universidade federal de pernambuco centro de ciências da saúde

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
COMPARAÇÃO DO MÉTODO DO ÍNDICE DE AVIDEZ COM O ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO-BED DE CAPTURA DE IgG, PARA DETECÇÃO DE
INFECÇÃO RECENTE PARA O HIV-1, DE DOIS CENTROS DE TESTAGEM E
ACONSELHAMENTO DO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL
DANIELA MEDEIROS SALUSTIANO
2010
DANIELA MEDEIROS SALUSTIANO
COMPARAÇÃO DO MÉTODO DO ÍNDICE DE AVIDEZ COM O ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO-BED DE CAPTURA DE IgG, PARA DETECÇÃO DE
INFECÇÃO RECENTE PARA O HIV-1, DE DOIS CENTROS DE TESTAGEM E
ACONSELHAMENTO DO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL
Dissertação
apresentada
à
banca
examinadora do Programa de PósGraduação em Medicina Tropical do
Centro
de
Ciências
da
Saúde
da
Universidade Federal de Pernambuco,
para obtenção do Título de Mestre.
ORIENTADORA: Profa. Dra Heloísa Ramos Lacerda
2010
Salustiano, Daniela Medeiros
Comparação do método do índice de avidez com
ensaio imunoenzimático-BED de captura de IgG, para
detecção de infecção recente para o HIV-1, de dois
centros de testagem e aconselhamento do estado de
Pernambuco / Daniela Medeiros Salustiano. – Recife: O
Autor, 2010.
72 folhas: il., fig., tab., gráf.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2010.
Inclui bibliografia, anexos e apêndice.
1. HIV. 2. Infecção recente. 3. Índice de avidez. 4.
BED-CEIA. I. Título.
616.98
616.979 2
CDU (2.ed.)
CDD (20.ed.)
UFPE
CCS2010-154
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. José Tadeu Pinheiro
COORDENADORA DA PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Profa. Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
VICE-COORDENADORA DA PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Profa. Heloísa Ramos Lacerda de Melo
CORPO DOCENTE
Profa. Ana Lúcia Coutinho Domingues
Profa. Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Prof. Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Profa. Elizabete Malagueño de Santana
Prof. Fábio André dos Santos Brayner
Profa. Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Profa. Maria Amélia Vieira Maciel
Profa. Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
Profa. Maria do Amparo Andrade
Profa. Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Profa. Marli Tenório Cordeiro
Prof. Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Profa. Valdênia Maria Oliveira de Souza
Profa. Vera Magalhães de Silveira
Ao meu pai, Eugênio Salustiano, pela vida que me deu, pela
formação moral e acadêmica que me proporcionou...
A minha Tia Ana Salustiano, pelo estímulo e confiança
depositado em mim e pelo exemplo de dedicação na busca dos
seus objetivos...
A minha vozinha Anita, por todo seu amor, pela paciência,
dedicação e compreensão nos momentos mais difíceis, pelo
apoio e motivação constantes em todo tempo da minha vida...
Ao meu filho, Felipe, pelas virtudes que possui,
pelo bem que me faz, pelo significado que deu à
minha vida com sua existência e pela possibilidade que me deu
de prosseguir...
A todos vocês dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre presente na minha vida, me fazendo superar todos
obstáculos e seguir em frente.
À minha orientadora, Profa. Dra. Heloisa Ramos Lacerda, pela oportunidade de
trabalho em colaboração, pelo incentivo na superação dos desafios, pelo apoio,
ensinamentos e confiança depositados em mim.
À minha Tia, amiga e mãe Ana Salustiano, pelo apoio, confiança, incentivo e amor
em todos os momentos de minha vida.
As minhas irmãs Gabi e Manu, que sempre me encorajam a vencer os obstáculos e
aos meus cunhados André e Ricardo (topó) pela compreensão e colaboração
durante essa empreitada.
Ao meu filho, que mesmo com 4 aninhos soube colaborar do seu jeitinho, para que a
mamãe concluísse este trabalho.
Às Coordenações de DST/Aids do município do Cabo de Santo Agostinho, e do
município de Paulista, por abrirem as portas para realização deste trabalho.
À minha chefinha e amiga Lúcia Cristina Buarque (Tininha), pela grande ajuda e
oportunidade, proporcionando a realização deste trabalho juntamente com o
desempenho de minhas funções.
Aos meus colegas do Centro Herbert de Souza – CTA – Cabo, pelo apoio,
colaboração e paciência nos momentos fundamentais deste trabalho.
Ao meu amigo e grande parceiro nesta jornada, Kledoaldo, pela troca de
conhecimentos, pelos bons e difíceis momentos compartilhados e principalmente
pela amizade que foi criada.
Ao programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade Federal de
Pernambuco – UFPE, pela oportunidade de crescimento científico.
Ao funcionário Walter Leite, pela ajuda e paciência nestes dois anos de mestrado.
A todos, que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho,
meu MUITO OBRIGADA!
O milagre não é dar vida ao corpo extinto, ou
luz ao cego, ou eloqüência ao mundo... nem
mudar água pura em vinho tinto... milagre é
acreditarem nisso tudo!
(Mário Quintana)
LISTA DE ABREVIATURAS
AC
Anticorpo
Ag
Antígeno
AIDS
Síndrome da imunodeficiência adquirida
ARV
Antiretroviral
BED-CEIA
Ensaio imunoenzimático de captura para
quantificação da IgG anti- gp41 do HIV-1,
subtipos B, E e D.
CAL
Calibrador
CD4
Grupo de diferenciação nº 4
CDC
Centros para o Controle e Prevenção de
Doenças Centers for Disease Control and
Prevention
CEP
Comissão de ética em pesquisa
CN
Controle negativo
CO
Valor de corte
Cut off
CRF
Forma recombinante circulante
Circulating recombinant form
CTA
Centro de Testagem e Aconselhamento
DNA
Ácido desoxirribonucléico
Deoxyribonucleic acid
DO
Densidade óptica
DOP
Densidade óptica padronizada
DST
Doenças sexualmente transmissíveis
EIA
Ensaio imunoenzimático
Enzyme immunoassay
ELISA
Ensaio imunoenzimático
Enzyme-linked immunosorbent assay
Env
Envelope
EUA
Estados Unidos da América
G
Guanidina
Gag
Antígeno grupo-específico Group-specific
antigen
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
Human immunodeficiency vírus
HSH
Homens que fazem sexo com homens
HTLV
Vírus T-linfotrópico humano
Human T-lymphotropic vírus
IA
índice de avidez
IC
Intervalo de Confiança
IFI
Imunofluorescência indireta
Ig
Imunoglobulina
OMS
Organização Mundial da Saúde
OR
Relação dos produtos cruzados
Odds Ratio
PBS
Solução salina tamponada com fosfatos
Phosphate-buffered saline
Pol
Polimerase
Ver
Regulador da expressão de proteínas
virais Regulator of expression of virus
proteins
RNA
Ácido ribonucléico
Ribonucleic acid
ROC
Receiver operating characteristic
SIV
Vírus da imunodeficiência símia
Simian immunodeficiency vírus
STARHS
Algoritmo de testes sorológicos para
detecção de soroconversão recente para o
HIV Serologic testing algorithm for recent
HIV seroconversion
Tat
Trans-ativador da transcrição
Transactivator of transcription
Th
Célula T auxilidadora
T helper cell
UDI
Usuário de droga injetável
UNAIDS
Programa conjunto das Nações Unidas
para a AIDS United Nations Joining Aids
Program
UNUSIDA
Programa da Organização das Nações
Unidas para o combate à Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida
Vif
Fator de infectividade viral
Virion infectivity factor
Vpr
Proteína viral R
Viral protein R
Vpu
Proteína viral U
Viral protein U
WB
Western blot; Western blotting
SUMÁRIO
1. DELIMITAÇÃO DO TEMA..................................................................
17
2. REVISÃO DA LITERATURA..............................................................
19
2.1. A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida............................
19
2.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana.....................................
20
2.3. Situação da epidemia de HIV/Aids no Brasil e no mundo.....
22
2.4.Desenvolvimento dos algoritmos de testes laboratoriais
para a identificação de infecções incidentes pelo HIV-1........
25
2.5. Métodos baseados em marcadores de infecção recente....... 26
3. PERGUNTA CONDUTORA................................................................
30
4. OBJETIVOS........................................................................................
31
4.1. Objetivo geral..............................................................................
31
4.2. Objetivos específicos.................................................................
31
5. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 32
5.1. Métodos......................................................................................
33
5.2 Análise estatística dos dados...................................................... 36
5.3. Aspectos éticos da pesquisa..................................................
36
6. ARTIGO..............................................................................................
37
7. CONCLUSÃO....................................................................................
58
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................
59
APÊNDICE A – QUESTIONÁRIO DE COLETA DE DADOS................
65
ANEXO A – APROVAÇÃO EM COMITÊ DE ÉTICA.............................
67
ANEXO B – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DA REVISTA.................
68
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Vírus da Imunodeficiência Humana – HIV........................................21
Figura 2 – Ciclo replicativo do HIV-1................................................................22
Figura 3 – Estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV/ Aids
em 2007.............................................................................................................23
Figura 4 – Municípios com pelo menos um caso de aids por período e ano de
diagnóstico. Brasil, 1980 – 2009 ......................................................24
Figura 5 – Fluxograma da metodologia do índice de Avidez ...........................35
Figura 6 – Esquema da interpretação do resultado do BED-CEIA ..................35
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
Tabela 1 - Características dos 364 pacientes diagnosticados para a infecção pelo
HIV
e
incluídos
no
estudo,
CTA-Cabo
e
CTA-Paulista,
2006
a
2009...................................................................................................................48
Tabela 2 - Resultados do teste de avidez com ponto de corte 0,8 comparados aos
resultados do ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG das 364 amostras,
CTA-Cabo e CTA-Paulista, período de 2006 a 2009.......................49
Tabela 3 - Resultados do teste de avidez com o ponto de corte 0,9 comparados aos
resultados do ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG das 364 amostras,
CTA-Cabo e CTA-Paulista, 2006 a 2009..........................................50
Tabela 4 - Performance do teste de avidez tendo como pontos de corte a densidade
ótica de 0,8 e 0,9, tento como Padrão ouro o ensaio Imunoenzimático-BED de
Captura de IgG das 364 amostras do estudo, CTA-Cabo e CTA-Paulista, 2006 a
2009...................................................................50
Gráfico 1 - Curva ROC mostra a sensibilidade e especificidade do Índice de Avidez
comparado ao BED de 364 amostras....................................................51
RESUMO
Em vigilância epidemiológica, um grande desafio é encontrar a melhor forma de
monitorar a incidência do vírus da imunodeficiência humana do tipo1 (HIV-1). A
Organização Mundial de Saúde (OMS) aprovou em 2001 uma metodologia
laboratorial que permite identificar infecções recentes.
O estudo foi desenhado para comparar o ensaio automatizado Axsym HIV 1/2gO
modificado pela Guanidina que avalia o Índice de Avidez, com o ensaio
imunoenzimático de captura de IgG BED-CEIA, na identificação de infecções
recentes pelo HIV-1 de usuários de dois Centros de Testagem e Aconselhamento
(CTA) do estado de Pernambuco.
