IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO

 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
PRISCILLA CRISTINA MOURA VIEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO
(SNPs) NOS GENES DE REPARO XRCC1 E XRCC3 COMO
POSSÍVEIS MARCADORES DE SUSCETIBILIDADE AO CÂNCER, NA
POPULAÇÃO DE BELÉM-PA
BELÉM
2010
PRISCILLA CRISTINA MOURA VIEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO
(SNPs) NOS GENES DE REPARO XRCC1 E XRCC3 COMO
POSSÍVEIS MARCADORES DE SUSCETIBILIDADE AO CÂNCER, NA
POPULAÇÃO DE BELÉM-PA
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina da
Universidade Federal do Pará, como
requisito para obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina.
Orientador: Prof.
Rodriguès Burbano
BELÉM
2010
Dr.
Rommel
Mário
PRISCILLA CRISTINA MOURA VIEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO
(SNPs) NOS GENES DE REPARO XRCC1 E XRCC3 COMO
POSSÍVEIS MARCADORES DE SUSCETIBILIDADE AO CÂNCER, NA
POPULAÇÃO DE BELÉM-PA
Trabalho
de
Conclusão
de
Curso
apresentado à Faculdade de Biomedicina da
Universidade Federal do Pará, como
requisito para obtenção do grau de Bacharel
em Biomedicina.
Data da defesa: 17 de dezembro de 2010.
Banca Examinadora:
_____________________________________
Prof. Dr. Rommel Mario Rodrigues Burbano
ICB – UFPA (orientador)
_____________________________________
Prof. Dr. André Salim Khayat
ICB – UFPA
_____________________________________
Prof.ª Dr.ª Raquel Carvalho Montenegro
ICB – UFPA
_____________________________________
Prof. Dr. Marcelo de Oliveira Bahia
ICB – UFPA (suplente)
Dedico este trabalho a minha família!
Nada que eu diga aqui conseguirá
expressar minha imensa gratidão a vocês.
Tudo o que tenho e sou hoje, devo a
vocês, que sempre estiveram ao eu lado
me dando todo o apoio, amor e carinho,
imprescindíveis para que eu chegasse ate
aqui. E por isso, dedico essa conquista a
vocês! AMO VOCÊS DEMAIS DA
CONTAAA!
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu maior e inseparável companheiro, que sempre meu deu forças para
vencer todos os obstáculos e etapas de minha vida.
Em especial minha querida e amada mãe Jocinete, por ter dedicado sua vida todos
esses anos a cuidar de mim. Obrigada pelo sacrifício, pela paciência, pelo colo,
pelos mimos, pelo seu imenso amor e por ser minha melhor amiga. Se hoje eu estou
aqui foi porque você sempre esteve ao meu lado em todos os momentos e
dificuldades. Sem você eu não estaria aqui para realizar este trabalho e você sabe
disso. Obrigada por salvar minha vida! Eu nunca esquecerei toda a garra que você
teve para possibilitar que eu chegasse até aqui. Eu tenho imenso orgulho de ter uma
mãe como você! TE AMO INCONDICIONALMEMTE!!!
Ao meu Pai amado Rodolfo, que mesmo distante, sei que sempre torce por mim e
pela minha felicidade. TE AMO DEMAIS!
Ao Marcos, por sempre acreditar em mim, por todo seu amor e afeto e pelos
momentos e atitudes em que se demostrou e demonstra ser um verdadeiro PAI pra
mim. Você foi um verdadeiro anjo que caiu em nossas vidas. Obrigada por tudo.
AMO VOCÊ!
A minha irmã Patricia (Paty), pelo se amor, pela paciência que tem comigo e por
sempre estar ao meu lado e querer meu bem. AMO MUITO VOCÊ!
A minha vó Garcinete, por sempre torcer por mim, pela preocupação, carinho e
amor, por suas orações que sempre me deram forças e me ajudaram a seguir em
frente.
As minhas queridas amigas do “G7” (Taíssa, Lúcia, Débora, Tana, Juliana e Ivy) por
todos os momentos que passamos juntas no decorrer destes quatro anos de curso,
obrigada pelas risadas, pelo colo, pelas conversas, enfim, obrigada pela alegria e
felicidade que a amizade de vocês me proporciona. (Obrigada Tata por ser minha
“anja”, literalmente!!!) AMO VOCÊS!!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Rommel Burbano, pela oportunidade que me deu em
ingressar no mundo da pesquisa, pelo apoio, paciência, e pela confiança depositada
em mim. Muito obrigada!
A todos os amigos do Laboratório de Citogenética Humana, pelos momentos de
descontração e pela boa convivência e pelas ótimas viagens. Em especial a Tati
pela amizade, pelos bons momentos, pelo apoio, pelos ensinamentos, por sempre
estar ao meu lado e disposta a me ajudar. Obrigada Tati por tudo!!!
Ao pessoal do laboratório de genética humana e médica (LGHM) por me receberem
tão bem, pela boa convencia nesse tempo em que passei por lá. Quero agradecer
principalmente a Deyse e a Paty por terem me ajudado com as técnicas, muito
obrigada mesmo meninas, de coração! Ao Ney Santos, meu co-orientador (rsrs), que
me ajudou em todos os sentidos nesse trabalho, sempre disposto a esclarecer
minhas dúvidas e a me ajudar, muito obrigada mesmo Ney!
A todos os meus amigos fora do âmbito do laboratório e da universidade, uns
próximos, outros mais distantes, mas que nunca deixaram de me apoiar e torcer por
mim. Obrigada!
Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. André Salim Khayat, Prof.ª Drª
Raquel Carvalho Montenegro e Prof. Dr. Marcelo de Oliveira Bahia, por aceitarem
meu convite e assim, garantirem críticas e sugestões preciosas para a finalização
desse trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Enfim, a todas as pessoas que, direta ou indiretamente, me ajudaram em alguma
etapa deste trabalho e da minha vida. MUITO OBRIGADA!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
i
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ii
RESUMO
iv
1 INTRODUÇÃO
1
1.1 CÂNCER: ASPECTOS GERAIS E FATORES DE RISCO
1
1.2 GENES ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE CARCINOGENESE
4
1.3 POLIMORFISMOS DE GENES DE REPARO DO DNA
5
1.4 GENE XRCC1
8
1.5 GENE XRCC3
11
2 JUSTIFICATIVA
14
3 OBJETIVOS
15
3.1 OBJETIVO GERAL
15
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
15
4 MATERIAL E MÉTODOS
16
4.1 AMOSTRAS ESTUDADAS
16
4.2 EXTRAÇÃO DE DNA
16
4.3 QUANTIFICACAO
16
4.4 ANÁLISE MOLECULAR DOS SNPs
16
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
17
5 RESULTADOS
18
6 DISCUSSÃO
21
7 CONCLUSÃO
26
8 PERSPECTIVAS
26
9 REFERENCIAS
28
i
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes estimados para o ano de 2010,
exceto pele não-melanoma, na população brasileira.
2
Figura 2: Proporção estimada de casos de câncer que podem ser prevenidos
alterando nove fatores de risco.
3
Figura 3: Mecanismo de reparo por excisão de bases (BER) (Snustad &
Simmons, 2008).
7
Figura 4: Mecanismo de reparo recombinacional homólogo.
7
Figura 5: Localização cromossômica do gene XRCC1.
8
Figura 6: Domínios da proteína XRCC1 e suas interações com outras
proteínas. NTD: domínio N-terminal; NLS: sinal de localização nuclear; Poli β:
DNA polimerase β; PNK: polinucleotídeo quinase; Lig3α: DNA ligase 3α.
