD24 e CD44 nas linhagens MDA-MB-231, MDA-MB468 e MCF7. O painel B mostra o aumento percentual da população CD44Hi na linhagem
celular T47-D após expansão em cultura com IMDM suplementado com 20% de SFB. Os
números representam o percentual de células CD44Hi nos quadrantes. Painel C é
representativo da distribuição de FCS e SSC (C1) e do controle de fluorescência das
linhagens utilizadas. Figura representativa de 3 experimentos independentes.
.
A partir do resultado obtido na caracterização fenotípica das linhagens, a
linhagem T-47D destacou-se por possuir duas populações distintas quanto à expressão
das moléculas CD24 e CD44, o que possibilitou a separação das mesmas por citômetro
de fluxo acoplado a sorter (Fig. 10), com o objetivo de estudar as duas populações
separadamente. Na análise após a seleção foi observada uma pureza de 97,3% para a
subpopulação CD24neg/lowCD44pos/Hi (denominada CD24neg, Fig. 10 B), e de 97,1% para a
subpopulação CD24posCD44neg/low (denominada CD24pos, Fig. 10 C). A manutenção in
vitro da subpopulação CD24pos apresentou uma progressiva expansão da subpopulação
CD24neg, o que levantou a hipótese de contaminação ou interconversão de fenótipos.
Desta forma, foi realizada uma dupla seleção da subpopulação CD24pos, com objetivo de
atingir 99,8% de pureza (Fig. 10 D). Após a segunda seleção, a subpopulação CD24pos
se manteve estável em cultura, assim como a população CD24neg, mesmo após 3
meses em cultura (Fig. 11).
Resultados | 34
FIGURA 10. Seleção por citometria de fluxo das subpopulações da linhagem de tumor
de mama T-47D. (A) Análise pré-seleção, da população CD24pos (Região 2, R2) e da
CD24neg (R3). (B) Análise pós-seleção da população CD24negCD44Hi. (C) Análise após a
primeira seleção da população CD24posCD44pos que foi novamente selecionada (D) para
atingir 99,8% de pureza, n=2.
FIGURA 11. Expressão de CD44 e CD24 nas células T-47D selecionadas por citometria
de fluxo e mantidas em cultura por 3 meses. Expressão de CD24 e CD44 nas células (A)
T47D CD24neg e (B) T-47D CD24pos.
Resultados | 35
4.2.
Caracterização das subpopulações CD24pos e CD24neg da linhagem
T47-D
Com intuito de avaliar a morfologia das subpopulações CD24 pos e CD24neg,
estas foram observadas em monocamada. As duas subpopulações apresentaram
morfologias distintas. A subpopulação CD24neg apresentou morfologia fibroblastóide
(mesenchymal-like) com células de aspecto fusiforme e que estendiam projeções de
membrana (lamelipódios) (Fig. 12 A e C). Em contrapartida, as células da
subpopulação CD24pos apresentaram morfologia poligonal, epitelióide, formando
colônias (Fig. 12 B e D).
T-47D CD24neg
T-47D CD24pos
A
B
C
D
FIGURA 12. Aspectos morfológicos das subpopulações T-47D CD24neg e T-47D
CD24pos em cultura. (A e C) As células T-47D CD24neg cultivadas em monocamada
apresentaram fenótipo fibroblastóide. (B e D) As células T-47D CD24pos apresentaram
aspecto epitelial luminal. Notar em (D) o crescimento em colônias das células. Microscopia
de contraste de fase. Os números nas barras de escala representam o valor de cada barra.
Resultados | 36
Com o propósito de aprofundar as observações acerca das diferenças entre
as subpopulações CD24pos e CD24neg, foi utilizado um modelo de cultura mais
complexo, baseado em culturas tridimensionais do tipo Matrigel. Após 4 dias em
cultura, a subpopulação T47-D CD24neg possuía estruturas semelhantes a túbulos,
com inúmeras ramificações (Fig.13 A e B). Por sua vez, as células T47-D CD24pos
formaram colônias circulares de tamanhos variados (Fig.13 C e D). Após 10 dias em
cultura, estruturas sugestivas de lúmen foram observadas na subpopulação CD24pos
(Fig.13 E). Análises por microscopia confocal (Fig.13 F) confirmaram que as
estruturas formadas eram semelhantes a ácinos.