Foram utilizadas 364 amostras de soro que tiveram diagnósticos positivos para o
HIV-1 de indivíduos que procuraram de forma espontânea, os Centros de Testagem
e Aconselhamento (CTA) da cidade do Cabo de Santo Agostinho e da cidade do
Paulista, ambas localizadas na região metropolitana do Recife, no período de 2006 a
2009.
Os resultados dos dois testes foram comparados utilizando o BED como Padrão
Ouro. Das 364 amostras, 103 (28,29%) foram identificadas como infecção recente
pelo BED; pelo índice de avidez, com ponto de corte 0,8 e 0,9 foram identificadas 76
amostras (20,87%) e 148 (40,7%), respectivamente. para um ponto de corte de 0,9.
A curva ROC mostrou que o ponto de corte para o IA com a melhor sensibilidade e
especificidade em relação ao BED foi de 0,9, no qual a sensibilidade foi de 85,4% e
especificidade de 77%.
O presente estudo permite concluir que o IA obtido pela metodologia Axsym-HIV1/2gO com adição de Guanidina, possui boa performance comparado ao BED na
detecção das infecções recentes pelo HIV, sendo de grande utilidade em regiões
com recursos limitados.
Palavras - chave: HIV, Infecção recente, Índice de avidez, BED-CEIA.
ABSTRACT
In surveillance remains an enormous challenge to find the best way to monitor the
incidence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The WHO in 2001
adopted a laboratory method for identifying recent infections.
The study was designed to compare the test automated AxSYM HIV 1/2gO modified
by Guanidine that measures the avidity index with the enzyme immunoassay IgG
capture BED-CEIA in the identification of recent infections with HIV-1 users of two
Voluntary and Counselling Testing (VCT) of Pernambuco - Brazil.
We analyzed 364 samples of serum that had positive diagnosis for HIV-1 individuals
searching, spontaneously, the Voluntary and Counselling Testing (VCT) from Cabo
de Santo Agostinho and Paulista, both lin the metropolitan area of Recife, in the
period 2006 to 2009.
The results of both tests were compared using the BED as Gold Standard. Of the
364 samples, 103 (28,29%) were identified as recent infections by BED and 76
(20,87%) by the avidity index (AI) with a cutoff point of 0,8 and 40,7% for a point
cutoff of 0,9. The ROC curve showed that the cutoff point for the AI that will bring the
best sensitivity and specificity in relation to BED was 0,9 in which the sensitivity was
85,4% and specificity of 77%.
This study shows that the IA methodology Axsym-HIV-1/2gO obtained by the addition
of Guanidine has good performance compared to the BED in the detection of recent
HIV infections, and is useful in regions with limited resources.
Key - words: VIH, Recent infections, Avidity index, BED-CEIA.
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
1. DELIMITAÇÃO DO TEMA
Os sistemas de vigilância epidemiológica têm sido desafiados constantemente
para melhorar os métodos para o monitoramento das tendências da epidemia de
HIV/Aids em todo o mundo (S. Bio Fernandes et al,2005). As informações
disponíveis são baseadas, na sua maioria, em estudos transversais de
soroprevalência os quais podem se constituir em uma ferramenta pobre para inferir
as tendências da epidemia, ao longo do tempo, em grupos populacionais em risco
para a infecção (McDougal et al, 2005).
A incidência de infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) era
avaliada por meio de estudos longitudinais em coortes de indivíduos soronegativos e
por meio do monitoramento da soroprevalência entre indivíduos que freqüentam com
periodicidade serviços de testagem sorológica (Walker et al, 2001). Contudo, a
modificação de comportamentos sexuais de maior risco, com conseqüente redução
da transmissão do HIV e de outras doenças sexualmente transmissíveis (DST), tem
contribuído para o viés de seguimento observado nos estudos longitudinais
tradicionais (Johnson et al., 2003). Além dos efeitos da intervenção, estes estudos
são geralmente dispendiosos, demorados e podem também ter seus resultados
influenciados pela participação seletiva e pelas diferenças de perda no seguimento
(Sahlu et al., 2002; Kaul et al., 2002).
O crescente interesse em estimar a incidência da infecção pelo HIV, utilizando
amostras de seção transversal tem levado ao desenvolvimento de métodos
laboratoriais diversos (Suligoi et al, 2002).
Em
2004,
Dobbs
e
colaboradores
avaliaram
as
características
de
desempenho do ensaio BED-CEIA, visando elaborar um algoritmo de testes
sorológicos alternativo às estratégias de testagem dupla sensível/menos sensível
para a detecção de infecções recentes pelo HIV-1. O teste baseia-se na
determinação da proporção de imunoglobulinas G (IgG) anti-HIV em relação ao total
de Imunoglobulinas G no sangue, através do teste ELISA (McWalter T et al, 2009).
O tempo da infecção do HIV pode então ser estimado, uma vez que em princípio a
razão entre a relação da IgG total e a IgG anti-HIV varia de acordo com a
progressão da doença (McWalter T et al, 2009). Esta técnica é freqüentemente
utilizada em conjunto com ferramentas matemáticas para estimar a incidência da
infecção pelo HIV e tem sido amplamente utilizada ( Hargrove J et al, 2009).
17
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Um outro método que permite distinguir as infecções recentes das
estabelecidas com base na avidez (afinidade) dos anticorpos foi descrito em 2002
(Suligoi et al, 2002). A metodologia baseia-se no princípio de que a avidez dos
anticorpos produzidos na fase inicial da infecção é reduzida, em oposição ao que se
observa em infecções estabelecidas. Na validação deste método, é calculado o
Índice de Avidez (I.A.) mediano em função do tempo de seroconversão para um
tempo inferior a seis meses (Suligoi et al, 2003). Assim, foram definidas como
infecções recentes as contraídas há menos de seis meses e infecções
estabelecidas, as contraídas há mais de 6 meses (Suligoi et al, 2003). Os autores
realçam a simplicidade e o automatismo da técnica, e ainda, o fato de teoricamente
detectar todos os subtipos virais e não ser influenciado pelo estádio da infecção.
O estudo foi desenhado para comparar um teste automatizado que avalia o
índice de avidez (Axsym-HIV1/2gO), com o ensaio Imunoenzimático-BED de
Captura de IgG (IgG-Capture BED-CEIA), para a detecção de infecção recente para
o HIV de amostras armazenadas em sorotecas de dois Centros de Testagem e
Aconselhamento (CTA) da região metropolitana do Recife-Pernambuco, no período
2006 a 2009.
.
18
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. A síndrome da imunodeficiência adquirida
Em 1981, os Centros para o Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC Centers for Disease Control) notificaram a ocorrência de casos de pneumonia pelo
Pneumocystis carinii [posteriormente classificado como Pneumocystis jiroveci
(Stringer et al., 2002)] e de Sarcoma de Kaposi em homossexuais masculinos jovens
previamente sadios, que passaram a apresentar um quadro de deficiência
imunológica severa, linfadenopatia generalizada e uma acentuada diminuição do
número absoluto de linfócitos T-auxiliadores no sangue periférico (CDC, 1981a;
Durack et al., 1981; Gottlieb et al., 1981; Masur et al., 1981). Após a descrição dos
primeiros casos, a imunodeficiência foi também observada em usuários de drogas
injetáveis, receptores de transfusão, hemofílicos e crianças recém-nascidas de mães
dependentes de drogas injetáveis (CDC, 1981b; CDC, 1982a, 1982b, 1982c).
Ao final de 1982, a denominação "Síndrome da Imunodeficiência Adquirida"
(Aids - Acquired Immunodeficiency Syndrome) já era utilizada para a descrição desta
síndrome, cuja investigação epidemiológica determinou ser uma doença infecciosa
transmitida por contato sexual, sangue e produtos do sangue.
Em 1983, Barré-Sinoussi e colaboradores (grupo de pesquisadores da
França) demonstraram atividade de transcriptase reversa (DNA polimerase
dependente de RNA) em sobrenadantes de culturas de linfócitos do sangue
periférico de um paciente com linfadenopatia.
Em 1984, Gallo e colaboradores (EUA) demonstraram que uma linhagem de
células T humanas era capaz de propagar o HIV, o que possibilitou grande avanço
no isolamento e na identificação de partículas virais a partir do sangue de portadores
de Aids.
Inicialmente, o vírus recebeu várias denominações. O grupo do Dr. Luc
Montagnier, do Instituto Pasteur da França, o denominou de Vírus Associado à
Linfadenopatia (LAV - Lymphadenopathy-associated virus); pesquisadores ligados
ao grupo do Dr. Robert Gallo o denominaram Vírus TLinfotrópico Humano do tipo III
(HTLV-III - Human T-lymphotropic virus type III) e o grupo do Dr. Jay Levy o
19
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
denominou Retrovírus Associado à AIDS (ARV - Aids-Associated Retrovirus) (Levy
et al., 1984).
Em 1986 foi proposta uma nomenclatura unificada para os vírus causadores
de imunodeficiência humana e este agente passou a ser denominado Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV - Human Immunodeficiency Virus) (Coffin et al.,
1986). Ainda em 1986, um segundo vírus causador de imunodeficiência em
humanos, também associado a Aids, foi descrito em países do oeste da África
(Clavel et al., 1986). Este novo vírus foi denominado HIV-2 e o primeiro foi
subseqüentemente renomeado, passando a ser chamado de HIV-1.
Desde o isolamento do vírus, várias descobertas sobre a biologia do HIV-1
permitiram a elucidação das vias de transmissão, além do desenvolvimento de
testes sorológicos e drogas anti-retrovirais, que são cruciais no controle da infecção
pelo vírus, até que seja possível a obtenção de uma vacina eficaz (Gallo &
Montagnier, 2002).
2.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana
O HIV possui um genoma com duas moléculas de RNA de fita simples,
pertencente ao gênero Lentivirus, subfamília Orthoretrovirinae e a família
Retroviridae. O vírion possui um diâmetro de aproximadamente 100 nm, um genoma
de 9,8kb e um envelope, oriundo da célula hospedeira (Rücker et al., 2004). As
glicoproteínas virais são derivadas de um precursor gp160, que é clivado por
proteases celulares, produzindo as glicoproteínas gp120 de superfície e gp41, a
glicoproteína transmembrana (Rücker et al., 2004). No interior do envelope encontrase um segundo envoltório, a matriz, que é constituída pela proteína p17. O capsídeo
é formado pela proteína p24, e no interior dele encontram-se as duas cópias do
genoma RNA fita simples, com polaridade positiva, associadas às proteínas p7 e p6,
formando o nucleocapsídeo. As enzimas virais transcriptase reversa (RT), integrase
(IN) e protease (PR) também são encontradas dentro da partícula viral (Larder et
al.,2001).
20
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Figura 1 - Vírus da Imunodeficiência Humana – HIV-1.
Fonte:(Levy.,J.A HIV and the pathogenesis of AIDS, 1994)
O Vírus HIV-1 (figura 1) contém pelo menos nove genes diferentes,
sendo três deles encontrados em todos os retrovírus, são eles: gag (que codifica as
proteínas estruturais), pol (que codifica a protease (PR), transcriptase reversa (RT) e
integrase (IN)) e env (que codifica glicoproteínas do envelope). Esses genes são
considerados os genes estruturais. Os genes gag, pol e env são traduzidas em
poliproteínas precursoras, que são posteriormente clivadas por proteases celulares e
por uma protease viral (Flint et al.,2004).