9
Figura 7: Localização cromossômica do gene XRCC3.
11
Tabela 1 Características clínicas dos indivíduos casos e controles.
18
Tabela 2 Associação entre as variações dos SNPs Arg194Trp/XRCC1 e
Thr241Met/XRCC3 e a susceptibilidade ao câncer.
19
ii
LISTA DE ABREVIATRURAS E SIGLAS
A
Adenina
AP
Apurínico/apirimidínico
APE
AP-endonuclease
Arg
Arginina
BER
Base excision repair (reparo por excisão de bases)
C
Citosina
DNA
Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico)
DSB
Double-Strand Break (quebra de dupla fita)
FRET
Transferência de energia por ressonância de fluorescência
G
Guanina
Gln
Glutamina
His
Histidina
HR
Recombinação homóloga
IARC
International Agency for Research on Cancer
INCA
Instituto Nacional de Câncer
Met
Metionina
OMS
Organização Mundial da Saúde
PCR
Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da
polimerase)
Espécies Reativas de Oxigênio
ROS
SNPs
T
Single Nucleotide Polymorphisms (polimorfismo de
nucleotídeo único)
Timina
Thr
Treonina
Trp
Triptofano
TSG
Genes Supressores de Tumor
UV
Ultravioleta
WHO
World Health Organization
XRCC
X-Ray Repair Cross Complementing
XRCC1
X-Ray Repair Cross Complementing group 1
XRCC3
X-Ray Repair Cross Complementing group 3
X2
Qui quadrado
iv
RESUMO
O câncer é considerado uma doença genética, onde a identificação e caracterização
dos genes envolvidos na sua origem e progressão são de fundamental importância
para a compreensão das bases moleculares da doença. A integridade do genoma é
mantida por mecanismos capazes de reconhecer e reparar danos na molécula de
DNA, falhas nesses mecanismos podem resultar no aumento da taxa de
desenvolvimento de câncer. Dada a complexidade da atuação das proteínas
codificadas pelos genes XRCC1 e XRCC3 no sistema de reparo do DNA, é de
fundamental importância avaliar os efeitos funcionais dos polimorfismos moleculares
destes genes e suas consequências na suscetibilidade ao câncer. Assim, este
trabalho visa identificar possíveis associações entre os polimorfismos de nucleotídeo
único (SNPs) Arg194Trp/XRCC1 e Thr241Met/XRCC3 com o desenvolvimento de
diferentes tipos de câncer na cidade de Belém-PA, em um estudo caso-controle. A
análise molecular dos SNPs foi realizada pela técnica de PCR em tempo real através do
sistema TaqMan®. Em relação ao polimorfismo Arg194Trp não foram observadas
diferenças significativas entre os genótipos dos dois grupos investigados, caso e
controle, que pudessem associar este polimorfismo com a suscetibilidade ao câncer
(P>0,05). Para o polimorfismo Thr241Met (C241T) observou-se um efeito significativo
de proteção ao câncer para os genótipos homozigoto selvagem CC (P=0,050; OR=
0,756; 95% IC 0,564-1,012) e heterozigoto CT (P=0,019; OR= 0,415; 95% IC 0,1970,874). Para o genótipo TT foi observado um efeito de aumento de risco ao câncer
(OR= 1,500; 95% IC 0,403 - 5,571) porem não significativo (P=0,543). A ausência de
significância encontrada nesse ultimo resultado, provavelmente está relacionada ao
número amostral restrito analisado. Portanto, apesar dos resultados do presente
estudo terem fornecido informações importantes com relação aos genes estudados,
é necessário que se amplie o numero amostral analisado, para assim tirar uma
conclusão final da relação dos efeitos dos SNPs investigados e a suscetibilidade ao
desenvolvimento do câncer.
1 1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER: ASPECTOS GERAIS E FATORES DE RISCO
Câncer é um termo genérico utilizado para um grupo de mais de 100
doenças que podem afetar várias partes do corpo e caracteriza-se pela proliferação
celular anormal (INCA, 2008). Esta doença é considerada uma das maiores causas
de morte no mundo e é definida como uma doença genômica, surgindo como
consequência de alterações cumulativas no material genético de células normais, as
quais sofrem transformações até se tornarem malignas (Jorde, et al., 2000) . Estas
células tendem a ser muito agressivas determinando a formação de tumores e
neoplasias malignas (WHO, 2008).
Os diferentes tipos de câncer são nomeados conforme a origem tecidual
do tumor. A proliferação incontrolada de células anormais pode afetar tecidos
contíguos e se espalhar para outros órgãos do corpo levando ao chamado processo
metastático, o qual é considerado a maior causa de morte por câncer (WHO, 2008).
Segundo relatório recente da Agência Internacional para Pesquisa em
Câncer (IARC)/OMS (World Cancer Report, 2008), o impacto global do câncer mais
que dobrou em 30 anos. No Brasil, as estimativas para 2010 apontam para a
ocorrência de 489.270 casos novos de câncer, dos quais 236.240 afetarão o gênero
masculino e 253.030 o gênero feminino. Destes, os tipos mais incidentes, à exceção
do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os de próstata (52.350), de pulmão
(17.800) e de estômago (13.820) em homens, e os de mama (49.240), de colo do
útero (18.430) e de cólon e reto (14.800), em mulheres (Figura1).
Para a região Norte do Brasil, essas estimativas apontam para ocorrência
de 19.120 novos casos, sendo os tipos de câncer mais incidentes semelhantes aos
estimados para todo o Brasil, com exceção ao câncer gástrico, que aparece como o
segundo mais incidente em homens, com 860 casos, depois do de próstata (1.960),
e como terceiro mais incidente em mulheres com 440 casos, depois do de mama
com 1.350 casos (INCA, 2009).
2 Figura 1: Tipos de câncer mais incidentes estimados para o ano de 2010, exceto pele nãomelanoma, na população brasileira (INCA, 2009).
O câncer pode ser considerado uma doença genética uma vez que é
desencadeado por alterações no DNA da célula. No entanto, ao contrário das
demais doenças genéticas humanas, o câncer não é necessariamente uma doença
hereditária. Os cânceres humanos são, na sua maioria, de origem somática
resultantes da interação de fatores genéticos e ambientais (Perera, 1997; Jelonek et
al., 2010).
Muitas alterações no DNA são causadas por agentes mutagênicos
endógenos, incluindo espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como erros
originados do processo de replicação, recombinação e do próprio reparo em si.
Entretanto, diversas alterações são resultantes da interação do DNA com uma
variedade de compostos físicos, químicos e biológicos, muitos dos quais estão
presentes no ambiente, onde o homem pode permanecer em exposição contínua
(Lindahl, 2000; Jelonek et al., 2010).
Dentre os principais fatores ambientais associados à origem dos tumores
malignos estão os carcinógenos químicos e físicos, agentes infecciosos e o estilo de
vida do indivíduo. Esses fatores podem ser assim exemplificados:
a - carcinógenos químicos ambientais como os encontrados na fumaça do
cigarro e contaminantes de dieta, como a aflatoxina B1;
b - agentes físicos, como a radiação UV;
3 c - outros fatores incluem vírus e bactérias patogênicas, como
Helicobacter pylori, o vírus do papiloma humano (HPV), e os vírus das hepatites B e
C (HBV/ HCV);
d - estilos de vida que ignoram determinados fatores de risco, como o
hábito tabagista, exposição excessiva à luz solar, dieta gordurosa e o estresse.
