avaliação da função do toll like receptor 2 (tlr2) no desenvolvimento

JULIANA ALVES DE CAMARGO
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO TOLL LIKE
RECEPTOR 2 (TLR2) NO DESENVOLVIMENTO DE
CÂNCER EM ANIMAIS OBESOS
Campinas
2014
i
ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JULIANA ALVES DE CAMARGO
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO DO TOLL LIKE
RECEPTOR 2 (TLR2) NO DESENVOLVIMENTO DE
CÂNCER EM ANIMAIS OBESOS
Orientador(a): Prof. Dr. José Barreto Campello Carvalheira
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa
de
pós-graduação
em
Fisiopatologia Médica da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade Estadual
de Campinas para obtenção do titulo de
Mestra em Ciências.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DE MESTRADO DEFENDIDA PELA ALUNA JULIANA ALVES DE CAMARGO
E ORIENTADA PELO PROFESSOR
DR. JOSÉ BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA
Assinatura do Orientador
__________________________________
Campinas
2014
iii
iv
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais,
Gerson e Sandra Lúcia e às minhas irmãs
Alessandra e Carolina.
v
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Professor José Barreto Campello Carvalheira, pela sua
orientação, exemplo profissional e dedicação. Agradeço pela oportunidade, pelo
voto de confiança dado a mim e ao meu trabalho.
Ao Prof. Dr. Mário Saad, que permitiu a utilização de seu laboratório, pelo grande
exemplo de liderança e pelo conhecimento transmitido,
Ao Prof. Dr. Lício Velloso, por sempre se mostrar solícito, colaborando junto ao
seu laboratório, sempre que necessário.
Aos amigos, colegas e funcionários do Laboratório de Oncologia Molecular, LICRI
e LABMEX pela ajuda, por estarem ao meu lado durante esses anos e pelo
aprendizado.
Aos meus amigos e Professores da Faculdade de Americana, agradeço pelos
momentos juntos de aprendizagem e experiências, horas e horas de estudo e
também as inesquecíveis alegrias. Agradeço, em especial, aos Professores, pelo
apoio e incentivo à pesquisa.
À minha família, meu norte, minha base, minha vida. Agradeço aos meus pais
Sandra e Gerson e minhas irmãs Alessandra e Carolina pela educação e pelo
exemplo. Sem vocês nada seria possível. Agradeço por aceitarem, entenderem e
apoiarem a minha escolha profissional. Obrigada por estarem junto comigo,
mesmo de longe, em cada segundo da minha vida.
vi
Às agências de fomento, Fundação de amparo a Pesquisa do Estado de São
Paulo – FAPESP, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico – CNPQ e
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia – INCT de Obesidade e Diabetes, pela
bolsa de estudo concedida e financiamento das pesquisas que permitiram o
desenvolvimento deste trabalho.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
Akt/PKB Proteína quinase B
AOM Azoximetano
AP-1 Proteína de ativação - 1
ASO Antisense
CD células dendríticas
CTL controle
DAB diaminobenzidina
DIO Diet induced obesity (Obesidade induzida por dieta)
DMBA 7,12-dimetillbenz(a)anthraceno
DNA Ácido desoxirribonucleico
DSS Dextran-sulfato de sódio
DTT ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
HBSS Hank’s buffered salt solution
IGF-1 Fator de crescimento análogo à insulina 1
IkBα Inibidor do NFκB no citoplasma
viii
IKK Inhibitor of IκB Kinase (Complexo de quinases que ativam o NF-κB)
IKKα Inhibitor of IκB Kinaseα
IKKβ Inhibitor of IκB Kinaseβ
IL-1β Interleucina-1β
IL-6 Interleucina -6
INCA Instituto Nacional do Câncer
IP Imunoprecipitado
IR Receptor de insulina
IRAK Interleukin-1 receptor-associated kinase
ITT Teste de tolerância a insulina
JNK Quinase da c-Jun
MAPK8 Proteína quinase ativadora de mitose
mTOR Proteína alvo da rapamicina em mamíferos
MyDD88 diferenciação mielóide resposta primária 88
NF-KB Fator de transcrição nuclear factor kappa B
NK células natural killer
p70S6K Quinase 1 da S6 de 70kDa
ix
PAMPs padrões moleculares associados a patógenos
PBS Tampão fosfato salino
PMSF fenilmetilsulfonilfluoreto
SD Sprague Dawley
SDS-PAGE Dodecil sulfato de poliacrilamida
STAT-3 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3
TIR receptor de interleucina 1, chamado Toll/Il-1 recetor
TLR2 Toll like receptor2
TLR4 Toll like receptor4
TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa
WINS The Women´s Intervention Study (estudo de intervenção nutricional das
mulheres)
ZY – zymosan
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição das dietas padrão e hiperlipídica
Tabela 2. Caracterização de Ratas SD alimentadas com ração padrão
(SD CTL) e dieta hiperlipídica (SD DIO)
Tabela 3. Caracterização de camundongos fêmea C57BL/6 e knockouts
para TLR2 alimentadas com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO).
Tabela 4. Caracterização de camundongos machos C57BL/6 e knockouts
para TLR2 alimentados com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO)
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tipos de inflamação na tumorigênese.
Figura 2. Via de sinalização do TLR2.
Figura 3. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em
camundongo.
Figura 4. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em ratas.
Figura 5. Esquema do modelo de indução de câncer de cólon em
camundongos.
Figura 6. Caracterização de ratas Sprague Dawley após tratamento com
DMBA e dieta hiperlipídica.
Figura 7. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e
mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 8. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento
celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD)
tratadas com DMBA.
Figura 9. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) em ratas
Sprague Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA .
Figura 10. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e
mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
xii
Figura 11. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento
celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD)
tratadas com DMBA.
Figura 12. Dose resposta do zymosan de ratas em ração padrão.
Figura 13. Caracterização da ativação do TLR2 pelo agonista Zymosan
(ZY) em ratas Sprague Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com
DMBA.
Figura 14. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e
mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA.
Figura 15. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento
celular em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD)
tratadas com DMBA.
Figura 16. Caracterização de Camundongos fêmea knockouts para TLR2 e
C57BL6 após tratamento com DMBA e dieta hiperlipídica.
Figura 17. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e anexo
cutâneo de camundongos fêmea tratadas com DMBA.
Figura 18. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento
celular em tecido tumoral e anexo cutâneo de camundongos fêmea tratadas com
DMBA.
xiii
Figura 19. Caracterização inflamatória do cólon e tecido adiposo em
camundongos TLR2-/- e C57BL6 em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica
(DIO) tratados com AOM + 3 doses de DSS.
Figura 20. Atividade das proteínas da via de sinalização inflamatória (A) e
de crescimento celular (B) no cólon de camundongos tratados com AOM + 3
doses de DSS.
Figura 21. Caracterização dos animais TLR-/- em ração padrão e dieta
hiperlipídica tratados com AOM + 3 doses de DSS.
Figura 22. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) dos
animais NODSCID em ração padrão e dieta com inoculação de célula HT-29.
Figura 23. Caracterização da ativação do TLR2 utilizando o agonista
Zymosan nos animais NODSCID em ração padrão e dieta com inoculação de
célula HT-29.
xiv
RESUMO
Dentre as doenças com a maior incidência de morte em países ocidentais,
destacam-se a obesidade e o câncer, e hoje pode-se dizer que estão fortemente
interligadas. Estudos mostraram uma forte associação entre obesidade e câncer
de cólon e de mama, sendo que quanto maior a adiposidade, pior é o prognóstico
para estas doenças. Entretanto, as razões pelas quais a obesidade eleva o risco
destes tipos
de câncer ainda não foram completamente elucidadas. Algumas
hipóteses foram levantadas, entre elas a associação da adiposidade com a
resposta inflamatória subclínica, onde o excesso de tecido adiposo resulta em
altos níveis de citocinas inflamatórias, contribuindo para a iniciação e progressão
do câncer. Especificamente, a inflamação gerada pela adiposidade apresenta
como cerne de sua patogênese a ativação de proteínas inflamatórias, como JNK e
IKK. Estas proteínas ativam fatores de transcrição, como NF-kB, Stat-3 e AP-1
que controlam a expressão de genes pró-inflamatórios como o TNF e a IL-6.
Recentemente, demonstrou-se a participação do TNFa, como sendo uma
molécula importante na promoção de tumores de cólon em animais obesos. Neste
estudo avaliamos o papel do TLR2 - um receptor com a função já estabelecida na
gênese da inflamação subclínica encontrada na obesidade, no câncer de cólon e
de mama mediados pela obesidade. Nossos resultados demonstram que a
redução da atividade do TLR2 protege os roedores do desenvolvimento de câncer
de mama, cólon e pele. Á semelhança dos animais controle, os animais
submetidos
à
dieta
hiperlipídica
também
xv
apresentaram
atenuação
do
desenvolvimento de câncer. Mecanisticamente, a inibição do TLR2 reduz a
atividade de IKK e protege do desenvolvimento de câncer por meio da repressão
da liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF. Assim, neste trabalho
demonstramos que o TLR2 é crucial para o desenvolvimento de diferentes tipos
de câncer, tanto em animais controle como submetidos à dieta hiperlipídica.
xvi
ABSTRACT
Among the diseases with the highest incidence of death in American countries,
obesity and cancer are very important, and today we can say that these are
connected. Studies have shown a strong association between obesity and some
types of cancer, such as colon and breast cancer. Higher adiposity result in the
worse prognosis for these diseases. However, the reasons why obesity increase
the risk of these cancers have not been completely elucidated. Several hypotheses
have been raised, including the association of adiposity with subclinical
inflammatory response, in which excess of adipose tissue results in high levels of
inflammatory cytokines, contributing to the initiation and progression of cancer. The
inflammation generated by adiposity stimulates the activation of inflammatory
proteins such as JNK and IKK. These proteins activate transcription factors such
as NF-kB, Stat-3 and AP-1, that control the expression of pro-inflammatory genes
such as TNF and IL-6. Recently our group demonstrated that the TNFa is an
important molecule in the promotion of colon tumors in obese animals. We
evaluated in this study the role of TLR2, as receptor that is already established the
role in the genesis of subclinical inflammation found in obesity, colon and breast
cancer mediated by obesity. Our results demonstrated that the reduction of TLR2
activity protects the animals from development of breast, colon, and skin cancer.
Interestingly, like the animal control, animals in high fat diet also showed
attenuation of the development of cancer. Mechanistically, inhibition of TLR2
reduces the activity of IKK and protects the development of cancer through
xvii
repression of the release of IL-6 and TNF pro-inflammatory cytokines. Accordingly,
this study demonstrated that TLR2 is crucial for the development of different types
of cancer in both animals control and fed with high fat diet.
xviii
SUMÁRIO
Pág.
