em canceres orais, idênticas àquelas previamente - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : 09/15 a 01/16
(X ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: PESQUISA DOS GENOTIPOS DE HPV EM
MULHERES ATENDIDAS NA REDE DE SAÚDE DE BELÉM
Nome do Orientador: Raquel Carvalho Montenegro
Titulação do Orientador: PhD
Faculdade : Universidade Federal do Pará
Unidade: Instituto de Ciências Biológicas (ICB)
Laboratório: Citogenética Humana
Título do Plano de Trabalho: Determinação epidemiológica e distribuição do
HPV 16 em mulheres com câncer cervical
Nome do Bolsista: Adrielly Vada Uchôa Pinto
Tipo de Bolsa :
( X ) PIBIC/CNPq
INTRODUÇÃO
O HPV é universalmente aceito como agente causal do câncer de colo
uterino. Recentemente, vem se especulando sua relação com o câncer de
cavidade oral e orofaringe. A possível relação do HPV na etiologia das lesões
cancerizáveis e no câncer oral foi primeiramente estimada em 1983, quando
foram descritas alterações citopáticas de HPV(coilócitos) em canceres orais,
idênticas àquelas previamente encontradas em lesões pré-cancerosas e
carcinomas de cérvice uterina (Goodman, 2007) . No decorrer dos anos, vários
estudos tem identificado o papel dos HPVs no carcinoma e em outras lesões
orais potencialmente malignas (Bouda, 2000). Outros trabalhos indicam que
HPV é um fator de risco para o carcinoma epidermoide oral (Miller, 2001)
A incidência por câncer de colo uterino torna-se evidente na faixa etária
de 20 a 29 anos e o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico geralmente
na faixa de 45 a 49 anos. Com aproximadamente 530 mil casos novos por ano
no mundo, o câncer do colo do útero é o quarto tipo de câncer mais comum
entre as mulheres, sendo responsável pelo óbito de 265 mil mulheres por ano
(WHO, 2012)
No Brasil, em 2014, foram diagnosticados 15.590 casos novos, com um
risco estimado de 15,3 casos a cada 100 mil mulheres. Em 2012, esta
neoplasia representou a terceira causa de morte por câncer em mulheres com
óbitos, representando uma taxa de mortalidade ajustada para a população
mundial de 4,72 óbitos para cada 100 mil mulheres(INCA 2014). As maiores
taxas de incidência encontram-se na America do Sul, Caribe, Africa subSaárica e no Sul e Sudeste da Asia. Nos países desenvolvidos as taxas médias
de incidência anuais ajustadas por idade são baixas (menores que
14/100.000)(Parkin 2002).
Existem aproximadamente 40 subtipos de HPV capazes de infectar por
meio da exposição do trato genital durante o ato sexual. Nesta perspectiva, os
vários tipos de HPV já identificados, capazes de infectar o trato genital, foram
agrupados em tipos de baixo risco(6, 11, 26, 42, 44, 54, 70, 73), e alto risco(
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 55, 56, 58, 59, 66, 68) para o desenvolvimento de
câncer cervical uterino (Kojima 2002). Os de baixo risco causam vários tipos de
lesões benignas, como verrugas, papilomas laríngicos e tumores ano-genitais,
gerando por vezes comichão e até sensações dolorosas. Os tipos de HPV de
alto risco, por sua vez, também podem provocar tumores benignos em
mucosas; sendo, porem estes tipos bem mais carcinogênicos que os
anteriores, principalmente os associados ao câncer do colo do útero (Rosa
2008).
O reconhecimento das papilomaviroses como um importante agente
etiológico de cânceres humanos tem aumentado sua importância médica e
estimulado pesquisas no desenvolvimento de estratégias para rastreamento,
diagnóstico, prevenção e tratamento de doenças associadas ao HPV (Xavier
2007).
JUSTIFICATIVA
Apesar dos importantes avanços no entendimento das neoplasias, o
câncer representa-se como a segunda principal causa de morte por doenças
no mundo, sendo diagnosticados cerca de 10 milhões de novos casos a cada
ano (Schiffman 2007).
O Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2008) informa que, no Brasil, o
câncer de colo de útero constitui um dos mais importantes problemas de saúde
pública, apresentando altas taxas de mortalidade em mulheres de várias faixas
etárias. O HPV, por sua vez, é considerado o agente viral mais frequentemente
transmitido por via sexual e é considerado necessário, mas não suficiente para
causar o câncer cervical (Van, 1996)
Seu controle é de grande importância para prevenção do câncer de colo
uterino, de modo que, segundo estimativas do Centers of disease control and
prevention (CDC) de 1996, cerca de 500.000 a 1 milhão de novos casos de
infecção por HPV ocorrem anualmente em todo mundo, com 11.100 casos
registrados de HPV nos EUA e aproximadamente 3.670 mortes estimadas em
2007, em virtude do câncer cervical associado ao HPV (Trottier 2006).
Evidências obtidas usando testes de PCR de uma vasta coleção
internacional de tipos de canceres uterinos, mostraram que o DNA do HPV
estava presente em 92,9 a 97 por cento dos casos de câncer cervical invasivo.
Deste modo, são pertinentes os estudos que demonstrem os tipos e subtipos
de HPV para contribuir na busca de um melhor tratamento (Gonzalez, 2006).
OBJETIVOS
Objetivo Primário
Estimar a frequência do HPV 16 presentes em amostras de câncer
cervical uterino de mulheres atendidas em unidades selecionadas da rede de
saúde pública de Belém, bem como conhecer a prevalências de fatores de
risco associados.
Objetivo Secundário
- Descrever o perfil epidemiológico da população de estudo;
- Descrever a frequência de fatores de risco associados (tabagismo, iniciação
sexual, idade, número de parceiros e uso de hormônios);
- Estimar a freqüência de infecção pelo HPV 16 em mulheres atendidas.
MATERIAL E MÉTODOS
A população de estudo foi composta por mulheres com câncer de colo
uterino atendidas na rede pública de saúde de Belém. Foi coletado material
tumoral a partir de biópsias de tumores cervicais. Foram incluídas mulheres
com câncer cervical a partir de estádio IB1. Foi aplicado um questionário
epidemiológico, após a assinatura do TCLE, contendo perguntas sobre
características sócio-demográficas, acesso aos serviços de saúde e fatores de
risco associados ao câncer cervical. As amostras de tumor foram obtidas a
partir de biópsias realizadas ambulatorialmente. O material foi armazenado em
criotubos em 1mL de RNA Later e enviadas ao Laboratório de Citogenética
Humana do Instituto de Ciências Biológicas da UFPA.
Critério de Inclusão
Foram incluídas pacientes portadoras de câncer de colo de útero nos
estádios IB1, IB2, IIA, IIB, IIIA, IIIB, IVA e IVB e que concordaram em participar
da pesquisa, após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido.
Critério de Exclusão
Foram excluídas as pacientes que já tiverem iniciado algum tipo de
tratamento radio ou quimioterápico, as pacientes com câncer cervical estadio
1A, e aquelas que não concordarem em participar da pesquisa.
Risco
Pode ocorrer sangramento local no momento da coleta de material.
Nesse caso, é feito um tamponamento vaginal com um tampão de gaze e a
solução de Monsel.
Isolamento (Extração de DNA)
Foi realizado o isolamento do DNA genômico, foi utilizado o kit do
fabricante (Qiagen) seguindo o protocolo desse kit sob nº de catálogo 1306 QL
amp mini and blood (qiagen). Ao final do processo de isolamento o DNA foi
quantificado em espectrofotômetro Nanodrop e feito um gel de agarose para
verificar se o DNA genômico extraído está em boas condições de integridade.
Amplificação do DNA viral e sequenciamento
O DNA viral foi amplificado por PCR utilizando-se o conjunto de primers
PGMY9/PGMY11, conforme protocolo descrito a seguir.