FIGURA 13. Aspectos morfológicos das subpopulações T-47D CD24neg e T-47D
CD24pos em Matrigel. As subpopulações CD24neg (A e B) e CD24pos (C e D) da linhagem T47D foram cultivadas por 4 dias (A-D) ou 10 dias (E e F) em Matrigel. Notar as estruturas
ramificadas semelhantes a túbulos (A e B) e as colônias circulares (C e D). Microscopia de
contraste de fase. (F) Microscopia de confocal. Notar estrutura na região central semelhante
a lúmen (setas). Núcleos corados em azul com TOPRO-3. Barras de escala correspondem a
50 µm (A, C, E, F), 20 µm (C, D e insertos em E e F), n=2.
Resultados | 37
4.3.
Análise da invasão de linhagens de carcinoma de mama em
modelo de cultura tridimensional
A capacidade invasiva das subpopulações da linhagem T-47D foi avaliada em
modelo de cultura tridimensional do tipo esferoide de MO, o qual mimetiza o nicho
subendosteal. Este modelo se mostrou adequado para estudos de migração e
quiescência de progenitores hematopoéticos (de Barros et al., 2010). Após 72 horas
de co-cultura, observou-se que as células CD24pos estabeleceram um limite nítido
com os esferoides de MO (Fig. 14 B), sugerindo que estas células não foram
capazes de invadir estas estruturas. A ausência de limites nítidos verificada entre as
células CD24neg e o esferoide (Fig. 14 A), indicou que as mesmas foram capazes de
invadi-los. Foram realizadas análises histológicas para melhor avaliar a interação
entre as células tumorais e os esferoides. Mediante imunohistoquímica para
citoqueratinas de baixo e alto peso molecular, para identificar as células tumorais,
confirmou-se que as células CD24pos aderiram à superfície dos esferoides de MO,
mas que não foram capazes de invadi-los (Fig. 14 D). Apesar das células CD24neg
apresentaram uma marcação mais tênue para citoqueratinas, foi possível observar
que elas se encontravam entre as células do estroma da MO, indicando, então, que
estas células foram capazes de penetrar e migrar através dos esferoides de MO
(Fig. 14 C). As linhagens MDA-MB-231 e MCF-7 foram utilizadas nesse experimento
como controles de alta e baixa capacidade invasiva, respectivamente. Os resultados
obtidos na subpopulação CD24neg foram semelhantes aos observados na linhagem
invasiva, MDA-MB-231 (Fig. 14 E e G), por outro lado, os resultados observados
pela subpopulação CD24pos foram semelhantes aos encontrados na linhagem MCF7 (Fig. 14 F e H)
Resultados | 38
FIGURA 14. Co-culturas de esferoides de MO com células T-47D CD24neg, T-47D
CD24pos, MDA-MB-231 ou MCF-7. Células CD24neg (A e C), células CD24pos (B e D), MDAMB-231 (E e G) ou MCF-7 (F e H) foram co-cultivadas por 72h com esferoides de MO.
Notar os limites nítidos que as células CD24+ e MCF-7 estabelecem com os esferoides e a
ausência destes limites nas co-culturas com células CD24neg e MDA-MB-231. Microscopia
de contraste de fase. (A-B, E-F) Imunohistoquímica para citoqueratinas de baixo e alto peso
molecular nas secções histológicas dos esferoides de MO co-cultivados com as
subpopulações da linhagem T-47D e os controles, MDA-MB-231 e MCF-7. Notar em (D e H)
que as células CD24pos e MCF-7 encontram-se aderidas à superfície do esferoide. Notar em
(C e G) as células CD24neg e MDA-MB-231 em permeio ao esferoide. Microscopia óptica. Os
números nas barras de escala representam o valor de cada barra. Fotomicrografia
representativa de dois experimentos independentes feitos em setuplicata.