RESUMO
XV
1- INTRODUÇÃO
21
1.1 Obesidade e Câncer
22
1.2 Obesidade, Resistência a Insulina e Câncer
24
1.3 Câncer e Inflamação
25
1.3.1 Inflamação e Câncer de Mama
27
1.3.2 Inflamação e Câncer de Cólon
28
1.3.3 Fatores Inflamatórios Associados ao Processo de
Tumorigênese
29
1.4 A Via de Sinalização do Toll Like Recetor 2
30
2-OBJETIVOS
33
3- MATERIAIS E MÉTODOS
36
4- RESULTADOS
46
5- DISCUSSÃO
81
6- CONCLUSÃO
86
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
88
ANEXO
95
xix
INTRODUÇÃO
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 Obesidade e Câncer
Obesidade pode ser definida como um estado de aumento de peso corpóreo, caracterizado
pelo desequilíbrio entre o excesso de calorias consumidas e o gasto energético, em uma
magnitude suficiente para gerar consequências adversas, como reduzir a qualidade de vida e
aumentar o risco de doenças como diabetes tipo 2, hipertenção arterial, doenças
coronarianas, hipercolesterolemia, esteatose hepática e diversos tipos de câncer.
(Spiegelman and Flier 2001);(Calle, Rodriguez et al. 2003); (Singla, Bardoloi et al. 2010).
Estudos apontam que 68 % dos adultos nos EUA, hoje, com idade acima de 20 anos estão
com sobrepeso ou são obesos, sendo que de 1988-1994, apenas 56 % dos adultos com
idade acima de 20 anos estavam com sobrepeso ou obesidade
(Ballard-Barbash,
Hunsberger et al. 2009). O impacto que tem o excesso de peso sobre o risco de câncer,
incidência
e
mortalidade
vem
sendo
estudado.
As
estimativas
apontam
para
aproximadamente 30% de casos de câncer em obesos nos países ocidentais. Em
consonância, estudos epidemiológicos predizem que a obesidade poderá levar a cerca de
500 000 casos de câncer nos Estados Unidos até 2030 (Wang, McPherson et al. 2011).
Estimativas apontam que a redução dos níveis de obesidade no Brasil pode evitar 19% dos
casos de câncer (INCA, 2010).
Dados históricos revelam que nos últimos 25 anos a obesidade pode ter sido a causa de
aproximadamente 14% de morte por câncer em homens e 20% de morte por câncer em
mulheres.Especificamente a obesidade é considerada o principal agente causador de
aproximadamente 11% dos casos de câncer de cólon, 9% de câncer de mama na pós22
menopausa, 39% dos casos de câncer endometrial, 25% dos casos de câncer de rim e 37%
dos casos de câncer de esôfago. Além disso, dados revelam que a obesidade pode estar
relacionada à mortalidade por câncer de fígado, câncer de pâncreas, linfoma não-Hodgkin,
próstata, estômago, tireoide e mieloma (Wolin, Carson et al. 2010).
Além do aumento da incidência, o sobrepeso e obesidade estão correlacionados com o
aumento do risco da recorrência do câncer de mama e da diminuição da sobrevida de
pacientes portadores do mesmo (Vainio, Kaaks et al. 2002); (Caan, Kwan et al. 2008).
Interessantemente, o estudo de intervenção nutricional das mulheres, The Women´s
Intervention Study (WINS) mostrou que a redução de 22% do consumo de gordura na dieta
pode reduzir em 24% o risco de câncer. (Chlebowski, Blackburn et al. 2006). De modo
semelhante, o consumo da típica dieta "ocidental" entre os sobreviventes de câncer colorretal
tem sido associada a um aumento de 3,5 vezes o risco de recidiva da doença (Meyerhardt,
Niedzwiecki et al. 2007)
Alguns mecanismos foram descritos, explicando a possível associação entre a adiposidade e
o aumento do risco de câncer, como por exemplo, o câncer de mama na pós-menopausa, o
qual pode ser fortemente associado à obesidade pelo aumento dos níveis de estradiol (Key,
Appleby et al. 2003); (Missmer, Eliassen et al. 2004). Outro fator considerado importante no
desenvolvimento do câncer mediado pela obesidade é a produção de adipocinas, como a
leptina, que está presente em maior concentração nos obesos, promovendo o crescimento
celular,ao passo que a adiponectina, que é menos abundante em pessoas obesas, pode ter
efeitos anti-proliferativos (Roberts, Dive et al. 2010). Outro mecanismo descrito é que o
aumento da adiposidade apresenta efeitos diretos e indiretos sobre outros reguladores de
23
crescimento de tumores, incluindo a proteína mTOR, a qual possui uma atividade essencial
nesse contexto (Laplante and Sabatini 2012).
1.2 Obesidade, Resistência a Insulina e Câncer
O tecido adiposo é importante na regulação do balanço energético e metabolismo lipídico
através da liberação de hormônios, como a leptina, adiponectina, resistina e o fator de
necrose tumoral (TNF). O aumento da liberação de ácidos graxos livres, resistina e TNF pelo
tecido adiposo e liberação reduzida de adiponectina estão envolvidos diretamente na gênese
da resistência à insulina, um estado metabólico caracterizado pela redução da ativação da
via de sinalização da insulina de tecidos como músculo, fígado e tecido adiposo, bem como
hiperinsulinemia compensatória (Reaven 1988, Wajchenberg 2000). O excesso de peso,
baixos níveis de atividade física e alguns fatores dietéticos podem elevar as concentrações
circulantes de insulina. Estudos sugerem que cronicamente aumentados, os níveis de
insulina podem ser associados a alguns modelos tumorais, com o câncer de cólon, câncer de
mama, pâncreas e endométrio (Weiderpass, Partanen et al. 1998). Primeiramente estes
efeitos pró-tumorigênicos provenientes do aumento de insulina poderiam ser diretamente
mediados por ativação de receptores IGF-1 nas células alvo pré-neoplásicas. Neste sentido,
a insulina promove a ativação de IGF-1R,
receptor que tem uma estrutura molecular
bastante semelhante ao do IR e está envolvido na regulação da proliferação celular. Desta
maneira, elevados níveis circulantes de insulina, provenientes do excesso de peso, poderiam
estimular o crescimento de alguns tumores e inibir a morte celular (Shafie and Grantham
1981).
Recentemente, foi demonstrada uma forte associação entre inflamação subclínica da
obesidade e carcinogênese (Park, Lee et al. 2010). O entendimento atual é que o principal
24
mecanismo envolvido na obesogênese é também um dos fatores essenciais na
tumorigênese mediada pela obesidade, ou seja, foram publicados alguns trabalhos
mostrando que a inflamação subclínica proveniente do excesso de tecido adiposo gera uma
infiltração de células inflamatórias, como macrófagos. Estas células, juntamente com os
adipócitos, secretam citocinas inflamatórias, que são essenciais na tumorigênese
(Grivennikov and Karin 2010);(Grivennikov, Greten et al. 2010);(Bromberg and Wang 2009).
Esse processo se dá pelo fato de que a adiposidade está fortemente associada ao estado
inflamatório crônico de baixo grau.
1.3 Câncer e Inflamação
No século 19, Rudolf Virchow mostrou as primeiras evidências da presença
de células
inflamatórias em tumores, sugerindo uma possível associação entre inflamação e câncer.
Entretanto, este assunto não foi explorado naquela época. Recentemente esse processo foi
novamente investigado, indicando que a inflamação possui um papel crítico na
carcinogênese (Figura1) (Karin 2006).
O microambiente inflamatório é um componente essencial para a progressão dos tumores
(Mantovani, Allavena et al. 2008). Apenas uma minoria de todos os cânceres é causada por
mutações germinativas, sendo que a vasta maioria (90%) está relacionada a mutações
somáticas e fatores ambientais. Muitas causas ambientais e fatores de risco para cânceres
em geral estão associadas a alguma forma de inflamação crônica. Mais de 20% dos
cânceres estão relacionados a infecções; 30% podem ser atribuídos ao tabaco e poluentes
inalados e 35% estão possivelmente atribuídos a fatores dietéticos; (20% dos cânceres estão
ligados à obesidade (Aggarwal, Vijayalekshmi et al. 2009).
25
Como pode ser observado na Figura 1, a inflamação é um dos fatores ambientais mais
importantes para a carcinogênese (Grivennikov, Greten et al. 2010).
Figura 1. Tipos de inflamação na tumorigênese e Câncer
A
inflamação crônica associada à infecção ou doença autoimune precede o desenvolvimento do tumor e pode
contribuir para isso através da indução de mutações oncogênicas, instabilidade genômica, promoção tumor e
precoce e aumento da angiogênese. A exposição prolongada a irritações ambientais, bem como a obesidade
também podem resultar em baixo grau de inflamação crônica que precede o desenvolvimento do tumor. Podese dizer que a inflamação caminha de mãos dadas com o desenvolvimento do tumor. Esta resposta inflamatória
pode contribuir com a neoangiogênese, promover a progressão tumoral e disseminação metastática, causando
imunossupressão local, e aumenta ainda mais a instabilidade genômica. A terapia contra o câncer também
pode desencadear uma resposta inflamatória causando trauma, necrose e injúria tecidual, que estimula a reemergência e resistência à terapia. Entretanto, em alguns casos a inflamação induzida pela terapia pode
aumentar a apresentação de antígenos, levando à erradicação do tumor, mediada pelo sistema imune.
Adaptado de Grivenikov et al 2010.
Como resultado destas diferentes formas de inflamação, o microambiente tumoral contém
células da imunidade inata (incluindo macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e células
NK) e do sistema imune adaptativo (linfócitos B e T) além de células tumorais e o estroma
26
circunjacente (o qual consiste de fibroblastos, células endoteliais e células mesenquimais)
(de Visser, Eichten et al. 2006). Essas diversas células se comunicam por meio de contato
direto e também pela produção de citocinas e quimiocinas, que atuam no sistema de
crescimento tumoral. Esta é a expressão de vários mediadores e moduladores imunológicos,
que estão ativados no microambiente tumoral (Karin 2007); (Smyth, Dunn et al. 2006).
As células do sistema imunológico mais frequentes no microambiente tumoral são os
macrófagos associados a tumores e células T. Os macrófagos, principalmente, promovem o
crescimento tumoral e possivelmente angiogênese, invasão e metástases (Condeelis and
Pollard 2006). Consequentemente, grandes concentrações de macrófagos podem estar
relacionados a um pior prognóstico (Murdoch, Muthana et al. 2008).
1.3.1 Inflamação e câncer de mama
A Associação entre obesidade e o risco para o desenvolvimento do câncer de mama é
dependente dos períodos pré e pós-menopausa. Há uma evidência consistente para esta
associação em mulheres na pós-menopausa (Brodie, Lu et al. 2001). O efeito negativo da
obesidade no prognóstico do câncer de mama pode ser explicado pelo efeito biológico da
adiposidade, onde estão presentes maiores concentrações de estradiol, demonstrando um
maior risco para o desenvolvimento de câncer de mama. Outro hormônio que também já foi
associado ao câncer de mama é a leptina, a qual também está em altas concentrações em
mulheres obesas (Surmacz 2007).
Além disso, estudos mostraram que a obesidade e o excesso de peso podem levar a um
estado inflamatório no tecido mamário, em camundongos e humanos, tendo um acúmulo de
células inflamatórias, principalmente macrófagos, os quais secretam citocinas pró27
inflamatórias entre outros hormônios (Maccio and Madeddu 2011). Em conjunto, esses dados
sugerem que a inflamação pode aumentar o risco de câncer de mama em mulheres com
sobrepeso no período de pós-menopausa (Rose and Vona-Davis 2013).