Os retrovírus utilizam a enzima transcriptase reversa para a transcrição
do RNA em DNA. Após a síntese do DNA, o genoma viral se integra ao genoma da
célula hospedeira e recebe o nome de provírus. Os retrovírus pertencentes ao
gênero Lentivirus, do latim lentus (lentos), receberam essa denominação porque
possuem em longo período de incubação no hospedeiro, podendo persistir e
replicar-se por muitos anos antes de causar sinais clínicos e doença (figura 2).
Os lentivírus produzem efeitos citopaticos, provocam deficiência
imunológica, desordens hepáticas e nervosas, além de doenças autoimunes
(http://hiv-web.lanl.gov). Os genomas desses vírus são relativamente grandes,
apresentando um número maior de genes do que outros retrovírus. Além dos genes
estruturais, gag, pol e env, comuns a todos os retrovírus, os lentivírus codificam
proteínas acessórias e regulatórias da replicação viral. A descoberta do HIV levou á
caracterização e vários outros lentivírus, como aqueles isolados de primatas não
21
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
humanos, SIV (simian immunodeficieny vírus) (Janeway et al., 2002; Flint et al.,
2004).
Figura 2 – Ciclo replicativo do HIV-1
Fonte:(Levy.,J.A HIV and the pathogenesis of AIDS, 1994)
2.3. Situação da epidemia de HIV/Aids no Brasil e no mundo
Conforme o relatório anual do Programa Conjunto das Nações Unidas sobre
HIV/aids, existem no mundo aproximadamente 33 milhões de pessoas vivendo com
HIV/aids (UNAIDS, 2007). O número de pessoas que vivem com o HIV diminuiu
globalmente em comparação com os dos anos anteriores. A diferença nos números
se deve ao aperfeiçoamento da metodologia e às ações efetivas de enfrentamento
da epidemia que vêm sendo desenvolvidas em diversos países (UNAIDS, 2007). A
figura 3 mostra distribuição da estimativa de adultos e crianças vivendo com
HIV/Aids em 2007.
22
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
América do Norte
1.3 milhões
(480.000 – 1.9 milhões)
Europa Central
760.000
(600.000 – 1.1 milhões)
Leste da Europa e Ásia
Central
1.6 milhões
(1.2 – 2.1 milhões)
Leste da Ásia
800.000
(620.000 – 960.000)
Caribe
230.000
(210.000 – 27.000)
América Latina
1.6 milhões
(1,4 – 19 milhões)
Norte da África
380.000
(270.000 – 500.000)
Sul e Sudeste da Ásia
4.0 milhões
(3.3 – 5.1 milhões)
África Sub-Saariana
22.5 milhões
(20.9 – 24.3 milhões)
Oceania
75.000
(53.000 – 120.000)
TOTAL: 33.2 (30.6 – 36.1) milhões
Figura 3 – Estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV/ Aids em 2007.
Fonte:(UNAIDS, 2007)
A África Subsaariana é a área mais afetada, com aproximadamente dois
terços do total mundial (22,5 milhões de pessoas com o HIV); desse número três
quartos são do sexo feminino. A região também concentra 76% das mortes pela
doença. Na América Latina, o relatório afirma que a epidemia permanece estável.
Em 2007, o número estimado de novas infecções na região foi de 100 mil; e o de
mortes, de 58 mil. Atualmente, estima-se que 1,6 milhão de pessoas vivam com aids
na América Latina (UNAIDS/ WHO, 2007).
Estima-se que, no Brasil, cerca de 630 mil indivíduos, de 15 a 49 anos, vivam
com o HIV/aids. De acordo com parâmetros estabelecidos pela Organização Mundial
de Saúde (OMS), a epidemia de aids no país é concentrada, ou seja, apresenta taxa
de prevalência da infecção pelo HIV menor que 1% entre parturientes, residentes em
áreas urbanas, e maior que 5% em subgrupos populacionais sob maior risco para
infecção pelo HIV (Barbosa-Jr Aristides et al, 2009). A taxa de prevalência da
infecção pelo HIV, no país, na população de 15 a 49 anos, mantém-se estável em
aproximadamente 0,6% desde 2004, sendo 0,4% entre as mulheres e 0,8% entre os
homens. Entre os jovens do sexo masculino entre 17 e 20 anos, a taxa de
prevalência do HIV foi estimada, em 2007, em 0,12%, apresentando ligeiro aumento
23
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
quando comparado com a estimativa de 2002 (0,09%), embora não estatisticamente
significativo (Szwarcwald CL, 2009). Entre mulheres jovens de 15 a 24 anos, a taxa
estimada em 2006 foi semelhante à encontrada em 2004, em torno de 0,28%. Em
relação aos subgrupos populacionais de risco acrescido, estudos realizados em 10
municípios brasileiros (Manaus, Recife, Salvador, Belo Horizonte, Rio de Janeiro,
Santos, Curitiba, Itajaí, Campo Grande e Brasília), de 2008 e 2009, estimaram taxas
de prevalências de HIV de 5,9% entre usuários de drogas ilícitas, de 10,5% entre
homens que fazem sexo com homens (HSH) e de 5,1% entre mulheres profissionais
do sexo Barbosa-Jr Aristides et al, 2009).
Com relação aos casos de aids, de 1980 até junho de 2009, foram
identificados 544.846 casos. Em média, são identificados cerca de 35 mil novos
casos por ano. A taxa de incidência de aids vem apresentando uma tendência à
estabilização, em patamares elevados nos últimos anos, atingindo em 2008 18,2 por
100.000 habitantes (http://www.aids.gov.br). Existem, entretanto, grandes diferenças
regionais, com declínio da taxa de incidência nas regiões Sudeste e Centro- Oeste,
no período de 2000 a 2008, e aumento nas regiões Norte, Nordeste e Sul. A Região
Sudeste ainda concentra o maior percentual de casos identificados no país com
59,3%; a região Sul, 19,2%; a Nordeste, 11,9%; a Centro-Oeste, 5,7%; e, a Norte,
3,9% (http://www.aids.gov.br).
1980 -1994
2000 - 2004
1995 -1999
2005 - 2009
Figura 4 – Municípios com pelo menos um caso de aids por período e ano de
diagnóstico. Brasil, 1980 – 2009. Fonte:(www.aids.gov.br)
24
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
2.4. Desenvolvimento dos algoritmos de testes laboratoriais para a
identificação de infecções incidentes pelo HIV-1
Os dados de soroprevalência, isoladamente, podem não ser suficientes para
inferir sobre as tendências da epidemia de HIV/Aids ao longo do tempo em grupos
populacionais específicos em risco para a infecção (Heyward et al, 1994; Batter et
al., 1994, McDougal et al, 2005). As medidas da incidência da infecção pelo HIV
podem prover informações mais detalhadas para monitorar a epidemia, o que é
crucial para a identificação de grupos de maior vulnerabilidade para a infecção e
para direcionar os programas de prevenção e controle (Walker et al, 2001).
Os programas de intervenção baseados no aconselhamento e na educação
individual
ou
coletiva
têm
demonstrado
efetividade
na
modificação
de
comportamentos sexuais de maior risco e na redução da transmissão do HIV e de
outras doenças sexualmente transmissíveis (DST). Mas, isto tem contribuído para o
chamado "viés de seguimento" (ou "efeito coorte") em estudos longitudinais
tradicionais, realizados para se verificar a incidência do HIV em coortes de
indivíduos não infectados (Laga et al., 1994; Heyward et al., 1994; Sahlu et al., 2002;
Kaul et al., 2002; Johnson et al., 2003).
Em 1989, a Organização Mundial da Saúde (OMS) elaborou a primeira norma
para o estabelecimento de sistemas para a vigilância da infecção pelo HIV.
Baseados no rastreamento por meio de vigilância sentinela, da dispersão do vírus
em subgrupos populacionais e da vigilância dos casos de Aids notificados, estes
sistemas se limitavam ao registro das infecções em curso (ONUSIDA/OMS, 2000).
Contudo, estudos para medir a incidência de HIV-1 em populações específicas têm
demonstrado que os métodos de vigilância baseados na prevalência de anticorpos
específicos na população ou na notificação de casos não são suficientemente
sensíveis para detectar as tendências da epidemia em curso (Batter et al., 1994;
Brookmeyer et al., 1995; Wawer et al., 1997; Mcfarland et al., 1997; Mcfarland et al,
1999; Rutherford et al., 2000), sendo necessária a implementação de estratégias
complementares para aprimorá-los.
25
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
2.5. Métodos baseados em marcadores de infecção recente
Em 1998, Janssen e colaboradores padronizaram uma nova metodologia,
baseada em um algoritmo de ensaios sorológicos para a identificação de infecções
recentes pelo HIV-1. Neste algoritmo, conhecido como STARHS - Serologic Testing
Algorithm for Recent HIV Seroconversion, amostras de soro/plasma, positivas para a
presença de anticorpos anti-HIV (confirmado por meio de teste de Western blotting),
são analisadas para a pesquisa de anticorpos anti-HIV em duas etapas, sendo uma
delas em um ensaio imunoenzimático padrão (sensível), comercialmente disponível,
e outra em um ensaio imunoenzimático modificado, conhecido como DetunedELISA, que apresenta menor sensibilidade em relação aos ensaios do tipo padrão
(McDougal, J. S. et al, 2006). Amostras com resultado "reagente" no ensaio sensível
e "não reagente" no ensaio menos sensível são classificadas, em relação à infecção
pelo HIV-1, como amostras de infecção recente ou amostras incidentes (também
chamadas de "amostras detunadas") (Oliveira, C., 2006).
O ensaio Detuned-ELISA, padronizado por Janssen e colaboradores,
baseava-se no emprego do reagente comercial Abbott 3A11 (Abbott Park, IllinoisEUA), um ensaio imunoenzimático indireto produzido a partir de antígeno viral total
obtido do lisado de culturas celulares infectadas pelo HIV-1, subtipo B (HIV-1IIIB).
Este ensaio foi modificado na diluição da amostra, no tempo de incubação da
mesma, do conjugado e no método de cálculo do Cutt Off (valor de corte da reação)
(Peterson ML, et al, 2006). Para que a reatividade das amostras pudesse absorver o
impacto das variações inter-ensaio, a densidade óptica (DO) da amostra foi
normalizada ou padronizada (DOP), passando a ser calculada com base nos valores
de DO dos controles negativo (CN) e positivo (CP) dos seus respectivos ensaios
[(DOP = valor da DO da amostra - valor da DO do CN)/valor da DO do CP].
Analisando painéis de amostras seqüenciais de soro/plasma de pessoas que
soroconverteram (soroconvertores) para o HIV-1, Janssen e colaboradores (1998)
estabeleceram condições ótimas do ensaio menos sensível, capazes de estimar o
tempo decorrido desde a soroconversão para essas amostras conhecidas.
O tempo decorrido desde a soroconversão, também chamado de "período de
janela de detecção" neste protocolo, foi determinado por meio de modelagem
matemática, considerando-se o tempo estimado entre o último resultado "não
reagente" e o primeiro resultado "reagente" das séries de amostras seqüenciais dos
26
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
painéis, no ensaio sensível e no ensaio menos sensível (Peterson ML, et al, 2006).