Será utilizada a Taq platinum da life Technologies. Os componentes da solução
da reação são 2,5 uL de tampão 10x; 0,5uL de MgCl2, cujo estoque está a
50mM; 0,2 uL do mix de dNTP, cujo o estoque está a 2 mM; 1uL da mistura
dos iniciadores PGMY9 e PGMY11, cada; e 0,2 uL de Taq Platinum DNA
polimerase cujo estoque está a 5U/uL e aproximadamente 100ng de DNA
genômico. O mix final é de 25 uL para cada amostra. As ciclagens são as
seguintes: 94ºC por 5min, seguindo-se de 40 ciclos de 94ºC por 40 segundos,
ºC por 40 segundos e 72ºC por 40 segundos; e por fim 72ºC por 5 minutos. As
amostras são posteriormente conservadas a -20ºC.
Para a confirmação da presença dos produtos de PCR, 4uL de cada
reação foram corridos em géis de agarose 1,5% (a 4volts/cm) durante 40
minutos. Os produtos amplificados, de aproximadamente 450 pares de base,
foram purificados com o kit Ilustra GFX PCR and DNA Gel Band Purification Kit,
de acordo com o protocolo recomendado pelos fabricantes. Uma alíquota de
4uL de produto amplificado e purificado foi posteriormente corrida em gel de
agarose (1,5%) para confirmar a presença do produto a 4volts/cm por 40
minutos. Os produtos purificados foram a seguir sequenciados com a
plataforma de sequenciamento automático ABI Prism 3130XL (Applied
Biosystems), de acordo com o protocolo recomendado pelos fabricantes, nos
dois sentidos.
Nested PCR
Quando a PCR utilizando o conjunto de Primers PGMY9/PGMY11 não
amplificou alguns fragmentos, seguimos para uma PCR nested utilizando outro
conjunto de primers: GP+/GP6+, que são iniciadores internos do fragmento
gerado pela PCR PGMY9/PGMY11, e o protocolo é descrito a seguir.
Primeiro foi feita a PCR PGMY9/11 novamente. Essa reação não é corrida em
gel de agarose para evitar possível contaminação com a abertura do tubo
durante a aplicação da amostra. Essa reação, após a sua conclusão é
centrifugada brevemente e diluída 50 vezes com agua molecular grade, e essa
diluição é utilizada como molde de amplificação.
Para PCR GP5+/6+: Os componentes da solução da reação são: 2,5 uL
de tampão 10x; 1,5uL de MgCl2, cujo estoque está a 50mM; 1uL de mix dNTP,
cujo estoque está a 2mM; 2,5uL de cada iniciador, cujo estoque está a 10uL; e
0,3uL de Taq platinum DNA polimerase cujo estoque está a 5U/mL e 2uL do
produto de PCR PGMY9/11 diluído (1:50). O mix final é de 20uL para cada
amostra. As ciclagens são as seguintes: 94°C Por 5 minutos, seguindo-se de
40 ciclos de 94°C por 40 segundos, 40°C por 20 segundos e 72°C por 40
segundos; e por fim 72°C por 3 minutos. As amostras são posteriormente
conservadas a -20°C. O produto gerado é de aproximadamente 110pb.
Após a reação de Nested-PCR são seguidos os mesmos passos de
verificação do produto por gel sendo aplicados simultaneamente em poços
separados 4 uL da reação com PGMY e da reação com GP5/6+. A seguir os
produtos de PCR são purificados e sequenciados nos dois sentidos com os
respectivos primers.
Purificação de DNA a partir de tecidos
Primeiramente deve-se extrair a amostra do tecido ou remove-la do
deposíto. Determinar a quantidade de tecido. Cortar 25mg de tecido em
pedaços pequenos. Colocar em microtubo de 1,5 ml e adicionar 180 ul de
tampão de ATL. Paosteriormente, Adicionar 20 ul de proteinase K, vortexar por
15s e incubar overnight a 56°C em banho de água com agitação ou em
termobloco com agitação até que o tecido seja completamente lisado. Depois
de lisado, dar Short spin no microtubo para remover gotas do interior da tampa.
Adicionar 200ul de tampão AL, vortexar por 15s e incubar a 70°C por 10 min.