1.3.2 Inflamação e câncer de cólon
Somente cerca de 20% dos casos de câncer de cólon são provenientes de histórico familiar
(Rustgi 2007). No entanto, a maior fração desses tumores foi associado a condições
ambientais e não alterações genéticas. Os fatores de risco incluem ambientais e
mutagênicos de origem alimentar, patógenos e inflamação intestinal crônica, que precede o
desenvolvimento do tumor. Câncer de cólon associado à colite é o subtipo de câncer que
está associado à doença inflamatória do intestino, onde há um infiltrado de células imunes.
As células do sistema imune inato, tal como neutrófilos, mastócitos, células natural killer
(NK), células dendríticas (CD) e macrófagos associados a tumores podem ser facilmente
detectadas nestes tumores. Além disso, tumores avançados podem recrutar subconjuntos
mieloides específicos, que ajudam a suprimir o efeito antitumoral da resposta imunológica e
favorece a angiogênese. (Gabrilovich and Nagaraj 2009). Por outro lado, células do sistema
imune adaptativo também são recrutadas para o microambiente tumoral, onde podem
exercer um papel anti-tumorigênico, como as células T, por exemplo, que apresentam um
mecanismo de “imunovigilância”. Esse processo se da pelo fato de que durante a metástase,
quando um pequeno número ou células metastáticas individuais se deslocam, podem ser
atacados por células imunes antitumorais, como as células T, que geralmente estão
associadas a um bom prognóstico de câncer de cólon (Guidoboni, Gafa et al. 2001).
28
A
inflamação subclínica mediada pela obesidade, onde há um infiltrado de células do
sistema imune inato, pode ser um forte indutor de câncer de cólon. Já se sabe que a
produção de TNFα está aumentada nesses casos. Recentemente foi descrito que essas
proteínas e vias de sinalização inflamatórias também estão associadas à carcinogênese do
cólon (Terzic, Grivennikov et al. 2010).
1.3.3 Fatores inflamatórios associados ao processo de tumorigênese
Proteínas intracelulares tais como JNK e IKK, que transmitem o sinal inflamatório na
imunidade inata, controlam a expressão de genes pró-inflamatórios, o que induz à ativação
de células como neutrófilos, células NK, células endoteliais, e também ao processo de
angiogênese, motilidade, migração e proliferação celular. Estes fatores estão associados ao
processo de tumorigênese e desenvolvimento metastático, associado a um pior prognóstico
em diversos tipos de câncer (Popovic, DeMarco et al. 2006);(Ito, DeMarco et al. 2007)
Existem fatores de transcrição, como NF-Kb, STAT3 e AP1, que são ativados pelas proteínas
JNK, IKK entre outras. Esses fatores induzem a expressão de genes, que são responsáveis
pelo aumento de citocinas inflamatórias, como IL-6, TNFα, IL-1β, etc (Grivennikov, Greten et
al. 2010);(Karin 2006). Recentemente o nosso grupo demonstrou que o aumento do TNF-α,
mediado pela obesidade, está envolvido na carcinogênese (Flores, Rocha et al. 2012)
Por outro lado, alguns trabalhos mostram que o Toll Like Receptor 2 (TLR2) também atua
neste contexto inflamatório. Foi observado em células mieloides, que o TLR2 aumenta o
TNFα, que age como indutor de metástase no carcinoma de pulmão. Mecanisticamente, as
células tumorais apresentam aumento de proliferação através do NF-kB e redução da
apoptose (Luo, Maeda et al. 2004).
29
1.4 A via de sinalização do Toll Like Receptor 2
Toll-like receptors (TLRs) são amplamente distribuídos em células do sistema imunológico e
caracterizados como sensores imunológicos de patógenos invasores. As vias de sinalização
são desencadeadas pela detecção desses patógenos, iniciando a resposta imune inata (Xie,
Wang et al. 2009).
Os TLRs são reconhecidos por detectar padrões moleculares associados a patógenos
(PAMPs) incluindo vírus, bactérias, fungos e parasitas (Liew, Xu et al. 2005). Atualmente
foram identificados 11 receptores da família dos TLRs com a característica de possuírem um
domínio extracelular, constituindo múltiplas repetições ricas em leucina, um domínio
transmembrana e um domínio intracelular (Akira and Sato 2003).
A sinalização do TLR2 é iniciada com a ligação do receptor a ácidos graxos, particularmente
saturados. As subunidades do TLR se associam, levando à formação de um complexo da
região de interação Toll com proteínas adaptadoras da família MyD88, caracterizada como
um componente essencial para a ativação da imunidade inata em todos os TLRs (Figura 2).
Esta proteína é recrutada para o receptor através do domínio TIR, proteína que tem
similaridade com o receptor de interleucina 1, chamado Toll/Il-1 recetor (TIR) o qual interage
com o receptor TLR. Quando estimulada, a MyD88 se associa ao IRAK, identificada como
uma serina/threonina kinase associada ao receptor de Il-1.
Existem quatro membros da família de IRAK identificados como IRAK1, IRAK2, IRAKM e
IRAK4. Essas proteínas consistem em um domínio N-terminal, responsável pela interação
com a MyD88 e um domínio central kinase. O IRAK4, então, fosforila o IRAK1. Quando o
IRAK 1 é fosforilado, é ativado e associado ao TRAF6, que se dissocia do receptor e interage
com o TAK1, TAB1 E TAB2. Este complexo se associa a Ubc13 e Uev1A, o qual induz
ativação de TAK1. A TAK1 ativada, fosforila o complexo IKK, constituído de IKKα, IKKβ, e
30
NEMO/IKKY, levando à ativação de duas vias de sinalização distintas, com a finalidade de
ativar JNK e NF-kB- um fator de transcrição que estimula a expressão de genes- alvos
responsáveis por estimular a liberação de citocinas inflamatórias (Figura2) (Takeda and Akira
2004); (Liew, Xu et al. 2005)
Estudos recentes identificaram certos receptores de TLRs em células que não são do
sistema imune, como por exemplo o TLR2, encontrado em células tronco com o papel de
controlar a diferenciação celular, e o TLR4 em adipócitos, relacionado à resistência à insulina
(Xie, Wang et al. 2009). Novas evidências têm mostrado que os TLRs estão presentes em
algumas células tumorais de camundongos. Por exemplo, o TLR4 em tumor de cólon, facilita
a evasão de vigilância imune. A ativação do TLR2 promove o crescimento tumoral no fígado,
via IL-6.
Figura 2. Via de sinalização do TLR2.
31
Recentemente, o nosso grupo descreveu a inibição da expressão do TLR2, que diminui a
ativação de IKK e MAPK8. Porém, aumenta a ativação de JNK e a resistência à insulina em
camundongos, indicando que o TLR2 pode ser um modulador chave na inflamação e vias
metabólicas (Caricilli, Picardi et al. 2011). Entretanto, a função do TLR2 na carcinogênese
mediada pela obesidade é desconhecida.
32
OBJETIVOS
33
2
OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Investigar o efeito da inibição do TLR2 no desenvolvimento de tumores em animais controles
e obesos.
2.2 Objetivos específicos

Verificar a incidência e número de tumores de mama e investigar a via de sinalização do
TLR2 e de proliferação em ratas Sprague Dawley, com obesidade induzida por dieta
hiperlipídica.

Investigar o efeito da inibição do TLR2 no desenvolvimento de câncer de mama em ratas
Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta hiperlipídica

Investigar o efeito da ativação do TLR2 no desenvolvimento de câncer de mama em ratas
Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta hiperlipídica

Verificar a incidência e número de tumores de pele em camundongos fêmea C57/BL6 e
knockout para TLR2 submetidos a dieta hiperlipídica e investigar a ativação de proteínas
da via de sinalização do TLR2 e de proliferação celular.

Verificar a incidência e número de tumores de cólon em camundongos machos C57/BL6
e knockout
para TLR2 submetidos a dieta hiperlipídica e investigar a ativação de
proteínas da via de sinalização do TLR2 e de proliferação celular.

Investigar o efeito da inibição de TLR2 no crescimento de células tumorais de câncer de
cólon HT-29 em camundongos NODSCID com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
34

Investigar o efeito da inibição de TLR2 no crescimento de células tumorais de câncer de
cólon HT-29 em camundongos NODSCID controle
35
MATERIAIS E MÉTODOS
36
3. MATERIAS E MÉTODOS
3.1 Animais
Os camundongos knockout para TLR2, seus controles C57BL6 , ratos fêmeas
Sprague Dawley e camundongos NOD.CB17-Prkdcscid/JUnib com 8 semanas de vida foram
divididos em 2 grupos, sendo um grupo submetido à obesidade induzida por dieta
hiperlipídica e outro grupo com dieta padrão. Todos os animais foram obtidos do Centro de
Bioterismo da Unicamp (CEMIB) e mantidos em condições de fotoperíodo (12 horas no claro
e 12 horas no escuro). A temperatura do biotério foi mantida entre 21-23°C. Os animais
foram mantidos em gaiolas com maravalha, sendo 5 animais por gaiola.
3.2 Materiais
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Oncologia Molecular e no Laboratório de
Investigação Clínica de Resistência a Insulina no período de 08/2011 – 08/2014. Os
reagentes e os aparelhos para gel de dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) foram
(Richmond CA). Foi utilizado
TRIS-HCL, fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), aprotinina e
ditiotreitol (DTT) comprados da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A membrana de
nitrocelulose (0,25mm) foi proveniente da Bio-Rad. Todos os anticorpos utilizados foram
provenientes da Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA); Cell Signaling Technology
(Beverly, MA, USA). Para indução de tumor de mama e de pele foi utilizado o 7,12dimetillbenz(a)anthraceno (DMBA) da Sigma Chemical Co. As ratas foram tratadas com
oligonucleotídeo inibidor do TLR2, cujas sequências são: antisense (5´- GCA GGG AAT
AGA GGT 3´) e sense (5´- ACC TCT ATT CCC TGC 3´) por 30 dias, com injeções
intraperitoneais de 8 nmol. Foi utilizado o Zymosan, agonista do TLR2 na dose crônica de
37
2,5mg/kg durante todo o experimento.
Para indução de tumor de cólon, foi utilizado o
carcinógeno Azoximetano (AOM) (12,5mg/kg) e Dextran-sulfato de sódio (DSS) a 2,5%. Em
animais NODSCID foi feito o xenoenxerto com inoculação de 1x106 células da linhagem
celular HT-29 para câncer de cólon. Esses animais foram tratados com oligonucleotídeo
inibidor do TLR2, cujas sequências são: antisense (5´-GAG CTC GCA TCC TCT-3´) e sense
(5´-GCT CTA TGA CTC CCA G-3´) por 30 dias, com injeções intraperitoneais de 4 nmol.
3.3 Dietas
As composições das dietas padrão e hiperlipídica estão descritas na tabela abaixo.