Resultados | 39
T-47D CD24
neg
T-47D CD24
A
B
C
D
MDA-MB-231
MCF-7
E
F
G
H
pos
Resultados | 40
4.4.
Indução de atividade pró-coagulante por linhagens de carcinoma
de mama
Tendo em vista que as linhagens de carcinoma mamário apresentaram
distintas capacidades invasivas, interessamo-nos em investigar se elas eram
capazes potencializar a coagulação sanguínea, já que existe uma forte correlação
entre a desregulação da coagulação sanguínea e eventos metastáticos. Quando as
células potencializam a coagulação do plasma sanguínea, ou seja, quando há
formação do coágulo em menor tempo, isso é um indicativo da presença do FT nas
células testadas. O FT presente na membrana das células se liga ao FVII presente
no plasma, iniciando a coagulação sanguínea (Fernandes et al., 2006). Diferentes
concentrações de células tumorais foram incubadas com plasma humano na
presença de cloreto de cálcio e o tempo de formação de coágulo foi determinado
como
descrito
na
metodologia.
Verificou-se
que
a
subpopulação
T-47D
CD24negCD44pos ativou a coagulação de forma similar ao observado com a linhagem
MDA-MB-231. Por outro lado, a subpopulação T-47D CD24posCD44neg apresentou
propriedade reduzida de ativação da coagulação, semelhante a da linhagem MCF-7
(Fig. 15).
Resultados | 41
FIGURA 15. Tempo de coagulação do plasma sanguíneo em contato com linhagens de
câncer de mama. No eixo X, as linhagens de carcinoma de mama, T-47DCD24pos (triângulo
azul), T-47DCD24neg (triângulo vermelho), MDA-MB-231 (quadrado preto preenchido) e
MCF-7 (quadrado preto vazado), diluídas em três diferentes concentrações: 2,5 x 105, 2,5 x
104 e 2,5 x 103 células por mL, ou na ausência de células (circulo preto preenchido). No eixo
Y, o tempo que transcorrido até a formação do coágulo em segundos. Média e desvio
padrão; n=3; * p<0,05.
Resultados | 42
4.5.
Expressão de Fator Tecidual nas linhagens de carcinoma de
mama
A atividade pró-coagulante de linhagens tumorais pode ser resultado da
expressão do FT, principal proteína iniciadora da cascata de coagulação. Por essa
razão, a expressão deste fator na superfície membranar das linhagens humanas de
tumor de mama foi avaliada por citometria de fluxo (Fig. 16) e microscopia confocal
(Fig.17). Verificou-se que as células tumorais pró-coagulantes, T-47D CD24neg e
MDA-MB-231, são homogeneamente positivas para FT e a intensidade de
fluorescência foi semelhante em ambas as linhagens (Fig. 16A e B), assim como
apresentaram elevados valores de ΔMFI (Variação da Intensidade Média de
Fluorescência), respectivamente, 118,3 e 113,28 (Fig. 16E e F). A expressão de FT
foi observada inclusive em compartimento intracelular (Fig. 17B e F). As células com
baixa atividade de coagulação, T-47D CD24pos e MCF-7, foram negativas para FT
(Fig. 16, 17C e G), embora um discreto deslocamento do pico de fluorescência fosse
observado na análise por citometria de fluxo da linhagem MCF-7 (Fig. 16D), o que
sugere uma baixa expressão do fator. No entanto, não se observou, por microscopia
confocal, expressão membranar ou intracelular de FT nestas linhagens (Fig. 17).
Esta diferença pode ser devido à distinta sensibilidade de detecção entre os
métodos utilizados.
Resultados | 43
F
E
Linhagens
MDA-MB-231
T-47D CD 24MCF-7
T-47D CD24+
Isotipo
FT
Isotipo
FT
Isotipo
FT
Isotipo
FT
MFI
4,9
118,18
6,3
124,6
6,3
10,9
9,1
12,5
ΔMFI
113,28
118,3
4,6
3,4
FIGURA 16. Expressão do FT na superfície de células de carcinoma de mama.