Após a incubação, dar short spin no microtubo para remover gotas do interior
da tampa. Adicionar 200ul de etanol (96-100%), vortexar por 15s. Short spin
no microtubo para remover gotas do interior da tampa. Aplicar a mistura
(excluindo o precipitado), cuidadosamente, à coluna de spin em tubo coletor de
2ml limpo. Fechar a tampa e centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Colocar a
coluna em tubo coletor de 2 ml limpo e descartar o tubo coletor contendo o
filtrado. Abrir cuidadosamente a coluna e adicionar 500 ul de tampão AW1 sem
molhar a borda do tubo.
Fechar a tampa e centrifugar a 8000 rpm por 1
minuto. Colocar a coluna em tubo coletor de 2 ml limpo e descartar o tubo
coletor contendo o filtrado. Abrir cuidadosamente a coluna e adicionar 500ul de
tampão AW2 sem molhar a borda do tubo. Fechar a tampa e centrifugar na
velocidade máxima de 14000 rpm por 3 minutos. Colocar a coluna em tubo
novo coletor de 2 ml e descartar o tubo coletor com o filtrado. Centrifugar na
velocidade máxima 14000 rpm por 1 min. Colocar a coluna em microtubo limpo
de 1,5 ml e descartar o tubo coletor contendo o filtrado. Abrir cuidadosamente a
coluna de spin e adicionar 100 ul do tampão AE ou água destilada. Incubar à
TA por 10 min e, em seguida, centrifugar a 8000 rpm por 1 min. O Dna eluído é
estocado em microtubo de 1,5mL.
Análise de dados
Os dados epidemiológicos foram armazenados no aplicativo Epi-Info. Os
resultados para o genótipo do HPV foram planilhados utilizando-se como
variável de identificação o número de prontuário das pacientes e esse banco
será relacionado ao conjunto de dados epidemiológicos obtidos na entrevista.
O conjunto total de dados foi analisado utilizando-se o aplicativo estatístico
Stata 9.0 para obtenção do perfil sócio demográfico e a prevalência de fatores
de risco na população de estudo, a distribuição dos tipos de HPV encontrados
e o tempo médio de acesso ao tratamento a partir do exame citopatológico.
Resultados
Foram coletadas biópsias de 317 mulheres, sendo todos os dados
epidemiológicos tabulados. Com relação à faixa etária, 240 mulheres (75,7%)
apresentaram idades acima dos 39 anos. Já em relação à situação conjugal,
182 (57,41%) eram casadas ou possuíam união consensual. Grande parte da
população, 257 (81,07%) foi composta por mulheres que se autodeclaram com
a cor da pele parda/morena/mulata/mestiça e 241 (76,03%) declararam ter
escolaridade fundamental incompleta.
A maioria das mulheres (64,66%), um total de 205, relatou ter sido
submetida a mais de quatro partos, sendo que a idade destas no nascimento
do filho primogênito variou entre 16 a 20 anos em 185 mulheres (59,29%). Em
relação ao tabagismo, 168 mulheres (52,99%) relataram ser fumantes ou exfumantes. Quanto ao exame preventivo, 211 mulheres (66,56%) afirmaram ter
feito o exame, sendo que 134 delas (63,51%) não apresentavam periodicidade
na realização deste exame. Além disso, 173 mulheres (54,57%) afirmaram não
conhecer o exame Papanicolau.
Em relação aos exames requisitados, 211 mulheres (66,56%) afirmaram
que nenhum exame fora solicitado em consultas anteriores ao diagnóstico.
Dentre estes, o papanicolau, a colposcopia e a ultrassonografia não foi
solicitado para 218 (68,77%), 263 (82,97%), 294 (92,74%) das mulheres,
respectivamente. Das mulheres que relataram a solicitação de exames durante
a consulta, 43 (82,69%) relataram que o pagamento foi feito pela paciente e
não pelo SUS, das quais 61,54 % fizeram o exame fora da cidade que residem.
A maior parcela das mulheres, 304 (95,9%) mulheres realizaram biópsia
após a consulta. No entanto, apenas 98 (32,24%) foram realizadas pelo SUS.
Em relação ao estadiamento clínico, 154 (48,58) das mulheres encontravam-se
em estadio 2 da doença.