Ao contrário disso, a ingestão alimentar de fibras, antioxidantes e a
prática de exercícios físicos podem contribuir na prevenção ao desenvolvimento de
tumores malignos (Minamoto et al., 1999). Na figura 2 é mostrado como mudanças
em alguns hábitos poderiam diminuir a incidência de câncer.
Figura 2: Proporção estimada de casos de câncer que podem ser prevenidos alterando nove fatores de risco
(Adaptado de WHO, 2008)
Entre os fatores endógenos que influenciam na carcinogênese, podem ser
citadas as variações individuais nos mecanismos de defesa que incluem o sistema
de reparo do DNA e o sistema de detoxificação e eliminação de carcinógenos
(Minamoto et al., 1999).
Mutações e polimorfismos são duas alterações genéticas frequentes. As
mutações são representadas pela substituição de bases, alterações na organização
ou no tamanho das sequências, incorporação do DNA extracromossômico e
alterações anafásicas ou da citocinese. Essas alterações estão associadas à
frequência de alelos heterozigotos presentes em menos de 1% da população
(Brasileiro-filho et al., 1998). Os polimorfismos genéticos são variações na sequência
de DNA que podem provocar alterações no produto proteico do gene e parecem
4 estar associados a apenas uma base. A frequência de alelos heterozigotos para o
polimorfismo genético ocorre em mais de 1% da população. Algumas dessas
alterações ocorrerão em sequências não codificadoras do gene, que na maioria dos
casos não terão efeito em suas funções; outras ocorrerão em sequências
codificadoras, levando à produção de proteínas defeituosas. Deste modo, em alguns
casos polimorfismos genéticos podem aumentar a suscetibilidade ao câncer (Lodish
et al., 2002).
Os polimorfismos de nucleotídeo único - SNPs (do inglês Single
Nucleotide Polymorphism), são os mais abundantes, estáveis e amplamente
distribuídos pelo genoma (Iida et al., 2001).
1.2 GENES ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE CARCINOGENESE
Sendo o câncer uma doença genética, a identificação e caracterização
dos genes envolvidos na sua origem e progressão são de fundamental importância
para a compreensão das bases moleculares da doença (Parmigiani e Camargo,
2004).
A carcinogênese resulta de múltiplas etapas e pode envolver dezenas, até
centenas, de genes, por meio de mutações gênicas, quebras e perdas
cromossômicas, amplificações gênicas, instabilidade genômica e mecanismos
epigenéticos, sendo os principais grupos de genes envolvidos nesse processo:
proto-oncogenes, genes supressores de tumor e genes relacionados ao reparo do
DNA (Rocha e Silva, 2003).
Trabalhos publicados na última década revelaram mutações em muitos
genes responsáveis pela progressão de vários tipos de câncer. Dentre essas, estão
inclusas mutações de ativação de alguns proto-oncogenes, mutações de inativação
de genes supressores de tumor, e alterações na instabilidade de outros genes
(Berger & Garraway, 2009).
Os proto-oncogenes são genes celulares normais que atuam no controle
positivo, ou seja, estimulam o crescimento e a diferenciação celular (Irish &
Bernstein, 1993). Podem tornar-se oncogenes por meio de mutações resultantes da
exposição aos agentes carcinogênicos físicos, químicos ou biológicos. A ativação
destes genes ocorre por meio de translocações, amplificações gênicas ou mutações
de ponto, de maneira que alterações em um único alelo são suficientes para
5 transformá-los em oncogenes e contribuir na transformação maligna. Como
consequência dessas alterações, a expressão dos oncogenes leva a uma
proliferação celular anormal, resultando na formação do tumor (Cooper, 1994).
Os genes supressores de tumor (TSG) compõem a outra classe de genes
relacionada ao câncer, e atuam como reguladores negativos, retardando a
proliferação celular (Verma & Triantafillou, 1998). Estes supressores codificam
proteínas reguladoras dos checkpoints celulares e inibem a progressão do ciclo
celular, caso o DNA esteja danificado. Nesta classe de genes, estão inclusas as
proteínas promotoras de apoptose e as que estão envolvidas no reparo de danos ao
DNA (Weinberg, 1991).
Sendo assim, alterações inativadoras em genes supressores de tumor
liberariam a célula da inibição imposta por estes genes, levando à proliferação
desordenada, característica das células cancerosas (Weinberg, 1991).
Como se pode perceber, a identificação dos genes envolvidos no câncer
proporciona uma melhor compreensão acerca da doença, bem como contribui para
novas formas de diagnosticá-lo precocemente, facilitando assim o seu tratamento
(Garnis et al., 2004).
1.3 POLIMORFISMOS DE GENES DE REPARO DO DNA
A integridade do genoma é mantida por mecanismos capazes de
reconhecer e reparar danos na molécula de DNA. Estes mecanismos são
constituídos por complexos enzimáticos que monitoram os cromossomos corrigindo
nucleotídeos danificados (Wood et al., 2005). Falhas nesses mecanismos podem
resultar no aumento da taxa de desenvolvimento de câncer. Está cada vez mais
claro que deficiências nos processos de sinalização de danos do DNA e nas vias de
reparo dos mesmos, são fundamentais para a etiologia da maioria, se não de todos,
os cânceres humanos (Goode et al., 2002; Khanna & Jackson, 2001).
Os polimorfismos em genes de reparo do DNA são eventos comuns, e
alguns estudos mostraram o efeito significativo de muitos desses polimorfismos na
capacidade de reparar danos no DNA, influenciando assim na suscetibilidade do
individuo à carcinogênese (Pachkowski et al., 2006; Mandal et al., 2010).
Esses polimorfismos podem afetar a função da proteína, a atividade do
promotor, a estabilidade do mRNA, entre outras variantes, podendo resultar na
6 inabilidade celular de responder aos danos do DNA, o que pode contribuir para o
aumento da susceptibilidade a vários tipos de cânceres (Webb et al., 2005; Hung, et
al., 2005; Seedhouse et al., 2004; Goode et al., 2002).
Os sistemas de reparo exercem um papel essencial na proteção do
genoma contra danos causados por agentes carcinogênicos. Atualmente, sabe-se
que mais de uma centena de proteínas envolvidas em mecanismos de reparo estão
presentes nas células humanas (Lopez- Cima et al., 2007).
Em células de mamíferos, as quebras de fita simples são reparadas
predominantemente pelo reparo por excisão de base (BER) (Figura 3) (Cline &
Hanawalt, 2003). As quebras de fita dupla (DSBs) são reparadas, principalmente,
por duas vias distintas de reparo: reparo por recombinação homóloga (HR) (Figura
4) e reparo não-homólogo (West, 2003). As DSBs representam as lesões mais
prejudiciais, uma vez que acarretam em morte celular ou perda de material genético
(Costa et al., 2007). As células respondem a tais quebras induzindo a parada do
ciclo celular, seguido do reparo do DNA e/ou morte celular por apoptose (Christmann
et al., 2003; Rafii et al., 2003).
7 Figura 3: Mecanismo de reparo por excisão de bases (BER) (Snustad & Simmons, 2008).
Figura 4: Mecanismo de reparo recombinacional homólogo (Modificado de Christmann et al., 2003).
8 A variação no reparo do DNA observada na população pode ser
decorrente dos polimorfismos de nucleotídeos simples (SNPs) que, frequentemente,
têm sido detectados em genes envolvidos nas vias de reparo tanto do BER quanto
do HR, contribuindo, dessa forma, para a suscetibilidade ao câncer (Thyagarajan et
al., 2006).