Histograma de intensidade de fluorescência de FT nas linhagens pró-coagulantes T-47D
CD24neg (A), MDA-MB-231 (B), e sem atividade de coagulação, T-47D CD24pos (C) e MCF-7
(D) foram incubadas com anti-FT e este foi revelado com anticorpo secundário conjugado a
Alexa-488. Linha pontilhada corresponde ao controle negativo. (E-F) Intensidade média de
fluorescência (MFI) e ΔMFI, n=2.
Resultados | 44
T-47D CD24neg
T-47D CD24pos
MDA-MB-231
MCF-7
B
C
D
E
F
G
H
Superfície
A
Intracelular
FIGURA 17. Expressão de FT membranar e intracelular nas linhagens de carcinoma de mama. Marcação de superfície (A, B, C e D) e
marcação intracelular (B, D, F e H). (A e E) T-47D CD24neg, (B e F) MDA-MB-231, (C e G) T-47D CD24pos e (D e H) MCF-7 por microscopia de
fluorescência. As barras representam 20 μm. FT em vermelho e núcleos corados com DAPI (azul), n=2.
Resultados | 45
Diferentes funções do FT envolvidas em mecanismos tumorais podem ser
avaliadas através da utilização de anticorpos monoclonais que se ligam a diferentes
epítopos do FT. O anticorpo 5G9 reconhece o sítio de ligação do FX, impedindo a
formação do complexo ternário (FT-FVII-FX) e consequentemente inibindo a
ativação da cascata de coagulação e sinalização. Enquanto o anticorpo 10H10
bloqueia a sinalização do complexo binário (FT-FVII), não sendo capaz de bloquear
a coagulação (Versteeg et al., 2008). A reatividade dos anticorpos foi testada para
verificar se eram capazes de se ligar aos complexos do FT na membrana da
linhagem T47-D CD24neg. Estes resultados são importantes para futuramente
analisarmos o bloqueio das diferentes funções do FT sobre a capacidade invasiva
dessas células. Também utilizamos como controle as linhagens MDA-MB-231 e
MCF-7 que são amplamente utilizadas nessa área do conhecimento. Verificou-se
que, de forma semelhante a linhagem MDA-MB-231, as células T47-D CD24neg
foram positivas para ambos os anticorpos (Fig. 18).
Resultados | 46
A
T-47D CD24neg
B
MDA-MB-231
C
93%
2%
89%
D
E
97%
MCF-7
F
92%
1%
FIGURA 18. Atividade dos anticorpos anti-FT (10H10 e 5G9). Marcação na superfície de
FT nas linhagens T-47D CD24neg (A e D), MDA-MB-231 (B e E) e MCF-7 (C e F) por
citometria de fluxo. 10H10 (A-C) e 5G9 (D-F), n=1.
Resultados | 47
4.6.
Análise da ativação da cascata de coagulação medida pelo FT
presente nas células de carcinoma mamário
Como visto nos resultados anteriores, as linhagens T-47D CD24neg e MDAMB-231 expressam FT membranar. Contudo, somente a presença da proteína não
caracteriza sua funcionalidade, sabendo-se que o FT pode estar presente na
membrana em uma conformação inativa (Chen e Hogg, 2006). Desta forma, o
ensaio de ativação do FX em FXa permite avaliar a formação do complexo tenase
extrínseco ativo (FT-FVII-FX). O FT presente nas células tumorais se liga ao fator
VIIa adicionado e juntos são capazes de ativar o FX também adicionado ao ensaio
(Fig. 19).
Vmax (mOD/min)
5
T-47DCD24neg + FVIIa
T-47DCD24neg
4
T-47DCD24pos + FVIIa
3
T-47DCD24pos
2
MDA-MB-231 + FVIIa
MDA-MB-231
1
FVIIa
0
0
5
10
15
20
25
30
35
tempo (min)
FIGURA 19. Ensaio de ativação do FX. As linhagens T-47D CD24pos, T-47D CD24neg e
MDA-MB-231 foram incubadas com FX, na presença (símbolos preenchidos) ou ausência
(símbolos vazios) de FVIIa. A ativação do FX foi avaliada através da quantificação do seu
substrato cromogênico específico por densidade óptica. Resultado representativo de n=3.