Identificação dos tipos de HPV
Das 317 biópsias coletadas, todas tiveram o DNA extraído e já foram
identificados o tipo de HPV presente (Gráfico 1). Foram identificadas: 67.08%
com HPV 16; 9,09% com HPV 18; 3,19% das mulheres com HPV 31, 33, 35 e
45. O restante somou 11,06% dos tipos de HPV (52, 59, 58, 69, 73, 51, 56, 39,
26, 11, 53,66, 67, 68, 70 e 82).
Gráfico 1. Percentual de HPV em tumores de colo uterino.
DISCUSSÃO
Carvalho et al. (2003) e Del Prete et al. (2008) encontraram a maior
prevalência de HPV nas mulheres entre 20 anos e 30 anos (45,7% e 32,6%,
respectivamente), enquanto Dunne et al. (2007) e Selors et al. (2000)
observaram as mais altas taxas na faixa etária de 20 anos a 24 anos (44,8% e
24%, respectivamente). No entanto, nosso estudo demonstrou um pico de
prevalência em mulher na faixa etária acima de 39 anos (cerca de 75,7%).
Naucler et al. (2007) consideram que a maior especificidade do teste de DNA-
HPV ocorre em mulheres com mais de 35 anos, pois embora a prevalência
tenha seu pico nas mulheres em torno de 20 anos de idade, esta infecção é
geralmente transitória neste período e o desenvolvimento carcinogênico resulta
da infecção HPV persistente com replicação viral sustentada no epitélio
escamoso, apresentando um pico de incidência do câncer cervical por volta
dos 40 anos de idade.
Vários fatores sócio-demográficos e comportamentais são classicamente
descritos como fatores de risco para o câncer de colo uterino. Diversos autores
apontam risco aumentado para lesões cervicais em mulheres com menor
escolaridade (Adam 2000; Khan 2005). Kornya et al. (2002) encontraram maior
prevalência da infecção HPV nas mulheres com menor escolaridade. Em nosso
estudo obtivemos o mesmo resultado, uma maior prevalência desta infecção
em mulheres que declararam ter ensino fundamental incompleto (76,03%).
Entretanto, Adam et al. (2000) não encontraram associação entre o nível de
educação e a infecção pelo HPV. Sendo assim, o estudo desta doença não
pode ser analisado com apenas um dado isolado, uma vez que provavelmente
há uma associação com outros fatores de risco.
Outro fator sócio-demográfico a ser analisado é a etnia. Em nosso
estudo, 81,07% das mulheres se autodeclararam com a cor da pele
parda/morena/mulata/mestiça. Shields et al. (2004) observaram aumento do
risco da infecção HPV em mulheres negras e hispânicas, atribuindo isso a uma
característica socioeconômica e não genética. O risco de desenvolvimento de
câncer cervical nessas mulheres, entretanto, é menor do que nas de etnia
caucasiana (SHIELDS, 2004).
A multiparidade, o risco de infecção pelo HPV e o desenvolvimento o
câncer do colo uterino estão intimamente relacionadas (Castellsague, 2002).
Adam et al. (2000) demonstraram que mulheres com três ou mais gestações
foram consideradas de risco para a infecção HPV. Quanto ao câncer cervical,
Castellsagué e Muñoz (2003) observaram um aumento do risco de câncer
cervical em mulheres com maior número de gestações completas após ajuste
para a idade de início da atividade sexual e o número de parceiros sexuais. A
explicação para tal resultado seria o fato de que com múltiplas gestações o
epitélio de transição do ectocérvice é mantido por muitos anos, ficando mais
exposto ao vírus (Castellsague, 2003; Muñoz, 2006).
Sendo assim, em nosso estudo; 64,66% das mulheres, um total de 205;
relatou ter tido mais de 4 gestações, sendo que 185 mulheres (59,29%) teriam
tido o primogênito entre 16 a 20 anos. Parece também haver uma relação entre
o início precoce da atividade sexual e um maior risco de aquisição da infecção
HPV, possivelmente pelo aumento do tempo de exposição ao vírus (NAUD et
al., 2006).