Os genes “X-Ray Repair Cross Complementing” (XRCC) são importantes
componentes de várias vias do reparo do DNA e contribuem para a estabilidade
genômica (Thacker & Zdzienicka, 2003).
1.4 GENE XRCC1
O gene XRCC1 humano (do inglês X-ray repair cross-complementing
group 1) está localizado no cromossomo 19q13.2, é composto de 17 éxons e
codifica a proteína nuclear XRCC1, que é composta de 633 aminoácidos (Figura 5)
(Hung et al., 2005).
Figura 5: Localização cromossômica do gene XRCC1. Fonte: NCBI Map Viewer adaptado.
9 A proteína XRCC1 está envolvida no BER (Thompson et al., 1989). O
BER é responsável por identificar e remover danos no DNA, como bases oxidadas,
desaminadas ou alquiladas, surgidos espontaneamente na célula ou da exposição a
agentes exógenos como as radiações ionizantes e a luz UV (Christmann et al.,
2003).
No BER, a lesão é removida por uma enzima DNA glicosilase específica,
criando um sítio abásico - AP (sítio apúrico ou apirimídico), e a ligação
remanescente 5’ fosfodiéster é quebrada pela ação de endonucleases (APE); logo
após a DNA polimerase-β (com ajuda de outras proteínas incluindo XRCC1)
adiciona um novo nucleotídeo à extremidade 3’-OH e excisa a base e o resíduo de
fosfato livres; finalmente, o complexo DNA ligase IIIα/XRCC1 sela a nova ligação
(Figura 3) (Brem & Hall, 2005).
Aparentemente, a proteína XRCC1 não desempenha uma função
enzimática, porém atua como proteína suporte, ligando-se e interagindo com várias
outras enzimas participantes do BER, como a DNA ligase III, a DNA polimerase β e
a APE, e parece contribuir para a eficiência do processo, bem como para a
estabilidade genômica após a ocorrência da lesão (Saadat e Ansari-Lari, 2008;
Smith et al., 2008; Brem e Hall, 2005). Essa proteína apresenta três domínios
funcionais: um domínio de ligação a DNA N-terminal (ligação específica com
quebras de fita simples de DNA) e os domínios BRCT-I central e BRCT- II Cterminal
(Horton et al., 2008). A Figura 6 indica os domínios funcionais da XRCC1 e as
regiões de interações com outras proteínas.
Figura 6: Domínios da proteína XRCC1 e suas interações com outras proteínas. NTD: domínio Nterminal; NLS: sinal de localização nuclear; Pol β: DNA polimerase β; PNK: polinucleotídeo quinase;
Lig3α: DNA ligase 3α (Caldecott, 2003).
10 Desta forma, a proteína XRCC1 atua como facilitadora e coordenadora do
processo de reparo por excisão de base, sendo imprescindível na formação do
complexo com as demais proteínas (Caldecott, 2003; Jelonek, 2010). Sugere-se que
polimorfismos no gene XRCC1, que causam mudanças de aminoácidos, possam
impedir
a
interação
de
XRCC1
com
outras
proteínas
enzimáticas
e
consequentemente alterar a atividade do sistema de reparo de DNA por BER
(Saadat; Ansari-Lari, 2008).
Encontram-se amplamente descritos três SNPs para o gene XRCC1 que
resultam em alterações de aminoácidos: o primeiro, uma transição de C por T no
códon 194 do éxon 6 resulta em substituição de um resíduo de Arginina por um de
Triptofano (Arg194Trp – rs1799782), o segundo é uma transição de G por A no
códon 280 do éxon 9 que resulta em substituição de um resíduo de Arginina por um
de Histidina (Arg280His – rs25489) e o terceiro, uma transição de G por A no códon
399 do éxon 10, resulta em substituição de um resíduo de Arginina por um de
Glutamina (Arg399Gln, rs25487). Os polimorfismos Arg194Trp e Arg399Gln são os
mais frequentemente observados (Saadat e Ansari-Lari, 2008; Wang et al., 2008;
Chacko et al., 2005; Shen et al., 2005).
O SNP Arg194Trp (C194T) ocorre na posição 26304, referente ao exon 6,
do gene XRCC1 resultando em alteração do produto proteico no códon 194. Esse
códon se encontra na região intermediária que separa o domínio de ligação da DNA
polimerase β do domínio de ligação da PARP (domínio BRCT-I), sendo esta região
parte do sítio de interação com a endonuclease APE1. A habilidade da XRCC1 em
interagir com a APE1 pode estar alterada na presença do polimorfismo, o que pode
influenciar na eficiência do reparo por via BER (Mateuca et al., 2005). A presença
simultânea desse polimorfismo e de outro no gene da APE1 aumenta o risco para o
desenvolvimento de câncer pancreático (Jiao et al., 2006).
A presença do alelo variante 194T no gene XRCC1 está associada a
diversas doenças malignas. Os genótipos variantes (194CT e TT) estão associados
com risco aumentado em mais de cinco vezes ao desenvolvimento de leucemia
linfoblástica aguda em crianças do sexo feminino (Batar et al., 2008). Associações
do alelo 194T também foram observadas com o risco de câncer colo-retal (AbdelRahman et al., 2000), carcinoma de nasofaringe (Yang et al., 2007) câncer oral
(Ramachandran et al., 2006) e carcinoma de tireoide (Chiang et al., 2008).
11 Ao mesmo tempo, esse alelo variante (194T) também foi indicado como
um fator de proteção para diversos cânceres, como linfoma de Burkitt (Celkan et al.,
2008) e linfoma não-Hodgkin (Shen et al., 2007).
Dados contraditórios nos estudos de associação podem ser resultados de
diversos fatores como etnicidade, diferentes padrões de exposição a carcinógenos,
combinações de variantes de susceptibilidade ou o número de pacientes (Batar et
al., 2008).
1.5 GENE XRCC3
O gene XRCC3 (do inglês X-ray repair cross-complementing group 3) está
mapeado ao cromossomo humano em 14q32.3 (Figura 7). Apresenta sete éxons e
codifica a proteína XRCC3, de 346 aminoácidos, participante do reparo por HR de
quebras de fita dupla de DNA, interagindo com RAD-51, mantendo a estabilidade
cromossômica e reparando o dano no DNA (Tebbs et al., 1995; Millikan et al., 2005;
Karran, 2000).
Figura 7: Localização cromossômica do gene XRCC3. Fonte: NCBI Map Viewer adaptado.
12 O sistema de reparo por HR preserva a integridade cromossômica
durante a replicação do DNA contribuindo para a remoção de DBSs (Yamada et al.,
2004). Polimorfismos em genes dessa via tem sido associados com o risco de
câncer (Krupa et al., 2010).
Durante o reparo por HR, a molécula de DNA danificada estabelece uma
sinapse ou pareamento com a molécula de DNA intacta, compartilha a extensiva
homologia da sequência, e assim recupera a informação genética (Jackson, 2002).
O reparo por HR envolve a reação entre três moléculas de DNA: duas
extremidades de fita de DNA e um DNA molde (Figura 4). A recombinação homóloga
é mediada pelo grupo de proteínas RAD52, que inclui a RAD50, RAD51 e RAD54 e
MRE11(van Gent; Hoeijmakers; Kanaar, 2001).