Tabela 1. Composição das dietas padrão e hiperlipídica
Ingredientes
Ração padrão (g/kg)
Kcal/kg
Dieta hiperlipídica Kcal/kg
Amido de milho
397,5
1590
115,5
462
Caseina
200
800
200
800
Açúcar
100
400
100
400
Amido dextrinizado
132
528
132
528
Gordura saturada
-
-
312
2808
Óleo de soja
70
630
40
360
Celulose
50
-
50
-
Mistura de minerais
35
-
35
-
Mistura de vitaminas
10
-
10
-
L-Cystina
3
-
3
-
Colina
2,5
-
2,5
-
38
Kcal/kg
Total
1000
3948
1000
5358
3.4 Protocolo para indução de tumor de mama em Camundongos fêmea.
O DMBA dissolvido em óleo de soja foi administrado em 5 doses, por gavagem, na
concentração de 1mg/dose por animal após 5 semanas de nascimento (Blanco-Aparicio,
Perez-Gallego et al. 2007). Os animais foram sacrificados 26 semanas após o tratamento
(Figura 3).
Figura 3. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em camundongo
3.5 Protocolo para indução de tumor de mama em ratos fêmea
O DMBA dissolvido em óleo de soja foi administrado em uma dose, por gavagem, na
concentração de 100mg/kg por animal após 16 semanas de nascimento (Barros, Muranaka
et al. 2004). Os animais foram sacrificados 12 semanas após o tratamento (Figura 4).
39
Figura 4. Esquema do modelo de indução de câncer de mama em ratas
3.6 Protocolo para indução de tumor de cólon em Camundongos macho.
Animais C57 e TLR2-/- foram mantidos em dieta controle (proteína, 20%; carboidrato,
70%; lipídio,10%) ou em dieta hiperlipídica (proteína,20%; carboidrato, 35%; lipídio, 45%). O
Azoximetano (AOM) (12,5 mg/kg) foi injetado intraperitonealmente nos dois grupos após 8
semanas de tratamento com dieta hiperlipídica ou controle. Uma semana após a aplicação
do AOM os animais receberam o tratamento com dextran-sulfato de sódio (DSS) a 2,5% na
água a eles oferecida aos animais por cinco dias. O tratamento com DSS foi repetido mais
duas vezes, na quinta e oitava semanas após o tratamento com AOM (Popivanova, Kitamura
et al. 2008). Os animais foram sacrificados 10 dias após o último tratamento com DSS
(Figura 5).
40
Figura 5. Esquema do modelo de indução de câncer de cólon em camundongos
3.7 Protocolo de extração de tecidos
Os animais foram sacrificados com uma overdose de anestésico Tiopental sódico
Thiopentax, da Cristália, 40mg/kg diluído em soro fisiológico, assegurando-se a eutanásia
através da avaliação da perda dos reflexos da perna e córnea. Foi coletado
aproximadamente 800µl de sangue para as dosagens séricas por Elisa. Foi feita a avaliação
macroscópica dos tecidos, os quais foram extraídos e encaminhados aos procedimentos de
western blotting e análise histopatológica, como descrito abaixo.
3.8 Protocolos de Extração e análise protéica por immunoblotting
Os tecidos extraídos dos animais foram embebidos em tampão de extração (1% Triton
X-100, 100 mM Tris (pH 7.4), 100 mM pirofosfato de sódio, 100 mM fluoreto de sódio, 10 mM
EDTA, 10 Mm vanadato de sódio, 2 mM fluoreto de fenilmetanossulfonila e 0.1 mg/ml
aprotinina) e homogeneizado com Politron PTA 20S Generator, Brinkmann Instruments
model PT 10/35, ajustado à velocidade máxima. Foi feita a centrifugação do material extraído
em microcentrífuga refrigerada a 4ºC (Bioanalytical) a 12.000 rpm por 40 minutos; parte do
sobrenadante foi utilizada para determinação da concentração de proteínas por fragmento de
tecido extraído e outra para aplicação de SDS-PAGE.
Foi utilizado o método fotocolorimétrico do reagente biureto (Bradford, M.M., 1976) da Bio
Rad para a determinação da concentração protéica.
41
O sobrenadante das amostras obtidas foi aliquotado com tampão de Laemmli (Laemmli
1970) acrescido de DTT 200mM, numa proporção de 1:5 (400 µl do sobrenadante em 100 µl
do tampão de Laemmli com DTT). Este material foi, então, fervido a 100ºC por 5 minutos e
submetido à eletroforese gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). O gel foi balizado por marcador
de alto peso molecular da Bio Rad. A eletroforese foi realizada em cuba de minigel da Bio
Rad, com solução tampão para eletroforese previamente diluída. O SDS-PAGE sempre
submetido a 30 volts inicialmente, até a passagem pela fase de empilhamento (stacking) e
100 volts até o final do gel de resolução (resolving).
A transferência das proteínas separadas no gel foi feita eletricamente para uma membrana
de nitrocelulose, através de um aparelho também da Bio Rad por 90 minutos a 120 volts,
como descrito por Towbin (Towbin, Staehelin et al. 1979).
As membranas com as proteínas transferidas foram incubadas em solução bloqueadora (leite
desnatado Molico 5%, Tris 10mM, NaCl 150mM e Tween 20 0,02%) por duas horas a
temperatura ambiente a fim de diminuir a ligação inespecífica dos anticorpos à membrana de
nitrocelulose. Após lavadas em solução basal, estas membranas foram então incubadas
com anticorpos específicos para as proteínas MyD88, IKKβ, IκB e JNK, mantidas a 4°C
overnight sob agitação contínua. Após este procedimento as membranas foram outra vez
lavadas com solução basal, durante quatro sessões de dez minutos cada. A seguir, as
membranas foram submetidas à solução de quimioluminescência SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrate, da Pierce, por cerca de três minutos, sob agitação manual
constante, sendo, posteriormente, expostas ao filme de RX (Eastman Kodak, Rochester, NY)
com uso de intensificador (Cronex Lightning Plus intensifying screens – DuPont, Washington,
DE) por cerca de vinte minutos. Após a primeira revelação, foi feita a avaliação da qualidade
42
da imagem obtida, e, quando necessário, novas exposições ao filme de RX foram realizadas,
em intervalos de tempos maiores ou menores do que o primeiro. As bandas identificadas nas
autorradiografias, foram encaminhadas ao processo de leitura por densitometria óptica,
quantificando suas áreas, utilizando-se, para isso, o software Scion. A partir de então foi
realizada a análise dos dados, comparando-se o tecido do animal - controle com o outro em
experimento, de maneira que sempre haverá controle intra-experimento.
3.9 Imunoprecipitação
Após a extração dos tecidos, as amostras foram centrifugadas por 45 minutos a 11
000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi preservado e a leitura proteica foi realizada através do
método de Biureto. O volume das amostras foi normalizado por concentração proteica e as
amostras foram incubadas com o anticorpo específico e permaneceram sob agitação
contínua a 4ºC overnight. Foram adicionados 60 µl de proteína A-Sepharose 6MB para a
precipitação do complexo proteína A anticorpo, mantida sob agitação por 2 horas. As
amostras foram novamente centrifugadas por 15 minutos a 11.000 rpm a 4ºC e o
sobrenadante foi descartado. Foi feita a lavagem do precipitado com o tampão específico
para lavagem de imunoprecipitado 3 vezes (2mmol/l Ortovanadato de Sódio; 100mmol/l
Trisma; 1mmol/l EDTA e 0,5% Triton X-100). Foi adicionado tampão de Laemmili com
100mM de DTT as proteínas precipitadas e aquecidas por 5 minutos. Foi feita a análise por
immunoblotting.
3.10 Análise histopatológica
Os tumores foram ressecados durante a necrópsia, imersos overnight
em
paraformoldeído 4% para fixação. Em seguida, o material foi desidratado com diferentes
43
concentrações de etanol (70%, 80% 95% e 100%, xilol e emblocado em parafina. O material
foi cortado em micrótomo e fixado em lâminas de microscopia. As lâminas foram coradas
com Hematoxilina e Eosina. Para análise de proliferação celular, através do kit Ki-67, as
lâminas foram desparafinizadas com xilol e hidratadas com diferentes concentrações de
etanol (100% - 70%). A recuperação antigênica do tecido foi realizada em forno microondas
doméstico a 700W e foi distribuído nas lâminas imersas em um tampão de citrato a 0,01 mol/l
e pH igual a 6, 9 minutos, com intervalo de 2 minutos entre as imersões. As lâminas foram
mantidas
em temperatura ambiente para resfriarem, antes de serem retiradas do forno
microondas. Em seguida foi realizado o bloqueio com a peroxidade endógena (1% H2O2 em
metanol) por 15 minutos. Após o bloqueio com BSA 3%, o material foi incubado overnight, a
4 ºC com o anticorpo monoclonal de origem murina para Ki-67 clone MIB-1 anti-humano
(Dako Cytomation). As lâminas foram então incubadas com o kit LSAB+ e complexadas com
avidina-biotina (Dako Cytomation), por 30 minutos, seguido da adição de tetrahidrocloreto
diaminobenzidina (DAB) (Sigma Aldrich) como uma solução de substrato cromógeno. Após
coloração com hematoxilina e desidratação, as lâminas foram montadas em Entellan (Merck,
Darmstadt, Alemanha). Os experimentos foram realizados pelo menos em triplicata para
cada animal.
3.11 ELISA
Foi utilizado soro dos animais para detecção de citocinas inflamatórias, como Il-6 e
TNF-α por ELISA através do kit da Millipore, St. Charles, MO, USA.
44
3.12 Protocolo de separação de adipócito e estroma vascular
O tecido adiposo visceral foi fragmentado e embebido em tampão de Krebs (118mM
NaCl; 4,7mM KCl; 1,2mM MgSO4; 1,25mM CaCl2; mM KH2PO4; 23mM NaHCO3; 11mM
Glicose). Foi adicionado colagenase tipo 2 (1mg/ml) em 10ml de tampão de Krebs. As
amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC por 30 min. O material foi passado por um
filtro de 100µm. O sobrenadante foi separado do corpo de fundo e ambos foram lavados
com tampão de Krebs. Tanto o sobrenadante quanto o corpo de fundo foram preservados e
ressuspendidos em tampão para extração de proteínas.
3.13 Protocolo de isolamento de macrófagos do cólon
O cólon foi fragmentado e lavado com PBS 0,1M. Em seguida o tecido foi embebido em
tampão HBSS (Hank’s buffered salt solution) e adicionado 1mM de EDTA e 1mM de DTT por
15 minutos a 37ºC. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado o meio de cultura RPMI
com 0,02% de colagenase tipo 5 e mantido sob agitação por 30 minutos a 37ºC. O material
foi passado por um filtro de 100µm e centrigugado a 1500rpm por 5 minutos a 4ºC. O corpo
de fundo foi preservado e ressuspendido em tampão para extração de proteínas.
3.14 Análise estatística
Neste trabalho foram realisados os testes estatísticos Test T, One-way ANOVA e
Kaplan-Meier. Projeto aprovado pelo Comitê de ética 2413-1
45
RESULTADOS
46
4.0 RESULTADOS
4.1 O Efeito da obesidade induzida por dieta hiperlipídica em ratas Sprague
Dawley tratadas com DMBA.