Discussão | 48
5. Discussão
No câncer de mama, o principal fator que determina um pior prognóstico é o
surgimento de metástases, sendo esta a principal causa de morte das pacientes
(Sleeman & Stegg, 2010). Segundo a teoria das Células-Tronco do Câncer (CTC),
uma pequena população celular seria responsável pela manutenção do tumor,
disseminação precoce e micrometástase medular. Em pacientes de câncer de mama
metastático, cerca de 70% das células tumorais presentes na medula óssea
apresentam os marcadores descritos para CTC (Balic et al., 2006). Esta observação
reforça a proposta destas células como sendo as responsáveis pela recidiva da
doença após retirada do tumor primário e tratamento.
Entretanto, a teoria das CTC vem sendo questionada por alguns grupos de
pesquisadores que demostraram que a TEM é capaz de gerar células com fenótipo
semelhante ao das CTC (Mani et al., 2008; Morel et al., 2008; Blick et al., 2010). Por
meio desse mecanismo, células de carcinoma perderiam sua polaridade apicalbasal, apresentariam uma inversão na expressão de caderinas de membrana,
exibindo queda nos níveis de E-caderina e aumento nos níveis de N-caderina; e
adquiririam mobilidade e capacidade de invadir a matriz extracelular. Além dessas
modificações essenciais para a conquista de novos sítios, essas células também
passariam a expressar marcadores de CTC, CD44posCD24neg (Mani et al., 2008), o
que indicaria que esse fenótipo pudesse ser adquirido por meio da TEM.
Como citado anteriormente, as linhagens celulares são um interessante
modelo para o estudo da biologia tumoral, além de já ter sido demonstrado que são
capazes de representar os diferentes subtipos tumorais encontrados em pacientes.
Utilizando os marcadores CD24 e CD44, nosso estudo identificou na linhagem de
tumor mamário humano, T-47D, classificada na literatura (Blick et al., 2010; Neve et
Discussão | 49
al., 2006) como luminal e, por isso mesmo apresentando fenótipo CD44 neg/LoCD24pos
e comportamento não invasivo, uma pequena população com o fenótipo de CTC de
mama, CD44posCD24neg, que mostrou características morfofuncionais de linhagem
Basal. As subpopulações da T-47D apresentaram crescimento in vitro, em sistema
bidimensional ou tridimensional, em matrigel, com morfologia característica dos
respectivos subtipos. Curiosamente, nas culturas da subpopulação CD24pos com 10
dias em matrigel foram observadas estruturas semelhantes a ácinos que são
descritas como sendo formadas somente a partir de células epiteliais não malignas
(Kenny et al., 2007). Este resultado precisa ser melhor avaliado neste modelo,
podendo ser resultante do tempo prolongado de cultura, seis dias a mais do que foi
testado por Kenny e colaboradores. Ao utilizar o modelo de cultura tridimensional
que mimetiza o microambiente da medula óssea, desenvolvido pelo grupo (de
Barros et al., 2010), verificou-se neste estudo que somente a população com
fenótipo CTC foi capaz de invadir estes esferoides. Este resultado sugere que, como
suspeitado, as metástases medulares, majoritariamente constituída por células com
fenótipo de CTC (Balic et al., 2006), sejam efetivamente dependentes da presença
destas células nos tumores primários. Finalmente, deve ser ressaltado que, embora
tenha sido descrita a conversão in vitro entre os fenótipos luminal (CD24pos) e basal
(CD24neg) em linhagens de câncer de mama (Meyer et al., 2009), isto não foi
observado nesse estudo, onde as subpopulações mantiveram um fenótipo estável in
vitro.
