Introdução. Conceitos de genética e genética de populações

+
GCCT
GGTT
GGAA
CTGG
GTTA
TCTTT
ACTG
CCTG
Marcadores
Moleculares
Roseli Tuan, Biólogo, Pesquisador Cientifico
Superintendência de Controle de Endemias
Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo
[email protected]
+
  Surpreenderá
a todos, não por ser exótico
Mas pelo fato de poder ter sempre estado
oculto
Quando terá sido o óbvio
+
A percepção da diversidade
biológica:
da morfologia às moléculas
+
+
Structure for Deoxyribose Nucleic
Acid.
Watson J.D. and Crick F.H.C. Nature
171, 737-738 (1953)April 25, 1953.
James Watson and Francis Crick's
classic paper that first describes the
double helical structure of DNA. With
some understatement they note that
the structure “suggests a possible
copying mechanism for the genetic
material”.
+
DOGMA
CENTRAL DA
BIOLOGIA
+
Enzimas De
Restrição
+
Tecnologia do
DNA
Recombinante
+
Clonagem
molecular
+
Clonagem e PCR
www-math.mit.edu/.../18.417/lectures/01_Intro/
DNA muito repetido – repetições em
tandem
microsatélites
• telómeros
• DNA satélite ‘clássico’
• minisatélites
Os microsatélites são muito pequenos não tendo mais
de 2-4
bases
Estão espalhados por todo o genoma em tandem. São
raros em
regiões codificantes e nos telómeros.
O microsatélites mais comum no genoma humano é o
dinucleótido repetido (CA)n
…………CACACACACACACACACACACA
……………
…………GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT……………
+
Marcadores citogeneticos
http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci111b/allozymes/supplemental.htm
CÁTODO
polo ou eletrodo
negativo
Ânodo
Polo ou eletrodo positivo
+
Pergunta
+
PCR
 
Técnica de biologia molecular
empregada para obter-se
amplificação exponencial de
pequenas quantidades de DNA in
vitro, empregando elementos do
processo natural de replicação do
DNA. Técnica “inventada” em 1985
por Kary B. Mullis .A técnica já
existia, entretanto, a DNA
polimerase utilizada (E. coli) era
destruída durante os ciclos de
aquecimento e era necessário
adição consecutiva a cada novo
ciclo .
+
 
O primeiro termociclador foi
projetado para que a DNA
polimerase pudesse ser
adicionada a cada ciclo
 
Taq DNA polimerase
 
My discovery of T. aquaticus and
other high-temperature bacteria
could not have been made without
studies directly in the natural
environment in Yellowstone
National Park
 
BROCKT, . D., and H. FREEZE, I969
Thmmus uquatiru.~g en. 11. and
sp. n., a non-sporulating
extreme thermophile. J.
Bacteriol. 98:289-297.
 
The Value of Basic Research:
Discovery of 117termus
aquaticus and Other Extreme
Thermophiles.Thomas D.
BrockGenetics 146 1207-1210
(August, 1997)
Taq DNA Pol
Estabilidade
+
 
DNA polimerase termoestável
 
Um par de oligonucleotídeos para
iniciar a síntese de DNA (primers)
 
Deoxinucleotídeos trifosfato
(dNTPs)
 
Cátion divalente: toda DNA
polimerase requer cátion
divalente, usualmente Mg2+
 
Tampão para manter o pH
 
Cátions monovalentes, usualmente
K+ (KCl)
 
DNA molde
O que é preciso?
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/74/
PCR_basic_principle1.jpg
+
Estringencia
 
A estringência determina a
especificidade no produto deDNA
a ser amplificado.
 
- T anneal é o fator mais
significante que afeta a
estringênciano anelamento do
primer.
 
-T anneal :Muito baixa = menor
estringência = primer pareia em
qualquerlugar.
 
muito alta = maior estringência =
primer pode não parear.
http://users.ugent.be/~avierstr/
principles/pcrani.html
+
A amplificação é
infinita?
 Perda
da atividade da enzima
as enzimas disponíveis estão ocupadas
com a síntese de DNA
 Acúmulo de produtos amplificados que
tendem a parear entre si, em detrimento do
pareamento com os primers -Aumenta
possibilidade de amplificação de produtos
inespecíficos
 Redução dos reagentes, especialmente de
primers e dNTPs
 Competição com outros produtos de
amplificação (amplificados com eficiência
menor) que foram acumulando
 Todas
+
Otimização da
PCR
 
Aumentar a eficiência =
quantidade de produto final
Aumentar a especificidade,
Melhorar a reprodutibilidade (de
tubo para tubo e de reação para
reação)
 
Desenho dos primers
 
Condições de ciclagem:
tempeatura de hibridação
 
Concentração dos reagentes
 
Composição do tampão
Tm (melting temperature)- temperatura à qual metade da
sequência de bases de determinada molécula de DNA, está
denaturada.
Amplificação do vírus do
papiloma Humano. A
amostra de DNA foi retirada
de uma biópsia e foi
amplificado com primers
específicos para este vírus
e com diferentes
temperaturas de
emparelhamento.
Especificidade a 50ºC
Fatores que afetam a desnaturação/renaturação da dupla
hélice:
• % G/C
• Sequência do DNA (DNA repetitivo)
• % incompatibilidade de pb
• Dimensão da molécula
• Concentração do DNA
• Força iónica (Na+, neutraliza P-; logo quando a
concentração salina é mais baixa, a dupla hélice fica
mais instável
• Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc)
Medição da concentração da dos ácidos
nucleicos em solução
Pure dsDNA has A260/A280 = 1,8
> 1,8 RNA contamination
<1,8 Protein contamination
+
Tipos de
marcadores
 
RFLP
 
RAPD
 
ITS
 
Microsatelites
 
mtDNA
 
SNP
Polimorfismo de Comprimento de
Fragmentos de Restrição
Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso
No uso da técnica RAPD é desnecessário o conhecimento prévio da
seqüencia do DNA.Utilizando-se um único primer por reação,
observa-se a geração de numerosos segmentos amplificados, de
tamanhos variados. Cada banda tem caráter dominante. Não é
possível detectar alelos. As análises são feitas considerando a
distribuiçãopresença/ausência das bandas geradas pela reação de
amplificação.
Entre as limitações da técnica, duas podem
ser consideradas as mais importantes. Uma
delas se refere à característica dominante
do marcadores RAPD que não permite a
diferenciação de indivíduos heterozigotos e,
consequentemente, a obtenção de outras
informações relevantes para estudos
genéticos. Outra limitação, bastante
avaliada durante os primeiros anos de
aplicação da técnica de RAPD, é a questão
da baixa repetibilidade de algumas bandas.