O tabagismo é considerado um dos mais importantes fatores de risco
para o câncer cervical (CASTELLSAGUÉ et al., 2002; BASEMAN et al., 2005;
MUÑOZ et al., 2006; CAVALCANTI et al., 2000; DEFAUX et al., 2004). De
acordo com Geller et al. (2008) isso se deve a vários mecanismos: presença de
metabólitos
carcinogênicos
do
tabaco
nas
secreções
cervicais,
imunossupressão levando à persistência viral e dano genômico à célula por
genotoxinas.
Em estudos brasileiros, Cavalcanti et al. (2000) e Naud et al. (2006)
também observaram que as mulheres fumantes apresentaram maior risco de
desenvolvimento de câncer cervical. Naud et al. observaram que uma carga
tabágica de no mínimo 100 cigarros na vida já é um forte preditor de
positividade para o HPV. Shields et al. (2004), no entanto, não verificaram
relação entre o hábito de fumar e a soropositividade para HPV. Neste trabalho,
168 mulheres (52,99%) relataram ser fumantes ou ex-fumantes, corroborando
com os estudos citados acima.
Neste estudo foi avaliado, além dos fatores de risco, a frequência do
HPV16 em mulheres submetidas a tratamento contra o câncer de colo uterino
nas redes públicas de Belém. Das 317 biópsias coletadas, foram identificadas:
67.08% com HPV 16; 9,09% com HPV 18; 3,19% das mulheres com HPV 31,
33, 35 e 45. O restante somou 11,06% dos tipos de HPV (52, 59, 58, 69, 73,
51, 56, 39, 26, 11, 53,66, 67, 68, 70 e 82). De acordo com Zampirolo et al.
(2007), a frequência do HPV 16 foi semelhante nos estados do Rio Grande do
Sul (68,6%) e em Santa Catarina (67,2%) (Dunne et al., 2007).
Esta predominância foi observada entre os diferentes resultados da
citologia, dados plenamente concordantes com a literatura mundial e nacional
(MEIJER, 2000; ROUSSEAU, 2001; AULT, 2007; NAUCLER, 2007; DEL
PRETE, 2008). O HPV 16 é o mais comum nas pesquisas realizadas no Rio
Grande do Sul (KORNYA, 2002), Natal (CARVALHO, 2003), Rio de Janeiro
(DEL PRETE, 2008), Caxias do Sul (ROUSSEAU, 2001), Distrito Federal
(TROTTIER, 2006) e Ouro Preto (BASEMAN, 2005). Em metanálise com
amostras de mulheres apresentando citologias normais, provenientes de cinco
continentes, o HPV 16 foi detectado em 22,5% das mulheres HPV positivas. O
segundo genótipo mais comum na prevalência mundial foi o HPV 18
(SELLORS, 2000), porém com algumas variações geográficas (FRANCO,
2007).
A coinfecção HIV e HPV é um fenômeno completamente previsível,
tendo em vista que os fatores de risco para essas duas infecções são bastante
similares. Múltiplos parceiros sexuais, idade precoce para a primeira relação
sexual, sexo com homens que tiveram múltiplas parceiras, baixo nível
socioeconômico e prática sexual sem proteção, são importantes fatores de
risco comuns às duas infecções virais. Vários estudos na literatura referenciam
a forte associação existente entre a oncogênese e a progressão neoplásica
relacionada ao HPV e ao sistema imunológico (NICOL et al., 2005). Porém, em
nosso estudo não foi verificado esta similaridade. De 2 a 10 pacientes
apresentaram coinfecção, não sendo estatisticamente significativo para ser
apresentado como fator de risco.
Estudos prospectivos serão importantes para estabelecer os fatores que
determinam a incidência, a dinâmica da infecção e a persistência do HPV nas
diferentes faixas etárias a fim de que se possam adotar medidas preventivas
que contemplem adequadamente todas as fases de vida da mulher.
PRINCIPAIS PROBLEMAS E DIFICULDADES PARA A REALIZAÇÃO DAS
ATIVIDADES
Não foram encontradas dificuldades que comprometessem o transcorrer
do projeto.
PUBLICAÇÕES
Até
o
presente
momento,
não
houve
publicações
apresentações em eventos científicos com este projeto.
PARECER DO ORIENTADOR
tampouco
A aluna desenvolveu de forma satisfatória as atividades do projeto de
pesquisa.
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