Primeiramente, avaliamos a importância da obesidade no processo de tumorigênese,
especificamente adenocarcinoma de mama, em ratas tratadas com o carcinógeno DMBA. Os
animais que foram alimentados com dieta hiperlipídica por um período de 2 meses,
apresentaram um aumento significativo de tecido adiposo, que equivale a aproximadamente
20% da massa corporal em relação ao grupo controle (TABELA2). Observamos também um
aumento na concentração de insulina no soro de animais com obesidade induzida por dieta
hiperlipídica (TABELA2). Sendo assim, avaliamos os parâmetros inflamatórios destes
animais e encontramos um aumento substancial nas concentrações séricas da citocina
inflamatória IL-6 (TABELA2).
Tabela 2. Caracterização de Ratas SD alimentadas com ração padrão (SD CTL) e dieta hiperlipídica
(SD DIO)
Peso corporal (g)
Tecido adiposo
ovariano (g)
Insulina (ng/ml)
Il-6 (ng/ml)
SD CTL
261,5 ± 1,29
SD DIO
471 ± 1,28
3,71 ± 0,66
0,23 ± 0,01
2,1 ± 2,0
4,9 ± 0,28
0,44 ± 0,05
7,25 ± 2,72
N=10 por grupo. P<0,05 em relação aos animais controle.
Em relação à tumorigênese, observamos que os animais tratados com o carcinógeno DMBA,
desenvolveram neoplasia maligna composta principalmente por ductos neoformados,
associada a um estroma desmoplásico. Além disso, observamos uma ligeira deposição de
47
colágeno intersticial e discretos focos de necrose. Estas alterações são condizentes com
carcinoma ductal (Figura 6A e B).
O grupo dos animais obesos induzidos por dieta hiperlipídica apresentou maior incidência
tumoral e tendência a um aumento no número de tumores quando comparado ao grupo
controle (Figura 6C e E). Em relação ao crescimento tumoral, nós não observamos diferença
entre os grupos. Porém, os tumores dos animais obesos apresentaram um desenvolvimento
mais precocemente. Sendo assim, sua sobrevida livre de tumor foi significativamente mais
baixa (Figura 6D e F). Portanto, nossos dados sugerem que a obesidade pode estar
associada à carcinogênese dos tumores de mama, agindo provavelmente nas fases de
iniciação e promoção dos tumores.
48
A
SD CTL
SD DIO
B
SD CTL
SD DIO
*
Incidência Tumoral
*
100
Incidência %
80
60
40
20
0
SD CTL
SD DIO
D
Porcentagem de sobrevivência
C
Sobrevivência livre de tumor
110
SD CTL
SD HFD
100
90
80
70
0
50
100
150
Dias depois do tratamento com DMBA
E
Número de tumores
F
Crescimento tumoral
2.5
8000
SD HFD
Volume (mm³)
2.0
1.5
1.0
SD CTL
6000
4000
2000
0.5
0
60
0.0
SD CTL
80
100
Dias depois do tratamento com DMBA
SD DIO
49
Figura 6. Caracterização de ratas Sprague Dawley após tratamento com DMBA e dieta hiperlipídica:
(A) Análise macroscópica de tumores de mama de animais controle (SD CTL) e animais alimentados
com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO). (B) Análise microscópica de animais controle (SD
CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO) método de coloração com Hematoxilina e Eosina
(HE). (C) Incidência tumoral de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD DIO).
(D) Sobrevivência livre de tumor de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD
DIO). (E) Número de tumores de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD
DIO). (F) Crescimento tumoral de animais controle (SD CTL) e animais em dieta hiperlipídica (SD
DIO). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Tendo em vista esta associação entre obesidade e promoção tumoral, fomos investigar a
atividade das proteínas da via de sinalização inflamatória pelo método de western blot,
inicialmente no tecido e tumoral e mamário sem tumor dos animais obesos e controle.
Fizemos um imunoprecipitado (IP) com o TLR2 e blotamos com a proteína MYD88.
Obervamos uma maior interação entre essas proteínas nos animais obesos. Sendo assim,
fomos investigar a ativação de outras proteínas desta via inflamatória e observamos um
aumento da fosforilação das proteínas IKK e JNK em ambos os tecidos, nos animais com
obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Observamos também um aumento da proteína
IkBα total nos animais controle em relação aos animais obesos. Esses dados caracterizam
um visível estado inflamatório nos animais obesos, quando comparados com os animais
controle (Figura 7). Diante desses resultados observamos a importância especificamente
dessas proteínas no processo tumorigênico.
50
Figura 7. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas
Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL) e grupo com obesidade induzida
por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO). A ativação das proteínas foi avaliada
por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Investigamos também as proteínas da via de sinalização de crescimento celular.
Observamos uma diferença na ativação e fosforilação das proteínas AKT, mTOR e p70S6K
no tecido tumoral e mamário desses animais em relação aos animais controle (Figura 8).
Figura 8. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e
mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL) e
51
grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO). A
ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB).
4.2 O Efeito da inibição do TLR2 em ratas Sprague Dawley com obesidade
induzida por dieta hiperlipídica tratadas com DMBA.
Com base nesses resultados, decidimos então avaliar a função do TLR2 na condição
de obesidade associada à tumorigênese. Os animais submetidos à dieta hiperlipídica por 8
semanas e seus controles alimentados com ração padrão foram tratados com o antisense
(ASO) - sequência de nucleotídeos bloqueadora do TLR2. Observamos que os animais
desenvolveram neoplasia maligna classificada como adenocarcinoma mamário (Figura 9A e
B). No entanto, os animais tratados com o inibidor de TLR2 (ASO) apresentaram uma menor
incidência tumoral, tanto do grupo obeso quanto do grupo em dieta padrão, quando
comparados com os animais controle. Avaliamos também o número de tumores e, da mesma
forma, observamos um menor número de tumores nos animais tratados com ASO, tanto
obesos quanto em ração padrão (Figura 9C e E). Ao analisarmos o crescimento destes
tumores, não encontramos diferença entre os grupos, entretanto, os animais obesos e os
animais
alimentados
com
dieta
padrão,
tratados
com
ASO,
apresentaram
um
desenvolvimento tumoral mais tardio em relação aos seus controles, apresentando uma
maior sobrevida livre de tumor (Figura 9D e F).
52
53
Figura 9. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) em ratas Sprague Dawley em
dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA: (A) Análise macroscópica de tumores de mama
de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais
alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados
com ASO (SD DIO+ASO). (B) Análise microscópica de tumores de mama de animais controle (SD
CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta
hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD
DIO+ASO). método de coloração com Hematoxilina e Eosina (HE). (C) Incidência tumoral de animais
controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados
com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO
(SD DIO+ASO) (D) Sobrevivência livre de tumor de animais controle (SD CTL), animais em ração
padrão tratados com ASO (SD CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8
semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO) (F)
Crescimento tumoral animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD
CTL+ASO), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta
hiperlipídica tratados com ASO (SD DIO+ASO). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Com esses resultados, investigamos a atividade das proteínas inflamatórias da via de
sinalização do TLR2 pelo método de western blot no tecido tumoral e mamário destes
animais. Como esperado, pudemos notar a ausência da interação entre o receptor TLR2 e a
proteína MYD88 nos animais tratados com ASO. Em relação às outras proteínas desta via,
observamos uma diminuição da fosforilação de proteínas IKK e JNK no tecido tumoral e
mamário sem tumor dos animais tratados com ASO, tanto em ração padrão como em dieta
hiperlipídica. Observamos também um aumento da proteína IkBα total nos animais
alimentados com ração padrão e animais obesos
animais controle (Figura 10).
54
tratados com ASO,
em relação aos
Figura 10. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas
Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL), grupo em ração padrão tratado
com ASO (SD CTL ASO), grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8
semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado com ASO (SD DIO ASO). A
ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Ao avaliar as proteínas da via de sinalização de crescimento celular, notamos uma maior
ativação e fosforilação das proteínas AKT, mTOR e p70S6K no tecido tumoral e mamário em
relação aos animais obesos tratados com ASO (SD DIO ASO) e em dieta padrão tratados
com ASO (SD CTL ASO) (Figura 11).
55
Figura 11. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e
mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL),
grupo em ração padrão tratado com ASO (SD CTL ASO), grupo com obesidade induzida por dieta
hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado
com ASO (SD DIO ASO). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB)
4.3 O papel do TLR2 na promoção tumoral em ratas Sprague Dawley com
obesidade induzida por dieta hiperlipídica tratadas com DMBA.
Para avaliar a importância do receptor TLR2 na promoção e progressão tumoral, decidimos
estimular a ativação do mesmo com o agonista Zymosan (ZY) o qual ativa o receptor e as
proteínas de sua via de sinalização.
Fizemos um tratamento crônico com ZY na dose de 2,5mg/kg, para que os animais
desenvolvessem o mesmo perfil inflamatório de um animal obeso (Figura 12) .
Figura 12. Dose resposta do zymosan de ratas em ração padrão. Ratas SD em ração padrão foram
tratadas com diferentes doses de Zymosan comparadas com um animal obeso sem tratamento (SD
DIO). Avaliamos a ativação do TLR2 no tecido adiposo por immunoblot (IB).
Ao estabelecermos uma dose crônica de ZY, tratamos os animais em ração padrão e com
obesidade induzida por dieta hiperlipídica diariamente após a administração do DMBA até o
final do experimento.
56
Sendo assim, observamos que os animais obesos e os animais alimentados com ração
padrão tratados com o ZY desenvolveram adenocarcinoma mamário, assim como seus
controles (Figura 13A e B). Porém, notamos que os animais tratados com o ZY apresentaram
uma maior incidência tumoral, tanto do grupo obeso quanto do grupo em dieta padrão. Da
mesma forma, o número de tumores nos animais tratados com ZY, tanto obesos quanto em
ração padrão, foi maior do que nos animais controle (Figura 13C e E). Ao avaliarmos o
crescimento destes tumores, não encontramos diferença entre os grupos, porém, os animais
obesos e os animais alimentados com ração padrão, tratados com ZY, desenvolveram
tumores mais precocemente. Consequentemente, os animais tratados com ZY obtiveram
uma menor sobrevida livre de tumor (Figura 13D e F).
57
58
Figura 13. Caracterização da ativação do TLR2 pelo agonista Zymosan (ZY) em ratas Sprague
Dawley em dieta hiperlipídica e dieta padrão tratadas com DMBA: (A) Análise macroscópica de
tumores de mama de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD
CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta
hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY). (B) Análise microscópica de tumores de mama de
animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais
alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados
com ZY (SD DIO+ZY). Método de coloração com Hematoxilina e Eosina (HE). (C) Incidência tumoral
de animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais
alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados
com ZY (SD DIO+ZY) (D) Sobrevivência livre de tumor de animais controle (SD CTL), animais em
ração padrão tratados com ZY (SD CTL+ZY), animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8
semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica tratados com ZY (SD DIO+ZY) (F) Crescimento
tumoral animais controle (SD CTL), animais em ração padrão tratados com ASO (SD CTL+ZY),
animais alimentados com dieta hiperlipídica por 8 semanas (SD DIO) e animais em dieta hiperlipídica
tratados com ZY (SD DIO+ZY). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Desta forma, fomos investigar a atividade das proteínas inflamatórias da via de sinalização
do TLR2 pelo método de western blot no tecido tumoral e mamário destes animais.