Enquanto os protocolos STARHS eram validados e recomendados oficialmente para
a estimativa da incidência de HIV-1, como ferramenta auxiliar às iniciativas de
vigilância e prevenção de HIV/Aids nos Estados Unidos (CDC-EUA, 2001),
diferentes estudos eram conduzidos com o objetivo de desenvolver métodos
laboratoriais alternativos, que pudessem superar as limitações técnicas impostas
pela diversidade viral e pela dinâmica da progressão da doença.
Com base nos resultados que mostraram uma distinção entre o título, a
afinidade e a quantidade proporcional de anticorpos dirigidos contra a gp41, Parekh
e colaboradores (2001b) desenvolveram um novo método, chamado de Ensaio
Imunoenzimático-BED de Captura de IgG (IgG-Capture BED-EIA), baseado na
detecção de proporções crescentes de IgG específica após soroconversão.
Realizado em microplacas com 96 cavidades, este método utiliza, como antígenos,
peptídeos derivados da região imunodominante da gp41, contendo seqüências dos
subtipos B, E e D, representativas de múltiplos subtipos do HIV-1 (Parekh e
McDougal, 2001; Parekh et al., 2002). O período de janela para a soroconversão
neste método é de 160 dias, empregando-se um CO de 1,0 para a DOP; o ensaio
apresenta índices de sensibilidade e de especificidade para a identificação de
amostras incidentes de 81,7% e 89,1%, respectivamente, e um índice de exatidão
para a estimativa da incidência de 93%. O desempenho do método não é afetado
pela diversidade do HIV-1, mas, da mesma forma como para os protocolos
STARHS-3A11, ele depende da imunocompetência do indivíduo cuja amostra será
analisada (Parekh, 2002).
Dobbs e colaboradores (2004) avaliaram as características de desempenho
do ensaio BED-CEIA, visando elaborar um algoritmo de testes sorológicos
alternativo às estratégias de testagem dupla sensível/menos sensível para a
detecção de infecções recentes pelo HIV-1. Os autores propuseram a inclusão de
controles positivo-fraco e forte e do calibrador (CDC-EUA) em cada corrida e a
normalização da DO da amostra (DOP) frente às DO destes controles. O CO
proposto para a discriminação de amostras de soroconversão recente e infecção
crônica foi de 1,0 e o período de janela de detecção foi inicialmente de 160 dias,
tendo sido posteriormente estabelecido em 153 dias (Calypte Biomedical
Corporation, 2005).
27
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Além do protocolo BED-CEIA, outros métodos têm sido padronizados e
avaliados para a identificação de amostras de infecção recente pelo HIV-1. A medida
do índice de avidez da reação de anticorpos policlonais anti-HIV presentes em
amostras de soro foi explorada como forma alternativa para a discriminação entre
infecção crônica e recente pelo HIV-1.
Suligoi e colaboradores (2002) Avaliou a precisão e exatidão de um
procedimento para detectar o HIV, especificamente, o índice de avidez (IA),
calculado através de um método baseado em um teste HIV AxSYM 1/2gO
automatizado (Abbott). Para avaliar a precisão, foram realizadas várias repetições
em oito amostras de soro HIV-positivos. Para avaliar a precisão na identificação de
infecções recentes (isto é, dentro de 6 meses de soroconversão), utilizou-se um
painel de amostras amostras de soro cujas datas de soroconversão foram
conhecidos.
Para avaliar a sensibilidade e a especificidade do processo de
diferentes pontos de corte do Índice de Avidez (IA) foi realizada análise receiver
operating characteristic (ROC). O estudo mostrou que a precisão do procedimento
foi robusto (isto é, a variação total do IA foi inferior a 10%). Quanto à precisão, a
média IA foi significativamente menor para as amostras coletadas dentro de 6 meses
de soroconversão, em comparação com as amostras coletadas depois (0,68 + / 0,16 versus 0,99 + / - 0,10; P <0,0001), sem sobreposição dos intervalos de
confiança de 95%. A análise de ROC revelou que o valo dor IA de 0,6, apresentou
sensibilidade de 33,3% e especificidade de 98,4%, em comparação com 87,9 e
86,3%, respectivamente, para um IA inferior a 0,9.
Tratamento anti-retroviral, a
contagem de células CD4 baixa, e baixa carga viral não teve nenhum efeito aparente
sobre o IA.
Em conclusão, este procedimento é reprodutível e preciso para a identificação
de infecções recentes. É automatizado, fácil de executar e fornece um resultado
quantitativo com diferentes níveis de sensibilidade e especificidade, dependendo do
corte escolhido (AxSYM HIV 1/2gO, Abbott Diagnostics, Alemanha).
Não foram introduzidas modificações no procedimento original do ensaio,
mas sim o pré-tratamento das amostras com guanidina 1M. As estimativas de
incidência da infecção pelo HIV calculadas com base em métodos para detecção de
infecção recente/incidente variam de acordo com a região e com as populações
analisadas e são dependentes do subtipo viral predominante. (Suligoi et al., 2003).
28
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Tanto o BED-CEIA quanto a metodologia para a determinação do índice de
avidez de anti-HIV, AxSYM HIV 1/2gO, tiveram altos índices de reprodutibilidade, a
sensibilidade.
Assim, justificamos a proposta deste estudo, a comparação do índice de
avidez através do ensaio automatizado Axsym HIV1/2 gO com a técnica BED-CEIA,
que permitem identificar infecções recentes pelo HIV-1, a partir de amostras de soro,
provenientes de duas populações com características epidemiológicas distintas, e
será avaliada a sensibilidade e a especificidade do IA em relação ao BED.
29
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
3. PERGUNTA CONDUTORA
Qual a sensibilidade e especificidade do ensaio automatizado Axsym
HIV1/2gO modificado pela Guanidina que avalia o Ìndice de Avidez de IgG na
detecção da infecção recente pelo HIV, quando comparado com ensaio
imunoenzimático de captura de IgG BED-CEIA?
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SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
•
Comparar o ensaio automatizado Axsym HIV 1/2gO modificado pela Guanidina
que avalia o Índice de Avidez, com o ensaio imunoenzimático de captura de
IgG BED-CEIA, na identificação de infecções recentes pelo HIV-1 de usuários
de dois Centros de Testagem e Aconselhamento (CTA) do estado de
Pernambuco.
4.2 Objetivos específicos
•
Determinar a sensibilidade e especificidade do teste de avidez Axsym HIV 1/2gO
modificado pela Guanidina com base no BED-CEIA;
•
Determinar o valor preditivo positivo e negativo para o teste avidez Axsym HIV
1/2gO, com base no BED-CEIA ;
•
Realizar a curva ROC para indicar o melhor ponto de corte para uma melhor
sensibilidade e especificidade do teste de avidez Axsym HIV 1/2gO em relação
ao BED-CEIA;
•
Avaliar a performance do teste de avidez Axsym HIV 1/2gO modificado pela
Guanidina no diagnóstico da infecção recente pelo HIV-1, comparado ao BEDCEIA;
31
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
5. MATERIAL E MÉTODOS
População de estudo
Foram utilizadas 364 amostras de soro que tiveram diagnóstico positivo para
o HIV-1, de indivíduos dos sexos masculino e feminino que procuraram, de forma
espontânea, os Centros de Testagem e Aconselhamento (CTA) da cidade do Cabo
de Santo Agostinho e da cidade do Paulista, ambos pertencentes à região
metropolitana do Recife, no período de 2006 a 2009 e cujos resultados foram
positivo para o HIV-1.
Seleção das Amostras
A presença dos anticorpos anti-HIV foi definida com base nos registros de
protocolos de exames dos CTAs, de acordo com seguinte critério: apresentar dois
resultados reativos pela metodologia ELISA (ensaio imunoenzimático) de princípios
metodológicos ou antígenos distintos de fabricantes diferentes, e que foram
confirmados pela técnica de imunofluorescência (IFI) ou Westernblot (WB), conforme
a portaria nº 59 do Ministério da Saúde. (http:// www.aids.gov.br)
As amostras de soro foram codificadas a partir dos seus números de registro
originais, e encontravam-se armazenadas a -20ºC, nas sorotecas dos seus
respectivos CTAs.
Coleta de dados
Foi realizado um questionário (apêndice A) com os dados dos usuários
obtidos através livros de registros/planilhas de protocolos de exame dos laboratórios
dos respectivos CTA´s. Os dados sócio-demográficos dos indivíduos foram
coletados no, banco de dados do Sistema de Informação de Resultado de Exame de
HIV (SIREX-HIV), disponível nos CTAs da pesquisa, de forma anônima e
desvinculados para garantir o sigilo e a confidencialidade em relação à identidade
dos mesmos.
32
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
5.1. MÉTODOS
Parekh e colaboradores (2001b) desenvolveram um novo método chamado
de Ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG (IgG-Capture BED-EIA),
baseado na detecção de proporções crescentes de IgG específica após
soroconversão.
Suligoi
e
colaboradores
(2002)
padronizaram
metodologia
para
a
determinação do índice de avidez de anti-HIV, empregando um ensaio de ELISA
com micropartículas (AxSYM HIV 1/2gO, Abbott Diagnostics,Alemanha)
Esses testes são para estimativa de incidência da infecção recente pelo HIV1, apenas para fins de pesquisa para investigação em epidemiologia.
Método de avidez (IA)
Após descongelamento da amostra foram feitas duas alíquotas de 20 µL, e
submetidas a uma diluição de 1:10: uma alíquota (alíquota PBS) foi diluída com
180µL de uma solução de tampão fosfato (PBS - PhosphateBuffered Saline) e a
outra alíquota (alíquota G) foi diluída com 180 µL de uma solução 1M de Guanidina
(G). Após diluição, todas as amostras foram agitadas no vortex e incubadas durante
10 minutos à temperatura ambiente. Ambas alíquotas de cada amostra foram
testadas no ensaio automatizado HIV1/2gO do equipamento AxSYM (Abbott
DiagnosticsDivision, Wiesbaden, Germany), seguindo as instruções do fabricante,
sem
alterações.
O AxSYM
HIV1/2gO
é
um ensaio
imunoenzimático
de
micropartículas (MEIA) utilizado para a detecção qualitativa de anticorpos para HIV-1
(grupos M e O) e/ou HIV-2 em soro ou plasma humano. Este dispositivo é um ensaio
de terceira geração que não faz a distinção entre a reatividade a anticorpos para
HIV-1 e/ou HIV-2, apresentando uma sensibilidade e especificidade >99,9%. O
AxSYM HIV1/2gO utiliza antígenos recombinantes derivados, correspondentes a
quatro proteínas virais (invólucro do HIV-1 grupo M, invólucro do HIV-1 grupo O,
núcleo do HIV-1 e invólucro do HIV-2) e dois peptídeos sintéticos correspondentes
aos do invólucro do HIV-1 e do invólucro do VIH-2. O ensaio é completamente
automatizado e a presença ou ausência de anticorpos para HIV-1/HIV-2 na amostra
é determinada pela intensidade da fluorescência obtida para essa amostra,
comparada com o valor de cut-off, calculado a partir de uma calibração índice
33
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
AxSYM HIV1/2gO feita anteriormente. Se a intensidade da fluorescência da amostra
for superior ou igual ao valor de cut--off, a amostra é considerada reativa (tem
anticorpos para HIV), ou seja, a razão S/CO (sample/cut-off) será maior ou igual a 1.