A proteína ATM medeia a resposta celular inicial a quebras de fita dupla
juntamente com a NBS1. O segundo passo do reparo inclui o reconhecimento das
extremidades de DNA pela RAD52 e processamento nucleolítico destas com a
formação de fitas simples nessas extremidades. A proteína RAD51 se liga a essas
fitas simples (formação de um filamento nucleoprotéico), mediando a busca pelo
DNA homólogo de fita dupla e a formação da junção de moléculas entre as
extremidades do DNA lesionado e o molde de reparo. Os seguintes estágios
referem-se à polimerização dos nucleotídeos pela DNA polimerase para a
restauração das fitas de DNA degradadas a partir da fita molde, dispersão dos
intermediários do reparo e liberação das moléculas de DNA (van Gent; Hoeijmakers;
Kanaar, 2001).
Entre as proteínas que auxiliam a RAD51 em vários estágios do reparo
por recombinação homóloga, está a proteína XRCC3. Esta, juntamente com outras,
tem uma participação importante na manutenção da estabilidade cromossômica.
Células em que o gene XRCC3 está mutado apresentam níveis reduzidos em até 25
vezes de reparo por recombinação homóloga (Pierce et al., 1999) e altos níveis de
aberrações cromossômicas e segregação cromossomal anormal na mitose (Griffin et
al., 2000).
A proteína XRCC3 parece atuar na fase inicial da recombinação
homóloga na qual procura por homologia a molécula não danificada e invade a
cadeia para a síntese de DNA (Bishop et al., 1998), podendo participar também dos
últimos eventos de recombinação, auxiliando a estabilização do complexo de
nucleoproteínas e a formação de DNA heteroduplex (Brenneman et al., 2002).
13 Um grande número de estudos moleculares e epidemiológicos já foram
realizados para avaliar o papel dos polimorfismos no gene XRCC3 em várias
neoplasias. A transição de C para T no éxon 7 (C18067T, rs861539) é o
polimorfismo mais intensamente investigado em vista da substituição de treonina
para metionina na posição 241 (Thr241Met) (Han et al., 2006 ; Krupa et al., 2010).
Vários estudos têm relacionado esta variante com alguns tipos de câncer,
como o de mama (Smith et al., 2003; Synowiec et al., 2008), de pulmão (Jacobsen et
al., 2004; Manuguerra et al., 2006) o melanoma (Winsey et al., 2000), coloretal
(Krupa & Blasiak, 2004), de bexiga (Andrew et al., 2008) e carcinoma de células
escamosas de cabeça e pescoço (Werbrouck et al., 2008).
Em um estudo de associação entre polimorfismos de genes de reparo de
DNA e o desenvolvimento de melanoma maligno, Winsey et al. (2000) verificaram
que a presença do alelo variante T está significantemente associada ao
desenvolvimento do melanoma, com um risco relativo de mais de 2 vezes,
comparativamente aos indivíduos que não apresentam esse alelo. Esse mesmo
alelo T também se mostrou associado a um risco relativamente maior ao câncer de
pulmão com um risco relativo de 1,54 para heterozigotos e de 1,46 para
homozigotos (Jacobsen et al., 2004).
Indivíduos homozigotos para a metionina (alelo T) também apresentaram
um risco aumentado para o desenvolvimento de câncer de mama comparativamente
aos homozigotos para a treonina (alelo C) (Kuschel et al., 2002). A avaliação da
combinação de genótipos em vários genes de reparo de quebra de fita dupla,
incluindo a mudança Thr241Met no XRCC3, indicou que mulheres com duas a
quatro variações nesses genes apresentaram associação positiva entre um aumento
da exposição à radiação de baixa dose e o risco ao câncer de mama (Millikan et al.,
2005).
Andrew et al. (2008) verificaram uma associação entre o genótipo
homozigoto variante 241Met/Met (TT) e o risco de câncer de bexiga aumentado em
quase duas vezes em fumantes, comparativamente ao genótipo selvagem
241Thr/Thr (CC). Uma associação positiva entre esse polimorfismo e o carcinoma de
células escamosas de cabeça e pescoço foi encontrada, indicando um risco relativo
de 1,96 vezes (Werbrouck et al., 2008).
Apesar dos resultados que comprovam a associação desse polimorfismo
com o risco de desenvolvimento de neoplasias, existem também trabalhos que
14 supõem que o polimorfismo C241T não desempenharia um papel fundamental na
etiologia de alguns tipos de câncer. Os genótipos variantes CT e TT,
comparativamente com o genótipo CC, não se apresentaram associados a um risco
aumentado para o câncer gástrico. É muito provável que várias variantes ou
polimorfismos de susceptibilidade comuns em genes de reparo, e não somente um,
possam contribuir conjuntamente para a susceptibilidade ao câncer gástrico, assim
como para outras neoplasias (Shen et al., 2004).
2. JUSTIFICATIVA
Apesar de grandes avanços terem sido realizados nos últimos anos, a luta
contra o câncer permanece, havendo ainda a necessidade de maior conhecimento
sobre sua etiologia e seus fatores de risco. Portanto, torna-se essencial a criação e o
aprimoramento de ferramentas de estudo que auxiliem no desenvolvimento dessas
áreas.
Sendo assim, a utilização de marcadores genéticos como os SNPs,
merecem atenção como possíveis ferramentas para diagnóstico, prognóstico e
detecção de fatores de risco do câncer, por fornecerem informações de maior poder
resolutivo e precisão, podendo auxiliar na melhoria da qualidade de vida de
pacientes com câncer, além de contribuírem para o entendimento do caráter
multifatorial da doença.
Dada a complexidade da atuação das proteínas codificadas pelos genes
XRCC1 e XRCC3 no sistema de reparo do DNA, é de fundamental importância
avaliar os efeitos funcionais dos polimorfismos moleculares destes genes e suas
consequências na suscetibilidade ao câncer.
15 3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Identificar possíveis associações entre os polimorfismos de nucleotídeo
único (SNPs) C26304T e C18067T, nos genes de reparo XRCC1 e XRCC3,
respectivamente, com o desenvolvimento de diferentes tipos de câncer em dois
grupos: pacientes portadores desta doença (casos) e um grupo de indivíduos sadios
(controles), na população de Belém-PA.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
™ Estimar a frequência dos SNPs C26304T no gene XRCC1 e C18067T
no gene XRCC3, na amostra de pacientes com câncer e em indivíduos sadios
(controles);
™ Identificar possíveis associações entre os polimorfismos analisados e o
risco de desenvolvimento do câncer, através de análises estatísticas apropriadas.
™ Auxiliar a criação de um painel de marcadores genéticos que poderão
ser utilizados como ferramenta de auxílio para a determinação do risco e diagnóstico
do câncer, podendo auxiliar na melhoria da qualidade de vida dos pacientes, além
de contribuir para o melhor entendimento do caráter multifatorial da doença.
.
16 4 MATERIAL E METODOS
4.1 AMOSTRAS ESTUDADAS
Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 83 pacientes com
diagnóstico clínico de diversos tipos de câncer, sendo 31 indivíduos portadores de
câncer de mama (46,3% dos pacientes), 33 (49,3% dos pacientes) pacientes com
câncer gástrico e 3 (4,5% dos pacientes) portadores de outros tipos de câncer
(leucemia, adenoma viloso e coriocarcinoma). Foram utilizadas como controle, 90
amostras de indivíduos representativos da população investigada. Tanto as
amostras de pacientes quanto de indivíduos controles, pertencem ao banco do
Laboratório de Citogenética Humana da Universidade Federal do Pará (UFPA) que
contam com aprovação do Comitê de ética dos diferentes Hospitais de onde foram
coletadas.