Experimentos adicionais para verificar o potencial tumorigênico das linhagens
e a capacidade das células T-47D CD24neg de gerarem in vivo células mais
diferenciadas, luminais, estão sendo realizados pelo nosso grupo. Resultados
preliminares indicam que somente a linhagem T-47D CD24neg é tumorigênica,
Discussão | 50
formando tumores com um padrão heterogêneo quanto à organização celular, ou
seja, apresentam regiões típicas de carcinoma sólido, outras regiões com células
mioepiteliais e outras regiões de transição; e também quanto à expressão de
citoqueratinas características de diferentes subtipos tumorais. Independentemente
da população T-47D CD24neg ser realmente uma população de CTC ou ter sido
gerada pelo processo de TEM, ela apresenta características relacionadas com o
subtipo basal de carcinoma dutal invasivo de mama, também denominado de triplo
negativo, RE-, RP- e HER2- (Schnitt, 2010) e, portanto, representa uma população
de alta malignidade.
Estudos comparativos entre linhagens com comportamentos de baixa e alta
agressividade geralmente são realizados com as linhagens de tumor mamário
humano MDA-MB-231 e MCF-7, que são linhagens originadas de diferentes tumores
e, portanto, de indivíduos geneticamente distintos. A utilização das duas linhagens
T-47D CD24pos e T-47D CD24neg é bastante promissora, já que as duas populações
se mostraram estáveis em cultura, apresentaram características morfofuncionais
bastante distintas e tiveram origem em um tumor de uma única paciente, ou seja,
apresentam o mesmo código genético.
Tanto a linhagem MDA-MB-231 quanto a linhagem T-47D CD24neg mostraram
potencial invasivo em modelo tridimensional complexo, onde as células de estroma
de MO secretam e organizam a matriz extracelular de forma similar a vista in vivo
(de Barros et al., 2010). Portanto, estas linhagens são potencialmente capazes de
desenvolver metástase. Como a subpopulação CD24neg tem um fenótipo descrito
para CTC de mama, levantou-se então a hipótese de que esta subpopulação, como
descrito para a MDA-MB-231, também teria modulado positivamente fatores
Discussão | 51
envolvidos na ativação da coagulação sanguínea, que já foram descritos como tendo
papel importante na metástase tumoral.
O FT tem sido descrito como principal responsável pela desregulação da
coagulação constatada em pacientes com câncer, podendo estar aumentada tanto
em células tumorais, como no microambiente tumoral, como no plasma sanguíneo.
Já foi relatado que a presença de FT no microambiente tumoral poderia ser tão
relevante quanto a presença de células tumorais positivas para FT, demonstrando
então uma correlação entre níveis de FT no estroma e o processo tumoral (Ueno et
al., 2000). Contudo, utilizando modelo de nocaute para FT, demonstrou-se que
somente a presença deste nas células tumorais, e não em células do
microambiente, é capaz de estimular o crescimento tumoral (Liu et al., 2011).
Recentemente foi demostrado que a fosforilação do domínio citoplasmático do FT
poderia dar resultados mais fidedignos quanto ao prognostico, já que muitas vezes a
ligação extracelular do FT com o FVII pode impedir a ligação do anticorpo ao FT.
Desta forma, a fosforilação do sítio citoplasmático do FT foi correlacionada com a
expressão de PAR2 e a sobrevida reduzida (Ryden et al., 2010). Estes resultados
sugerem que além de seu papel na coagulação, a sinalização de FT via receptor
PAR-2 poderia ser relevante na biologia tumoral. De fato, utilizando anticorpo
específico que bloqueia a sinalização via PAR-2, mas não a ativação da cascata de
coagulação, verificou-se bloqueio de angiogênese e redução do volume de tumor
induzido por MDA-MB-231 em xenoenxerto (Versteeg et al., 2008).
Neste trabalho, a expressão de fator tecidual foi avaliada em linhagens
representativas do fenótipo basal e luminal, MDA-MB-231, MCF-7, respectivamente
e as subpopulações da linhagem T-47D que, como vimos, se enquadraram nestes
subtipos. A presença do FT se correlacionou com o comportamento das mesmas.