A adição de um agente desnaturante (Guanidina) quebra as pontes de
hidrogênio que ajuda a determinar a estrutura secundária dos anticorpos levando um
efeito residual na interação antígeno-anticorpo. Esse tratamento tem um maior efeito
nos anticorpos recentes, que são os anticorpos de baixa avidez (Murphy e Parry,
2008).
Este procedimento resulta numa razão S/CO menor para alíquota G quando
comparados com alíquota de PBS. O Índice de Avidez é calculado após a obtenção
das razões S/CO para as alíquotas em PBS e G. O Índice de Avidez (I.A.) dos
anticorpos anti-HIV foi calculado através da seguinte fórmula:
I.A. = Resultado da alíquota G
Resultado da alíquota PBS
Valores de corte de 0,8 e 0,9 foram utilizados para a classificação das
infecções recentes.
INDICE AVIDEZ (I.A)
SOROTECA
SEPARAÇÃO DE 2 ALIQUOTAS
DE 20 µL CADA
ALIQUOTA 1
Diluir com 180 µl
Guanidina (G) 1M
ALIQUOTA 2
Diluir com 180 µl
PBS – 7,0ph
Vortex e incubar por
10 minutos a T.A
Colocar no equipamento
automatizado Axsym-Abbott
CALCULO DO INDICE AVIDEZ
IA= resultado G / resultado PBS
Figura 5 – Fluxograma da metodologia do índice de avidez
34
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Método BED-CEIA
O BED-CEIA (Calypte Biomedical Corporation) é um ELISA de captura de IgG
(IgG-CaptureBED-EIA) o qual é baseado na detecção de proporções crescentes de
IgG específica após soroconversão. É realizado em microplacas de 96 cavidades
sensibilizadas com antígenos, peptídeos derivados da região imunodominante da
gp41, contendo sequencias dos subtipos B, E e D, representativas de múltiplos
subtipos do HIV-1 (Calypte Biomedical Corporation, 2005). O kit contém soro
controle negativo (CN) (do próprio conjunto de reagentes), um soro controle positivo
forte (CP), um soro controle positivo fraco (CPF) e um soro calibrador (CAL), que
devem ser analisados em todas as corridas. O teste foi realizado em duas etapas,
uma de triagem e uma confirmatória, onde a triagem de cada amostra será incluída
no ensaio uma única vez; na etapa confirmatória, as amostras serão analisadas em
triplicata a partir de três diluições independentes da amostra original. O período de
janela para a soroconversão neste método é de 153 dias, empregando-se um valor
de corte (cut-off) de 1,2 para a densidade óptica padrão (DOP). A interpretação do
teste foi realizada da seguinte maneira:
•
Interpretação triagem: toda amostra com D.O ≤ 1.2, foram testadas em
triplicadas para confirmação da infecção recente ou não.
•
Interpretação confirmatória: amostras com D.O >0.8, foram caracterizadas
infecção não recentes, antiga ou estabelecida; e as D.O ≤ 0.8, foram
caracterizadas como infecção recente.
Amostras HIV positivas
confirmadas
Se DOn > 1.2
Infecção tardia
Se DOn ≤ 1.2
Repete-se o teste em
triplicada (confirmação)
Se DOn > 0.8
Infecção tardia
Se DOn ≤ 0.8
Infecção recente
Figura 6 – Fluxograma da interpretação do resultado do BED-CEIA
35
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
5.2. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS
Na análise dos resultados foram utilizados os softwares: MSOffice Excel
versão 2000 para o gerenciamento do banco de dados; SPSS for Windows versão
12.0 - Statistical Pachage for the Social Science, para a execução dos cálculos
estatísticos, elaboração e edição de gráficos e na elaboração das tabelas e redação
usamos o MSOffice Word versão 2000. Para comparar as distribuições de
frequência das variáveis qualitativas foi utilizado o teste Qui-Quadrado de Pearson.
5.3. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do Hospital
Agamenon Magalhães (HAM) sob nº Registro 518, resolução 196/96 e autorizado
pelos Centros de Testagem e Aconselhamento (CTA) onde a pesquisa foi realizada
(Anexo A ).
Não foi obtido o consentimento pós-informação dos sujeitos da pesquisa, por
tratar-se de levantamento sorológico anônimo desvinculado, a partir de amostras
armazenadas em bancos de soros. O sigilo e a confidencialidade a respeito dos
dados disponíveis dos indivíduos cujas amostras foram analisadas neste estudo
foram preservados, não tendo sido utilizados os nomes ou outros identificadores
destes sujeitos.
36
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
6. ARTIGO
Comparação do método do índice de avidez com o ensaio
imunoenzimático-BED de captura de IgG, para detecção de
infecção recente para o HIV-1, de dois Centros de Testagem
e Aconselhamento (CTA) do Estado de Pernambuco-Brasil.
37
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
ARTIGO ORIGINAL
Comparação do índice de avidez com o ensaio imunoenzimático-BED de
captura de IgG, para detecção de infecção recente para o HIV-1, em dois
Centros de Testagem e Aconselhamento do estado de Pernambuco-Brasil.
Autores:
Daniela Medeiros Salustianoa
Kledoaldo de Lima Oliveirab
Ana Maria S Cavalcantic
Heloisa Ramos Lacerdad
a
Centro de Testagem e Aconselhamento (CTA) Herbert de Souza, Cabo de Santo
Agostinho Pernambuco, Pernambuco, Brasil.
b
Centro de Testagem e Aconselhamento (CTA) Paulista, Centro do Paulista,
Pernambuco, Brasil.
c
Laboratório Central de Parnambuco (LACEN-PE), setor de virologia, Recife,
Pernambuco, Brasil.
d
Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Universidade Federal de
Pernambuco,Recife, Pernambuco, Brasil.
Endereço para Correspondência:
Heloisa Ramos Lacerda
Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, Universidade Federal de
Pernambuco, Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife-PE-Brasil
E-mail: [email protected]
38
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
RESUMO
O estudo foi desenhado para comparar o teste automatizado Axsym-HIV1/2gO
modificado com a adição de Guanidina para avaliar o índice de avidez (IA), com o
ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG (IgG-Capture BED-CEIA), com o
objetivo de detectar infecção recente para o HIV. A pesquisa incluiu 364 amostras
positivas para HIV das sorotecas de dois Centros de Testagem e Aconselhamento
(CTA) da região Metropolitana do Recife, sendo 206 do CTA do Cabo de Santo
Agostinho e 158 do CTA de Paulista, de 2006 a 2009. As amostras foram
submetidas ao teste BED-CEIA e ao teste de avidez. Os resultados dos dois testes
foram comparados utilizando o BED como Padrão Ouro. Das 364 amostras, 103
(28,29%) foram identificadas como infecção recente pelo BED; pelo índice de
avidez, com ponto de corte 0,8 e 0,9 foram identificadas 76 amostras (20,87%) e 148
(40,7%), respectivamente. para um ponto de corte de 0,9. A curva ROC mostrou que
o ponto de corte para o IA com a melhor sensibilidade e especificidade em relação
ao BED foi de 0,9, no qual a sensibilidade foi de 85,4% e especificidade de 77%. A
área sob a curva foi de 0,883 (IC 95%: 0,842 – 0,925). O presente estudo permite
concluir que o IA obtido pela metodologia Axsym-HIV-1/2gO com adição de
Guanidina possui boa performance quando comparado ao BED na detecção das
infecções recentes pelo HIV, sendo de grande utilidade em regiões com recursos
limitados.
Palavras - chave: HIV, Infecção recente, Índice de avidez, BED-CEIA.
39
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
ABSTRACT
The study was designed to compare the automated test Axsym-HIV1/2gO modified
with the addition of Guanidine to assess the avidity index (AI) with the enzyme
immunoassay-Capture BED IgG (IgG-Capture BED-EIA), with order to detect recent
HIV infection. The survey included 364 HIV positive samples from two Soroteca
Voluntary and Counselling Testing (VCT) of the metropolitan area of Recife, and 206
of the VCT of Cabo de Santo Agostinho and 158 of the VCT Paulista, 2006-2009.
The samples were tested with BED-CEIA and then submitted to the avidity test. The
results of both tests were compared using the BED as Gold Standard. Of the 364
samples, 103 (27.9%) were identified as recent infections by BED and 76 (20.87%)
by the avidity index (AI) with a cutoff point of 0.8 and 40.7% for a point cutoff of 0.9.
The ROC curve showed that the cutoff point for the AI that will bring the best
sensitivity and specificity in relation to BED was 0.9 in which the sensitivity was
85.4% and specificity of 77%. The area under the curve was 0.883 (95% CI: 0.842 to
0.925). This study shows that the IA methodology Axsym-HIV-1/2gO obtained by the
addition of Guanidine has good performance compared to the BED in the detection of
recent HIV infections, and is useful in regions with limited resources.
Key - words: VIH, Recent infections, Avidity index, BED-CEIA.
40
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
INTRODUÇÃO
O crescente interesse em estimar a incidência da infecção recente para o
vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem levado ao desenvolvimento de métodos
laboratoriais diversos (S. Bio Fernandes et al, 2005).
Em 1998, foi descrita na literatura uma adaptação de um teste de diagnóstico
para o HIV-1 que veio revolucionar os métodos epidemiológicos para estudo da
história natural do vírus (Janssen et al,1998). O princípio do teste é a diferenciação
das infecções recentes (menos de seis meses) das infecções estabelecidas, graças
ao conhecimento da cinética dos anticorpos após a infecção do HIV-1, o que permite
estimar a incidência a partir de um estudo transversal e com um único soro por caso
estudado (S. Bio Fernandes et al, 2005). Esta metodologia, reconhecida pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) é utilizada apenas para fins de investigação
em epidemiologia, sendo conhecida pela sigla STARHS (Serological Testing
Algorithm for Recent HIV Seroconversion - Detuned )(UNAIDS-WHO, 2001).
Em
2004,
Dobbs
e
colaboradores
avaliaram
as
características
de
desempenho do ensaio BED-CEIA, visando elaborar um algoritmo de testes
sorológicos alternativo às estratégias de testagem dupla sensível/menos sensível
para a detecção de infecções recentes pelo HIV-1. O teste baseia-se na
determinação da proporção de imunoglobulinas G (IgG) anti-HIV em relação ao total
de Imunoglobulinas G no sangue, através da utilização do teste ELISA (McWalter T
et al, 2009). Realizada em microplacas com 96 cavidades, este método utiliza, como
antígenos, peptídeos derivados da região imunodominante da gp41, contendo
seqüências dos subtipos B, E e D, representativas de múltiplos subtipos do HIV-1
(Parekh e McDougal, 2001; Parekh et al., 2002). O tempo da infecção do HIV pode
então ser estimado, uma vez que, em princípio, a razão entre a relação da IgG total
41
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
e a IgG anti-HIV varia de acordo com a progressão da doença (McWalter T et al,
2009). Esta técnica é freqüentemente utilizada em conjunto com ferramentas
matemáticas para estimar a incidência da infecção pelo HIV e tem sido amplamente
utilizada ( Hargrove J et al, 2009).