Observamos uma maior interação entre o receptor TLR2 e a proteína MYD88 nos animais
tratados com ZY. Em relação às outras proteínas desta via, pudemos notar um aumento da
fosforilação de proteínas IKK e JNK no tecido tumoral mamário sem tumor dos animais
tratados com ZY tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica. Observamos também
uma diminuição da proteína IkBα total nos animais alimentados com ração padrão e animais
obesos tratados com ZY em relação aos animais controle (Figura 14).
59
Figura 14. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e mamário sem tumor de ratas
Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL), grupo em ração padrão tratado
com ZY (SD CTL ZY), grupo com obesidade induzida por dieta hiperlipídica por um período de 8
semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado com ZY (SD DIO ZY). A ativação
das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Analisando as proteínas da via de sinalização de crescimento celular, atentamos para uma
maior ativação e aumento da fosforilação nos animais obesos tratados com ZY (SD DIO ZY)
e em dieta padrão (SD CTL ZY) das proteínas AKT, mTOR e p70S6K no tecido tumoral e
mamário em relação aos animais obesos (SD DIO) e em dieta padrão (SD CTL) (Figura 15),
sugerindo que a ativação do TLR2 pode ser um mecanismo chave em tumores de mama.
60
Figura 15. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e
mamário sem tumor de ratas Sprague Dawley (SD) tratadas com DMBA. Grupo controle (SD CTL),
grupo em ração padrão tratado com ZY (SD CTL ZY), grupo com obesidade induzida por dieta
hiperlipídica por um período de 8 semanas (SD DIO) grupo com obesidade induzida por dieta tratado
com ZY (SD DIO ZY). A ativação das proteínas foi avaliada por immunoblot (IB)
4.4 O papel do TLR2-/- na tumorigênese associada à obesidade em camundongos
-fêmea tratadas com o carcinógeno DMBA.
Com base nos resultados descritos acima, investigamos o perfil de camundongos
knockout para TLR2 (TLR2-/-) no processo tumorigênico com o carcinógeno DMBA. O grupo
TLR2-/- e o grupo dos animais selvagem (C57BL6), que foram alimentados com dieta
hiperlipídica após completarem 8 semanas de vida, não apresentaram diferença significativa
de peso corporal no período em que começaram a desenvolver tumores, possivelmente
devido ao pouco tempo em dieta hiperlipídica. (Tabela 3). Porém, mesmo assim pudemos
observar que alguns parâmetros metabólicos associados à obesidade, como a dosagem de
insulina sérica, nossos dados mostraram um aumento significativo no grupo TLR2-/- quando
comparado com o grupo C57BL6 (TABELA 3), ambos alimentados com dieta hiperlipídica.
Em relação à inflamação, nossos dados demonstraram uma diminuição significativa das
61
citocinas IL-6 e TNFα nos grupos TLR2-/- quando comparados aos grupos C57BL6, ambos
em dieta hiperlipídica e dieta padrão (TABELA 3).
Tabela 3. Caracterização de camundongos fêmea C57BL/6 e knockouts para TLR2 alimentadas
com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO).
Peso corporal (g)
C57 CTL
21 ± 1,2
TLR2 CTL
22,1 ± 2,45
C57 DIO
23,21 ± 1,19
TLR2 DIO
22,4 ± 1,04
Tecido adiposo
ovariano (g)
Insulina (ng/ml)
Il-6 (ng/ml)
TNFα (ng/ml)
0,041 ± 1,43
0,32 ± 0,67
63,67 ± 1,26
34,67 ± 1,67
0,043 ± 0,53
0,73 ± 1,4ª
16,75 ± 1,32ª
16,73 ± 1,2ª
0,041 ± 1,48
1,43 ± 1,71ª
87,5 ± 2,7ª
42,38 ±2,8ª
0,05 ± 1,2
2,40 ± 2,1ª
38,9 ± 2,79ª
22,41 ± 1,67ª
N=10 por grupo. ª P<0,05 em relação aos animais controle.
Após o tratamento com o carcinógeno DMBA, observamos a iniciação e progressão de
tumores nesses animais. Na análise macroscópica e microscópica, os animais de ambos os
grupos apresentaram carcinoma epidermóide moderadamente diferenciado com áreas de
diferenciação basalóide (Figura 16A e B).
O grupo TLR2-/-, tanto controle quanto alimentado com dieta hiperlipídica, apresentou uma
tendência à diminuição da incidência tumoral e número de tumores (Figura 16C e E). Em
relação ao crescimento tumoral, nós não encontramos uma diferença significativa entre os
grupos, porém pudemos observar que os grupos dos C57, tanto alimentados com dieta
hiperlipídica quanto controles, apresentaram uma diferença significativa no tempo de
surgimento dos tumores, de maneira que nos animais TLR2-/- o surgimento dos tumores
ocorreu mais tardiamente (Figura 16D e F).
62
63
Figura 16. Caracterização de Camundongos fêmea knockouts para TLR2 e C57BL6 após
tratamento com DMBA e dieta hiperlipídica: (A) Análise macroscópica do tecido tumoral dos animais
C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados
com dieta hiperlipídica. (B) Análise microscópica do tecido tumoral dos animais C57/BL6 e TLR2-/dos grupos controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados com dieta
hiperlipídica. Método de coloração com Hematoxilina e Eosina. (C) Incidência tumoral dos animais
C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados
com dieta hiperlipídica. (D) Sobrevida livre de tumor dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos
controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados com dieta hiperlipídica. (E)
Número de tumores dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle e dos animais C57/BL6 e
TLR2-/- dos grupos alimentados com dieta hiperlipídica (F) Crescimento tumoral dos animais
C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados
com dieta hiperlipídica. p< 0,05 vs C57 DIO (n=10 animais por grupo)
Com esses resultados, decidimos então investigar a atividade de proteínas inflamatórias que
participam da via de sinalização do TLR2, no tecido tumoral e anexo cutâneo, pelo método
de western blot. Primeiramente, fizemos um imunoprecipitado (IP) com MYD88 e blotamos
com TLR2. Pudemos notar a ausência da interação entre o receptor TLR2 e a proteína
MYD88 nos animais TLR2-/-.
Em relação às outras proteínas desta via de sinalização,
observamos uma diminuição da fosforilação da proteína IKK no tecido tumoral e anexo
cutâneo dos animais TLR2-/-, tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica, quando
comparados com os seus controles. Notamos também um aumento da proteína IkBα total
nos animais TLR2-/- alimentados com ração padrão e animais obesos (Figura 17). Porém, ao
avaliarmos a atividade da proteína inflamatória pJNK, observamos que ela se mostrou mais
ativa nos animais TLR2-/- tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica.
64
Figura 17. Atividade das proteínas inflamatórias em tecido tumoral e anexo cutâneo de
camundongos fêmea tratadas com DMBA. Grupos em ração padrão (C57 CTL e TLR2-/-CTL) e
grupos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica (C57 DIO e TLR2-/- DIO) com início de 8
semanas de vida e duração de até o final do experimento. A ativação das proteínas foi avaliada por
immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Analisando as proteínas da via de sinalização de crescimento celular, observamos uma
maior ativação e fosforilação das proteínas AKT, mTOR e p70S6K no tecido tumoral e
subcutâneo nos animais C57BL6 em dieta padrão e em dieta hiperlipídica (Figura 18),
sugerindo que a ativação do TLR2 pode ser um mecanismo chave no desenvolvimento
tumoral.
65
Figura 18. Atividade das proteínas da via de sinalização de crescimento celular em tecido tumoral e
anexo cutâneo de camundongos fêmea tratadas com DMBA. Grupos em ração padrão (C57 CTL e
TLR2-/-CTL) e grupos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica (C57 DIO e TLR2-/- DIO) com
início de 8 semanas de vida e duração de até o final do experimento. A ativação das proteínas foi
avaliada por immunoblot (IB).
4.5 O papel do TLR2 no desenvolvimento de tumor de cólon associado á
obesidade.
Partindo dos resultados da avaliação do papel do TLR2 no câncer de mama em ratas
e câncer de pele em camundongos, decidimos investigar a importância deste receptor no
câncer de cólon, pelo fato de que em 2012 publicamos um trabalho mostrando a forte
associação entre a inflamação subclínica causada pela obesidade e o câncer de cólon em
camundongos. Sendo assim, investigamos o perfil de camundongos knockout para TLR2
(TLR2-/-) no câncer de cólon com o protocolo do carcinógeno AOM + 3 doses de DSS. O
grupo TLR2-/- e o grupo dos animais controle (C57BL6), foram alimentados com dieta
hiperlipídica após completarem 8 semanas de vida.
Pudemos observar uma
diferença
significativa de peso corporal, sendo que os animais TLR2-/- tanto com ração padrão como
66
em dieta hiperlipídica apresentaram um maior ganho de peso em relação aos controles
(Tabela 4). Observamos também uma diminuição da sensibilidade à insulina em animais
TLR2-/- tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica quando comparados aos animais
controle no teste de tolerância à insulina (ITT). Fizemos a dosagem de insulina sérica e
nossos dados mostraram um aumento significativo no grupo TLR2 -/- quando comparado com
o grupo C57BL6 (TABELA 4), ambos alimentados com dieta hiperlipídica ou ração padrão.
Porém, em relação à inflamação, nossos dados demonstraram uma diminuição significativa
das citocinas IL-6 e TNFα nos grupos TLR2-/-, ambos em dieta hiperlipídica e dieta padrão
(TABELA 4).
Tabela 4. Caracterização de camundongos machos C57BL/6 e knockouts para TLR2 alimentados
com ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica ( DIO)
Peso corporal (g)
Tecido adiposo
epididimal (g)
Insulina (ng/ml)
Il-6 (ng/ml)
TNFα (ng/ml)
kitt (%min)
C57 CTL
21,9 ± 0,54
TLR2 CTL
25,55 ± 0,51
C57 DIO
35,77 ± 1,22
TLR2 DIO
44,69 ± 1,79
0,046 ± 0,61
0,4 ± 0,2
70,67 ± 2,6
32,55 ± 2,01
6,0 ± 1,2
0,13 ± 0,58
1,00 ± 0,81
14,55 ± 2,3
14,3 ± 0,7
4,2 ± 1,34
0,42 ± 0,48
1,2 ± 0,91
97,5 ± 2,8
38,67 ± 2,1
3,1 ± 0,1
1,73 ± 0,55
2,30 ± 1,4
35,19 ± 2,4
20,01 ± 2,36
2,01 ± 0,4
N=10 por grupo. P<0,05 em relação aos animais controle.
Em relação ao cólon, observamos que os animais tratados com o carcinógeno AOM + DSS
desenvolveram uma importante condição inflamatória, sendo que o grupo dos animais TLR2 /-
alimentados com ração padrão e o grupo dos TLR2 -/- alimentados com dieta hiperlipídica
apresentaram um menor índice inflamatório do que os animais controle
(Figura 19A e B).