Discussão | 52
Em acordo com a literatura, as linhagens com maior grau de malignidade (MDA-MB231 e T-47DCD24neg) apresentaram fator tecidual na sua membrana, enquanto as
linhagens mais diferenciadas (MCF-7 e T-47DCD24pos) apresentaram baixos ou
indetectáveis níveis desta proteína. Além disso, a presença do fator tecidual foi
correlacionada com um perfil pró-coagulante das linhagens, ou seja, a presença do
FT na membrana permitiu a formação do complexo tenase extrínseco e consequente
ativação do FX. No entanto, na linhagem MCF-7, o baixo nível de expressão do FT
não foi suficiente para potencializar a ativação da cascata de coagulação, como foi
observado nas linhagens com maior expressão. Portanto, o fenótipo Basal, ou de
CTC, correlaciona-se com a atividade pró-coagulante, devendo-se investigar o grau
de fosforilação de FT, a expressão dos receptores PAR-1 e PAR-2 e a sinalização
mediada por estes.
Os mecanismos envolvidos na elevação dos níveis de expressão do FT são
complexos, finamente controlados e variam entre diferentes tipos celulares. Na
linhagem A431 de carcinoma epidermóide verificou-se que o estímulo da sinalização
do receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) levou a um aumento da
expressão do FT. Além disso, o bloqueio de E-caderina também levou a um
aumento dos níveis de FT e as células passaram a apresentar um fenótipo mais
metastático (Milsom et al., 2008). Na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231, foi
visto que a ativação de via de MAPK/ERK, que é promovida por EGF, está envolvida
no aumento de FT e a inibição do EGFR foi capaz de reduzir os níveis de FT (Hu et
al., 2012). Esses dados sugerem uma notável correlação entre mecanismos que
promovem o aumento do FT e a TEM, que pode ser induzida com TGF-β associado
à EGF em linhagens de carcinoma de mama (Mani et al., 2008). Além disso, a perda
de E-caderina também está associada a TEM e gera células com fenótipo Basal
Discussão | 53
(Mani et al., 2008; Milsom et al., 2008). Desta forma, neste trabalho encontramos
correlação entre o fenótipo Basal/CTC de mama, expressão de FT, atividade prócoagulante e aquisição de comportamento invasivo, o que condiz com resultados
obtidos em linhagem de carcinoma epidermóide (Milsom et al., 2007) e sugere que a
diferente expressão de FT nas subpopulações de T47-D esteja associada aos
processos de progressão tumoral, como TEM e ativação das vias de MAPK/ERK e
sinalização por EGFR, que devem ser investigadas.
As células T47D com fenótipo basal mostraram atividade pró-coagulante,
expressão de TF funcional, enquanto as células com fenótipo luminal apresentam
comportamento oposto. Portanto, estas subpopulações, por serem derivadas da
mesma linhagem, são um modelo atrativo para o estudo de moléculas relacionadas
à aquisição de comportamento invasivo e metastático, como expressão e função de
FT.
Conclusões | 54
6. Conclusões
- A expressão de CD24 e CD44 na linhagem MCF-7 e na subpopulação T47D
CD44negCD24pos correlacionou-se com o fenótipo luminal. Enquanto na linhagem
MDA-MB-231 e na subpopulação T47D CD44posCD24neg, o perfil correlacionou-se
com o fenótipo basal.
- Duas populações morfológica e funcionalmente distintas foram identificadas
e isoladas na linhagem de tumor de mama T-47D. A população majoritária,
CD44negCD24pos, apresentou comportamento não invasivo, semelhantemente a
linhagem MCF-7. Enquanto a população com fenótipo descrito para CTC de mama,
ou seja, CD44posCD24neg, apresentou características invasivas, assim como a
linhagem MDA-MB-231. As duas populações da linhagem T-47D mantiveram
fenótipo e propriedades biológicas estáveis em cultura e, portanto, são um modelo
interessante para estudos comparativos entre células oriundas da mesma linhagem
parental, ou seja, do mesmo tumor, mas que apresentam características distintas
quanto ao potencial invasivo.
- A atividade pró-coagulante, capacidade de ativar o FX da coagulação e a
expressão de FT se correlacionaram com o perfil de CTC e a invasividade nas
linhagens T-47D CD44posCD24neg e MDA-MB-231.
Referências Bibliográficas | 55
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