4.2 EXTRAÇÃO DE DNA
O DNA foi extraído a partir de sangue total pelo método convencional com
fenol-clorofórmio e precipitação com etanol, conforme descrito por Sambrook et al.
(1989).
4.3 QUANTIFICACÃO DO DNA
A
determinação
da
concentração
do
DNA
foi
realizada
em
espectrofotômetro GeneQuant RNA/DNA (Pharmacia Biotech).
4.4 ANÁLISE MOLECULAR DOS SNPs
A análise molecular dos SNPs estudados foi realizada utilizando técnica
PCR em tempo real através do sistema TaqMan® (Applied Biosystems®, Foster City,
Califórnia, EUA). O sistema TaqMan utiliza uma sonda fluorescente para possibilitar
a detecção de um produto específico da PCR conforme esse se acumula durante os
ciclos da reação. O processo é dividido em quatro etapas, primeiramente uma sonda
(oligonucleotídeo) é construída contendo um corante reporter fluorescente na
17 extremidade 5´ e um fluorocromo quencher (silenciador) na extremidade 3´.
Enquanto a sonda está intacta, a proximidade do quencher reduz bastante a
fluorescência emitida pelo corante reporter através da transferência de energia por
ressonância de fluorescência (FRET) através do espaço, posteriormente se a
sequência alvo estiver presente, a sonda se anela logo após um dos primers e é
clivada através da atividade da nuclease 5´ da Taq DNA polimerase enquanto o
primer é estendido. A clivagem da sonda separa o fluorocromo reporter do corante
quencher, aumentando o sinal do fluorocromo repórter e agindo na remoção da
sonda da fita alvo, permitindo que a extensão do primer continue até o final da fita
molde. Assim, a inclusão da sonda não inibe o processo geral da PCR. E finalmente,
moléculas adicionais do corante reporter são clivadas de suas respectivas sondas
em cada ciclo, resultando em um aumento na intensidade de fluorescência, que é
proporcional à quantidade de amplicon produzido.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A frequência alélica de cada gene foi investigada por contagem gênica.
As freqüências alélicas e genotípicas foram calculadas e submetidas ao teste x2 para
verificar se estavam de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. A avaliação da
susceptibilidade foi realizada utilizando-se métodos estatísticos univariados para
verificar a ocorrência de diferenças nas frequências alélicas entre os grupos (caso e
controle), bem como por métodos multivariados para determinar se fatores de
confusão tais como Gênero, idade e tipo de câncer, os quais poderiam estar
influenciando na susceptibilidade genética dos genes XRCC1 e XRCC3 ao
desenvolvimento de neoplasias. Esses testes foram realizados utilizando-se o
pacote estatístico SPSS V.8.0.
18 5 RESULTADOS
Foram analisadas 83 amostras de pacientes portadores de diferentes
formas de neoplasias. Sendo 31 indivíduos portadores de câncer de mama (46,3%
dos pacientes), 33 (49,3% dos pacientes) pacientes com câncer gástrico e 3 (4,5%
dos pacientes) portadores de outros tipos de câncer (leucemia, adenoma viloso e
coriocarcinoma). Quanto ao grupo controle, foram analisadas 90 amostras de
indivíduos sadios da população investigada.
A
Tabela
1
apresenta
um
quadro
das
características
clínico-
epidemiológicas que podem ser considerados fatores de riscos ao desenvolvimento
de neoplasias, investigados na amostra de pacientes com diferentes formas de
câncer e indivíduos controle, entre eles: gênero, idade e tipo de câncer.
Tabela 1 Características clínico-epidemiológicas dos indivíduos casos e controles
Variável
Casos
Controle
Total
Total
Gênero
83
90
177
Masculino
19 (22%)
42 (46,7%)
61(34,5%)
Feminino
68 (78%)
48(53,3%)
116 (65,5%)
0,000
0,000
Idade
Média
P valor
68,2 ± 14
23,1 ± 5
Tipo de câncer
Gástrico
33 (49,3%)
Mama
31 (46,3%)
Outros
3 (4,5%)
Para a variável de risco gênero, observou-se um P valor significativo
(P=0,000) que diferencia os grupos com câncer e indivíduos sadios. Sendo o gênero
feminino, o mais representativo com 68 (78%) indivíduos no grupo caso e 48(53,3%)
no grupo controle, totalizando 116 (65,5%) indivíduos do gênero feminino contra
61(34,5%) do masculino (Tabela1).
19 Encontrou-se também uma diferença estatística significante (P=0,000),
para a variável de idade entre os grupos investigados. A média de idade dos
pacientes portadores de neoplasias foi de 68.2±14 anos e para os indivíduos sadios
da população investigada de 23,1±5 anos (Tabela1).
Esses
resultados
evidenciam
que
ambas
as
variáveis
são
estatisticamente diferentes entre os dois grupos estudados (considerando P≤0,05),
indicando necessidade de empregá-las como fatores de interferência nas análises
de associações entre os marcadores genéticos investigados e risco de
desenvolvimento de neoplasias.
Tabela 2 Associação entre as variações dos SNPs C194T/XRCC1 e C241T/XRCC3
e a susceptibilidade ao câncer
Genótipo
Casos [N (%)]
Controles [N (%)]
P valor
OR (95%)
CT/TT
CC
CT
TT
18 (20,7%)
65 (74,7%)
17 (19,5)
1 (1,1%)
17 (18,9%)
73 (81,1%)
15 (16,7%)
2 (2,2%)
0,764
0,305
0,619
0,580
1,120 (0,534 - 2,348)
0,688 (0,336 - 1,408)
1,214 (0,564 - 2,615)
0,512 (0,046 - 5,747)
C
T
0,89
0,11
0,89
0,11
1
C241T/XRCC3
CT/TT
CC
CT
TT
22 (32,8%)
45 (67,2%)
16 (23,9%)
6 (9%)
32 (49,2%)
33 (50,8%)
28 (43,1%)
4 (6,2%)
0,050
0,050
0,019
0,543
C
T
0,79
0,21
0,72
0,28
0,603
C194T/XRCC1
0,504 (0,249 - 1,020)
0,756 (0,564 – 1,012)
0,415 (0,197 -0,874)
1,500 (0,403 - 5,571)
20 A Tabela 2 apresenta a distribuição genotípica e alélica para os SNPs
C194T e C241T dos genes XRCC1 e XRCC3 respectivamente, nos pacientes com
câncer (casos), e indivíduos sadios (controles).
As freqüências genotípicas e alélicas encontram-se em equilíbrio de HardyWeinberg (P >0,05 )
Em relação ao polimorfismo XRCC1/C194T não foram observadas
diferenças significativas entre os genótipos dos dois grupos investigados, caso e
controle, que pudessem associar este polimorfismo com a susceptibilidade ao
câncer (P>0,05).
Os resultados para o SNP XRCC3/C241, revelaram que esse
polimorfismo possui relação significativa para susceptibilidade ao câncer (P<0,05).
Os dados apresentados na tabela 2 demonstram um efeito significativo de
proteção ao câncer para o genótipo homozigoto selvagem CC (P=0,050; OR= 0,756;
95% IC 0,564-1,012). Da mesma maneira, observou-se um efeito significativo de
proteção para o genótipo heterozigoto CT (P=0,019; OR= 0,415; 95% IC 0,1970,874) e para combinação deste, com do homozigoto mutante TT (CT/TT) (P=0,050;
OR= 0,504; 95% IC 0,249-1,020), evidenciando a relação de proteção positiva
desses genótipos com o mecanismo neoplásico.