Desta forma, fomos avaliar os níveis das citocinas inflamatórias IL-6 e TNFα especificamente
nos adipócitos, no estroma vascular do tecido adiposo e nos macrófagos isolados do cólon,
67
para ver se esta inflamação está mais presente no tecido adiposo, proveniente da obesidade,
ou se pode ser originária do cólon. Observamos que, mesmo com uma adiposidade intensa
presente nos animais TLR2-/- tanto alimentados com ração padrão como em dieta
hiperlipídica, os níveis das citocinas inflamatórias IL-6 e TNFα foram significativamente mais
baixos quando comparados aos animais controle, tanto nos adipócitos quanto no estroma
vascular do tecido adiposo. Entretanto, nos macrófagos isolados do cólon, não encontramos
diferença nestas citocinas, mostrando uma importância expressiva da adiposidade no
processo inflamatório crônico e sistêmico, e também a importância do receptor TLR2 na
ativação da via inflamatória e liberação destas citocinas no tecido adiposo (Figura 19C e D).
68
Figura 19. Caracterização inflamatória do cólon e tecido adiposo em camundongos TLR2-/- e
C57BL6 em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO) tratados com AOM + 3 doses de DSS: (A)
Análise macroscópica do cólon dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle (TLR2-/- CTL e
69
C57BL6 CTL) e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados com dieta hiperlipídica
(TLR2-/- DIO e C57BL6 DIO). (B) Análise microscópica do cólon dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos
grupos controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados com dieta hiperlipídica.
Método de coloração com Hematoxilina e Eosina. (C) Níveis de TNFα nos adipócitos, estroma
vascular e macrófagos isolados do cólon dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle e dos
animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados com dieta hiperlipídica. (D) Níveis da citocina
inflamatória IL-6 nos adipócitos, estroma vascular e macrófagos isolados do cólon dos animais
C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos controle e dos animais C57/BL6 e TLR2-/- dos grupos alimentados
com dieta hiperlipídica. * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
Ao avaliarmos as proteínas inflamatórias da via de sinalização do TLR2 no cólon,
observamos, por imunoprecipitado (IP), a ausência da interação entre MYD88 e TLR2 nos
animais knockouts para TLR2. Sendo assim, notamos que nos animais TLR2-/- tanto em
ração padrão como em dieta hiperlipídica, a fosforilação da proteína
IKK mostrou-se
diminuída quando comparada aos animais controle. Neste sentido encontramos um aumento
da proteína IkBα
total
nos animais TLR2-/- tanto em ração padrão como em dieta
hiperlipídica. Porém, observamos que a fosforilação e ativação da JNK esteve mais
acentuada nos animais TLR2-/- alimentados com dieta padrão e em dieta hiperlipídica do que
nos animais controle (Figura 20A).
Em relação à via de crescimento celular, analisando as proteínas, notamos uma menor
ativação e fosforilação de AKT, mTOR e p70S6K no cólon, nos animais TLR2-/- em dieta
padrão e em dieta hiperlipídica quando comparados aos animais controle (Figura 20B).
70
Figura 20. Atividade das proteínas da via de sinalização inflamatória (A) e de crescimento celular (B)
no cólon de camundongos tratados com AOM + 3 doses de DSS. Grupos em ração padrão (C57 CTL
e TLR2-/-CTL) e grupos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica (C57 DIO e TLR2-/- DIO) com
início de 8 semanas de vida e duração de até o final do experimento. A ativação das proteínas foi
avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP).
Desta forma, fomos avaliar a carcinogênese nestes animais TLR2 -/- e C57BL6. Obervamos
que tanto o número quanto o tamanho de tumores de cólon foi significativamente menor nos
animais TLR2-/- tanto em ração padrão como em dieta hiperlipídica (Figura 21A e B). Em
relação à atividade das proteínas inflamatórias da via de sinalização do TLR2, verificamos
que os resultados no tecido tumoral de cólon foram bem parecidos com os resultados do
cólon. Novamente observamos, por imunoprecipitado (IP), a ausência da interação entre
MYD88 e TLR2 nos animais TLR2-/-. Notamos também que tanto nos animais TLR2-/alimentados com dieta padrão como em dieta hiperlipídica, a fosforilação da proteína IKK
atentou-se diminuída quando comparada aos animais controle. Sendo assim, observamos
um aumento da proteína IkBα total tanto nos animais TLR2-/- alimentados com ração padrão
como em dieta hiperlipídica. Quanto à ativação da proteína JNK, observamos que a
71
fosforilação e ativação da mesma esteve mais acentuada nos animais TLR2-/- alimentados
com dieta padrão e em dieta hiperlipídica do que nos animais controle (Figura 21C).
Já a via de crescimento celular, observamos que as proteínas AKT, mTOR e p70S6K no
tecido tumoral, mostraram-se menos fosforiladas e ativas nos animais TLR2-/- em dieta
padrão e em dieta hiperlipídica (Figura21D). Avaliamos também por imunohistoquímica a
proliferação celular por marcação de ki-67 no cólon e observamos que os animais TLR2 -/alimentados com dieta padrão e dieta hiperlipídica apresentaram um índice de menor
proliferação do que os animais controle (Figura 21E)
72
73
Figura 21. Caracterização dos animais TLR-/- em ração padrão e dieta hiperlipídica tratados com
AOM + 3 doses de DSS: (A) Análise macroscópica de tumores de cólon de animais TLR-/- controle
(TLR2-/- CTL), animais C57BL6 controle (C57BL6 CTL), animais alimentados com dieta hiperlipídica
por 8 semanas (TLR2-/- DIO e C57BL6 DIO). (B) Número e tamanho de tumores de animais TLR-/controle (TLR2-/- CTL), animais C57BL6 controle (C57BL6 CTL), animais alimentados com dieta
hiperlipídica (TLR2-/- DIO e C57BL6 DIO). (C) Via de sinalização inflamatória de animais C57BL6
controle (C57BL6 CTL), animais alimentados com dieta hiperlipídica (TLR2-/- DIO e C57BL6 DIO). (D)
Via de sinalização de crescimento celular de animais C57BL6 controle (C57BL6 CTL), animais
alimentados com dieta hiperlipídica (TLR2-/- DIO e C57BL6 DIO). A ativação das proteínas foi
avaliada por immunoblot (IB) e imunoprecipitado (IP). (E) Imunohistoquímica com marcação do fator
de proliferação Ki-67 do cólon de animais C57BL6 controle (C57BL6 CTL), animais alimentados com
dieta hiperlipídica (TLR2-/- DIO e C57BL6 DIO). * p< 0,05 vs SD CTL (n=10 animais por grupo).
4.6 O Efeito da inibição do TLR2 em xenoenxerto de células de câncer de cólon
HT-29 em camundongos NODSCID com obesidade induzida por dieta hiperlipídica .
Com esses resultados descritos acima, fomos investigar se a inibição do TLR2 como
um tratamento para câncer de cólon seria eficaz na diminuição do crescimento tumoral.
Sendo assim, inoculamos células HT-29 em cultura no dorso de camundongos NODSCID
alimentados com ração padrão ou dieta hiperlipídica e tratamos com uma sequência
bloqueadora (ASO) para TLR2 por 30 dias. Observando diariamente durante este período,
notamos que os animais tratados com ASO, tanto em ração padrão como em dieta
hiperlipídica, obtiveram um crescimento tumoral expressivamente mais lento quando
comparados aos seus controles (Figura 22A e B).
Ao avaliarmos a atividade das proteínas inflamatórias da via de sinalização do TLR2 no
tecido tumoral, observamos, por imunoprecipitado (IP), a ausência da interação entre MYD88
e TLR2 nos animais tratados com ASO, tanto em dieta padrão como em dieta hiperlipídica.
Desta forma, verificamos que a fosforilação das proteínas inflamatórias IKK e JNK, mostrouse
diminuída nos animais tratados com ASO tanto em ração padrão quanto em dieta
hiperlipídica quando comparados aos animais controle. Consequentemente,
74
houve um
aumento da proteína IkBα total nos animais tratados com ASO alimentados com dieta padrão
e também nos animais em dieta hiperlipídica, quando comparados aos controle (Figura
22C).
Em relação à via de crescimento celular, observamos que as proteínas AKT, mTOR e
p70S6K no tecido tumoral, mostraram-se menos fosforiladas e ativas nos animais tratados
com ASO em dieta padrão e em dieta hiperlipídica quando comparados aos animais controle
(Figura 22D). Fizemos imunohistoquímica
e observamos que a proliferação celular por
marcação de ki-67 no tumor mostrou-se menos intensa nos animais tratados com ASO
alimentados com dieta padrão e dieta hiperlipídica (Figura 22E).
75
76
Figura 22. Caracterização da inibição do TLR2 por antisense (ASO) dos animais NODSCID
em ração padrão e dieta com inoculação de célula HT-29. (A) Crescimento tumoral de NODSCID
tratados com ASO alimentados com dieta padrão (CTL+ASO) e alimentados com dieta hiperlipídica
(DIO+ASO) comparados aos animais controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). (B)
Análise macroscópica de NODSCID tratados com ASO alimentados com dieta padrão (CTL+ASO) e
alimentados com dieta hiperlipídica (DIO+ASO) comparados aos animais controle em ração padrão
(CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). (C) Via de sinalização inflamatória de NODSCID tratados com ASO
alimentados com dieta padrão (CTL+ASO) e alimentados com dieta hiperlipídica (DIO+ASO)
comparados aos animais controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). (D) Via de
sinalização de crescimento celular de NODSCID tratados com ASO alimentados com dieta padrão
(CTL+ASO) e alimentados com dieta hiperlipídica (DIO+ASO) comparados aos animais controle em
ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). (E) Imunohistoquímica com marcação do fator de
proliferação Ki-67 em células HT-29 inoculadas em NODSCID tratados com ASO alimentados com
dieta padrão (CTL+ASO) e alimentados com dieta hiperlipídica (DIO+ASO) comparados aos animais
controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). * p< 0,05 vs CTL (n=10 animais por
grupo).
4.7 O papel do TLR2 na promoção tumoral em xenoenxerto de células de câncer
de cólon HT-29 em camundongos NODSCID com obesidade induzida por dieta
hiperlipídica.
Com os resultados da inibição do TLR2 no crescimento tumoral, decidimos verificar a
real importância deste receptor no câncer de cólon, utilizando o agonista Zymosan (ZY) como
um indutor de inflamação crônica por ativação da via de sinalização do TLR2. Utilizamos do
mesmo princípio do tratamento crônico com ZY na dose de 2,5mg/kg, para que os animais
desenvolvessem o mesmo perfil inflamatório de um animal obeso, ou seja, crônico (Figura
12) . Deste modo, tratamos com ZY os animais NODSCID alimentados com ração padrão ou
dieta hiperlipídica após a inoculação de células HT-29 e avaliamos o crescimento tumoral
destes animais comparados aos seus controles por 30 dias. Sendo assim, observamos que
estes animais tratados com ZY, tanto em dieta hiperlipídica como em ração padrão
apresentaram um maior crescimento tumoral quando comparados aos seus controles (Figura
23A e B). Verificarmos a atividade das proteínas inflamatórias da via de sinalização do TLR2
77
no tecido tumoral e, como esperado, observamos por imunoprecipitado (IP) a intensa
interação entre MYD88 e TLR2 nos animais tratados com ZY, tanto em dieta padrão como
em dieta hiperlipídica. Desta forma, observamos que a fosforilação das proteínas
inflamatórias IKK e JNK, mostrou-se mais presente nos animais tratados com ZY tanto em
ração padrão quanto em dieta hiperlipídica quando comparados aos animais controle. Sendo
assim, houve uma diminuição da
proteína IkBα total nos animais tratados com ZY
alimentados com dieta padrão e também nos animais em dieta hiperlipídica (Figura 23C).