Um outro método que permite distinguir as infecções recentes das
estabelecidas, com base na avidez (afinidade) dos anticorpos foi descrito em 2002
(Suligoi et al, 2002). A metodologia baseia-se no princípio de que a avidez dos
anticorpos produzidos na fase inicial da infecção é reduzida, em oposição ao que se
observa em infecções estabelecidas. Na validação deste método é calculado o
Índice de Avidez (I.A.) mediano em função do tempo de seroconversão: 0,68 para
um tempo inferior a seis meses e 0,99 para um tempo superior a seis meses em que
os intervalos de confiança a 95% destes valores não são sobreponíveis (0,68 ± 0,16
versus 0,99 ± 0,10, respectivamente, (p<0,001)(Suligoi et al, 2002). Assim, foram
definidas como infecções recentes as contraídas há menos de seis meses e
infecções estabelecidas as contraídas há mais de 6 meses (Suligoi et al, 2003). Os
autores realçam a simplicidade e o automatismo da técnica, e ainda, o fato de
teoricamente detectar todos os subtipos virais e não ser influenciado pelo estágio da
infecção.
Tendo em vista a importância da identificação das infecções recentes para a
compreensão da dinâmica da epidemia pelo HIV em diferentes regiões, as
diferenças de subtipos e a sua interferência na detecção de anticorpos, bem como o
custo elevado do teste BED, o presente estudo foi desenhado para comparar o teste
automatizado Axsym-HIV1/2gO com adição de Guanidina que avalia o índice de
avidez ao ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG (IgG-Capture BEDCEIA), para a detecção de infecção recente para o HIV de amostras positivas para
42
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
esse vírus de dois Centros e Testagem e Aconselhamento (CTA) da região
metropolitana do Recife-Pernambuco, do período de 2006 a 2009.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizadas 364 amostras de soro que tiveram diagnósticos positivos
para o HIV-1 de indivíduos que procuraram, de forma espontânea, os Centros de
Testagem e Aconselhamento (CTA) da cidade do Cabo de Santo Agostinho e da
cidade do Paulista, ambas localizadas na região metropolitana do Recife, no período
de 2006 a 2009.
Os dados referentes ao sexo e à idade dos indivíduos, foram resgatados
através de livros de registros/planilhas de protocolos de exame, que se encontravam
nos laboratórios dos CTAs, e os dados sócio- demográficos dos usuários, através do
banco de dados do Sistema de Informação de Resultado de Exame de HIV (SIREXHIV), disponível nos CTAs. Estas informações foram coletados de forma anônima e
desvinculadas das amostras para garantir o sigilo e a confidencialidade em relação à
identidade dos mesmos. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em
Pesquisa do Hospital Agamenom Magalhães sob nº 518, resolução 196/96.
Preparação das amostras para Índice de Avidez (IA)
Após descongelamento da amostra, foram feitas duas alíquotas de 20 µL, que
foram submetidas a uma diluição de 1:10. Uma alíquota (alíquota PBS) foi diluída
com 180µL de uma solução de tampão fosfato (PBS - PhosphateBuffered Saline) e a
outra alíquota (alíquota G) foi diluída com 180 µL de uma solução 1M de Guanidina
43
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
(G). Após diluição, todas as amostras foram agitadas no vortex e incubadas durante
10 minutos à temperatura ambiente. As duas alíquotas de cada amostra foram
testadas no ensaio automatizado HIV 1/2 gO do equipamento AxSYM (Abbott
DiagnosticsDivision, Wiesbaden, Germany), seguindo as instruções do fabricante.
O ensaio é completamente automatizado e a presença ou ausência de
anticorpos para HIV-1/HIV-2 na amostra é determinada pela intensidade da
fluorescência obtida para essa amostra, comparada com o valor de cut-off, calculado
a partir de uma calibração índice AxSYM HIV 1/2gO feita anteriormente. Se a
intensidade da fluorescência da amostra for superior ou igual ao valor de cut--off, a
amostra é considerada reativa (tem anticorpos para HIV), ou seja, a razão S/CO
(sample/cut-off) será maior ou igual a 1. A adição de um agente desnaturante
(Guanidina) quebra as pontes de hidrogênio, que ajuda a determinar a estrutura
secundária dos anticorpos levando a um efeito residual na interação antígenoanticorpo. Esse tratamento tem maior efeito nos anticorpos recentes, que são os
anticorpos de baixa avidez (Murphy e Parry, 2008). Este procedimento resulta numa
razão S/CO menor para alíquota G quando comparado com a alíquota de PBS. O
Índice de Avidez é calculado após a obtenção das razões S/CO para as alíquotas
em PBS e G. O Índice de Avidez dos anticorpos anti-HIV foi calculado através da
seguinte fórmula: I.A. = Resultado da alíquota G
Resultado da alíquota PBS
Valores de corte de 0,8 e 0,9 foram utilizados para a classificação das
infecções recentes.
44
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Método BED-CEIA
O BED-CEIA (Calypte Biomedical Corporation) é um ELISA de captura de IgG
(IgG-CaptureBED-EIA) baseado na detecção de proporções crescentes de IgG
específica anti-HIV-1 após soroconversão. É realizado em microplacas de 96
cavidades,
sensibilizadas
com
antígenos,
peptídeos
derivados
da
região
imunodominante da gp41, contendo seqüência dos subtipos B, E e D,
representativas de mútipols subtipos do HIV-1.
O conjunto original do fabricante contém um soro controle negativo (CN), um
soro controle positivo forte (CP), um soro controle positivo fraco (CPF) e um soro
calibrador (CAL), que devem ser analisados em todas as corridas. O teste deve ser
realizado em duas etapas, uma de triagem e uma confirmatória. Na etapa de triagem
cada amostra será incluída no ensaio uma única vez; na etapa confirmatória, as
amostras serão analisadas em triplicata a partir de três diluições, independentes da
amostra original. O período de janela para a soroconversão neste método é de 153
dias, empregando-se um valor de corte de 1,2 para a densidade óptica padrão
(DOP). O teste foi interpretado da seguinte maneira: Interpretação triagem: todas as
amostras com D.O ≤ 1.2, foram testadas em triplicadas para confirmação da
infecção recente ou não; Interpretação confirmatório: amostras com D.O >0.8 foram
caracterizadas não recentes, antigas ou estabelecidas; e as com D.O ≤ 0.8 foram
caracterizadas como infecções recentes conforme bula do fabricante (Calypte
Biomedical Corporation, 2005).
45
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Métodos Estatísticos
Para avaliar a qualidade dos resultados do teste de Avidez, considerando o
BED como Padrão Ouro, foram utilizadas medidas que caracterizam a qualidade
intrínseca dos testes de diagnósticos e avaliados dois pontos de corte: 0,8 e 0,9.
Para estes dois pontos de corte foram avaliados, sensibilidade, especificidade, valor
preditivo positivo, valor preditivo negativo, acurácia, razão de verossimilhança para o
teste positivo, razão de verossimilhança para o teste negativo, Kappa e uma curva
ROC. Os softwares utilizados foram: MSOffice Excel versão 2000 para o
gerenciamento do banco de dados; SPSS for Windows versão 12.0 - Statistical
Pachage for the Social Science. Para a execução dos cálculos estatísticos,
elaboração e edição de gráficos usamos o MSOffice Word versão 2000. Para
comparar as distribuições de freqüência das variáveis qualitativas foi utilizado o teste
Qui-Quadrado de Pearson. O teste exato de Fisher foi utilizado nas situações onde
os valores esperados foram inferiores a 5. Valor de p menor do que 0,5 identificou a
associação estatisticamente significativa entre as variáveis.
46
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
RESULTADOS
Características da população estudada
A população de estudo consistiu de 175 (48%) homens e 189 (52%)
mulheres, entre elas, 53 (28%) eram gestantes. A mediana da idade foi de 29 anos.
Quanto à categoria de exposição sexual, 14 (3,8%) eram bissexuais, 303 (82,2%)
heterossexuais e 36 (9,8%) homossexuais. Vinte e sete (7,1%) indivíduos eram
parceiros de pessoas positivas para o HIV e o uso de drogas injetáveis não foi
referido por nenhum paciente. Em relação à inserção no mercado de trabalho
observamos que 115 (31,5%) tinham alguma ocupação (empregados e autônomos)
e 122 (33,5%) eram donas de casa. (Tabela 1).
47
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Tabela 1. Características dos 364 pacientes diagnosticados para a infecção pelo
HIV e incluídos no estudo, CTA-Cabo e CTA-Paulista, 2006 a 2009.
Total
Pacientes HIV positivos
CTA-Cabo
N
%
CTA-Paulista
N
%
N
%
Sexo
Feminino
Masculino
116
90
56,3
43,8
73
85
45,9
54,1
189
175
52,0
48,0
Gestação
Sim
Não
33
83
15,7
40,6
20
53
12,6
33,3
53
136
28,0
72,0
Idade (anos) mediana
Situação de Risco
BSX
HTS
HSH
Hemotransfusão
Profissional do sexo
Transmissão vertical
UDI
Parceiro HIV+
Estupro
27
30
29
6
178
10
11
6
7
-
2,8
86,4
4,8
5,1
2,8
3,2
-
8
125
26
3
2
1
20
1
5,0
78,6
16,4
1,9
1,3
0,6
12,6
0,6
14
303
36
14
8
1
27
1
3,8
82,2
9,8
3,8
2,1
0,2
7,4
0,2
Escolaridade
≤ 8 anos
> 8 anos
Não informado
148
49
9
73,3
22,6
4,1
78
78
2
49,1
49,7
1,3
226
127
11
62,0
35,0
3,0
Local de residência
Cabo
Paulista
Outra cidade RMR
Interior do Estado
148
42
16
73,3
19,4
7,4
123
35
-
77,4
22,6
-
148
123
42
16
73,3
77,4
19,4
7,4
Inserção no mercado de
trabalho
Empregado
Autônomo
Desempregado
Estudante
Dona de casa
Aposentado
Não informado
33
21
34
09
75
7
27
16,0
10,1
16,5
4,3
36,4
3,3
13,1
40
21
28
15
47
2
5
25,3
13,2
17,7
9,4
29,7
1,2
3,1
73
42
62
24
122
09
32
20,0
11,5
17,0
6,5
33,5
2,4
8,8
48
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Comparação das infecções recentes avaliados pelo BED-CEIA e índice de
Avidez
Os resultados do teste de avidez e do ensaio Imunoenzimático-BED de
Captura de IgG nas 364 amostras estão descritos nas Tabelas 2,3 e 4. Para
analisarmos a qualidade dos resultados do teste de Avidez, considerando o BED
como Padrão Ouro, foram utilizadas algumas medidas que caracterizam a qualidade
intrínseca dos testes de diagnósticos, descritos na tabela 5. Foi realizado IA para
dois pontos de corte, 0,8 e 0,9. Apesar da sensibilidade ser maior para um IA 0,9 o
kappa foi substancial para IA 0,8 : 0,669 (p< 0,001).
Tabela 2. Resultados do teste de avidez com ponto de corte 0,8 comparados aos
resultados do ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG das 364 amostras,
CTA-Cabo e CTA-Paulista, período de 2006 a 2009.