Contudo os resultados para o genótipo homozigoto mutante (TT) não
foram significativos (P=0,543), porém demonstraram uma tendência de risco para
ínvidos portadores deste genótipo (OR= 1,500; 95% IC 0,403 - 5,571).
Através da análise desses resultados, pode-se sugerir que a incorporação
do alelo C (selvagem) ao genótipo confere um efeito de proteção ao
desenvolvimento de câncer, já que para os genótipos CC e CT foi encontrado um
efeito de proteção e em contraste, um efeito de risco para o genótipo TT, que reforça
esta hipótese.
Em relação à análise das frequências alélicas, não foram encontradas
diferenças significativas entre pacientes com câncer e indivíduos sadios, para ambos
os genes XRCC1 (P=1) e XRCC3 (P=0,603).
21 6 DISCUSSÃO
A integridade do genoma é mantida por mecanismos capazes de
reconhecer e reparar danos na molécula de DNA. Estes mecanismos são
constituídos por complexos enzimáticos que monitoram os cromossomos corrigindo
nucleotídeos danificados (Wood et al., 2005). Falhas nesses mecanismos podem
resultar no aumento da taxa de desenvolvimento de câncer. Está cada vez mais
claro que deficiências nos processos de sinalização de danos do DNA e nas vias de
reparo dos mesmos, são fundamentais para a etiologia da maioria, se não de todos,
os cânceres humanos (Goode et al., 2002; Khanna e Jackson, 2001).
Os polimorfismos em genes de reparo do DNA são eventos comuns e
alguns estudos mostraram o efeito significativo de muitos desses polimorfismos na
capacidade de reparar danos no DNA, contribuindo dessa forma para a diferença
entre indivíduos (Pachkowski et al., 2006).
Um dos objetivos deste trabalho foi estimar e analisar a frequência de
dois polimorfismos, em dois genes, XRCC1/Arg194Met e XRCC3/Thr241Met,
envolvidos no reparo do DNA, e verificar se existe relação destes, com a
suscetibilidade ao câncer.
No presente estudo, com relação às variáveis clínico – epidemiológicas,
tanto a idade quanto o gênero foram significativamente diferentes (P<0,05) entre
casos e controles. É importante destacar que ambas as variáveis foram controladas
em função de uma elevada contribuição do gênero feminino na amostragem do
grupo de indivíduos com câncer (78%) e em função desta doença possuir uma
elevada incidência em pacientes com idade avançada.
Os cânceres humanos são, na sua maioria, de origem somática
resultantes da interação de diversos fatores genéticos e ambientais (Perera, 1997).
Sendo assim, fica clara a necessidade de se ampliar o número de
variáveis clinicas nas análises desse estudo, para assim definir com maior precisão
quais variáveis podem interferir na susceptibilidade a cada tipo de câncer
investigado. É necessário incluir principalmente, variáveis de exposição a agentes
carcinógenos químicos e físicos.
Entre os fatores endógenos que influenciam na carcinogênese, podem ser
citadas as variações individuais nos mecanismos de defesa que incluem o sistema
de reparo do DNA (Minamoto et al., 1999).
22 A proteína XRCC1, codificada pelo gene de mesmo nome, está envolvida
na via de reparo por BER (Thompson et al., 1989). Esta via é responsável por
identificar e remover danos no DNA, como bases oxidadas, desaminadas ou
alquiladas, surgidos espontaneamente na célula ou da exposição aos agentes
exógenos como as radiações ionizantes e a luz UV (Christmann et al., 2003).
Sugere-se que polimorfismos no gene XRCC1, que causam mudanças de
aminoácidos, possam impedir a proteína XRCC1 de exercer sua função de forma
eficaz e consequentemente alterar a atividade do sistema de reparo de DNA por
BER (Saadat; Ansari-Lari, 2008).
O SNP Arg194Trp está entre os dois mais frequentemente observados
entre os polimorfismos para o gene XRCC1(Shen et al., 2005).
Dados da literatura relatam que a presença do alelo variante 194T está
associado a diversas doenças malignas. Os genótipos variantes CT e TT estão
associados com risco aumentado em mais de cinco vezes ao desenvolvimento de
LLA em crianças do sexo feminino (Batar et al., 2008). Vários autores também
identificaram associação desse alelo (194T) com o risco de câncer colo-retal (AbdelRahman et al., 2000), carcinoma de nasofaringe (YANG et al., 2007) câncer oral
(Ramachandran et al., 2006) e carcinoma de tireoide (Chiang et al., 2008).
Um estudo de associação entre SNPs no XRCC1 e o desenvolvimento do
carcinoma de tireoide, realizado por Chiang et al (2008), em populações de origem
asiáticas revelou risco significativamente aumentado para o genótipo TT (P = 0,018;
OR= 1,85; 95% IC 1,11-3,07).
Ao mesmo tempo, esse alelo variante (194T) também foi indicado como
um fator de proteção para diversos cânceres, como linfoma de Burkitt (Celkan et al.,
2008) e linfoma não-Hodgkin (Shen et al., 2007).
Lee et al (2002), também identificaram um efeito de proteção ao câncer
gástrico, para o genótipo combinado CT/TT, tendo CC como referência (OR=0,66 IC
95% 0,44-1,00).
Uma meta-análise realizada por Hu et al (2005) na literatura mundial,
avaliou o polimorfismo no gene XRCC1 (Arg194Trp) na suscetibilidade a diferentes
neoplasias. Nesta investigação, observou-se a existência de resultados discordantes
com relação ao polimorfismo Arg194Trp para os diferentes grupos étnicos
investigados. Foi detectado uma elevada frequência do alelo 194T para o grupo
23 étnico asiáticos (31,2% IC 95% 29,6-32,8) e baixas frequências deste alelo em
europeus (6,6%, 95% CI, 5,9-7,4) e africanos (7,3%, 95% IC 5,7-9,2, P <0,0001).
Em um estudo realizado por Santos et.al (2009) foi possível identificar na
população do Norte do Brasil um elevado grau de subestruturamento populacional
que justifica realizar o controle genômico de ancestralidade em estudos de
associação nessa população.
Com base nas evidências de que este polimorfismo apresenta diferenças
com relação aos grupos étnicos e com relação a elevada subestruturação étnicas na
população investigada pretende-se em estudos futuros realizar um controle
genômico da ancestralidade nas amostras caso e controle .
No presente estudo, os resultados para o SNP Arg194Trp, no gene
XRCC1, não indicaram diferenças significativas entre os genótipos dos grupos caso
e controle que pudessem associar este polimorfismo com a susceptibilidade ao
câncer (P>0,05).
Um estudo desenvolvido por Duell et al (2001) investigou o gene XRCC1
como candidato à susceptibilidade ao câncer de mama em um estudo caso-controle
de base populacional, em mulheres da Carolina do Norte, EUA. Seus resultados
também revelaram não haver nenhuma associação entre os genótipos do XRCC1,
códon 194 e o câncer de mama, corroborando com os resultados obtidos no
presente estudo. Huang et al (2009), em uma meta-análise, também não
encontraram associação deste SNP com o câncer de mama.
Dados contraditórios nos estudos de associação podem ser resultados de
diversos fatores como etnicidade, diferentes padrões de exposição à carcinógenos,
combinações de variantes de susceptibilidade ou o número de pacientes (Batar et
al., 2008).