Ao estudar a via de crescimento celular, notamos uma intensa ativação e fosforilação das
proteínas AKT, mTOR e p70S6K, no tecido tumoral dos animais tratados com ZY em dieta
padrão e em dieta hiperlipídica (Figura 23D).
Na imunohistoquímica, analisamos a
proliferação celular por marcação de ki-67 no tumor, a qual mostrou-se mais expressiva nos
animais tratados com ZY alimentados com dieta padrão e dieta hiperlipídica quando
comparados aos animais controle (Figura 23E).
78
79
Figura 23. Caracterização da ativação do TLR2 utilizando o agonista Zymosan nos animais
NODSCID em ração padrão e dieta com inoculação de célula HT-29. (A) Crescimento tumoral de
NODSCID tratados com ZY alimentados com dieta padrão (CTL+ZYMOSAN) e alimentados com
dieta hiperlipídica (DIO+ZYMOSAN) comparados aos animais controle em ração padrão (CTL) e dieta
hiperlipídica (DIO). (B) Análise macroscópica de tumores de NODSCID tratados com ZYMOSAN
alimentados com dieta padrão (CTL+ZYMOSAN) e alimentados com dieta hiperlipídica
(DIO+ZYMOSAN) comparados aos animais controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica
(DIO). (C) Via de sinalização inflamatória de NODSCID tratados com ZYMOSAN alimentados com
dieta padrão (CTL+ZYMOSAN) e alimentados com dieta hiperlipídica (DIO+ZYMOSAN) comparados
aos animais controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). (D) Via de sinalização de
crescimento celular de NODSCID tratados com ZYMOSAN alimentados com dieta padrão
(CTL+ASO) e alimentados com dieta hiperlipídica (DIO+ZYMOSAN) comparados aos animais
controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica (DIO). (E) Imunohistoquímica com marcação do
fator de proliferação Ki-67 em células HT-29 inoculadas em NODSCID tratados com ZYMOSAN
alimentados com dieta padrão (CTL+ZYMOSAN) e alimentados com dieta hiperlipídica
(DIO+ZYMOSAN) comparados aos animais controle em ração padrão (CTL) e dieta hiperlipídica
(DIO). * p< 0,05 vs CTL (n=6 animais por grupo).
80
DISCUSSÃO
81
5. DISCUSSÃO
O principal motivo deste trabalho foi avaliar o papel do TLR2 no desenvolvimento
tumoral. Como estudos epidemiológicos mostraram uma forte interação entre obesidade e o
risco para certos tipos de cânceres, incluindo cólon, mama, endométrio, rim, esôfago,
pâncreas e fígado (Calle and Kaaks 2004), estudamos o efeito da obesidade em três
modelos tumorais. Inicialmente, avaliamos se a obesidade influencia a iniciação e progressão
do câncer de mama em ratas Sprague Dawley tratadas com DMBA. Em concordância com
os dados da literatura os nossos resultados demonstraram que a obesidade promove o
aumento da incidência de câncer de mama em paralelo com o aumento da atividade de
proteínas pró-inflamatórias como pJNK, pIKK, IkBα, bem como proteínas de crescimento
celular, como mTOR e p70S6K (Park, Lee et al. 2010); (Grivennikov, Greten et al. 2010).
Este quadro inflamatório pode ser proveniente do excesso de tecido adiposo, onde existe
uma elevada ativação de proteínas inflamatórias e liberação de citocinas. Estes dados
sugerem que o quadro de inflamação subclínica proveniente do excesso de tecido adiposo
se espalhe para outros tecidos tornando-se sistêmico e favorável a iniciação e promoção
tumoral no tecido mamário. (Okwan-Duodu, Umpierrez et al. 2013). Com a intenção de
melhor entender o papel da inflamação na carcinogênese neste modelo animal nós inibimos
a expressão do TLR2 e interessantemente observamos que o aparecimento de tumores de
mama em animais ocorreu mais tardiamente quando comparados com animais controles. Em
paralelo, a inibição da expressão do TLR2 não apenas diminuiu a atividade e/ou expressão
de proteínas inflamatórias, mas também reprimiu a expressão de proteínas envolvidas na
proliferação celular. Em contraste, o tratamento com o agonista do TLR2 (Zymosan) levou ao
aumento da incidência e do número de tumores, o que sugere que o TLR2 contribui para a
82
carcinogênese. O TLR2 na obesidade é um receptor inflamatório que pode ser ativado por
ácidos graxos saturados, provenientes de uma dieta rica em gordura. Essa ativação pode
gerar uma inflamação sistêmica, levando a um aumento da ativação de proteínas
inflamatórias em diversos tecidos e liberação de citocinas circulantes (Ahmad, Al-Mass et al.
2012).
Dando continuidade ao trabalho, o nosso próximo passo foi avaliar a iniciação tumoral em
camundongos fêmea knockout para TLR2 com obesidade induzida por dieta hiperlipídica
tratados com DMBA. Observamos que esses animais TLR2-/- apresentaram uma melhor
sobrevida livre de tumores e menor incidência de câncer de pele. Interessantemente, apesar
de observarmos nos animais TLR2-/- menor atividade das proteínas IKK e IkBα observamos
aumento da pJNK sugerindo que a via de sinalização da IKK seja crucial para o
desenvolvimento
tumoral
neste
modelo
animal.
Recentemente,
mostramos
que
camundongos knockouts para o TLR2 apresentam maior resistência à insulina e ganho de
peso de forma JNK dependente. Especificamente, proteínas pró-inflamatórias do complexo
IKK e NF-kB, apresentam uma menor atividade, enquanto a JNK está hiperativa levando a
maior resistência à insulina (Caricilli, Picardi et al. 2011). Em conjunto, estes dados sugerem
que o aumento da atividade da JNK em animais obesos é suficiente para levar a resistência
à insulina, mas não promove o câncer..
Em relação ao câncer de cólon, os animais TLR2-/- apresentam menor número e tamanho de
tumores, menor atividade de proteínas inflamatórias, como IKK e IkBα, menor atividade de
proteínas de crescimento celular, como mTOR e pp70S6K e menor marcação de proliferação
celular por Ki67 . Esses dados mostram que os animais TLR2-/-, mesmo com um maior
ganho de peso e maior resistência à insulina, apresentam uma menor incidência tumoral,
83
condizendo com o trabalho que publicamos anteriormente, (Flores, Rocha et al. 2012)
mostrando que o desenvolvimento de tumor de cólon é dependente do processo inflamatório
crônico causado pela obesidade e independente da resistência à insulina.
Neste último experimento, é possível notar que a inflamação gerada pela ativação do
receptor TLR2 pode ser de suma importância para o desenvolvimento de tumor de cólon.
Resultados semelhantes foram obtidos em animais NODSCID com obesidade induzida por
dieta hiperlipídica portadores de xenoenxerto de células em cultura, HT-29, ou seja com a
inibição do TLR2 observamos menor ativação de proteínas e citocinas inflamatórias, menor
ativação de proteínas da via de crescimento celular e menor crescimento tumoral. Em
contraste, estes roedores quando tratados com Zymosan apresentaram maior taxa de
crescimento tumoral, aumento da atividade de proteínas inflamatórias da via de sinalização
do TLR2, destacando mais uma vez que o desenvolvimento de tumor de cólon mediado pela
obesidade é dependente do processo inflamatório crônico mediado pela ativação do TLR2
causado pela obesidade e independente da hiperinsulinemia.
Ao estudar a atividade de citocinas inflamatórias no tecido adiposo, mais especificamente
nos adipócitos e estroma vascular, observamos que os animais TLR2-/- apresentam uma
diminuição de IL-6 e TNFα, mostrando que esta inflamação dos animais controle gerada
pela obesidade é proveniente do tecido adiposo, e não do cólon.
Em 2012, nosso grupo mostrou que a inibição do TNF resultou em melhora significativa na
iniciação e progressão tumoral em animais obesos (Flores, Rocha et al. 2012).
TNF-α é um importante componente da rede de mediadores inflamatórios do câncer, como
as citocinas e VEGF (Balkwill 2009). Esta rede atua por modular o microambiente, levando
84
ao crescimento tumoral (Li, Vincent et al. 2009). Também foi demonstrado que a via PI3K/Akt
pode ser ativada pelo TNF-α, contribuindo para a carcinogênese colônica (Chen, Casali et al.
2006).
Nosso grupo mostrou que a redução da via de sinalização Akt/mTOR, a qual é
importante para o crescimento tumoral, está atenuada em animais obesos com câncer de
cólon tratados com infliximab, inibidor do TNF-α (Flores, Rocha et al. 2012) Os nossos dados
mostram que a semelhança da inibição do TNF, a repressão da expressão do TLR2 diminui a
atividade da via de sinalização Akt/mTOR, via crucial para o desenvolvimento do câncer de
cólon.
O microambiente tumoral inflamatório promove o acúmulo de mutações e mudanças
epigenéticas, contribuindo para o crescimento tumoral. Especificamente, células inflamatórias
ativadas produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RIS) que promovem
mutações (Meira, Bugni et al. 2008); (Westbrook, Wei et al. 2009). Ou seja, a inflamação
gera um acúmulo de citocinas que levam ao aumento de ROS e RIS, gerando mutações e
desenvolvimento tumoral (Grivennikov, Greten et al. 2010). Em nossos experimentos,
observamos que os animais obesos tratados com o oligonucleotídeo antisense para o TLR2
apresentaram uma diminuição das citocinas inflamatórias o que foi correlacionado com
redução do risco de câncer de mama, de pele e de cólon, ressaltando que animais com
xenoenxerto de células de câncer de cólon tratados com o antisense para TLR2
apresentaram uma redução do crescimento tumoral. Estes dados indicam que a inibição do
TLR2 foi suficiente para atenuar o programa pró-tumoral induzido pela inflamação.
85
CONCLUSÃO
86
6.0 CONCLUSÃO
Nossos dados indicam que o TLR2 é uma molécula chave na carcinogênese e
sugerem que a inflamação, no microambiente tumoral e ampliada pela obesidade, possui um
papel relevante na iniciação e progressão de tumores de mama, pele e cólon, de forma
independente da hiperinsulinemia nos animais estudados. Dessa maneira os resultados aqui
apresentados delineiam um novo caminho para o desenvolvimento de drogas para
prevenção e tratamento do câncer mediado pela obesidade.
87
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9.0 REFERÊNCIAS BBLIOGRÁFICAS
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