BED
AXSYM
Recente (<=0,8)
Tardia (>0,8)
Total
N
Inf.Recente
67
Inf.Tardia
9
Total
%
65,0%
3,4%
20,9%
N
36
252
288
%
35,0%
96,6%
79,1%
N
103
261
364
%
100,0%
100,0%
100,0%
76
49
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Tabela 3. Resultados do teste de avidez com o ponto de corte 0,9 comparados aos
resultados do ensaio Imunoenzimático-BED de Captura de IgG das 364 amostras,
CTA-Cabo e CTA-Paulista, 2006 a 2009
BED
AXSYM Inf.Recente (<=0,9) N
Inf.Recente
88
Inf.Tardia
60
Total
148
%
85,4%
23,0%
40,7%
N
15
201
216
%
14,6%
77,0%
59,3%
N
103
261
364
%
100,0%
100,0%
100,0%
Inf.Tardia (>0.9)
Total
Tabela 4. Performance do teste de avidez tendo como pontos de corte a densidade
ótica de 0,8 e 0,9, tento como Padrão ouro o ensaio Imunoenzimático-BED de
Captura de IgG das 364 amostras do estudo, CTA-Cabo e CTA-Paulista, 2006 a
2009.
Ponto de corte ≤0,9
Ponto de corte ≤0,8
Medidas
Valor
Medidas
Valor
Sensibilidade
85,4%
Sensibilidade
65,0%
Especificidade
77,0%
Especificidade
96,6%
VPP
59,5%
VPP
88,2%
VPN
93,1%
VPN
87,5%
Acurácia
79,4%
Acurácia
87,6%
RV+
13,72
RV+
18,9
RV-
0,18
RV-
0,36
% Falso positivo
16,5%
% Falso positivo
2,5%
% Falso negativo
4,1%
% Falso negativo
9,9%
Kappa (p-valor)
0,552 (p<0,001)
Kappa (p-valor)
0,669 (p<0,001)
50
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
Curva ROC para os valores do IA
A curva ROC mostrou que o ponto de corte para o IA que trará a melhor
sensibilidade e especificidade em relação ao BED foi de 0,9 no qual a sensibilidade
foi de 85,4% e especificidade de 77%. Para avaliar se o ponto de corte é uma boa
classificação verificamos se a área sob a curva está entre 0,5 e 1. Essa área pode
ser interpretada como a probabilidade do indivíduo ter sido classificado
corretamente. No nosso caso a área foi de 0,883 (IC 95%: 0,842 – 0,925) (Figura 1).
Sensibilidade
1- Especificidade
Gráfico 1. Curva ROC mostra a sensibilidade e especificidade do Índice de Avidez
comparado ao BED de 364 amostras.
51
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
DISCUSSÃO
No estudo observamos que uma proporção elevada de indivíduos que
procuraram os dois Centros de Testagem e Aconselhamento (CTA) das cidades do
Cabo de Santo Agostinho e Paulista no período de 2006 a 2009 apresentaram
infecção recente, atingindo 27,9% da população testada. Os CTAs estão localizados
na região metropolitana da capital do estado de Pernambuco, pertencente à Região
Nordeste do Brasil onde a epidemia do HIV/Aids ainda cresce, diferentemente de da
região Sudeste do Brasil (MS Boletim Epidemiológico, 2009).
Ao compararmos o teste automatizado Axsym-HIV1/2gO modificado com a
adição de Guanidina para avaliar o índice de avidez (IA), com o ensaio
Imunoenzimático-BED de Captura de IgG (IgG-Capture BED-EIA), com o objetivo de
detectar infecção recente numa população de indivíduos que procuram os CTAs
verificamos que o IA tem uma boa performance que varia com o ponto de corte
utilizado.
A curva ROC mostrou que o ponto de corte 0,9 apresentou melhor
sensibilidade em relação ao BED, entretanto, para analisar a performance de um
teste, deve-se levar em conta várias medidas que caracterizam a qualidade
intrínseca do teste.
Quando analisamos a sensibilidade e a especificidade do IA em relação ao
BED para o ponto de corte 0,8, verificamos uma sensibilidade de 65% e uma
especificidade de 96,6%. Ao aumentar o valor de corte para 0,9, a sensibilidade do
teste aumentou para 85,4%, mas, sua especificidade diminuiu consideravelmente,
ficando em 77%. Conseqüentemente o percentual de falsos positivos aumentou para
16,5%, antes era de 2,5%, mostrando que o ponto 0,8 teve uma melhor performance
em relação ao corte 0,9.
Os resultados deste estudo concordaram parcialmente com os descritos por
Suligoi et al, 2002 quando analisou a precisão e a exatidão do IA para detectar
infecções recentes para o HIV em 47 pacientes com a data de soroconversão
conhecida. De acordo com o estudo, pontos de corte baixos, resultam em baixa
sensibilidade e alta especificidade para soroconversões recentes, enquanto os
maiores valores de corte correspondem a uma maior sensibilidade e menor
especificidade. IA <0,8 pode ser utilizado como ponto de corte para vigilância das
infecções incidentes, uma vez que a sensibilidade e especificidade observadas com
52
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
este corte iriam identificar corretamente cerca de 80% de todas as infecções
recentes pelo HIV e apenas 8% das infecções identificadas como infecções recentes
seriam infecções estabelecidas. IA de <0,6 e 0,7 poderia ser utilizado por médicos
em sua decisão sobre tratamento antirretroviral nas infecções agudas, porque
identificaria as pessoas na fase inicial da doença que poderiam se beneficiar do
tratamento precoce, reduzindo o risco do tratamento desnecessário pois
apresentaria taxas muito baixas, entre 1% e 5%, de resultados falso-positivos. IA
>0,9 poderia ser utilizado para a notificação de parceiros, uma vez que sugere que a
infecção tenha sido adquirido há mais de um ano, evitando assim o risco de
identificar um parceiro recente como fonte de infecção (Suligoi et,al, 2003). Na
prática, a escolha do valor de corte dependerá dos objetivos da sua utilização.
Estudos epidemiológicos se beneficiariam de uma maior sensibilidade e, portanto,
um corte maior, enquanto valor de corte menor seria preferível para fins clínicos.
Uma importante vantagem desta metodologia é que não é necessário
modificar o procedimento recomendado pelo fabricante do teste, sendo assim, não
necessitaria de aprovação de autoridade regulatória oficial para a sua utilização
(Chawla et al, 2007). O único passo adicional é a preparação da amostra, que
consiste na diluição de parte do soro com uma solução salina de tampão fosfato e
outra parte com guanidina, um agente de dissociação barato e fácil de obter. O
Axsym é totalmente automatizado, o que garante uma melhor reprodutibilidade dos
resultados e é usado rotineiramente em grande parte dos laboratórios para triagem
da infecção do HIV-1. O teste também pode ser usado para avaliar rapidamente a
incidência de infecção pelo HIV entre populações que são candidatos para teste de
vacinas, especialmente em países pobres sem recursos (Martró et al, 2005). O local
do estudo é também a região mais carente e populosa do Brasil, onde há
necessidade de metodologias simples e baratas que permitam a detecção de
infecções recentes.
O Axsym é um ensaio imunoenzimático por micropartículas (MEIA) de
terceira
geração
bastante
sensível
à
detecção
de
anticorpos
formados
precocemente e reconhece todas as classes de anticorpos. Além disso, permite a
detecção do HIV-1, grupos M e O e o HIV-2 (S.Bio Fernades et al, 2005). Em
virtude destas características o IA não é influenciado pelo estágio avançado da
doença, por qualquer tratamento antiviral e por subtipos virais (Chawla et al, 2007).
Considerando que no estado de Pernambuco predominam os subtipos B (82,4%) e
53
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
F (11,8%) (Cavalcanti et al, 2007), este último não estaria excluído nas análises de
infecção recente por este subtipo, constituindo mais uma vantagem desta
metodologia.
Entretanto é importante salientar que o nosso estudo comparou exames
realizados a partir de sorotecas, nas quais o período de soroconversão não foi
documentado, aspecto que poderia limitar o valor dos nossos achados.
Os resultados do nosso estudo confirmam a boa performance do índice de
avidez. O teste fornece resultado quantitativo com diferentes níveis de sensibilidade
e especificidade, a depender do ponto de corte escolhido, que pode variar de acordo
com a utilidade a ser conferida ao teste.
Somam-se ainda o baixo custo e a
facilidade na obtenção e execução, aspectos que sugerem fortemente o benefício da
sua utilização para a detecção das infecções recentes na região.
54
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
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SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
7. CONCLUSÃO
O presente estudo permite concluir que o IA obtido pela metodologia AxsymHIV-1/2gO com adição de Guanidina possui boa performance comparado ao BED na
detecção das infecções recentes pelo HIV, sendo de grande utilidade em regiões
com recursos limitados.
58
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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64
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
APÊNDICE A – QUESTIONÁRIO DE COLETA DE DADOS
DADOS DA AMOSTRA:
1) Código da amostra: _______________________
2) Origem: 1 – Cabo ( ) 2 – Paulista ( )
3) Ano de diagnóstico: 1 – 2004 ( ) 2 – 2005 ( ) 3 – 2006 ( ) 4 – 2007 ( )
5 - 2008 ( ) 6 – 2009 ( )
4) Sexo: 1 – Feminino ( )
2 – Masculino ( )
5) Gestante: 1- Sim ( ) 2- Não ( )
3- Não se aplica ( )
6) Idade: _____________ 1 – Não informado ( )
7) Situação de risco para a infecção pelo HIV:
– Acidente ocupacional.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Bissexual.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Heterossexual.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Homossexual.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Transfusão sanguínea.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Profissional do sexo.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Transmissão vertical.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Usuário de drogas injetáveis.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Parceiro de HIV+.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Paciente de clínica de DST.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Caminhoneiro.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Paciente de tuberculose.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
– Vítima de estupro.
0 – Não ( ) 1 – Sim ( ).
8) Escolaridade: 1 – ≤ 8 anos de estudo ( )
3- Não informado ( )
2 - > 8 anos de estudo ( )
65
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
9) Local de residência:
1 – Cabo ( )
2 – Paulista ( )
3 – Outra cidade da RMR ( )
4 – Cidade do interior do Estado ( )
5 – Outro Estado do Brasil ( )
6 – Estrangeiro ( )
7 – Não informado ( )
10) Inserção no mercado de trabalho:
1 – Empregado ( )
2 – Autônomo ( )
3 – Desempregado ( )
4 – Estudante ( )
5 – Dona de casa ( )
6 – Não informado ( )
7 – Aposentado ( )
11) Estado Civil:
1 – Solteiro ( )
2 – Casado/amigado ( )
3 – Separado/divorciado ( )
4 – Viúvo ( )
5 – Não informado ( )
DADOS RELACIONADOS AO DIAGNÓSTICO:
12) Sintomatologia: 1 – Sim ( ) 2 – Não ( ) 3 – Não informado ( )
13) D.O do EIE 1ª amostra: 1 – Fraca reação <1.0 ( )
2 – Forte reação ≥1.0 ( )
14) Resultados do BED: 1 – Infecção recente ( )
2 – Infecção tardia ( )
DO do BED: ______
15) Resultado Avidez (AXSYM): 1 – < 0.8 ( ) 2 – ≥ 0.8 ( )
AI do AXSYM: ______
66
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
ANEXO A – APROVAÇÃO EM COMITÊ DE ÉTICA
67
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
ANEXO B – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DA REVISTA
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
•
•
Objetivos e política editorial
Formato e estilo
ISSN 0074-0276 versão
impressa
ISSN 1678-8060 versão on-line
Objetivos e política editorial
As Memórias do Instituto Oswaldo Cruz são uma revista multidisciplinar que publica
pesquisas originais relativas aos campos da medicina tropical (incluindo patologia,
epidemiologia de campo e estudos clínicos), parasitologia médica e veterinária
(protozoologia, helmintologia, entomologia e malacologia) e microbiologia médica
(virologia, bacteriologia e micologia). A revista aceita, especialmente, pesquisas básicas e
aplicadas em bioquímica, imunologia, biologia molecular e celular, fisiologia, farmacologia
e genética relacionada a essas áreas. Comunicações breves são também consideradas.