Outro gene investigado no presente estudo é o XRCC3 que codifica a
proteína de mesmo nome, participante do reparo por HR de quebras de fita dupla de
DNA (Millikan et al., 2005). Células em que esse gene está mutado apresentam
níveis reduzidos em até 25 vezes de reparo por recombinação homóloga (Pierce et
al., 1999)
O polimorfismo Thr241Met, avaliado nesse estudo, é o mais intensamente
investigado na literatura mundial com relação à susceptibilidade ao câncer em vista
da substituição de treonima para metionina na posição 241 (Thr241Met) (Han et al.,
2006).
24 Vários estudos têm relacionado esta variante com o câncer de mama
(Smith et al., 2003; Kuschel et al., 2002), de pulmão (Jacobsen et al., 2004),
melanoma de pele (Winsey et al., 2000), coloretal (Krupa & Blasiak, 2004), de bexiga
(Andrew et al., 2008) e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço
(Werbrouck et al., 2008).
Os resultados da presente análise demonstraram que o polimorfismo
Thr241Met está significativamente associado à susceptibilidade ao câncer (P<0,05).
Nesse estudo observou-se um efeito significativo de proteção ao câncer para os
genótipos homozigoto selvagem CC (P=0,050; OR= 0,756; 95% IC 0,564-1,012) e
heterozigoto CT (P=0,019; OR= 0,415; 95% IC 0,197-0,874). Desta maneira foi
possível observar que indivíduos portadores dos genótipos CC e CT apresentam um
efeito de redução ao desenvolvimento de câncer de 76% e 42%, respectivamente,
se comparados com indivíduos portadores de genótipo homozigoto mutante TT.
Krupa & Blasiak (2004), em um estudo envolvendo o polimorfismo
Thr241Met e o câncer coloretal, também encontraram um efeito de redução de risco
para os genótipos CC e CT (OR = 0,16, IC 95% 0-0,26 e OR = 0,26 IC 95% 0,250,27, respectivamente), enquanto que a variante TT se mostrou fortemente
associada ao desenvolvimento da neoplasia estudada (OR = 9,45; 95% CI 8,7711,65).
Com relação ao genótipo mutante TT, os resultados encontrados não
foram significativos (P=0,543), porém foi possivel observar uma tendência de risco
(OR= 1,500; 95% IC 0,403 - 5,571) para indivíduos portadores desta variante com
relação ao desenvolvimento de câncer. A ausência de significância deste genótipo
se deve ao número amostral restrito investigado (10 indivíduos portadores deste
genótipo no total).
Diferentes trabalhos na literatura mundial evidenciam a associação do
genótipo mutante TT para a maior susceptibilidade a diferentes tipos de câncer.
Andrew et al (2008) encontraram associação entre o genótipo homozigoto
variante TT e o risco de câncer de bexiga aumentado em quase duas vezes em
fumantes, comparativamente ao genótipo selvagem CC. Uma associação positiva
entre esse polimorfismo e o carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço
foi encontrada, indicando um risco relativo de 1,96 vezes (WERBROUCK et al.,
2008).
25 De acordo com Kuschel et al. (2002), indivíduos homozigotos para a
metionina
(alelo
T)
também
apresentaram
um
risco
aumentado
para
o
desenvolvimento de câncer de mama comparativamente aos homozigotos para a
treonina (alelo C).
Winsey et al. (2000), em um estudo de associação entre polimorfismos de
genes de reparo de DNA e o desenvolvimento de melanoma maligno, identificaram
associação do polimorfismo Thr241Met com o desenvolvimento desta neoplasia. Os
indivíduos com o alelo para metionina (alelo T) tiveram um aumento significativo do
risco de desenvolver câncer de pele do tipo melanoma em comparação àqueles em
que o alelo estava ausente (genétipo CC) (P= 0,0004; OR= 2,36; 95% IC 1,44 -3,86).
Esse mesmo alelo T também se mostrou associado a um risco relativamente maior
ao câncer de pulmão com um risco relativo de 1,54 para heterozigotos e de 1,46
para homozigotos (Jacobsen et al., 2004).
Apesar de resultados que comprovam a associação desse polimorfismo
com o risco de desenvolvimento de neoplasias, existem também trabalhos que
supõem que o polimorfismo Thr241Met não desempenharia um papel fundamental
na etiologia de alguns tipos de câncer. Os genótipos variantes CT e TT,
comparativamente com o genótipo CC, não se apresentaram associados a um risco
aumentado para o câncer gástrico. É muito provável que várias variantes ou
polimorfismos de susceptibilidade comuns em genes de reparo, e não somente um,
possam contribuir conjuntamente para a susceptibilidade ao câncer gástrico, assim
como para outras neoplasias (Shen et al., 2004).
Desta forma, baseado nos resultados encontrados nesse estudo, fica
claro o papel do polimorfismo Thr241Met com um marcador genético importante
para ser usado no prognóstico do câncer, contudo é necessário haver uma melhor
investigação, pois não ficou clara a contribuição do homozigoto mutante TT na
determinação do risco para o desenvolvimento desta patologia. Logo é necessário
que se amplie o número amostral de indivíduos portadores de câncer para tornar a
investigação mais robusta.
A meta-análise desenvolvida por Fang et al. (2010) em diferentes
populações mundiais determinou que o SNP Thr241Met apresenta um elevado
efeito étnico para a associação deste com o risco de câncer gástrico. Desta forma,
torna-se interessante realizar o controle genômico da ancestralidade em estudos de
associação, uma vez que a população do Brasil apresenta uma elevada taxa de
26 miscigenação entre os diferentes grupos étnicos. Consequentemente, este fato pode
ocasionar uma flutuação de etnicidade entre os grupos investigados, o que poderia
gerar interpretações errôneas dos resultados.
7 CONCLUSÃO
• Não foi encontrada associação do polimorfismo Arg194Trp/XRCC1 com o
desenvolvimento de diferentes neoplasias.
• Quanto ao polimorfismo Thr241Met/XRCC3, observou-se uma associação
significativa para susceptibilidade ao câncer. Os resultados deste estudo
demonstraram que indivíduos portadores dos genótipos CC e CT apresentam
um efeito de redução do risco de desenvolvimento de câncer de 76% e 42%,
respectivamente, se comparados a indivíduos portadores de genótipo
homozigoto mutante TT.
8 PERSPECTIVAS
Apesar dos resultados do presente estudo terem fornecido informações
importantes com relação aos genes estudados, estes devem ser considerados com
prudência devido a existência de algumas limitações.
A primeira limitação é com relação ao número de variáveis de
interferência analisados. Sendo assim, a fim de alcançar conclusões mais
convincentes, pretende-se ampliar o número de variáveis clínico-epidemiológicas
nas análises desse estudo, tais como: exposição a agentes carcinógenos químicos
(quimioterápicos) e físicos (radiações ionizantes, UV), hábitos como o alcoolismo e
tabagismo, para assim definir com maior precisão quais variáveis podem interferir na
susceptibilidade a cada tipo de câncer investigado.
A segunda limitação é referente ao número amostral restrito analisado
nesse estudo, que ainda não é suficiente para tirar uma conclusão final da relação
dos efeitos dos SNPs investigados e a susceptibilidade ao câncer, já que os
resultados para o genótipo TT não foram significativos. Logo, é necessário que se
amplie o número amostral analisado para tornar a investigação mais robusta.
27 Pretende-se também futuramente incluir nas análises desse estudo o
controle genômico de ancestralidade, uma vez que a população brasileira apresenta
uma elevada taxa de miscigenação entre os diferentes grupos étnicos. Sendo assim,
torna-se relevante controlar o efeito dessa subestruturação populacional, que é
nítida, principalmente na região norte do Brasil.
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