Artigos de revisão só quando solicitados. A revista publica oito números regulares,
constitutindo um por ano. Ocasionalmente, trabalhos apresentados em simpósios ou
congressos são publicados como suplementos.
Os artigos apresentados devem ser escritos preferencialmente em inglês. Quando neste
idioma, para não causar atrasos na publicação sugerimos que sejam checados por alguém
que tenha o inglês como primeira língua e que, preferencialmente, seja um cientista da área.
A submissão de um manuscrito às Memórias requer que este não tenha sido publicado
anteriormente (exceto na forma de resumo) e que não esteja sendo considerado para
publicação por outra revista. A veracidade das informações e das citações bibliográficas é
de responsabilidade exclusiva dos autores.
Os manuscritos serão analisados por pelo menos dois pareceristas; a aprovação dos
trabalhos será baseada no conteúdo científico e na apresentação.
Somente serão aceitas submissões eletrônicas dos artigos, no seguinte endereço:
http://submission.scielo.br/index.php/mioc/login.
Por meio desse serviço você pode submeter o artigo e acompanhar o status do mesmo
durante todo o processo editorial. Garantindo rapidez e seguranças na submissão do seu
manuscrito e agilizando o processo de avaliação.
O manuscrito deverá ser preparado de acordo com as Orientações aos Autores.
Ao encaminhar um manuscrito para a revista, os autores devem estar cientes de que, se
aprovado para publicação, o copyright do artigo, incluindo os direitos de reprodução em
todas as mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para as Memórias. A
68
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revista não recusará as solicitações legítimas dos autores para reproduzir seus trabalhos.Para
maiores informações sobre o formato e o estilo da revista, favor consultar um número
recente da Revista ou entrar em contato com a Editoria Científica pelos telefones (+55-212598.4335/2561-1442), fax (+55-21-2280-5048), ou e-mail ([email protected] /
[email protected]).
Formato e estilo
O manuscrito (incluindo tabelas e referências) deve ser preparado em um software para
edição de textos, em espaço duplo, fonte 12, paginado. As margens devem ser de pelo
menos 3 cm. As figuras deverão vir na extensão tiff, com resolução mínima de 300 dpi.
Tabelas e figuras deverão vir em documentos separados.
Deve ser organizado de acordo com a seguinte ordem:
Título resumido: com até 40 caracteres (letras e espaços)
Título: com até 250 caracteres
Autores: sem títulos ou graduações
Afiliação institucional: endereço completo somente do autor correspondente
Resumo: com até 200 palavras (100 palavras no caso de comunicações breves). Deve
enfatizar novos e importantes aspectos do estudo ou observações.
Palavras-chave: devem ser fornecidos de 3 a 6 termos, de acordo com a lista Medical
Subject Headings (Mesh) do Index Medicus.
Notas de rodapé: indicando a fonte de financiamento e mudança de endereço
Introdução: deve determinar o propósito do estudo, oferecer um breve resumo (e não uma
revisão de literatura) dos trabalhos anteriores relevantes, e especificar quais novos avanços
foram alcançados através da pesquisa. A introdução não deve incluir dados ou conclusões
do trabalho em referência.
Materiais e Métodos: deve oferecer, de forma breve e clara, informações suficientes para
permitir que o estudo seja repetido por outros pesquisadores. Técnicas padronizadas bastam
ser referenciadas.
Ética: ao descrever experimentos relacionados a temas humanos, indicar se os
procedimentos seguidos estiveram de acordo com os padrões éticos do comitê responsável
por experimentos humanos (institucional ou regional) e de acordo com a Declaração de
Helsinki de 1975, revisada em 1983. Ao relatar experimentos em animais, indicar se
diretrizes de conselhos de pesquisa institucionais ou nacionais, ou qualquer lei nacional
relativa aos cuidados e ao uso de animais de laboratório foram seguidas.
Resultados: devem oferecer uma descrição concisa das novas informações descobertas,
com o mínimo julgamento pessoal. Não repetir no texto todos os dados contidos em tabelas
69
SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
e ilustrações.
Discussão: deve limitar-se ao significado de novas informações e relacionar as novas
descobertas ao conhecimento existente. Somente as citações indispensáveis devem ser
incluídas.
Agradecimentos: devem ser breves e concisos e se restringir ao absolutamente necessário.
Referências: devem ser precisas. Somente as citações que aparecem no texto devem ser
referenciadas. Trabalhos não publicados, a não ser os já aceitos para publicação, não devem
ser citados. Trabalhos aceitos para publicação devem ser citados como " in press "; nesse
caso, uma carta de aceitação da revista deverá ser fornecida. Dados não publicados devem
ser citados somente no texto como " unpublished observations "; nesse caso, uma carta com
a permissão do autor deve ser fornecida. As referências ao final do manuscrito devem ser
organizadas em ordem alfabética de acordo com o sobrenome do primeiro autor.
Os títulos de revistas devem ser abreviados de acordo com o estilo usado no Index
Medicus,consultar:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals&TabCmd=Limits.
• No texto, usar o sobrenome do autor e a data:
Lutz (1910) ou (Lutz 1910).
Com dois autores, a forma é:
(Lutz & Neiva 1912) ou Lutz and Neiva (1912).
Quando há mais que dois autores, somente o primeiro é mencionado:
Lutz et al. (1910) ou (Lutz et al. 1910).
• Nas referências, usar os seguintes estilos:
Artigo de revista
Chagas C, Villela E 1922. Forma cardíaca da tripanosomiase americana. Mem Inst Oswaldo
Cruz 14: 15-61.
Livro ou Tese
Forattini OP 1973. Entomologia Médica. Psychodidae, Phlebotominae, Leishmaniose,
Bartonelose, Vol. IV, Edgard Blucher, São Paulo, 658 pp.
Morel CM 1983. Genes and Antigens of Parasites. A Laboratory Manual, 2nd ed., Fundação
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, xxii + 580 pp.
Mello-Silva CC 2005. Controle alternativo e alterações fisiológicas em Biomphalaria
glabrata (Say, 1818), hospedeiro intermediário de Schistosoma mansoni Sambom, 1907 pela
ação do látex de Euphorbia splendens var. hislopii N.E.B (Euphorbiaceae), PhD Thesis,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 85 pp.
Capítulo de livro
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c1995-2002 [updated 2001 Aug 23; cited 2002 Aug 12]. AMA Office of Group Practice
Liaison;
[about
2
screens].
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from:
http://www.ama-assn.org/ama/pub/category/1736.html
BASE DE DADOS NA INTERNET
Acesso aberto:
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2001
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Available
from:
http://www.abms.org/newsearch.asp
Acesso fechado:
Jablonski S. Online Multiple Congenital Anomaly/Mental Retardation (MCA/MR)
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c1999 [updated 2001 Nov 20; cited 2002 Aug 12]. Available from:
http://www.nlm.nih.gov/mesh/jablonski/syndrome_title.html
Parte de uma base de dados na Internet
MeSH Browser [database on the Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine
(US); 2002 - [cited 2003 Jun 10]. Meta-analysis; unique ID: D015201; [about 3 p.].
Available from:
http://www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser.html Files updated weekly. Updated June 15,
2005
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SALUSTIANO, D.M.Comparação do Método do Índice de Avidez com o Ensaio Imunoenzimático–BED...
• Ilustrações: figuras e tabelas devem ser compreensíveis sem a necessidade de referência
ao texto.
- Figuras: as fotografias devem ser bem nítidas, com alto contraste, ampliadas em preto e
branco em papel brilhante, se apresentadas lâminas, as figuras devem ser numeradas
consecutivamente em algarismos arábicos. As escalas devem ser indicadas por uma linha ou
barra na figura, e referenciadas, se necessário, na legenda (por exemplo, bar = 1 mm etc.).
Lâminas e gráficos devem ajustar-se tanto em uma coluna (8 cm) ou na largura completa
(16.5 cm) da página, e devem ser menores que a página para permitir a inclusão da legenda.
As letras e números nas figuras devem ter tamanho legível após a redução ou a impressão.
Ilustrações coloridas somente podem ser aceitas se os autores assumirem os custos. Por
outro lado, uma fotografia colorida ilustra a capa de cada fascículo de Memórias, e os
autores são convidados a submeter para consideração da revista ilustrações com legendas de
seus manuscritos que poderão vir a ilustrar a capa.
- Tabelas: devem complementar, e não duplicar, o texto. Elas devem ser numeradas em
algarismos romanos. Um título breve e descritivo deve constar no alto de cada tabela, com
quaisquer explicações ou notas de rodapé (identificadas com letras a, b, c etc.) colocadas
abaixo.
• Comunicações breves: devem ser breves e diretas. Seu objetivo é comunicar com rapidez
resultados ou técnicas particulares. As comunicações não devem ocupar mais do que três
páginas impressas, incluindo figuras e/ou tabelas. Não devem conter referências em
excesso. As referências devem ser citadas no final do texto, usando o mesmo formato para
artigos originais. Um resumo breve e três palavras-chave devem ser apresentados.
• Formato alternativo: Os manuscritos podem ser submetidos seguindo os "Uniform
Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals" produzidos pelo
International Committee of Medial Journal Editors, também conhecidos como Vancouver
Style. Nesse caso, os autores devem seguir as diretrizes da quinta edição (Annals of Internal
Medicine
1997;
126:
36-47,
ou
no
website
http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm), sendo responsáveis por modificar
o manuscrito onde diferir das instruções aqui apresentadas, se o manuscrito for aceito para
publicação. Os autores também deverão seguir os Uniform Requirements para quaisquer
outras diretrizes omitidas nestas instruções.
Uma vez que um trabalho seja aceito para publicação, os autores devem enviar:
• uma declaração de affidavit fornecida pela produção editorial da revista, assinada por
todos os autores. Autores de diferentes países ou instituições podem assinar em diferentes
folhas
que
contenham
a
mesma
declaração.
• uma declaração de copyright fornecida pela produção editorial da revista, assinada pelo
autor
responsável
pela
correspondência.
•Taxas:
a
revista
não
cobra
taxas
para
publicação.
•Provas: serão enviadas provas tipográficas aos autores para a correção de erros de
impressão. As provas devem retornar para a Produção Editorial na data estipulada. Outras
mudanças no manuscrito original não serão aceitas nesta fase.
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